DE19758545A1

DE19758545A1 - Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren

Info

Publication number: DE19758545A1
Application number: DE19758545A
Authority: DE
Inventors: Arnd Baumann; Stephan Frings
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1997-12-23
Publication date: 1999-09-23
Also published as: WO1999033973A2; DE19757695A1; WO1999033973A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren. Dafür läßt man einen zu untersuchenden Liganden auf durch Neurotransmitter-Rezeptoren transformierte Zellen einwirken und bestimmt die Wirkung über die Bestimmung intrazellulärer Botenstoffe bzw. über die Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca·2+·-Ionenkonzentration. Vorzugsweise läßt man den Liganden auf durch Octopamin-Rezeptoren transformierte Zellen einwirken. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglich die Untersuchung einer großen Anzahl von Substanzen bei hohen Durchsatzzahlen. In relativ kurzer Zeit stehen damit wichtige Informationen über die Eigensschaften der getesteten Liganden zur Verfügung.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren gemäß Anspruch 1 bis 11.

Nervenzellen oder Neurone bilden die funktionellen Einheiten des Gehirns. Die Hauptaufgabe eines Neurons besteht in der Übertragung von Informationen auf andere Neurone oder auf Muskel- und Drüsenzellen. Um diese Aufgabe zu erfüllen, besitzt jedes Neuron nicht nur ein vielfältiges Repertoir hochspezialisierter, membranständiger Eiweißmoleküle (Proteine), sondern auch einen außergewöhnlichen zellulären Aufbau. Morphologisch werden folgende Zellbereiche unterschieden: Dendrit, Zellkörper, Axon und synaptisches Endknöpfchen. Die Informationsaufnahme erfolgt im dendritischen Bereich des Neurons und wird als elektrisches Signal weitergeleitet. Wenn ein bestimmter Schwellenwert der elektrischen Erregung überschritten wird, kommt es kurz unterhalb des Zellkörpers - im Bereich des Axon-Hügelchens - zur Auslösung eines Aktionspotentials. Das Aktionspotential ist durch den selektiven Einstrom von Natrium-Ionen durch Natrium-Kanäle in das Zellinnere gekennzeichnet. Man spricht von einer Depolarisierung. Dem Natrium-Ionen-Einstrom wirkt ein zeitlich verzögerter Kalium-Ionen- Ausstrom durch Kalium-Kanäle entgegen (Repolarisierung), so daß das Ruhepotential wieder eingestellt wird. Das Aktionspotential pflanzt sich entlang des Axons bis in das synaptische Endknöpfchen fort. Dies ist der Bereich des Neurons, an dem die Zelle mit Zielzellen in Kontakt tritt. Die Kontaktstelle wird auch als Synapse bezeichnet. Die Zellmembran des Neurons und der Zielzelle stehen jedoch nicht in unmittelbarem Kontakt, sondern sind durch einen flüssigkeitsgefüllten Bereich, den synaptischen Spalt, getrennt. Über den synaptischen Spalt kann das elektrische Signal (Aktionspotential) nicht weitergegeben werden. Zur Signalübertragung vom Neuron auf die Zielzelle muß das elektrische Signal daher in ein chemisches Signal übersetzt werden. Dies wird dadurch erreicht, daß das Aktionspotential die Freisetzung von Botenstoffen, die sogenannten Neurotransmitter, aus dem synaptischen Endknöpfchen bewirkt. Nach der Ausschüttung in den synaptischen Spalt diffundieren die Neurotransmitter zur Oberfläche der Zielzelle und binden dort an für den jeweiligen Neurotransmitter spezifische, hochaffine Bindungsproteine, die sogenannten Neurotransmitter-Rezeptoren.

Es werden in der Regel zwei Gruppen von Neurotransmitter-Rezeptoren unterschieden: In der ersten Gruppe werden solche Rezeptoren zusammengefaßt, die selbst Ionenkanäle bilden können (ionotrope Rezeptoren). Hierzu gehören die Acetylcholin- und Glutamat-Rezeptoren, durch deren Aktivierung die Zielzelle depolarisiert und ein neues Aktionspotential ausgelöst werden kann. Inhibitorisch wirkende Rezeptoren, wie beispielsweise Glycin- und γ-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptoren, hyperpolarisieren die Zielzelle und wirken daher der Auslösung eines neuen Aktionspotentials entgegen.

Die zweite Gruppe von Neurotransmitter-Rezeptoren bildet selbst keine Ionenkanäle aus. Die Aktivierung dieser Rezeptoren wird durch die Bindung des spezifischen Liganden (= Neurotransmitter) ausgelöst und führt zu einer Konzentrationsänderung von intrazellulären Botenstoffen, den sogenannten "second messenger"-Molekülen. Die Rezeptoren werden daher auch als metabotrope Rezeptoren bezeichnet. Mitglieder dieser Rezeptorfamilie verfügen als gemeinsames Strukturmerkmal über sieben hydrophobe Abschnitte in der Primärstruktur (Aminosäuresequenz), die die Zellmembran durchspannen. Die Änderung der intrazellulären Botenstoffkonzentration wird dadurch erreicht, daß die Rezeptoren mit GTP-bindenden (G) Proteinen wechselwirken. Durch diese Wechselwirkung werden die G-Proteine aktiviert und stimulieren oder inhibieren nachgeschaltete Zielenzyme. So führt beispielsweise die Aktivierung der Adenylat-Zyklase zu einer Erhöhung der intrazellulären Konzentration von zyklischem Adenosin-3',5'-Monophosphat (cAMP). Ein anderer Weg besteht in der Aktivierung einer Phospholipase C und der daraus resultierenden Synthese von Inositol-1,4,5-triphosphat (IP₃) und Diacylglycerol (DAG).

