DE19757695A1 - Klonierte, Neurotransmitter-Rezeptor produzierende Zellen - Google Patents
Klonierte, Neurotransmitter-Rezeptor produzierende ZellenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Neurotransmitter-
Rezeptor produzierenden Zellen gemäß Anspruch 1 bis 11, auf Octopamin-
Rezeptorgene nach Anspruch 12 bis 15, Genkonstrukte nach Anspruch 16 bis 18,
transformierte Zellen nach Anspruch 19 bis 24 sowie auf ein Verfahren zur
Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren gemäß Anspruch
25 bis 28.
Nervenzellen oder Neurone bilden die funktionellen Einheiten des Gehirns. Die
Hauptaufgabe eines Neurons besteht in der Übertragung von Informationen auf
andere Neurone oder auf Muskel- und Drüsenzellen. Um diese Aufgabe zu erfüllen,
besitzt jedes Neuron nicht nur ein vielfältiges Repertoir hochspezialisierter,
membranständiger Eiweißmoleküle (Proteine), sondern auch einen
außergewöhnlichen zellulären Aufbau. Morphologisch werden folgende Zellbereiche
unterschieden: Dendrit, Zellkörper, Axon und synaptisches Endknöpfchen. Die
Informationsaufnahme erfolgt im dendritischen Bereich des Neurons und wird als
elektrisches Signal weitergeleitet. Wenn ein bestimmter Schwellenwert der
elektrischen Erregung überschritten wird, kommt es kurz unterhalb des Zellkörpers -
im Bereich des Axon-Hügelchens - zur Auslösung eines Aktionspotentials. Das
Aktionspotential ist durch den selektiven Einstrom von Natrium-Ionen durch
Natrium-Kanäle in das Zellinnere gekennzeichnet. Man spricht von einer
Depolarisierung. Dem Natrium-Ionen-Einstrom wirkt ein zeitlich verzögerter Kalium-
Ionen-Ausstrom durch Kalium-Kanäle entgegen (Repolarisierung), so daß das
Ruhepotential wieder eingestellt wird. Das Aktionspotential pflanzt sich entlang des
Axons bis in das synaptische Endknöpfchen fort. Dies ist der Bereich des Neurons, an
dem die Zelle mit Zielzellen in Kontakt tritt. Die Kontaktstelle wird auch als Synapse
bezeichnet. Die Zellmembran des Neurons und der Zielzelle stehen jedoch nicht in
unmittelbarem Kontakt, sondern sind durch einen flüssigkeitsgefüllten Bereich, den
synaptischen Spalt, getrennt. Über den synaptischen Spalt kann das elektrische Signal
(Aktionspotential) nicht weitergegeben werden. Zur Signalübertragung vom Neuron
auf die Zielzelle muß das elektrische Signal daher in ein chemisches Signal übersetzt
werden. Dies wird dadurch erreicht, daß das Aktionspotential die Freisetzung von
Botenstoffen, die sogenannten Neurotransmitter, aus dem synaptischen Endknöpfchen
bewirkt. Nach der Ausschüttung in den synaptischen Spalt diffundieren die
Neurotransmitter zur Oberfläche der Zielzelle und binden dort an für den jeweiligen
Neurotransmitter spezifische, hochaffine Bindungsproteine, die sogenannten
Neurotransmitter-Rezeptoren.
Es werden in der Regel zwei Gruppen von Neurotransmitter-Rezeptoren
unterschieden: In der ersten Gruppe werden solche Rezeptoren zusammengefaßt, die
selbst Ionenkanäle bilden können (ionotrope Rezeptoren). Hierzu gehören die
Acetylcholin- und Glutamat-Rezeptoren, durch deren Aktivierung die Zielzelle
depolarisiert und ein neues Aktionspotential ausgelöst werden kann. Inhibitorisch
wirkende Rezeptoren, wie beispielsweise Glycin- und γ-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptoren,
hyperpolarisieren die Zielzelle und wirken daher der Auslösung eines
neuen Aktionspotentials entgegen.
Die zweite Gruppe von Neurotransmitter-Rezeptoren bildet selbst keine Ionenkanäle
aus. Die Aktivierung dieser Rezeptoren wird durch die Bindung des spezifischen
Liganden (= Neurotransmitter) ausgelöst und führt zu einer Konzentrationsänderung
von intrazellulären Botenstoffen, den sogenannten "second messenger"-Molekülen.
Die Rezeptoren werden daher auch als metabotrope Rezeptoren bezeichnet.
Mitglieder dieser Rezeptorfamilie verfügen als gemeinsames Strukturmerkmal über
sieben hydrophobe Abschnitte in der Primärstruktur (Aminosäuresequenz), die die
Zellmembran durchspannen. Die Änderung der intrazellulären
Botenstoffkonzentration wird dadurch erreicht, daß die Rezeptoren mit GTP-
bindenden
(G) Proteinen wechselwirken. Durch diese Wechselwirkung werden die
G-Proteine aktiviert und stimulieren oder inhibieren nachgeschaltete Zielenzyme. So
führt beispielsweise die Aktivierung der Adenylat-Zyklase zu einer Erhöhung der
intrazellulären Konzentration von zyklischem Adenosin-3',5'-Monophosphat (cAMP).
Ein anderer Weg besteht in der Aktivierung einer Phospholipase C und der daraus
resultierenden Synthese von Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol
(DAG).
Als Konsequenz der Regulation unterschiedlicher Botenstoffwege durch die
Neurotransmitter-Rezeptoren kann es zu einer Veränderung (Modulation) der
Eigenschaften von Ionenkanälen, Enzymen und sogar zur Aktivierung von Genen
kommen. Die metabotropen Rezeptoren greifen somit in die Regelung der zellulären
Aktivität ein und können die Plastizität neuronaler Verschaltungen entscheidend
beeinflussen. Im Nervensystem schreibt man gerade der Modulation der synaptischen
Plastizität eine entscheidende Rolle im Zusammenhang mit Lernleistungen und bei der
Gedächtnisbildung zu.
Viele der heute bekannten Neurotransmitter-/Rezeptorsysteme sind im Laufe der
Evolution erhalten geblieben. Einige kommen jedoch nur in bestimmten Tierarten vor.
Ein Beispiel für die Differenzierung von Neurotransmittern findet sich in der Gruppe
der biogenen Amine. Zur Gruppe der biogenen Amine gehören die Neurotransmitter
Adrenalin, Dopamin, Histamin, Noradrenalin, Octopamin, Serotonin und Tyramin.
