ES2289784T3 - Placas multipocillo de baja fluorescencia de base para las mediciones de fluorescencia de muestras biologicas y bioquimicas. - Google Patents
Placas multipocillo de baja fluorescencia de base para las mediciones de fluorescencia de muestras biologicas y bioquimicas. Download PDFInfo
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Abstract
Dispositivo para mediciones espectroscópicas, que comprende: una plataforma; y una capa de polímero con baja fluorescencia y elevada transmitancia, depositada separadamente sobre dicha plataforma, en el que dicha capa de polímero produce aproximadamente 400 por ciento o menos de fluorescencia comparada con la sílice fundida de aproximadamente 150 micrómetros de espesor a unas longitudes de onda de excitación de entre 300 a 400 nm y a unas longitudes de onda de emisión de entre aproximadamente 300 a 800 nm, y en el que dicha capa de polímero comprende un polímero basado en una cicloolefina.
Description
Placas multipocillo de baja fluorescencia de
base para las mediciones de fluorescencia de muestras biológicas y
bioquímicas.
Esta solicitud reivindica los derechos de una
fecha de presentación anterior en las solicitudes de patentes de
Estados Unidos: solicitud US 08/867.567, archivada el 2 de junio de
1997; solicitud US 08/868.018, archivada el 3 de junio de 1997;
solicitud US 08/867.584 archivada el 2 de junio de 1997; y solicitud
US 08/868.049, archivada el 3 de junio de 1997; incorporada cada
una como referencia.
La presente invención se refiere generalmente a
placas y a plataformas multipocillo compuestas de cicloolefinas
para su utilización en mediciones espectroscópicas y procedimientos
para producir tales dispositivos. Las placas y las plataformas
multipocillo son útiles particularmente para las mediciones de
fluorescencia de muestras químicas o biológicas.
Está disponible comercialmente un número de
placas multipocillo para el cultivo de células o para llevar a cabo
ensayos químicos o celulares. Mientras muchas de estas placas
multipocillo ofrecen las características deseadas de
biocompatibilidad, facilidad de producción e integridad estructural
sustancial, los inventores de la presente invención han descubierto
de manera general que estas placas, especialmente las placas con
fondos poliméricos, sufren de un elevado grado de fluorescencia
sustancialmente. La cantidad relativamente elevada de fluorescencia
de base inherente en las placas disponibles comercialmente con
fondos poliméricos hace que tales placas por lo general no sean
adecuadas para mediciones de fluorescencia elevadamente sensibles
asociadas con muchos ensayos, particularmente ensayos de volúmenes
de microlitros o inferiores.
Los inventores de la presente invención
reconocieron una necesidad en las técnicas químicas y biológicas de
placas y plataformas multipocillo para casos químicos o biológicos,
tales como los ensayos de enlace o los ensayos basados en células.
Los presentes inventores prepararon criterios de selección de
materiales adecuados para la producción de placas y plataformas
multipocillo para tales aplicaciones. Como un ejemplo clave de los
criterios de selección, que se describe completamente en la presente
memoria, los presentes inventores investigaron las propiedades
espectrales de polímeros diversos, incluyendo su fluorescencia y su
transmitancia, para la compatibilidad con las mediciones
espectroscópicas de los eventos químicos y biológicos. Tales
materiales poseerían asimismo de forma deseable, pero no
necesariamente dependiendo de la aplicación, biocompatibilidad,
relativa inertidad química y suficiente rigidez para la aplicación a
mano y facilidad de producción. Los presentes inventores
seleccionaron una variedad de polímeros para ensayar basados, en
parte, en las características estructurales de los polímeros, lo
que se describe completamente en la presente memoria. La búsqueda de
polímeros de los presentes inventores incluyó campos de búsqueda no
asociados con mediciones espectroscópicas, incluyendo técnicas
asociadas con polímeros de cicloolefina, tales como técnicas de
grabación electrónicas y de audio. Los presentes inventores
compararon una variedad de materiales con láminas de sílice fundida
(por ejemplo, vidrio) que poseen fluorescencia inherente
relativamente menor. Del número de películas ensayadas, los
presentes inventores encontraron sorprendentemente películas de
cicloolefinas que poseían las propiedades de fluorescencia y de
transmitancia que se aproximaban (o incluso mejoraban) a las del
vidrio de sílice fundida.