Als Konsequenz der Regulation unterschiedlicher Botenstoffwege durch die Neurotransmitter-Rezeptoren kann es zu einer Veränderung (Modulation) der Eigenschaften von Ionenkanälen, Enzymen und sogar zur Aktivierung von Genen kommen. Die metabotropen Rezeptoren greifen somit in die Regelung der zellulären Aktivität ein und können die Plastizität neuronaler Verschaltungen entscheidend beeinflussen. Im Nervensystem schreibt man gerade der Modulation der synaptischen Plastizität eine entscheidende Rolle im Zusammenhang mit Lernleistungen und bei der Gedächtnisbildung zu.

Viele der heute bekannten Neurotransmitter-/Rezeptorsysteme sind im Laufe der Evolution erhalten geblieben. Einige kommen jedoch nur in bestimmten Tierarten vor. Ein Beispiel für die Differenzierung von Neurotransmittern findet sich in der Gruppe der biogenen Amine. Zur Gruppe der biogenen Amine gehören die Neurotransmitter Adrenalin, Dopamin, Histamin, Noradrenalin, Octopamin, Serotonin und Tyramin.

Dopamin, Histamin und Serotonin sind sowohl in Wirbeltieren als auch in Wirbellosen als Neurotransmitter eindeutig nachgewiesen worden. Im Gegensatz dazu werden die Neurotransmitter Adrenalin und Noradrenalin nur in Wirbeltieren gefunden (Venter, J.C. et al.: "Evolution of neurotransmitter receptor systems", Progress in Neurobiology 30, 1988, 105-169). Die Aufgaben von Adrenalin/Noradrenalin werden bei Insekten und vielen anderen Wirbellosen vor allem von Octopamin übernommen.

In Evertebraten wirkt Octopamin als Neurotransmitter, Neurohormon und auch als Neuromodulator und steuert bzw. moduliert viele biochemische Reaktionen, die Motorik sowie das Verhalten. So ist beispielsweise beschrieben, daß Octopamin u. a. den Stoffwechsel und den Energiehaushalt reguliert. Darüber hinaus moduliert Octopamin den Biorhythmus der Tiere und ist entscheidend am Lernen und an der Gedächtnisbildung beteiligt. In Vertebraten werden nur geringe Octopamin-Konzentrationen gefunden. Es ist jedoch unklar, ob die Substanz neuroaktive Wirksamkeit besitzt.

Auch Octopamin-Rezeptoren sind bisher nur in Evertebraten geschrieben worden. Diese Proteine gehören zu der großen Genfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Aufgrund pharmakologischer Bindungsstudien und der Untersuchung der aktivierten intrazellulären Botenstoffwege werden zwei Klassen von Octopamin-Rezeptoren unterschieden (Evans, P.D. und Robb, S.: Octopamine receptor subtypes and their modes of action; Neurochemical Research 18, 1993, 869-874). Eine Rezeptorklasse - Octo pamin 1 (OCT1)-Rezeptoren - bewirkt eine - vermutlich über den intrazellulären Botenstoff IP₃ induzierte - Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration. Die zweite Rezeptorklasse - Octopamin 2 (OCT2)-Rezeptoren - stimuliert die Adenylat-Zyklase, und es kommt zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration. Die physiologisch wirksame Konzentration des Octopamins liegt im Bereich von 10^-8 bis 10^-10 M.

Da Octopamin nur in Wirbellosen als Neurotransmitter nachgewiesen ist, wäre es von großem Interesse, spezifische Pharmaka (Liganden) zu entwickeln, die nur an Octopamin-Rezeptoren binden. Da diese Rezeptoren nicht in Wirbeltieren vorkommen, könnten solche Liganden, ohne Nebenwirkungen bei Wirbeltieren befürchten zu müssen, als Insektizide eingesetzt werden.

Bisher konnten pharmakologische Untersuchungen der Neurotransmitter- Rezeptoren nur an Gewebehomogenaten durchgeführt werden. Diese Vorgehensweise hat den Nachteil, daß das Homogenat aus einer Mischung verschiedener Rezeptoren bzw. -Subtypen besteht, die Rezeptorpopulationen also nebeneinander bzw. gemischt vorliegen (Roeder, T. und Nathanson, J.A.: Characterization of insect neuronal octopamine receptors; Neurochemical Research 18, 1992, 921-925; Hiripi, L. et al.: Characterization of tyramine and octopamine receptors in the insect (Locusta migratoria migratorioides) brain; Brain Research 633, 1994, 119-126). Darüberhinaus ist die Präparation solcher Gewebehomogenate relativ zeit- und arbeitsaufwendig und erfordert z. T. die Verwendung proteinchemischer Reinigungs- und Trennverfahren. Ein ähnliches Problem trifft auch für die Quantifizierung der intrazellulären Botenstoffe cAMP und IP₃ zu. Die Bestimmung der entsprechenden Konzentrationen ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und oft auch fehlerbehaftet, weil in den Gewebepräparaten verschiedene Botenstoffwege gleichzeitig aktiviert werden können.

Desweiteren erfolgt die Charakterisierung der Rezeptoren bisher hauptsächlich mit dem Verfahren der Radioligandenbindung. Dazu werden Gewebehomogenate mit unterschiedlichen, radioaktiv markierten Verbindungen inkubiert und die spezifisch gebundene Radioaktivität nach mehreren Filtrations- und Waschschritten gemessen. Die Klassifizierung der Rezeptoren ist erst dann möglich, wenn mit einer Vielzahl verschiedener Substanzen getestet worden ist, ob und welche Substanz geeignet ist, die radioaktiv markierte Verbindung von dem Rezeptorprotein zu verdrängen (Kompetitionsexperimente). Diese Vorgehensweise ist ebenfalls arbeitsintensiv und wegen der Verwendung der radioaktiv markierten Verbindungen aus umweltpolitischen und gesundheitlichen Gründen (Strahlenbelastung) nicht unbedenklich. Der Einsatz einer Nachweismethode, die ohne die Benutzung von radioaktivem Material auskommt, ist deshalb wünschenswert und vorteilhaft.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man einen zu untersuchenden Liganden auf durch Neurotransmitter-Rezeptorgen transformierte Zellen einwirken läßt und die Wirkung über die Bestimmung intrazellulärer Botenstoffe bzw. über die Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca²⁺-Ionenkonzentration bestimmt. Vorzugsweise läßt man den Liganden auf durch Octopamin-Rezeptorgen transformierte Zellen einwirken.