Dopamin, Histamin und Serotonin sind sowohl in Wirbeltieren als auch in Wirbellosen
als Neurotransmitter eindeutig nachgewiesen worden. Im Gegensatz dazu werden die
Neurotransmitter Adrenalin und Noradrenalin nur in Wirbeltieren gefunden (Venter,
J.C. et al.: Evolution of neurotransmitter receptor systems", Progress in Neurobiology
30, 1988, 105-169). Die Aufgaben von Adrenalin/Noradrenalin werden bei Insekten
und vielen anderen Wirbellosen vor allem von Octopamin übernommen.
In Evertebraten wirkt Octopamin als Neurotransmitter, Neurohormon und auch als
Neuromodulator und steuert bzw. moduliert viele biochemische Reaktionen, die
Motorik sowie das Verhalten. So ist beispielsweise beschrieben, daß Octopamin u. a.
den Stoffwechsel und den Energiehaushalt reguliert. Darüber hinaus moduliert
Octopamin den Biorhythmus der Tiere und ist entscheidend am Lernen und an der
Gedächtnisbildung beteiligt. In Vertebraten werden nur geringe Octopamin-
Konzentrationen gefunden. Es ist jedoch unklar, ob die Substanz neuroaktive
Wirksamkeit besitzt.
Auch Octopamin-Rezeptoren sind bisher nur in Evertebraten geschrieben worden.
Diese Proteine gehören zu der großen Genfamilie der G-Protein gekoppelten
Rezeptoren. Aufgrund pharmakologischer Bindungsstudien und der Untersuchung der
aktivierten intrazellulären Botenstoffwege werden zwei Klassen von Octopamin-
Rezeptoren unterschieden (Evans, P.D. und Robb, S.: Octopamine receptor subtypes
and their modes of action; Neurochemical Research 18, 1993, 869-874). Eine
Rezeptorklasse - Octopamin 1 (OCT1)-Rezeptoren - bewirkt eine - vermutlich über
den intrazellulären Botenstoff IP3 induzierte - Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Die zweite Rezeptorklasse - Octopamin 2 (OCT2)-Rezeptoren -
stimuliert die Adenylat-Zyklase, und es kommt zu einem Anstieg der intrazellulären
cAMP-Konzentration. Die physiologisch wirksame Konzentration des Octopamins
liegt im Bereich von 10-8 bis 10-10 M.
Da Octopamin nur in Wirbellosen als Neurotransmitter nachgewiesen ist, wäre es von
großem Interesse, spezifische Pharmaka (Liganden) zu entwickeln, die nur an
Octopamin-Rezeptoren binden. Da diese Rezeptoren nicht in Wirbeltieren
vorkommen, könnten solche Liganden, ohne Nebenwirkungen bei Wirbeltieren
befürchten zu müssen, als Insektizide eingesetzt werden.
Bisher konnten pharmakologische Untersuchungen der Neurotransmitter-Rezeptoren
nur an Gewebehomogenaten durchgeführt werden. Diese Vorgehensweise hat den
Nachteil, daß das Homogenat aus einer Mischung verschiedener Rezeptoren bzw.
Subtypen besteht, die Rezeptorpopulationen also nebeneinander bzw. gemischt
vorliegen (Roeder, T. und Nathanson, J.A.: Characterization of insect neuronal
octopamine receptors; Neurochemical Research 18, 1992, 921-925; Hiripi, L. et al.:
Characterization of tyramine and octopamine receptors in the insect (Locusta
migratoria migratorioides) brain; Brain Research 633, 1994, 119-126). Darüberhinaus
ist die Präparation solcher Gewebehomogenate relativ zeit- und arbeitsaufwendig und
erfordert z. T. die Verwendung proteinchemischer Reinigungs- und Trennverfahren.
Ein ähnliches Problem trifft auch für die Quantifizierung der intrazellulären
Botenstoffe cAMP und IP3 zu. Die Bestimmung der entsprechenden Konzentrationen
ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und oft auch fehlerbehaftet, weil in den
Gewebepräparaten verschiedene Botenstoffwege gleichzeitig aktiviert werden
können.
Desweiteren erfolgt die Charakterisierung der Rezeptoren bisher hauptsächlich mit
dem Verfahren der Radioligandenbindung. Dazu werden Gewebehomogenate mit
unterschiedlichen, radioaktiv markierten Verbindungen inkubiert und die spezifisch
gebundene Radioaktivität nach mehreren Filtrations- und Waschschritten gemessen.
Die Klassifizierung der Rezeptoren ist erst dann möglich, wenn mit einer Vielzahl
verschiedener Substanzen getestet worden ist, ob und welche Substanz geeignet ist,
die radioaktiv markierte Verbindung von dem Rezeptorprotein zu verdrängen
(Kompetitionsexperimente). Diese Vorgehensweise ist ebenfalls arbeitsintensiv und
wegen der Verwendung der radioaktiv markierten Verbindungen aus
umweltpolitischen und gesundheitlichen Gründen (Strahlenbelastung) nicht
unbedenklich. Der Einsatz einer Nachweismethode, die ohne die Benutzung von
radioaktivem Material auskommt, ist deshalb wünschenswert und vorteilhaft.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Materialien bereitzustellen, mit denen ein
einfaches Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-
Rezeptoren ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von
Neurotransmitter-Rezeptor produzierenden Zellen, vorzugsweise von Octopamin-
Rezeptor produzierenden Zellen, gelöst, bei dem zumindest ein, für einen
Neurotransmitter-Rezeptor bzw. Octopamin-Rezeptor kodierendes Gen in eine
Wirtszelle transformiert wird. Dazu werden Neurotransmitter-Rezeptorgene
vorzugsweise aus der Taufliege Drosophila melanogaster kloniert. Nach der
Klonierung bzw. Isolierung sind insbesondere Gene mit den unter SEQ ID No. 1
und/oder 3 angegebenen Nukleotidsequenzen bzw. mit einer, für die unter SEQ ID
No. 2 und/oder 4 angegebenen Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen
kodierenden Nukleotidsequenz erhältlich. Diese Gene können vor allem zur
Herstellung von Octopamin-Rezeptortyp 1 und/oder 2 (OCT1 bzw. 2)
produzierenden Zellen eingesetzt werden.