Tal como se describe en la presente memoria, los
presentes inventores han desarrollado por primera vez nuevas placas
multipocillo utilizando cicloolefinas que ofrecen características de
funcionamiento excelentes en los ensayos. Tales placas multipocillo
se pueden utilizar en las placas de 96 pocillos convencionales o en
formatos de densidad más elevada. Los presentes inventores
describen asimismo en la presente memoria por primera vez
plataformas nuevas que se pueden utilizar para ensayos o sitios de
reacción que se corrigen particularmente para la producción con
cicloolefinas. Tales placas y plataformas se pueden utilizar
asimismo para otras aplicaciones tales como diagnósticos o síntesis
de productos químicos.
La presente invención incluye dispositivos para
mediciones espectroscópicas, tales como placas y plataformas
multipocillo. Típicamente, tales dispositivos comprenden una capa de
baja fluorescencia y de elevada transmitancia, que comprende un
polímero de cicloolefina y un(os) pocillo(s) de una
placa o de una plataforma multipocillo para sostener la capa.
Las placas multipocillo de la presente invención
comprenden una capa de baja fluorescencia y de elevada
transmitancia, que comprende un polímero de cicloolefina, y
un(os) pocillo(s) para sostener, o formar, la capa. La
cicloolefina habitualmente comprende por lo menos una porción de
una superficie de un fondo de un pocillo de la placa
multipocillo.
Las plataformas de la presente invención
comprenden una capa, o una ventana, de baja fluorescencia y de
elevada transmitancia, que comprende por lo general un polímero de
cicloolefina u otro material de baja fluorescencia, y un andamiaje
o un armazón para sostener, o formar, la capa. La ventana posee unas
dimensiones determinadas previamente y se puede disponer como una
pluralidad de ventanas sobre el armazón en cualquier disposición
geométrica, incluyendo las disposiciones en dos dimensiones. En
algunas formas de realización la ventana permite la detección de
eventos espectroscópicos, en los que la luz pasa a menudo a través
de la ventana. En otras formas de realización la ventana es
básicamente un sitio de reacción o de ensayo que puede permitir la
detección de una reacción química o ensayo.
La presente invención incluye asimismo
procedimientos para la detección y producción que se refieren a las
placas y plataformas multipocillo de la presente invención.
A menos que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria
poseen el mismo significado que entiende comúnmente cualquier
experto en la materia a la que pertenece esta invención. Por lo
general, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los
procedimientos de laboratorio de espectroscopia, descubrimiento de
fármaco, cultivo celular, genética molecular, producción de
plásticos, química de polímeros, diagnósticos, química de
aminoácidos y de ácidos nucleicos, y química de azúcares descritos
a continuación son bien conocidos y utilizados comúnmente en la
técnica. Las técnicas estándar se utilizan típicamente para la
preparación de plásticos, detección de señal, procedimientos
recombinantes de ácidos nucleicos, síntesis de polinucleótidos y
cultivo y transformación microbianas (por ejemplo, electroporación,
lipofección). Las técnicas y procedimientos se llevan a cabo por lo
general según los procedimientos convencionales de la técnica y
según diversas referencias generales (ver por lo general, Sambrook
et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989)
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., y
Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy,
Nueva York: Plenum Press (1983) para técnicas de fluorescencia, que
se incorporan a la presente memoria como referencia) que se
proporcionan en todo el documento. Las técnicas estándar se
utilizan para síntesis químicas, análisis químicos y ensayos
biológicos. Según se utilizan en toda la memoria, los términos
siguientes, a menos que se indique lo contrario, se entenderá que
poseen los significados siguientes:
"Mitad donadora fluorescente" se refiere al
radical de un compuesto fluorogénico que puede absorber energía y
es capaz de transferir la energía a otra molécula fluorogénica o a
una parte de un compuesto. Las moléculas fluorogénicas donadoras
adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cumarinas y colorantes
relacionados con los colorantes de xanteno tales como las
fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorrufinas, colorantes de
cianina, bimanes, acridinas, isoindoles, colorantes de dansilo,
hidrazidas aminoftálicas tales como luminol y derivados de
isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos,
aminoquinolinas, dicianohidroquinonas y complejos de europio y de
terbio y compuestos relacionados.