Beispielsweise aktivieren klonierte Octopamin-Rezeptoren nach der Bindung des Neurotransmitters bzw. Liganden ein zelleigenes G-Protein und nachfolgend eine Phospholipase. Dieses Enzym (PLC) spaltet ein membranständiges Substrat in zwei intrazelluläre Botenstoffe: IP₃ und DAG. Das IP₃ bindet an einen intrazellulären Rezeptor, der den Durchtritt von Ca²⁺-Ionen aus den Zellkompartimenten in das Zytoplasma der Zelle ermöglicht. Der Anstieg der zytoplasmatischen Ca²⁺-Ionenkonzentration kann mit Hilfe eines Ca²⁺-sensitiven Indikators, dem Fluoreszenzfarbstoff FURA-2, registriert werden. Die intrazelluläre Ca²⁺-Ionenkonzentration ist gut zu kalibrieren und die Konzentrationsänderung quantifizierbar. Die relative Änderung der Ca²⁺-Ionenkonzentration ist folglich ein Maß dafür, ob der getestete Ligand den Rezeptor aktiviert, d. h. als Agonist wirkt, oder alternativ bei gleichzeitiger Anwesenheit von Octopamin, die Rezeptoraktivität inhibiert, d. h. als Antagonist wirkt. Diese Vorgehensweise ermöglicht die Untersuchung einer großen Anzahl von Substanzen (Screening) bei hohen Durchsatzzahlen. In relativ kurzer Zeit stehen damit wichtige Informationen über die Eigenschaften der getesteten Liganden zur Verfügung, beispielsweise, ob ein Ligand agonistisch oder antagonistisch wirkt und welche Affinität und Spezifität der Ligand für den Rezeptor besitzt. Da die Messung an intakten Zellen durchgeführt wird, entfallen auch sämtliche arbeitsintensiven Schritte, die zur Herstellung von Gewebehomogenaten benötigt werden. Die Meßmethode, das sogenannte Ca²⁺-Imaging, ist etabliert (Roe, M.W. et al.: Assessment of FURA-2 for measurements of cytosolic free calcium; Cell Calcium 11, 1990, 63-75) und kann für Screening-Verfahren ebenfalls automatisiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch auf andere Rezeptoren übertragbar, beispielsweise solche, die die Produktion des Botenstoffes cAMP bewirken. Der Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration kann von Ionenkanälen registriert werden, die sich cAMP-abhängig öffnen und den Einstrom von Ca²⁺-Ionen ermöglichen. Diese Eigenschaften besitzen die sogenannten zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle. Der Anstieg der cAMP-Konzentrationen bewirkt somit ebenfalls eine Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, die mit der Ca²⁺-Imaging Methode gemessen werden kann. Im Unterschied zu dem Octopamin-Rezeptor vermittelten Signalweg fließt das Ca²⁺ bei dieser zweiten Variante jedoch vom extrazellulären Bereich in das Zellinnere. Die erfindungsgemäße Methode ist daher u. a. auf alle anderen Rezeptorsysteme übertragbar, die eine Erhöhung der intrazellulären Botenstoffe cAMP/cGMP und IP₃ bewirken. Desweiteren können auch Kopplungswege erfaßt werden, in deren Folge die Botenstoffkonzentration - beispielsweise von cAMP/cGMP - sinkt.

Zur Herstellung von Neurotransmitter- bzw. Octopamin-Rezeptorgen transformierten Zellen werden die entsprechenden Gene vorzugsweise aus der Taufliege Drosophila melanogaster kloniert. Nach der Klonierung bzw. Isolierung sind insbesondere Gene mit den unter SEQ ID No. 1 und/oder 3 angegebenen Nukleotidsequenzen bzw. mit einer, für die unter SEQ ID No. 2 und/oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz erhältlich. Diese Gene können vor allem zur Herstellung von Octopamin-Rezeptortyp 1 und/oder 2 (OCT1 bzw. 2) produzierenden Zellen eingesetzt werden.

Unter Verwendung einer DNA-Sonde, die beispielsweise aus einem cDNA- Klon, der für einen Drosophila Dopamin-Rezeptor kodiert (Gotzes, F. et al.: Primary structure and functional characterization of a Drosophila dopamine receptor with high homology to human D1/5 receptors; Receptors & Channels 2, 1994, 131-141), hergestellt werden kann, können genomische und cDNA-Bibliotheken unter erniedrigten Stringenzbedingungen hybridisiert werden. Mit Subfragmenten eines genomischen DNA-Klons kann anschließend eine cDNA-Bibliothek, die beispielsweise aus adulter Kopf-mRNA hergestellt worden ist, unter hoher Stringenz hybridisiert werden. Die beiden dadurch erhältlichen cDNA-Klone sind im 5'-Bereich identisch, unterscheiden sich aber unmittelbar hinter dem Sequenzabschnitt, der für die Transmembran-Region 5 kodiert. Aus Untersuchungen der Genstruktur geht hervor, daß die mRNAs, die für die Rezeptoren kodieren, durch sogenanntes "alternatives Spleißen" von dem Gen abgeschrieben werden.

Für die stabile Expression von Neurotransmitter-Rezeptorgenen in Wirtszellen werden diese in Genkonstrukte, beispielsweise in das Plasmid pcDNAIneo (Invitrogen, 9351 NV Leek, Niederlande) eingebaut. Die Konstrukte können dann insbesondere in eine Zellinie, vorzugsweise in die menschliche Nierenzellinie HEK 293, mit der Calcium-Phosphat-Methode (Chen, C. und Okayama, H.: High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA; Molecular and Cellular Biology 7, 1987, 2745-2752) transfiziert werden. Zellklone, die die DNA stabil aufgenommen haben, können durch Zugabe des Antibiotikums Geneticin (G418-sulfat) selektiert werden. Die DNA-Moleküle, die für die oben genannten Spleißvarianten kodieren, können auch unabhängig voneinander in das Genom der Wirtszelle integriert werden.