Unter Verwendung einer DNA-Sonde, die beispielsweise aus einem cDNA-Klon, der
für einen Drosophila Dopamin-Rezeptor kodiert (Gotzes, F. et al.: Primary structure
and functional characterization of a Drosophila dopamine receptor with high
homology to human D1/5 receptors; Receptors & Channels 2, 1994, 131-141),
hergestellt werden kann, können genomische und cDNA-Bibliotheken unter
erniedrigten Stringenzbedingungen hybridisiert werden. Mit Subfragmenten eines
genomischen DNA-Klons kann anschließend eine cDNA-Bibliothek, die
beispielsweise aus adulter Kopf-mRNA hergestellt worden ist, unter hoher Stringenz
hybridisiert werden. Die beiden dadurch erhältlichen cDNA-Klone sind im 5'-Bereich
identisch, unterscheiden sich aber unmittelbar hinter dem Sequenzabschnitt, der für
die Transmembran-Region 5 kodiert. Aus Untersuchungen der Genstruktur geht
hervor, daß die mRNAs, die für die Rezeptoren kodieren, durch sogenanntes
"alternatives Spleißen" von dem Gen abgeschrieben werden.
Für die stabile Expression von Neurotransmitter-Rezeptorgenen in Wirtszellen werden
diese in Genkonstrukte, beispielsweise in das Plasmid pcDNAIneo (Invitrogen, 9351
NV Leek, Niederlande) eingebaut. Die Konstrukte können dann insbesondere in eine
Zellinie, vorzugsweise in die menschliche Nierenzellinie HEK293, mit der Calcium-
Phosphat-Methode (Chen, C. und Okayama, H.: High-efficiency transformation of
mammalian cells by plasmid DNA; Molecular and Cellular Biology 7, 1987, 2745-2752)
transfiziert werden. Zellklone, die die DNA stabil aufgenommen haben, können
durch Zugabe des Antibiotikums Geneticin (G418-sulfat) selektiert werden. Die
DNA-Moleküle, die für die oben genannten Spleißvarianten kodieren, können auch
unabhängig voneinander in das Genom der Wirtszelle integriert werden.
Neben der Verwendung der genannten Zellinie (HEK 293) ist auch denkbar, die
DNA; die für einen Rezeptor kodiert, in andere Zellen, wie beispielsweise COS, NIH
3T3 oder Drosophila S2-Zellen, einzubringen. Dies kann sowohl in stabiler Form
geschehen, wie oben beschrieben, oder alternativ durch transiente Transfektion. Der
Nachteil der transienten Transfektion ist allerdings, daß die Rezeptoren nur für kurze
Zeit, d. h. bis ca. 48 h nach der Transfektion untersucht werden können. Danach sind
die Expressionskonstrukte durch die fortschreitende Zellteilung nur noch in geringen
Kopienzahlen in den Zellen vorhanden. Daraus resultiert eine niedrigere
Expressionsrate bzw. Syntheserate der Rezeptorproteine.
Eine weitere Möglichkeit, die Rezeptorproteine zu exprimieren, ist z. B. die
Verwendung des Baculovirussystems. Dafür muß die DNA lediglich in ein
entsprechendes Expressionsplasmid kloniert werden.
Die Klonierung von Neurotransmitter-, insbesondere Octopamin-Rezeptorgenen und
deren stabile Expression ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung einzelner,
strukturell genau definierter Neurotransmitter-Rezeptor Subtypen. Da die
erfindungsgemäßen Zellen in etwa gleiche Rezeptormengen herstellen, wird auch ein
weiterer Nachteil der Verwendung von Gewebehomogenaten überwunden, nämlich
die Schwankung in der Rezeptordichte, die von Experiment zu Experiment äußerst
variabel sein kann. Darüber hinaus werden insbesondere stabile Zellinien unter
konstanten und leicht zu kontrollierenden Bedingungen mit relativ geringem Aufwand
vermehrt. Hier bietet sich die Möglichkeit, den Vermehrungsprozeß zu
automatisieren: beispielsweise kann die Anzucht der Zellen in Fermentern erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind nunmehr in einem einfachen Verfahren zur
Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-Rezeptoren einsetzbar, bei
dem man einen zu untersuchenden Liganden auf diese Zellen einwirken läßt und die
Wirkung über die Bestimmung intrazellulärer Botenstoffe bestimmt. Beispielsweise
aktivieren klonierte Octopamin-Rezeptoren nach der Bindung des Neurotransmitters
bzw. Liganden ein zelleigenes G-Protein und nachfolgend eine Phospholipase. Dieses
Enzym (PLC) spaltet ein membranständiges Substrat in zwei intrazelluläre
Botenstoffe: IP3 und DAG. Das IP3 bindet an einen intrazellulären Rezeptor, der den
Durchtritt von Ca2+-Ionen aus den Zellkompartimenten in das Zytoplasma der Zelle
ermöglicht. Der Anstieg der zytoplasmatischen Ca2+-Ionenkonzentration kann mit
Hilfe eines Ca2+-sensitiven Indikators, dem Fluoreszenzfarbstoff FURA-2, registriert
werden. Die intrazelluläre Ca2+-Ionenkonzentration ist gut zu kalibrieren und die
Konzentrationsänderung quantifizierbar. Die relative Änderung der Ca2+-
Ionenkonzentration ist folglich ein Maß dafür, ob der getestete Ligand den Rezeptor
aktiviert, d. h. als Agonist wirkt, oder alternativ bei gleichzeitiger Anwesenheit von
Octopamin, die Rezeptoraktivität inhibiert, d. h. als Antagonist wirkt. Diese
Vorgehensweise ermöglicht die Untersuchung einer großen Anzahl von Substanzen
(Screening) bei hohen Durchsatzzahlen. In relativ kurzer Zeit stehen damit wichtige
Informationen über die Eigenschaften der getesteten Liganden zur Verfügung,
beispielsweise, ob ein Ligand agonistisch oder antagonistisch wirkt und welche
Affinität und Spezifität der Ligand für den Rezeptor besitzt. Da die Messung an
intakten Zellen durchgeführt wird, entfallen auch sämtliche arbeitsintensiven Schritte,
die zur Herstellung von Gewebehomogenaten benötigt werden. Die Meßmethode, das
sogenannte Ca2+-Imaging, ist etabliert (Roe, M.W. et al.: Assessment of FURA-2 for
measurements of cytosolic Iree calcium; Cell Calcium 11, 1990, 63-75) und kann für
Screening-Verfahren ebenfalls automatisiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch auf andere Rezeptoren übertragbar,
beispielsweise solche, die die Produktion des Botenstoffes cAMP bewirken. Der
Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration kann von Ionenkanälen registriert
werden, die sich cAMP-abhängig öffnen und den Einstrom von Ca2+-Ionen
ermöglichen. Diese Eigenschaften besitzen die sogenannten zyklisch Nukleotid-
gesteuerten Ionenkanäle. Der Anstieg der cAMP-Konzentrationen bewirkt somit
ebenfalls eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration, die mit der Ca2+-Imaging
Methode gemessen werden kann. Im Unterschied zu dem Octopamin-
Rezeptor vermittelten Signalweg fließt das Ca2+ bei dieser zweiten Variante jedoch
vom extrazellulären Bereich in das Zellinnere. Die erfindungsgemäße Methode ist
daher u. a. auf alle anderen Rezeptorsysteme übertragbar, die eine Erhöhung der
intrazellulären Botenstoffe cAMP/cGMP und IP3 bewirken. Desweiteren können auch
Kopplungswege erfaßt werden, in deren Folge die Botenstoffkonzentration -
beispielsweise von cAMP/cGMP - sinkt.