"Apagador" se refiere a una molécula
cromofórica o a una parte de un compuesto que es capaz de reducir la
emisión de un donador fluorescente cuando se une al donador. El
apagado puede ocurrir mediante cualquiera de los distintos
mecanismos incluyendo la transferencia de energía resonante de
fluorescencia, transferencia electrónica fotoinducida,
intensificación paramagnética del cruce entre sistemas, acoplamiento
de intercambio Dexter y acoplamiento de excitación tal como la
formación de complejos oscuros.
"Aceptor" se refiere a un apagador que
opera vía la transferencia de energía resonante de fluorescencia.
Muchos aceptores pueden reemitir la energía transferida como
fluorescencia. Los ejemplos incluyen cumarinas y fluoróforos
relacionados, xantenos tales como fluoresceínas, rodoles y
rodaminas, resorrufinas, cianinas, difluoroboradiazaindacenos y
ftalocianinas. Otras clases químicas de aceptores por lo general no
reemiten la energía transferida. Los ejemplos incluyen índigos,
benzoquinonas, antraquinonas, compuestos azo, compuestos nitro,
indoanilinas, di- y trifenilmetanos.
"Pareja de enlace" se refiere a dos mitades
(por ejemplo, química o bioquímica) que poseen una afinidad una
para la otra. Ejemplos de parejas de enlace incluyen
antígeno/anticuerpos, lectina/avidina, polinucleótido
objetivo/oligonucleótido sonda, anticuerpo/anticuerpo,
receptor/ligando, enzima/ligando y similares. "Un miembro de una
pareja de enlace" se refiere a una mitad de la pareja, tal como
un antígeno o un ligando.
"Colorante" se refiere a una molécula o a
una parte de un compuesto que absorbe frecuencias específicas de la
luz, incluyendo pero no limitándose a la luz ultravioleta. Los
términos "colorante" y "cromóforo" son sinónimos.
"Fluoróforo" se refiere a un cromóforo
fluorescente.
"Derivado permeante de membrana" se refiere
a un derivado químico de un compuesto que posee una permeabilidad
de membrana incrementada comparada con la de un compuesto no
derivatizado. Los ejemplos incluyen derivados de éster, éter y de
carbamato. Estos derivados están compuestos mejor para cruzar las
membranas celulares, es decir, permeantes a la membrana, porque los
grupos hidrofílicos se enmascaran para proporcionar más derivados
hidrofóbicos. También, los grupos enmascarantes se diseñan para
escindirse a partir de un precursor (por ejemplo, precursor de
sustrato fluorogénico) dentro de la célula para generar el sustrato
derivado intracelularmente. Ya que el sustrato es más hidrofílico
que el derivado permeante de membrana se captura ahora dentro de las
células.
"Alquilo" se refiere a grupos alifáticos,
lineales, ramificados y cíclicos por lo general de 1 a 8 átomos de
carbono, preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, y más
preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono. El término "alquilo
inferior" se refiere a grupos alquilo de cadena lineal y
ramificada de 1 a 4 átomos de carbono.
"Alifático" se refiere a grupos alquilo
saturados e insaturados por lo general de 1 a 10 átomos de carbono,
preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, y más preferentemente de
1 a 4 átomos de carbono.
"Soldadura por fusión con calor" se refiere
a una soldadura inducida por calor. La fuente de calor puede ser
cualquier fuente suficiente para promover algún grado de unión entre
las dos porciones (separada o de otra forma) de un
material(es), incluyendo una reacción química, una fuente de
calor externa (por ejemplo, un rodillo caliente, ultrasónico o
aire) o un calentamiento interno (por ejemplo, calentamiento por
radiofrecuencia).