Neben der Verwendung der genannten Zellinie (HEK 293) ist auch denkbar, die DNA, die für einen Rezeptor kodiert, in andere Zellen, wie beispielsweise COS, NIH 3T3 oder Drosophila S2-Zellen, einzubringen. Dies kann sowohl in stabiler Form geschehen, wie oben beschrieben, oder alternativ durch transiente Transfektion. Der Nachteil der transienten Transfektion ist allerdings, daß die Rezeptoren nur für kurze Zeit, d. h. bis ca. 48 h nach der Transfektion untersucht werden können. Danach sind die Expressionskonstrukte durch die fortschreitende Zellteilung nur noch in geringen Kopienzahlen in den Zellen vorhanden. Daraus resultiert eine niedrigere Expressionsrate bzw. Syntheserate der Rezeptorproteine.

Eine weitere Möglichkeit, die Rezeptorproteine zu exprimieren, ist z. B. die Verwendung des Baculovirussystems. Dafür muß die DNA lediglich in ein entsprechendes Expressionsplasmid kloniert werden.

Die Klonierung von Octopamin-Rezeptorgenen und deren stabile Expression ermöglicht die Untersuchung einzelner, strukturell genau definierter Neurotransmitter-Rezeptor Subtypen. Da die Zellen in etwa gleiche Rezeptormengen herstellen, wird ein Nachteil der Verwendung von Gewebehomogenaten überwunden, nämlich die Schwankung in der Rezeptordichte, die von Experiment zu Experiment äußerst variabel sein kann. Darüber hinaus werden insbesondere stabile Zellinien unter konstanten und leicht zu kontrollierenden Bedingungen mit relativ geringem Aufwand vermehrt. Hier bietet sich die Möglichkeit, den Vermehrungsprozeß zu automatisieren: beispielsweise kann die Anzucht der Zellen in Fermentern erfolgen.

Zusammenfassend bietet das erfindungsgemäße Verfahren u. a. folgende Vorteile:

1. Die Verfügbarkeit der Rezeptoren in stabil exprimierter Form bietet die Möglichkeit, definierte, homogene Rezeptorpräparate zu untersuchen. Die Kultivierung der Zellen ist in kleinen Schalen möglich, so daß viele Substanzen parallel getestet werden können. Diese Option ist vor allem für Screening-Verfahren in der pharmazeutischen Industrie wichtig.
2. Das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren bietet einen großen Zeitvorteil. Die Änderung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration kann innerhalb weniger Minuten registriert und quantifiziert werden.
3. Das Verfahren kann weitestgehend automatisiert und viele Arbeitsschritte maschinell durchgeführt werden.

Das Herstellungsverfahren von Octopamin-Rezeptor produzierenden Zellen sowie das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren werden anhand des folgenden Ausführungsbeispiels näher erläutert:

Ausführungsbeispiel 1. Isolierung des Octopamin-Rezeptorgens

Zur Isolierung des Rezeptorgens wurde die Methode der niedrig stringenten Hybridisierung von Genbibliotheken eingesetzt. Als Sonde wurde ein HindIII/NruI Restriktionsfragment des Drosophila Dopamin D1-Rezeptors (DmDop[-126]; Gotzes, F. und Baumann, A.: Functional properties of Drosophila dopamine D1-receptors are not altered by the size of the N-terminus; Biochemical Biophysical Research Communications 222, 1996, 121-126) verwendet. Hierzu wurde die Plasmid-DNA wie folgt gespalten:

DmDop1[-126] (3 µg)	3,0 µl
Restriktions-Puffer (10 ×)	3,0 µl
H₂O	22,0 µl
HindIII (10 U/µl)	1,0 µl
NruI (10 U/µl)	1,0 µl

Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 90 Min. Danach wurde der Ansatz mit 6 µl Stopp-Puffer (5 ×) (100 mM EDTA, 20% (w/v) Ficoll 400, 0,01% (w/v) Bromphenolblau, 0,01% (w/v) Xylencyanol) versetzt, auf ein 0,75% Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Unter UV-Licht wurde das ∼1000 Bp große HindIII/NruI- Fragment aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNA aus dem Agarosestückchen mit der Zentrifugationsmethode (Heery, D.M. et al.: A simple method for subcloning DNA fragments from gel slices; Trends in Genetics 6, 1990, 173) isoliert. 100 ng des aufgereinigten Fragments wurden unter Verwendung des "Megaprime DNA Labelling System" der Firma Amersham mit [³²P]dCTP radioaktiv markiert.

Eine Genbibliothek, in der genomische DNA des Drosophila Wildtyp Stamms CantonS in Charon 4A λ-Phagen kloniert ist (Maniatis, T. et al.: The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA; Cell 15, 1978, 687-701) wurde auf Agarplatten ausplattiert. Von 15 Platten, auf denen jeweils ∼45 000 rekombinante λ-Phagen gewachsen waren, wurden Filterabzüge hergestellt (Sambrook, J. et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989). Die Membranscheiben (Quibrane; Qiagen, Hilden) wurden für 2 h bei 65°C in einer Lösung vorhybridisiert, die die folgende Zusammensetzung hatte: 5 × SET (20 × SET = 3 M NaCl, 400 mM Tris-HCl pH 7,4, 20 mM EDTA), 5 × Denhardts (100 × Denhardts = 2% (w/v) Rinderserum Albumin, 2% (w/v) Ficoll 400, 2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon), 0,1% (w/v) SDS und 150 µg/ml autoklavierte Hering Sperma-DNA. Diese Lösung wurde anschließend gegen frische Hybridisierungslösung ausgetauscht, die ∼1 × 10⁶ cpm/ml der radioaktiv markierten Probe enthielt. Die erste Hybridisierung erfolgte unter hoher Stringenz für 16 h bei 65°C. Die unspezifisch gebundene Radioaktivität wurde durch zwei Waschschritte bei 65°C in 1 × SET/0,1% SDS für jeweils 30 Min. entfernt. Spezifisch gebundene Radioaktivität wurde durch Auflegen eines Röntgenfilms für 4-14 h bei -80°C sichtbar gemacht. Die gefundenen Signale entsprechen Gensequenzen, die identisch zum DmDop1-Gen sind.