Zusammenfassend bieten die erfindungsgemäßen Verfahren bzw. die
erfindungsgemäßen Zellen u. a. folgende Vorteile:
- 1. Die Verfügbarkeit der Rezeptoren in stabil exprimierter Form bietet die Möglichkeit, definierte, homogene Rezeptorpräparate zu untersuchen. Die Kultivierung der Zellen ist in kleinen Schalen möglich, so daß viele Substanzen parallel getestet werden können. Diese Option ist vor allem für Screening-Verfahren in der pharmazeutischen Industrie wichtig.
- 2. Das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren bietet einen großen Zeitvorteil. Die Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration kann innerhalb weniger Minuten registriert und quantifiziert werden.
- 3. Das Verfahren kann weitestgehend automatisiert und viele Arbeitsschritte maschinell durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren von Neurotransmitter-Rezeptor
produzierenden Zellen sowie das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren werden
anhand des folgenden Ausführungsbeispiels näher erläutert:
Zur Isolierung des Rezeptorgens wurde die Methode der niedrig stringenten
Hybridisierung von Genbibliotheken eingesetzt. Als Sonde wurde ein HindIII/NruI
Restriktionsfragment des Drosophila Dopamin D1-Rezeptors (DmDop[-126]; Gotzes,
F. und Baumann, A.: Functional properties of Drosophila dopamine D1-receptors are
not altered by the size of the N-terminus; Biochemical Biophysical Research
Communications 222, 1996, 121-126) verwendet. Hierzu wurde die Plasmid-DNA
wie folgt gespalten:
DmDop1[-126] (3 µg) | 3,0 µl |
Restriktions-Puffer (10 ×) | 3,0 µl |
H2O | 22,0 µl |
HindIII (10U/µl) | 1,0 µl |
NruI (10U/µl) | 1,0 µl |
Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 90 Min. Danach wurde der Ansatz mit 6 µl
Stopp-Puffer (5 x) (100 mM EDTA, 20%(w/v) Ficoll 400, 0,01%(w/v)
Bromphenolblau, 0,01%(w/v) Xylencyanol) versetzt, auf ein 0,75% Agarosegel (mit
Ethidiumbromid) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Unter UV-Licht
wurde das ∼1000 Bp große HindIII/NruI-Fragment aus dem Agarosegel
ausgeschnitten und die DNA aus dem Agarosestückchen mit der
Zentrifugationsmethode (Heery, D.M. et al.: A simple method for subcloning DNA
fragments from gel slices; Trends in Genetics 6, 1990, 173) isoliert. 100 ng des
aufgereingten Fragments wurden unter Verwendung des "Megaprime DNA Labelling
System" der Firma Amersham mit [32P]dCTP radioaktiv markiert.
Eine Genbibliothek, in der genomische DNA des Drosophila Wildtyp Stamms
CantonS in Charon 4A λ-Phagen kloniert ist (Maniatis, T. et al.: The isolation of
structural genes from libraries of eucaryotic DNA; Cell 15, 1978, 687-701) wurde auf
Agarplatten ausplattiert. Von 15 Platten, auf denen jeweils ∼45.000 rekombinante λ-Phagen
gewachsen waren, wurden Filterabzüge hergestellt (Sambrook, J. et al.:
Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989). Die Membranscheiben
(Quibrane; Qiagen, Hilden) wurden für 2 h bei 65°C in einer Lösung vorhybridisiert,
die die folgende Zusammensetzung hatte: 5×SET (20×SET = 3 M NaCl, 400 mM
Tris-HCl pH 7,4, 20 mM EDTA), 5×Denhardts (100×Denhardts = 2% (w/v)
Rinderserum Albumin, 2% (w/v) Ficoll400, 2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon), 0,1%
(w/v) SDS und 150 µg/ml autoklavierte Hering Sperma-DNA. Diese Lösung wurde
anschließend gegen frische Hybridisierungslösung ausgetauscht, die ∼1×106 cpm/ml
der radioaktiv markierten Probe enthielt. Die erste Hybridisierung erfolgte unter hoher
Stringenz für 16 h bei 65°C. Die unspezifisch gebundene Radioaktivität wurde durch
zwei Waschschritte bei 65°C in 1×SET/0,1% SDS für jeweils 30 Min. entfernt.
Spezifisch gebundene Radioaktivität wurde durch Auflegen eines Röntgenfilms für 4-14 h
bei -80°C sichtbar gemacht. Die gefundenen Signale entsprechen Gensequenzen,
die identisch zum DmDop1-Gen sind.
Um neue Gensequenzen zu erhalten, wurde in einer zweiten Hybridisierungsrunde die
Stringenz erniedrigt. Dazu wurde die Hybridisierungstemperatur von 65°C auf 52°C
abgesenkt. Nach der Hybridisierung wurde die unspezifisch gebundene Radioaktivität
in zwei Waschschritten bei 52°C in 2×SET/0,1% SDS für jeweils 25 Min. entfernt.
Die spezifischen Signale wurden wiederum durch Auflegen eines Röntgenfilms
sichtbar gemacht. Im Vergleich zum ersten Hybridisierungsdurchgang wurde ein
zusätzliches Signal auf dem Röntgenfilm identifiziert.