"Polinucleótido aislado" se refiere a un
polinucleótido genómico, de ADNc, o de origen sintético, o alguna
combinación de los mismos, el que en virtud de su origen el
"polinucleótido aislado" (1) no se asocia con la célula en la
que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza,
o (2) se une de forma operativa a un polinucleótido al que no está
unido en la naturaleza.
"Proteína aislada" se refiere a una
proteína de ADNc, de ARN recombinante, o de origen sintético o a
alguna combinación de los mismos, la que en virtud de su origen la
"proteína aislada" (1) no se asocia con proteínas encontradas
con las que normalmente se asocia en la naturaleza, o (2) se aísla a
partir de la célula en la que normalmente existe o (3) se aísla
libre de otras proteínas a partir de la misma fuente celular, por
ejemplo, libre de proteínas humanas, o (4) se expresa mediante una
célula de una especie diferente, o (5) no existe en la naturaleza.
La "proteína que existe de forma natural aislada" se refiere a
una proteína que en virtud de su origen la "proteína que existe
de forma natural aislada" (1) no está asociada con proteínas con
las que normalmente se encuentra en la naturaleza, o (2) se aísla a
partir de la célula en la que normalmente existe o (3) se aísla
libre de otras proteínas a partir de la misma fuente celular, por
ejemplo, libre de proteínas humanas.
"Polipéptido" tal como se utiliza en la
presente memoria como término genérico se refiere a una proteína
nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptido. Por
lo tanto, la proteína nativa, fragmentos y análogos son especies
del género del polipéptido.
"Existe de forma natural" tal como se
utiliza en la presente memoria, según se aplica a un objeto, se
refiere al hecho que un objeto se pueda encontrar en la naturaleza.
Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o de polinucleótido que
está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar
a partir de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada
intencionadamente por el hombre en el laboratorio es que existe de
forma natural.
"Unido de forma operativa" se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una
relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Una
secuencia de control "unida de forma operativa" a una
secuencia de codificación se liga de tal manera que la expresión de
la secuencia de codificación se consigue bajo condiciones
compatibles con las secuencias de control.
"Secuencia de control" se refiere a
secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la
expresión de las secuencias de codificación y de no codificación a
las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control
difiere dependiendo del organismo huésped; en los procariotas, tales
secuencias de control incluyen por lo general un promotor, un sitio
de enlace ribosomial y la secuencia de la terminación de la
transcripción; en los eucariotas, por lo general, tales secuencias
de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la
transcripción. El término "secuencias de control" pretende
incluir, como mínimo, componentes cuya presencia pueda influenciar
la expresión, y pueda asimismo incluir componentes adicionales cuya
presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias
de pareja de fusión.
"Polinucleótido" se refiere a una forma
polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, de
ribonucleótidos o desoxinucleótidos o de una forma modificada de
cada tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de doble
hélice y simple.
"Corresponde a" se refiere a que una
secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no
estrictamente relacionada evolutivamente) a toda o a una porción de
una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia
de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de
referencia. En contraposición, el término "complementario a"
se utiliza en la presente memoria para significar que la secuencia
complementaria es homóloga a toda o a una porción de una secuencia
de polinucleótido de referencia. Para ilustrar esto, la secuencia
de nucleótido "TATAC"
corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
El "fragmento de polipéptido" se refiere a
un polipéptido que posee una deleción amino-terminal
y/o carboxi-terminal, pero que el resto de la
secuencia de aminoácido es por lo general idéntica a las posiciones
correspondientes en la secuencia que existe de forma natural
deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud
completa. Los fragmentos típicamente son por lo menos de 5, 6, 8 ó
10 aminoácidos de longitud, preferentemente por lo menos de 14
aminoácidos de longitud, más preferentemente por lo menos de 20
aminoácidos de longitud, por lo general de por lo menos 50
aminoácidos de longitud, y más preferentemente incluso de por lo
menos 70 aminoácidos de longitud.
"Placa" se refiere a una placa
multipocillo, a menos que se modifique de otra manera en el contexto
de su utilización.
"Modulación" se refiere a la capacidad de
aumentar o inhibir una propiedad o procedimiento de actividad
biológicos (por ejemplo, actividad enzimática o enlace de
receptor); tal intensificación o inhibición puede depender de la
existencia de un evento específico, tal como la activación de una
ruta de transducción de señal, y/o se puede manifestar solo en
tipos de células particulares.