Um neue Gensequenzen zu erhalten, wurde in einer zweiten Hybridisierungsrunde die Stringenz erniedrigt. Dazu wurde die Hybridisierungstemperatur von 65°C auf 52°C abgesenkt. Nach der Hybridisierung wurde die unspezifisch gebundene Radioaktivität in zwei Waschschritten bei 52°C in 2 × SET/0,1% SDS für jeweils 25 Min. entfernt. Die spezifischen Signale wurden wiederum durch Auflegen eines Röntgenfilms sichtbar gemacht. Im Vergleich zum ersten Hybridisierungsdurchgang wurde ein zusätzliches Signal auf dem Röntgenfilm identifiziert.

Das Signal wurde einer "Plaqueregion" auf der Agarplatte zugeordnet. Diese Region wurde aus dem Agar ausgestochen und in Phagenpuffer eluiert (Sambrook, J. et al., s. o.). Nach mehreren Vereinzelungsrunden konnten schließlich die Hybridisierungssignale einzeln liegenden Plaqueregionen auf der Agarplatte zugeordnet werden. Die DNA der rekombinanten λ-Phagen wurde anschließend aus kleinen Lysaten isoliert (Santos, M.A.: An improved method for the small scale preparation of bacteriophage DNA based on phage precipitation by zinc chloride; Nucleic Acids Research 19, 1990, 5442).

Die DNA wurde mit mehreren Einzel- und Doppelkombinationen von Restriktionsenzymen verdaut, mit Stopp-Puffer (s. o.) versetzt, auf ein 0,75% Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran übertragen (Sambrook, J. et al., s. o.) und dieser Southern-Blot nochmals mit der o.a. Sonde unter niedriger Stringenz hybridisiert. Mehrere Restriktionsfragmente zeigten ein spezifisches Hybridisierungssignal. Einige Fragmente wurden ausgewählt und mit den o.a. Methoden aus der λ-Phagen DNA isoliert. Die Fragmente wurden in geeignete pBluescript Plasmid-Vektoren subkloniert. Die Ligationsansätze hatten folgende Zusammensetzung:

pBluescript-Vektor (50 ng)	1,0 µl
DNA-Fragment (10 ng)	3,0 µl
Ligase-Puffer (10 ×)	1,5 µl
H₂O	8,5 µl
T4-DNA-Ligase (1 U)	1,0 µl

Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur für 3 h. Der Ligationsansatz wurde in transformationskomponente Zellen des Bakterienstammes XL1-Blue (Invitrogen) transformiert. Die Zellen wurden auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten (Sambrook, J. et al., s. o.) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und die Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s.o) isoliert. Der korrekte Einbau der DNA-Fragmente wurde durch Restriktionsanalysen überprüft. Größere Mengen der Plasmid-Sub klone wurden aus 50 ml Flüssigkulturen aufgereinigt.

Die Nukleinsäuresequenz der subklonierten DNA-Fragmente wurde nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger, F. et al.: DNA sequencing with chain terminating inhibitors; Proceedings National Academy Sciences USA 74, 1977, 5463-5467) bestimmt. Ein Vergleich der Nukleinsäure- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit denen des DmDop1-Rezeptors zeigte, daß in der klonierten genomischen DNA Gensequenzen enthalten sind, die für zwei, bisher unbekannte Mitglieder der G-Protein gekoppelten Rezeptorgenfamilie kodieren.

Die neue Sequenzinformation wurde genutzt, um Oligonukleotide zu synthetisieren, die in Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendet wurden. Das 5' Oligonukleotid hatte die Sequenz: (#1) 5'-GCCGTACTCGAGTTCATCAAC-3'. Zwei 3' gelegene Gegenoligonukleotide hatten die Sequenz: (#2) 5'-GGCTGAATGCAGTGGTCG-3' und (#3): 5'-GGTCGACGCAGTCCTGGC-3'. PCR-Ansätze wurden mit den Oligonukleotidpaaren #1/#2 sowie #1/#3 durchgeführt. Als Matrize diente eine 2. Strang cDNA Präparation, die auf Drosophila Kopf-mRNA als Ausgangsmaterial synthetisiert worden war. Die PCR Ansätze hatten folgende Zusammensetzung:

2. Strang cDNA (25 ng)	1,0 µl
Oligonukleotid #1 (10 ng/Base × µl)	1,0 µl
Oligonukleotid #2 oder #3 (10 ng/Base × µl)	1,0 µl
Prime-Zyme Puffer (10 ×)	10,0 µl
Desoxynukleotide (je 20 mM)	1,0 µl
H₂O	85,0 µl
Prime-Zyme (2 U; Biometra)	1,0 µl

Die Amplifikation erfolgte mit folgenden Parametern:
1 Zyklus: 94°C, 2 Min. 30 Sek.
danach wurde 45 Mal die nachstehende Zyklusfolge durchgeführt:
94°C, 1 Min.
56°C, 1 Min.
72°C, 1 Min. 30 Sek.