Das Signal wurde einer "Plaqueregion" auf der Agarplatte zugeordnet. Diese Region
wurde aus dem Agar ausgestochen und in Phagenpuffer eluiert (Sambrook, J. et al.,
s. o.). Nach mehreren Vereinzelungsrunden konnten schließlich die
Hybridisierungssignale einzeln liegenden Plaqueregionen auf der Agarplatte
zugeordnet werden. Die DNA der rekombinanten λ-Phagen wurde anschließend aus
kleinen Lysaten isoliert (Santos, M.A.: An improved method for the small scale
preparation of bacteriophage DNA based on phage precipitation by zinc
chloride;.Nucleic Acids Research 19, 1990, 5442).
Die DNA wurde mit mehreren Einzel und Doppelkombinationen von
Restriktionsenzymen verdaut mit Stopp-Puffer (s. o.) versetzt, auf ein 0,75%
Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die
DNA wurde aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran übertragen (Sambrook, J. et
al., s. o.) und dieser Southern-Blot nochmals mit der o.a. Sonde unter niedriger
Stringenz hybridisiert. Mehrere Restriktionsfragmente zeigten ein spezifisches
Hybridisierungssignal. Einige Fragmente wurden ausgewählt und mit den o.a.
Methoden aus der λ-Phagen DNA isoliert. Die Fragmente wurden in geeignete
pBluescript Plasmid-Vektoren subkloniert. Die Ligationsansätze hatten folgende
Zusammensetzung:
pBluescript-Vektor (50 ng) | 1,0 µl |
DNA-Fragment (10 ng) | 3,0 µl |
Ligase-Puffer (10 ×) | 1,5 µl |
H2O | 8,5 µl |
T4-DNA-Ligase (1U) | 1,0 µl |
Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur für 3 h. Der Ligationsansatz wurde in
transformationskompetente Zellen des Bakterienstamms XL1-Blue (Invitrogen)
transformiert. Die Zellen wurden auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten (Sambrook,
J. et al., s. o.) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet. Einzelne Kolonien
wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und die Plasmid-DNA nach der Methode
der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.) isoliert. Der korrekte Einbau der DNA-Fragmente
wurde durch Restriktionsanalysen überprüft. Größere Mengen der
Plasmid-Subklone wurden aus 50 ml Flüssigkulturen aufgereinigt.
Die Nukleinsäuresequenz der subklonierten DNA-Fragmente wurde nach der
Kettenabbruch-Methode (Sanger, F. et al.: DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors; Proceedings National Academy Sciences USA 74, 1977, 5463-5467)
bestimmt. Ein Vergleich der Nukleinsäure- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen
mit denen des DniDop1-Rezeptors zeigte, daß in der klonierten genomischen DNA
Gensequenzen enthalten sind, die für zwei, bisher unbekannte Mitglieder der G-
Protein gekoppelten Rezeptorgenfamilie kodieren.
Die neue Sequenzinformation wurde genutzt, um Oligonukleotide zu synthetisieren,
die in Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendet wurden. Das 5' Oligonukleotid
hatte die Sequenz: (#1) 5'-GCCGTACTCGAGTTCATCAAC-3'. Zwei 3' gelegene
Gegenoligonukleotide hatten die Sequenz: (#2) 5'-GGCTGAATGCAGTGGTCG-3'
und (#3): 5'-GGTCGACGCAGTCCTGGC-3'. PCR-Ansätze wurden mit den
Oligonukleotidpaaren #1/#2 sowie #1/#3 durchgeführt. Als Matrize diente eine 2.
Strang cDNA Präparation, die auf Drosophila Kopf-mRNA als Ausgangsmaterial
synthetisiert worden war. Die PCR Ansätze hatten folgende Zusammensetzung:
2. Strang cDNA (25 ng) | 1,0 µl |
Oligonukleotid #1 (10ng/Base × µl) | 1,0 µl |
Oligonukleotid #2 oder #3 (10ng/Base x µl) | 1,0 µl |
Prime-Zyme Puffer (10 ×) | 10,0 µl |
Desoxynukleotide (je 20 mM) | 1,0 µl |
H2O | 85,0 µl |
Prime-Zyme (2 U; Biometra) | 1,0 µl |
Die Amplifikation erfolgte mit folgenden Parametern:
1 Zyklus: 94°C, 2 Min. 30 Sek.
danach wurde 45 Mal die nachstehende Zyklusfolge durchgeführt:
94°C, 1 Min.
56°C, 1 Min.
72°C, 1 Min. 30 Sek.
1 Zyklus: 94°C, 2 Min. 30 Sek.
danach wurde 45 Mal die nachstehende Zyklusfolge durchgeführt:
94°C, 1 Min.
56°C, 1 Min.
72°C, 1 Min. 30 Sek.
Nach der Amplifikation wurden die Fragmente zweimal mit Phenol/Chloroform, dann
zweimal mit Chloroform extrahiert und danach durch die Zugabe von 0,1 Vol. LiCl (3
M) und 3 Vol. Ethanol (absolut) ausgefällt. Nach einer Zentrifugation: Sigma
Zentrifuge, 18.000×g, 10 Min., 4°C wurde der Niederschlag getrocknet und in 10 µl
TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA) aufgenommen. Die Fragmente
wurden phosphoryliert:
DNA-Fragment | 10,0 µl |
Kinase-Puffer (10 ×) | 1,5 µl |
ATP (10 mM) | 0,5 µl |
H2O | 2,0 µl |
Polynukleotidkinase (5 U/µl) | 1,0 µl |
Die Inkubation erfolgte für 30 Min. bei 37°C. Danach wurde das Enzym für 10 Min.
bei 65°C inaktiviert. Die DNA wurde mit Stopp-Puffer (s. o.) versetzt, auf ein 0,75%
Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und
anschließend mit der Zentrifugationsmethode (Heery, D.M. et al., s. o.) aus dem
Agarosegel isoliert. Die aufgereinigten Fragmente wurden in einen EcoRV
geschnittenen, dephosphorylierten pBluescript-Vektor ligiert und anschließend in
XL1-Blue Zellen (s. o.) transformiert. Die Zellen wurden auf Ampicillin-haltigen LB-
Agarplatten (Sambrook, J. et al., s. o.) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C
bebrütet. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und die
Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.)
isoliert. Der Einbau der PCR-Fragmente wurde durch eine Restriktionsanalyse mit den
Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII überprüft. Jeweils ein Klon, der das PCR-
Fragment #1/#2 oder #1/#3 enthielt, wurde sequenziert.