El término "modulador" se refiere a un
compuesto químico (que existe de forma natural o no natural), tal
como una macromolécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico,
proteína, no péptido o molécula orgánica), o un extracto realizado
en materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o
células o tejidos animales (particularmente mamíferos). Los
moduladores se evalúan por su actividad potencial como inhibidores o
activadores (directa o indirectamente) de un procedimiento o
procedimientos biológicos (por ejemplo, agonista, antagonista
parcial, agonista parcial, antagonista, agentes antineoplásicos,
agentes citotóxicos, inhibidores de transformación neoplásica o de
proliferación celular, agentes promotores de la proliferación
celular y similares) mediante la inclusión de ensayos de
selección
descritos en la presente memoria. La actividad de un modulador se puede conocer, desconocer o conocer parcialmente.
descritos en la presente memoria. La actividad de un modulador se puede conocer, desconocer o conocer parcialmente.
El término "producto químico de ensayo" se
refiere a un producto químico que se va a ensayar por uno o más
procedimiento(s) de selección de la presente invención como
un supuesto modulador.
Los términos "marca" o "marcado" se
refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo,
mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o por la
unión a un polipéptido de mitades de biotinilo que se puede
detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que
contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que se
puede detectar mediante procedimientos ópticos o colorimétricos). Se
conocen en la técnica diversos procedimientos de marcaje de
polipéptidos y glicoproteínas y se pueden utilizar. Ejemplos de
marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los
siguientes: radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C,
^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcadores fluorescentes (por
ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcadores
enzimáticos (o genes informadores) (por ejemplo, peroxidasa de
rábano, \beta-galactosidasa,
\beta-lactamasa, luciferasa, fosfatasa alcalina),
quimioluminiscencia, grupos biotinilo, epítopes de polipéptidos
determinados previamente reconocidos por un informador secundario
(por ejemplo, secuencias de pareja de cremallera de leucina, sitios
de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal,
marcadores de epítope). En algunas formas de realización, los
marcadores se unen mediante brazos espaciadores de diversas
longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
El "marcador de fluorescencia" se refiere a
la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante
la incorporación de una mitad fluorescente a una entidad química que
se une a un objetivo o a una unión a un polipéptido de mitades de
biotinilo que se pueden detectar mediante avidina (por ejemplo, la
estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una
actividad enzimática que se puede detectar mediante procedimientos
de detección por fluorescencia). Se conocen en la técnica diversos
procedimientos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas y se
pueden utilizar. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen,
pero no se limitan a colorantes (por ejemplo, FITC y rodamina),
proteínas fluorescentes intrínsecamente, y fósforos de lantánido.
En algunas formas de realización, los marca-
dores se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
dores se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
El "gen informador" se refiere a una
secuencia de nucleótido que codifica una proteína que se detecta
fácilmente por su presencia o actividad, incluyendo, pero no
limitándose a, la luciferasa, proteína fluorescente verde,
cloranfenicol acetiltransferasa,
\beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina secretada
de placenta, \beta-lactamasa, hormona de
crecimiento humano y otros informadores enzimáticos secretados. Por
lo general, los genes informadores codifican un polipéptido que no
se produce de otra manera que por una célula huésped que se detecta
mediante análisis de la célula(s), por ejemplo, mediante
análisis fluorométricos, radioisotópicos o espectrofotométricos
directos de la célula(s) y preferentemente sin la necesidad
de eliminar las células para el análisis de la señal de un pocillo.
Preferentemente, el gen codifica una enzima que produce un cambio
en las propiedades fluorométricas de una célula huésped que se
detecta mediante la función de activación transcripcional
cualitativa, cuantitativa o semicuantitativa. Las enzimas ejemplares
incluyen esterasas, fosfatasas, proteasas (activador de
plasminógeno de tejido o urocinasa) y otras enzimas cuya función se
puede detectar mediante los sustratos cromogénicos o fluorogénicos
adecuados conocidos por los expertos en la materia. Las proteínas,
particularmente las enzimas, de genes informadores se pueden
utilizar asimismo como sondas en los ensayos bioquímicos, por
ejemplo después de la conjugación adecuada al objetivo o a una
entidad química que une al objetivo.