Nach der Amplifikation wurden die Fragmente zweimal mit Phenol/Chloroform, dann zweimal mit Chloroform extrahiert und danach durch die Zugabe von 0,1 Vol. LiCl (3 M) und 3 Vol. Ethanol (absolut) ausgefällt. Nach einer Zentrifugation: Sigma Zentrifuge, 18 000 × g, 10 Min., 4°C wurde der Niederschlag getrocknet und in 10 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA) aufgenommen. Die Fragmente wurden phosphoryliert:

DNA-Fragment	10,0 µl
Kinase-Puffer (10 ×)	1,5 µl
ATP (10 mM)	0,5 µl
H₂O	2,0 µl
Polynukleotidkinase (5 U/µl)	1,0 µl

Die Inkubation erfolgte für 30 Min. bei 37°C. Danach wurde das Enzym für 10 Min. bei 65°C inaktiviert. Die DNA wurde mit Stopp-Puffer (s. o.) versetzt, auf ein 0,75% Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend mit der Zentrifugationsmethode (Heery, D.M. et al., s. o.) aus dem Agarosegel isoliert. Die aufgereinigten Fragmente wurden in einen EcoRV geschnittenen, dephosphorylierten pBluescript-Vektor ligiert und anschließend in XL1-Blue Zellen (s. o.) transformiert. Die Zellen wurden auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten (Sambrook, J. et al., s. o.) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und die Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.) isoliert. Der Einbau der PCR-Fragmente wurde durch eine Restriktionsanalyse mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII überprüft. Jeweils ein Klon, der das PCR-Fragment #1/#2 oder #1/#3 enthielt, wurde sequenziert.

Zur Isolierung der vollständigen cDNA-Klone wurden die PCR-Fragmente aus den Subklonen (s. o.) mit EcoRI/HindIII ausgeschnitten, gelelektrophoretisch aufgetrennt und aus der Agarose isoliert (s. o.). Die Fragmente wurden radioaktiv markiert (s. o.) und zur Hybridisierung einer adulten Drosophila Kopf-cDNA Bibliothek eingesetzt. Die Bibliothek wurde bereits zur Isolierung des DmDop1-Rezeptorgens verwendet (Gotzes, F. et al., s. o.). Die cDNA Moleküle waren in λgt11-Phagen einkloniert. Die Hybridisierung der Bibliothek erfolgte unter hoher Stringenz (s. o.). Die DNA der vereinzelten Phagen wurde aus kleinen Lysaten präpariert (Santos, M.A., s. o.), mit EcoRI geschnitten und in einen ebenfalls EcoRI geschnittenen pBluescript-Vektor subkloniert. Die Nukleinsäuresequenzen der Rekombinanten wurden überlappend doppelsträngig unter Verwendung geeigneter Subklone und genspezifischer Oligonukleotide nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger, F. et al., s. o.) ermittelt.

2. Herstellung einer Zellinie, die den Octopamin 1B Rezeptor aus Drosophila stabil exprimiert

Die Expression der Octopamin-Rezeptorgene sollte in einer menschlichen embryonalen Nierenzellinie (HEK 293 Zelle) erfolgen. Um eine optimale Expression zu erzielen, ist es erfahrungsgemäß sinnvoll, vor das Starttriplett ATG des offenen Leserahmens die Konsensus-Sequenz der Ribosomenbindestelle von Wirbeltier-Gensequenzen (CCACC, vgl. Kozak, M.: Compalition and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs; Nucleic Acids Research 12, 1984, 857-872) einzufügen. Dies erfolgt unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit einem sogenannten Mutageneseoligonukleotid. Gleichzeitig mit dem Einfügen der Kozak-Sequenz wird am 5'-Ende des amplifizierten Fragments eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingefügt. Im vorliegenden Fall war dies die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI (GAATTC). Das Mutageneseoligonukleotid hatte die Sequenz: 5'-CTCAGGAATTCCACCATGAATGAAACAGAGTGC-3'. Das Gegenoligonukleotid für die PCR hat die Sequenz: 5'-CCATCCTCCGAGCTTGA-3'. Diese Sequenz ist komplementär zu den Nukleotiden 1009-1025 des offenen Leserahmens der Nukleinsäuresequenz der Drosophila Octopamin-Rezeptoren.

Die PCR wurde in einem 100 µl Ansatz durchgeführt:

Rezeptor-cDNA Klon (in pBluescript, 10 ng)	1,0 µl
Mutageneseoligonukleotid (10 ng/Base × µl)	1,0 µl
Gegenoligonukleotid (10 ng/Base × µl)	1,0 µl
Prime-Zyme Puffer (10 ×)	10,0 µl
Desoxynukleotid (je 20 mM)	1,0 µl
H₂O	85,0 µl
Prime-Zyme (2 U; Biometra)	1,0 µl

Die Amplifikation erfolgte mit folgenden Parametern:
1 Zyklus: 94°C, 2 Min. 30 Sek.

Danach wurde 25 Mal die nachstehende Zyklusfolge durchgeführt:
94°C, 45 Sek.
54°C, 45 Sek.
72°C, 45 Sek.

Nach der Amplifikation wurde das Fragment zweimal mit Phenol/Chloroform, dann zweimal mit Chloroform extrahiert und danach durch Zugabe von 0,1 Vol. LiCl (3 M) und 3 Vol. Ethanol (absolut) ausgefällt. Nach einer Zentrifugation (Sigma Zentrifuge, 18 000 × g, 10 Min., 4°C) wurde der Niederschlag getrocknet und in 10 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA) aufgenommen.

Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI (5'-Ende) und NaeI (spaltet bei Position 426) geschnitten:

PCR-Fragment	10,0 µl
Restriktionspuffer (10 ×)	2,5 µl
H₂O	11,5 µl
EcoRI (10 U/µl)	0,5 µl
NaeI (10 U/µl)	0,5 µl

Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 90 Min. Danach wurde der Ansatz mit 5 µl Stopp-Puffer (5 ×) (100 mM EDTA, 20% (w/v) Ficoll 400, 0,01% (w/v) Bromphenolblau, 0,01% (w/v) Xylencyanol) versetzt, auf ein 1,5% Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Unter UV-Licht wurde das ≈440 Bp große EcoRI/NaeI-Fragment aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNA aus dem Agarosestückchen mit der Zentrifugationsmethode (Heery, D.M. et al.: A simple method for subcloning DNA fragments from gel slices; Trends in Genetics 6, 1990, 173) isoliert. Parallel zur Restriktion des PCR-Fragments wurde der komplette cDNA-Klon (in pBluescript) ebenfalls mit EcoRI und NaeI restringiert. Die Spaltprodukte wurden in einem 0,75% Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetrennt und das ≈2000 Bp große Fragment, das den 3'-Bereich des Octopamin-Rezeptorgens enthält, ebenfalls mit der Zentrifugationsmethode (s. o.) isoliert.