Zur Isolierung der vollständigen cDNA-Klone wurden die PCR-Fragmente aus den
Subklonen (s.o) mit EcoR]/HindIII ausgeschnitten, gelelektrophoretisch aufgetrennt
und aus der Agarose isoliert (s. o.). Die Fragmente wurden radioaktiv markiert (s. o.)
und zur Hybridisierung einer adulten Drosophila Kopf-cDNA Bibliothek eingesetzt.
Die Bibliothek wurde bereits zur Isolierung des DmDopl-Rezeptorgens verwendet
(Gotzes, F. et al., s. o.). Die cDNA Moleküle waren in λgt11-Phagen einkloniert. Die
Hybridisierung der Bibliothek erfolgte unter hoher Stringenz (s. o.). Die DNA der
vereinzelten Phagen wurde aus kleinen Lysaten präpariert (Santos, M.A., s. o.), mit
EcoRI geschnitten und in einen ebenfalls EcoRI geschnittenen pBluescript-Vektor
subkloniert. Die Nukleinsäuresequenzen der Rekombinanten wurden überlappend
doppelsträngig unter Verwendung geeigneter Subklone und genspezifischer
Oligonukleotide nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger, F. et al., s. o.) ermittelt.
Die Expression der Octopamin-Rezeptorgene sollte in einer menschlichen
embryonalen Nierenzellinie (HEK 293 Zellen) erfolgen. Um eine optimale Expression
zu erzielen, ist es erfahrungsgemäß sinnvoll, vor das Starttriplett ATG des offenen
Leserahmens die Konsensus-Sequenz der Ribosomenbindestelle von Wirbeltier-
Gensequenzen (CCACC, vgl. Kozak, M.: Compalition and analysis of sequences
upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs; Nucleic Acids
Research 12, 1984, 857-872) einzufügen. Dies erfolgt unter Verwendung der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit einem sogenannten Mutageneseoligonukleotid.
Gleichzeitig mit dem Einfügen der Kozak-Sequenz wird am 5'-Ende des
amplifizierten Fragments eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingefügt. Im
vorliegenden Fall war dies die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI
(GAATTC). Das Mutageneseoligonukleotid hatte die Sequenz: 5'-
CTCAGGAATTCCACCATGAATGAAACAGAGTGC-3'. Das Gegenoligonukleotid
für die PCR hat die Sequenz: 5'-CCATCCTCCGAGCTTGA-3'. Diese Sequenz ist
komplementär zu den Nukleotiden 1009-1025 des offenen Leserahmens der
Nukleinsäuresequenz der Drosophila Octopamin-Rezeptoren.
Die PCR wurde in einem 100 µl Ansatz durchgeführt:
Rezeptor-cDNA Klon (in pBluescript, 10 ng) | 1,0 µl |
Mutageneseoligonukleotid (10 ng/Base × µl) | 1,0 µl |
Gegenoligonukleotid (10 ng/Base × µl) | 1,0 µl |
Prime-Zyme Puffer (10 ×) | 10,0 µl |
Desoxynukleotid (je 20 mM) | 1,0 µl |
H2O | 85,0 µl |
Prime-Zyme (2 U; Biometra) | 1,0 µl |
Die Amplifikation erfolgte mit folgenden Parametern:
1 Zyklus: 94°C, 2 Min. 30 Sek.
1 Zyklus: 94°C, 2 Min. 30 Sek.
Danach wurde 25 Mal die nachstehende Zyklusfolge durchgeführt:
94°C, 45 Sek.
54°C, 45 Sek.
72°C, 45 Sek.
94°C, 45 Sek.
54°C, 45 Sek.
72°C, 45 Sek.
Nach der Amplifikation wurde das Fragment zweimal mit Phenol/Chloroform, dann
zweimal mit Chloroform extrahiert und danach durch Zugabe von 0,1 Vol. LiCl (3 M)
und 3 Vol. Ethanol (absolut) ausgefällt. Nach einer Zentrifugation (Sigma Zentrifuge,
18.000×g, 10 Min., 4°C) wurde der Niederschlag getrocknet und in 10 µl TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA) aufgenommen.
Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI (5'-Ende) und NaeI (spaltet
bei Position 426) geschnitten:
PCR-Fragment | 10,0 µl |
Restriktionspuffer (10 ×) | 2,5 µl |
H2O | 11,5 µl |
EcoRI (10 U/µl) | 0,5 µl |
NaeI (10 U/µl) | 0,5 µl |
Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 90 Min. Danach wurde der Ansatz mit 5 µl
Stopp-Puffer (5 x) (100 mM EDTA, 20% (w/v) Ficoll 400, 0,01% (w/v)
Bromphenolblau, 0,01% (w/v) Xylencyanol) versetzt, auf ein 1,5% Agarosegel (mit
Ethidiumbromid) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Unter UV-Licht
wurde das ≈440 Bp große EcoRI/NaeI-Fragment aus dem Agarosegel ausgeschnitten
und die DNA aus dem Agarosestückchen mit der Zentrifugationsmethode (Heery,
D.M. et al.: A simple method for subcloning DNA fragments ftom gel slices; Trends
in Genetics 6, 1990, 173) isoliert. Parallel zur Restriktion des PCR-Fragments wurde
der komplette cDNA-Klon (in pBluescript) ebenfalls mit EcoRI und NaeI restringiert.
Die Spaltprodukte wurden in einem 0,75% Agarosegel (mit Ethidiumbromid)
aufgetrennt und das ≈2000 Bp große Fragment, das den 3'-Bereich des Octopamin-
Rezeptorgens enthält, ebenfalls mit der Zentrifugationsmethode (s. o.) isoliert.
Die isolierten Fragmente wurden anschließend in einen EcoRI geschnittenen,
dephosphorylierten Vektor (pcDNAI, Invitrogen) ligiert:
pcDNAI (50 ng) | 1,0 µl |
PCR-Fragment (10 ng) | 3,0 µl |
3'-Fragment (40 ng) | 5,0 µl |
Ligase-Puffer (10 ×) | 1,5 µl |
H2O | 3,5 µl |
T4-DNA-Ligase (1 U) | 1,0 µl |
Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur für 3 h. Der Ligationsansatz wurde in
transformationskompetente Zellen des Bakterienstammes MC1061-P3 (Invitrogen)
transformiert. Die Zellen wurden auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten (Sambrook,
J. et al.: Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989) ausgestrichen und über Nacht bei
37°C bebrütet. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und
die Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.)
isoliert. Der korrekte Einbau der Rezeptor-kodierenden cDNA wurde durch eine
Restriktionsanalyse mit dem Restriktionsenzym BamHI überprüft. Dabei entstehen
zwei BamHI-Fragmente von 684 Bp und 1395 Bp Größe. Von zwei Klonen, in die
die cDNA korrekt eingebaut war, wurde zusätzlich die Nukleinsäuresequenz des
PCR-amplifizierten Bereichs bestimmt. Nach dieser Prüfung wurden größere Mengen
des pcDNAI-Konstrukts (pcDmOCT1B) aus 250 ml Flüssigkulturen aufgereinigt.