Die isolierten Fragmente wurden anschließend in einen EcoRI geschnittenen, desphosphorylierten Vektor (pcDNAI, Invitrogen) ligiert:

pcDNAI (50 ng)	1,0 µl
PCR-Fragment (10 ng)	3,0 µl
3'-Fragment (40 ng)	5,0 µl
Ligase-Puffer (10 ×)	1,5 µl
H₂O	3,5 µl
T4-DNA-Ligase (1 U)	1,0 µl

Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur für 3 h. Der Ligationsansatz wurde in transformationskompetente Zellen des Bakterienstammes MC1061-P3 (Invitrogen) transformiert. Die Zellen wurden auf Ampicillin-hal tigen LB-Agarplatten (Sambrook, J. et al.: Molecular cloning: A laboratory manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und die Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.) isoliert. Der korrekte Einbau der Rezeptor-kodierenden cDNA wurde durch eine Restriktionsanalyse mit dem Restriktionsenzym BamHI überprüft. Dabei entstehen zwei BamHI-Fragmente von 684 Bp und 1395 Bp Größe. Von zwei Klonen, in die die cDNA korrekt eingebaut war, wurde zusätzlich die Nukleinsäuresequenz des PCR-amplifizierten Bereichs bestimmt. Nach dieser Prüfung wurden größere Mengen des pcDNAI-Kon strukts (pcDmOCT1B) aus 250 ml Flüssigkulturen aufgereinigt.

Für die Herstellung der Zellinie, die den Rezeptor stabil exprimiert, wurde das Genfragment aus dem pcDNAI-Konstrukt (pcDmOCT1B) wieder ausgeschnitten. Hierzu wurden die Restriktionsenzyme HindIII und XbaI verwendet. Diese Enzyme schneiden nur in der Vektor-Sequenz (im Bereich der Multiplen-Cloning-Stelle, MCS), jedoch nicht innerhalb der Rezeptorsequenz. Das cDNA-Fragment wurde wie oben beschrieben isoliert und anschließend in einen ebenfalls HindIII/XbaI geschnittenen pcDNAINeo-Vektor (Invitrogen) ligiert. Der Ligationsansatz wurde in MC1061-P3 Bakterienzellen transformiert und auf Ampicillin-haltige LB-Agarplatten ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und die Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.) isoliert. Der korrekte Einbau des cDNA-Fragments wurde durch eine Restriktion mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI überprüft. Das Konstrukt wird nachfolgend als pcNeoDmOCT1B bezeichnet.

Einen ersten Nachweis, daß die klonierten Gensequenzen für funktionelle Rezeptoren kodierten, wurde nach transienten Transfektionen von HEK 293-Zellen mit dem pcDNAI-Konstrukt (pcDmOCT1B) erhalten. Hierzu wurden ≈2 × 10⁵ Zellen auf einer 5 cm (Durchmesser) großen Petrischale ausgesät und am folgenden Tag mit ≈10 µg des Plasmidkonstrukts mit der Calcium-Phosphat-Methode (Chen, C. und Okayama, H.: High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA; Molecular and Cellular Biology 7, 1987, 2745-2752) transfiziert. Am Tag nach der Transfektion wurde das Präzipitat mit PBS/EDTA entfernt und die Zellen durch eine Trypsin-Behandlung von der Schale abgelöst. Verschiedene Volumina dieser Zellsuspension wurden auf Glasplättchen, die zuvor mit Poly-L-Lysin beschichtet wurden, ausgesät und weitere 20 h im Brutschrank inkubiert.

Für die Messung der Änderung der intrazellulären Ca²⁺-Ionen- Konzentration wurden die Zellen 1 h vor dem Experiment mit dem Fluoreszenzfarbstoff FURA-2 beladen (Frings, S. et al.: Profoundly different calcium permeation and blockage determine the specific function of distinct cyclic nucleotide-gated channels; Neuron 15, 1995, 169-179). Die Messung erfolgte anschließend in der Ca²⁺-Imaging Apparatur. Dazu wurde ein Glasplättchen in die Meßkammer überführt und mit PBS umspült. Zur Aktivierung der Rezeptoren wurde das PBS über eine Perfusionseinrichtung gegen eine PBS-Lösung ausgetauscht, die eine definierte Konzentration des zu testenden Liganden enthielt, im vorliegenden Fall 1 µM Octopamin. Durch die Bindung des Octopamins wird eine Enzymkaskade aktiviert und der Botenstoff IP₃ gebildet. Nachfolgend kommt es zur Freisetzung von Ca²⁺-Ionen aus intrazellulären Speichern. Die Änderung der Ca²⁺-Ionenkonzentration wurde mit dem Imaging-System aufgezeichnet. Bei der bisher beschriebenen Vorgehensweise reagierten jedoch nicht alle Zellen auf die Zugabe des Liganden mit einer Änderung der Ca²⁺-Ionenkonzentration, weil nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen das Plasmid aufgenommen und den Rezeptor exprimiert hatte. Um diese Variabilität zu vermeiden, wurden Zellinien hergestellt, in denen alle Zellen die Rezeptoren stabil, d. h. permanent exprimieren.

Die methodische Vorgehensweise ist in den ersten Schritten dem Verfahren der transienten Transfektion vergleichbar. Für die Transfektion wurde jedoch das pcNeoDmOCT1B-Konstrukt verwendet. Auf diesem Plasmid befindet sich noch das Neomycin (Neo)-Resistenzgen, dessen Expression die Selektion solcher Zellen ermöglicht, die das Plasmid aufgenommen haben, da sie gegen die Zugabe des Antibiotikums G418 (Geneticin) resistent sind. Zellen, die kein Plasmid aufgenommen haben, sterben durch die Zugabe von G418 zum Medium nach einigen Tagen ab. Wie bei der transienten Transfektion wurden ≈10 µg des pcDNAINeoDmOCT1B-Kon strukts mit der Calcium-Phsophat Methode (Chen, C. und Okayama, H., s. o.) in ca. 2 × 10⁵ Zellen in einer 5 cm großen Petri-Schale transfiziert. 20 h nach der Transfektion wurde das Präzipitat mit PBS/EDTA entfernt und die Zellen durch eine Trypsin-Behandlung abgelöst. Von dieser Zellsuspension wurden je 2 × 10⁴ Zellen auf fünf 9 cm große Petri-Schalen ausgesät. Nach 20 h wurde das Medium abgesaugt und gegen frisches Medium, das 1 mg/ml G418 enthielt, ausgetauscht. Nach ca. 12-14 Tagen, in denen alle 3 Tage das Medium mit G418 gewechselt wurde, waren die meisten Zellen, die kein Plasmid aufgenommen hatten, abgestorben. Von den fünf Petri-Schalen wurden insgesamt 50 Zellklone isoliert, die G418-re sistent waren. Die Klone wurden einzeln in Mikrotiterplatten überführt und weiter vermehrt. Zur Überprüfung der Rezeptorexpression wurde ein kleiner Teil der Zellen auf Glasplättchen ausgesät (s. o.) und die Reaktion der Zellen auf die Zugabe von Octopamin mit der Ca²⁺-Imaging Methode gemessen. Von den 50 Antibiotika-resistenten Zellinien exprimierte ein Zellklon den Octopamin-Rezeptor stabil. Diese Linie wurde vermehrt und ein Teil der Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Auf die oben beschriebene Weise wurden etwa 10 verschiedene Zellinien hergestellt, die unterschiedliche Rezeptoren oder Ionenkanäle stabil exprimieren. Die Integration der Konstrukt-DNA erfolgte dabei nicht zielgerichtet, sondern zufällig, d. h. an einem beliebigen Ort in das Genom der Wirtszelle. Es konnte aber festgestellt werden, daß der Integrationsort der Fremd-DNA im Genom der Wirtszelle keinen gravierenden Einfluß auf die Expression der Rezeptorproteine hatte.

3. Untersuchungen der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren

Die Bestimmung der pharmakologischen Eigenschaften der klonierten Octopamin-Rezeptoren erfolgte an den stabilen Zellinien. Zellen wurden dazu auf poly-L-Lysin beschichtete Glasplättchen ausgesät (s. o.) und in die Ca²⁺-Imaging Apparatur überführt. Die Zellen reagierten bei der Zugabe von 1 µM Konzentrationen der Neurotransmitter Tyramin und Octopamin mit einem deutlichen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration. Die Freisetzung des Ca²⁺ erfolgte nicht kontinuierlich sondern oszillierend. Bei der Inkubation mit den Neurotransmittern Dopamin und Serotonin wurde kein Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration beobachtet.

Es wurde geprüft, ob auch niedrigere Konzentrationen der Neurotransmitter Octopamin und Tyramin die zelluläre Reaktion auslösen können. Es wurde gefunden, daß bereits eine Konzentration von 10^-9 M Octopamin eine deutliche Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Kon zentration bewirkt. Die Reaktion erfolgt gegenüber der Inkubation mit 10^-6 M Octopamin jedoch langsamer. Mit steigender Konzentration des Neurotransmitters wird die zelluläre Antwort schneller und ab Konzentrationen von 10^-7 M Octopamin wird die Oszillation der Ca²⁺-Konzentration beobachtet. Im Gegensatz zu Octopamin, ist eine Antwort der Zellen auf Tyramin erst ab Konzentrationen ≧ 10^-7 M zu beobachten.

Die Reaktion der Zellen auf Octopamin wird durch verschiedene Liganden konzentrationsabhängig inhibiert. Beispielsweise bleibt die Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration aus, wenn die Zellen mit Octopamin und 25 Phentolamin (= Antagonist) in einer Konzentration von je 10^-7 M inkubiert werden. Die Inkubation mit dem Antagonisten kann sowohl vor als auch nach der Zugabe des Octopamins gestartet werden. In beiden Fällen wird die Wirkung des Octopamins selektiv kompetiert und die Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration bleibt aus. Dieser kompetitive Effekt nimmt ab, wenn der Antagonist in geringerer Konzentration zugegeben wird, d. h. die Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration tritt wieder auf, wenn bspw. 10^-7 M Octopamin und 10^-8 M Phentolamin verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren, bei dem man einen Liganden auf durch Neurotransmitter-Rezeptorgen transformierte Zellen einwirken läßt und die Wirkung über die Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca²⁺-Ionenkonzentration bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Änderung der intrazellulären Ca²⁺-Ionenkonzentration mittels der Ca²⁺-Imaging- Methode bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man den Liganden auf durch Octopamin-Rezeptorgen transformierte Zellen einwirken läßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem man den Liganden auf durch Octopamin-Rezeptorgen Typ 1 und/oder Typ 2 transformierte Zellen einwirken läßt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Octopamin-Rezeptorgen aus Drosophila melanogaster stammt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, gekennzeichnet durch ein Octopamin-Rezeptorgen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz.

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch das Octopamin-Rezeptorgen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, gekennzeichnet durch ein Octopamin-Rezeptorgen mit einer für die unter SEQ ID No. 4 angegebenen Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz.

9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch das Octopamin-Rezeptorgen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierte Zelle eine Zellinie ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch die Zellinie HEK293.