Für die Herstellung der Zellinie, die den Rezeptor stabil exprimiert, wurde das
Genfragment aus dem pcDNAI-Konstrukt (pcDmOCT1B) wieder ausgeschnitten.
Hierzu wurden die Restriktionsenzyme HindIII und XbaI verwendet. Diese Enzyme
schneiden nur in der Vektor-Sequenz (im Bereich der Multiplen-Cloning-Stelle,
MCS), jedoch nicht innerhalb der Rezeptorsequenz. Das cDNA-Fragment wurde wie
oben beschrieben isoliert und anschließend in einen ebenfalls HindIII/XbaI
geschnittenen pcDNAINeo-Vektor (Invitrogen) ligiert. Der Ligationsansatz wurde in
MC1061-P3 Bakterienzellen transformiert und auf Ampicillin-haltige LB-Agarplatten
ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Flüssigkulturen vermehrt und
die Plasmid-DNA nach der Methode der alkalischen Lyse (Sambrook, J. et al., s. o.)
isoliert. Der korrekte Einbau des cDNA-Fragments wurde durch eine Restriktion mit
den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI überprüft. Das Konstrukt wird
nachfolgend als pcNeoDmOCT1B bezeichnet.
Einen ersten Nachweis, daß die klonierten Gensequenzen für funktionelle Rezeptoren
kodierten, wurde nach transienten Transfektionen von HEK 293-Zellen mit dem
pcDNAI-Konstrukt (pcDmOCT1B) erhalten. Hierzu wurden ≈2×105 Zellen auf einer
5 cm (Durchmesser) großen Petrischale ausgesät und am folgenden Tag mit 10 µg
des Plasmidkonstrukts mit der Calcium-Phosphat-Methode (Chen, C. und Okayama,
H.: High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA; Molecular
and Cellular Biology 7, 1987, 2745-2752) transfiziert. Am Tag nach der Transfektion
wurde das Präzipitat mit PBS/EDTA entfernt und die Zellen durch eine Trypsin-
Behandlung von der Schale abgelöst. Verschiedene Volumina dieser Zellsuspension
wurden auf Glasplättchen, die zuvor mit Poly-L-Lysin beschichtet wurden, ausgesät
und weitere 20 h im Brutschrank inkubiert.
Für die Messung der Änderung der intrazellulären Ca2+-Ionen-Konzentration wurden
die Zellen 1 h vor dem Experiment mit dem Fluoreszenzfarbstoff FURA-2 beladen
(Frings, S. et al.: Profoundly different calcium permeation and blockage determine the
specific function of distinct cyclic nucleotide-gated channels; Neuron 15, 1995, 169-179).
Die Messung erfolgte anschließend in der Ca2+-Imaging Apparatur. Dazu wurde
ein Glasplättchen in die Meßkammer überführt und mit PBS umspült. Zur Aktivierung
der Rezeptoren wurde das PBS über eine Perfusionseinrichtung gegen eine PBS-
Lösung ausgetauscht, die eine definierte Konzentration des zu testenden Liganden
enthielt, im vorliegenden Fall 1 µM Octopamin. Durch die Bindung des Octopamins
wird eine Enzymkaskade aktiviert und der Botenstoff IP3 gebildet. Nachfolgend
kommt es zur Freisetzung von Ca2+-Ionen aus intrazellulären Speichern. Die
Änderung der Ca2+-Ionenkonzentration wurde mit dem Imaging-System
aufgezeichnet. Bei der bisher beschriebenen Vorgehensweise reagierten jedoch nicht
alle Zellen auf die Zugabe des Liganden mit einer Änderung der Ca2+-
Ionenkonzentration, weil nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen das Plasmid
aufgenommen und den Rezeptor exprimiert hatte. Um diese Variabilität zu vermeiden,
wurden Zellinien hergestellt, in denen alle Zellen die Rezeptoren stabil, d. h. permanent
exprimieren.
Die methodische Vorgehensweise ist in den ersten Schritten dem Verfahren der
transienten Transfektion vergleichbar. Für die Transfektion wurde jedoch das
pcNeoDmOCT1B-Konstrukt verwendet. Auf diesem Plasmid befindet sich noch das
Neomycin (Neo)-Resistenzgen, dessen Expression die Selektion solcher Zellen
ermöglicht, die das Plasmid aufgenommen haben, da sie gegen die Zugabe des
Antibiotikums G418 (Geneticin) resistent sind. Zellen, die kein Plasmid aufgenommen
haben, sterben durch die Zugabe von G418 zum Medium nach einigen Tagen ab. Wie
bei der transienten Transfektion wurden ≈10 µg des pcDNAINeoDmOCT1B-
Konstrukts mit der Calcium-Phsophat Methode (Chen, C. und Okayama, H., s. o.) in
ca. 2×105 Zellen in einer 5 cm großen Petri-Schale transfiziert. 20 h nach der
Transfektion wurde das Präzipitat mit PBS/EDTA entfernt und die Zellen durch eine
Trypsin-Behandlung abgelöst. Von dieser Zellsuspension wurden je 2×104 Zellen auf
fünf 9 cm große Petri-Schalen ausgesät. Nach 20 h wurde das Medium abgesaugt und
gegen frisches Medium, das 1 mg/ml G418 enthielt, ausgetauscht. Nach ca. 12-14
Tagen, in denen alle 3 Tage das Medium mit G418 gewechselt wurde, waren die
meisten Zellen, die kein Plasmid aufgenommen hatten, abgestorben. Von den fünf
Petri-Schalen wurden insgesamt 50 Zellklone isoliert, die G418-resistent waren. Die
Klone wurden einzeln in Mikrotiterplatten überführt und weiter vermehrt. Zur
Überprüfung der Rezeptorexpression wurde ein kleiner Teil der Zellen auf
Glasplättchen ausgesät (s. o.) und die Reaktion der Zellen auf die Zugabe von
Octopamin mit der Ca2+-Imaging Methode gemessen. Von den 50 Antibiotika
resistenten Zellinien exprimierte ein Zellklon den Octopamin-Rezeptor stabil. Diese
Linie wurde vermehrt und ein Teil der Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Auf die oben beschriebene Weise wurden etwa 10 verschiedene Zellinien hergestellt,
die unterschiedliche Rezeptoren oder Ionenkanäle stabil exprimieren. Die Integration
der Konstrukt-DNA erfolgte dabei nicht zielgerichtet, sondern zufällig, d. h. an einem
beliebigen Ort in das Genom der Wirtszelle. Es konnte aber festgestellt werden, daß
der Integrationsort der Fremd-DNA im Genom der Wirtszelle keinen gravierenden
Einfluß auf die Expression der Rezeptorproteine hatte.
Die Bestimmung der pharmakologischen Eigenschaften der klonierten Octopamin-
Rezeptoren erfolgte an den stabilen Zellinien. Zellen wurden dazu auf poly-L-Lysin
beschichtete Galsplättchen ausgesät (s. o.) und in die Ca2+-Imaging Apparatur
überführt. Die Zellen reagierten bei der Zugabe von 1 µM Konzentrationen der
Neurotransmitter Tyramin und Octopamin mit einem deutlichen Anstieg der
intrazellulären Ca2+-Konzentration. Die Freisetzung des Ca2+ erfolgte nicht
kontinuierlich sondern oszillierend. Bei der Inkubation mit den Neurotransmittern
Dopamin und Serotonin wurde kein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration
beobachtet.
Es wurde geprüft, ob auch niedrigere Konzentrationen der Neurotransmitter
Octopamin und Tyramin die zelluläre Reaktion auslösen können. Es wurde gefunden,
daß bereits eine Konzentration von 10-9 M Octopamin eine deutliche Erhöhung der
intrazellulären Ca2+-Konzentration bewirkt. Die Reaktion erfolgt gegenüber der
Inkubation mit 10-6 M Octopamin jedoch langsamer. Mit steigender Konzentration
des Neurotransmitters wird die zelluläre Antwort schneller und ab Konzentrationen
von 10-7 M Octopamin wird die Oszillation der Ca2+-Konzentration beobachtet. Im
Gegensatz zu Octopamin, ist eine Antwort der Zellen auf Tyramin erst ab
Konzentrationen ≧ 10-7 M zu beobachten.
Die Reaktion der Zellen auf Octopamin wird durch verschiedene Liganden
konzentrationsabhängig inhibiert. Beispielsweise bleibt die Erhöhung der
intrazellulären Ca2+-Konzentration aus, wenn die Zellen mit Octopamin und 25
Phentolamin (= Antagonist) in einer Konzentration von je 10-7 M inkubiert werden.
Die Inkubation mit dem Antagonisten kann sowohl vor als auch nach der Zugabe des
Octopamins gestartet werden. In beiden Fällen wird die Wirkung des Octopamins
selektiv kompetiert und die Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration bleibt
aus. Dieser kompetitive Effekt nimmt ab, wenn der Antagonist in geringerer
Konzentration zugegeben wird, d. h. die Erhöhung der intrazellulären Ca2+-
Konzentration tritt wieder auf, wenn bspw. 10-7 M Octopamin und 10-8 M
Phentolamin verwendet werden.
Claims (28)
1. Verfahren zur Herstellung von Neurotransmitter-Rezeptor produzierenden
Zellen, bei dem mindestens ein, für einen Neurotransmitter-Rezeptor
kodierendes Gen in eine Wirtszelle transformiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Octopamin-Rezeptor
produzierenden Zellen.
3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von Octopamin-Rezeptortyp 1
und/oder Octopamin-Rezeptortyp 2 produzierenden Zellen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Gen aus Drosophila melanogaster stammt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
ein Octopamin-Rezeptorgen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen
Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotid
sequenz.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
gekennzeichnet durch
das Octopamin-Rezeptorgen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1
oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
ein Octopamin-Rezeptorgen mit einer für die unter SEQ ID No. 4 angegebenen
Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotid
sequenz.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
gekennzeichnet durch
das Octopamin-Rezeptorgen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 3
oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß für die Transformation das Gen in ein Genkonstrukt eingebaut wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Wirtszelle eine Zellinie ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10,
gekennzeichnet durch
die Zellinie HEK293.
12. Octopamin-Rezeptorgen mit einer für die unter SEQ ID No. 2 angegebenen
Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden
Nukleotidsequenz.
13. Octopamin-Rezeptorgen nach Anspruch 12 mit der Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-
Sequenz.
14. Octopamin-Rezeptorgen mit einer für die unter SEQ ID No. 4 angegebenen
Aminosäuresequenz und/oder deren Allelvariationen kodierenden
Nukleotidsequenz.
15. Octopamin-Rezeptorgen nach Anspruch 14 mit der Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID Nr. 3 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-
Sequenz.
16. Genkonstrukt, enthaltend ein Neurotransmitter-Rezeptorgen.
17. Genkonstrukt nach Anspruch 16, enthaltend ein Octopamin-Rezeptorgen.
18. Genkonstrukt nach Anspruch 17, enthaltend ein Octopamin-Rezeptorgen
nach einem der Ansprüche 12 bis 15.
19. Transformierte Zelle, enthaltend ein Neurotransmitter-Rezeptorgen.
20. Transformierte Zelle nach Anspruch 19, enthaltend ein Octopamin-
Rezeptorgen.
21. Transformierte Zellen nach Anspruch 20, enthaltend ein Octopamin-
Rezeptorgen nach einem der Ansprüche 12 bis 15.
22. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 21, enthaltend ein
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 16 bis 18.
23. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Zellinie ist.
24. Transformierte Zelle nach Anspruch 23,
gekennzeichnet durch
die Zellinie HEK293.
25. Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften von Neurotransmitter-
Rezeptoren, bei dem man einen Liganden auf durch Neurotransmitter-
Rezeptorgen transformierte Zellen einwirken läßt und die Wirkung über die
Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca2+-Ionenkonzentration
bestimmt.
26. Verfahren nach Anspruch 25 zur Untersuchung der Eigenschaften von
Octopamin-Rezeptoren.
27. Verfahren nach Anspruch 26 zur Untersuchung der Eigenschaften von
Octopamin-Rezeptortyp 1 und/oder 2.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, bei dem die Änderung der
intrazellulären Ca2+-Ionenkonzentration mittels der Ca2+-Imaging-Methode
bestimmt wird.
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