La "transmitancia" se refiere a la fracción
de luz incidente que pasa a través de un medio a una longitud de
onda determinada. Se puede considerar asimismo la proporción de
poder radiante transmitido a través del medio al poder radiante
incidente sobre el medio a una longitud de onda particular.
Otros términos químicos de la presente memoria
se utilizan según la utilización convencional de la técnica, según
se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of
Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill,
San Francisco, incorporado a la presente memoria como
referencia).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Como una introducción no limitativa a la
amplitud de la presente invención, la presente invención incluye
aspectos generales y útiles diversos, incluyendo:
- 1)
- placas multipocillo con fondos de pocillo de cicloolefina que son útiles en las mediciones de fluorescencia,
- 2)
- plataformas con capas de cicloolefina o ventanas que son útiles en las mediciones de fluorescencia,
- 3)
- procedimientos de producción de (1) y (2), y
- 4)
- procedimientos y sistemas de detección basados, en parte, en (1) y (2).
Estos aspectos de la presente invención, además
de otros descritos en la presente memoria, se pueden conseguir
utilizando los procedimientos y composiciones de la materia descrita
en la presente memoria. Para obtener una apreciación completa del
alcance de la presente invención, se reconocerá además que se pueden
combinar aspectos diversos de la presente invención para llevar a
cabo las formas de realización deseadas de la presente
invención.
La presente invención incluye dispositivos para
las mediciones espectrofotométricas, tales como placas y plataformas
multipocillo. Típicamente, tales dispositivos comprenden una capa
de baja fluorescencia y de elevada transmitancia, que comprende un
polímero de cicloolefina y un(os) pocillo(s) de una
placa o plataforma multipocillo para sostener la capa. Tanto las
placas como las plataformas multipocillo se describen a
continuación.
Las placas multipocillo de la presente invención
comprenden una capa de baja fluorescencia y de elevada
transmitancia, que comprenden un polímero de cicloolefina, y
un(os) pocillo(s) para sostener, o formar, la capa. La
cicloolefina comprende por lo general por lo menos una porción de
una superficie del fondo de un pocillo de la placa multipocillo. En
muchas formas de realización, para facilitar la facilidad de
producción, la cicloolefina comprenderá sustancialmente el fondo
entero. La cicloolefina se puede utilizar asimismo para formar las
paredes de la placa, que es una segunda forma de reducir la
fluorescencia inherente de una placa. En algunas formas de
realización conformadas de la presente invención, la cicloolefina
comprenderá opcionalmente cualquier porción de una placa, incluyendo
el fondo de la placa, las paredes de los pocillos, los miembros
estructurales entre pocillos que interconectan los pocillos, los
lados de la placa, las superficies superior o inferior de la placa,
además de las tapas de la placa.
Las placas multipocillo pueden ofrecer cualquier
número de pocillos en cualquier disposición de pocillo sobre
cualquier formato o huella de placa multipocillo. Típicamente, los
pocillos se dispondrán en disposiciones lineales de dos dimensiones
y poseen por lo general entre aproximadamente 96 y 9.600 pocillos,
preferentemente el número de pocillos es un múltiplo de 96. Los
números superiores de pocillos o la densidad de pocillo incrementada
se pueden llevar a cabo asimismo fácilmente ya que los polímeros de
cicloolefina se pueden producir fácilmente en una variedad de
formas de pocillo y formas de dimensión y volumen pequeños. Otro
número de pocillos utilizado comúnmente incluye 1.536, 3.456 y
9.600. Los volúmenes de pocillo están típicamente comprendidos entre
500 nanolitros y más de 200 microlitros, dependiendo de la
profundidad de pocillo y de la área de sección transversal. Se
utilizan comúnmente los volúmenes de pocillo de 1, 2, 5, 10, 20, 50,
100, 200 y 500 microlitros. Los pocillos se pueden producir en
cualquier forma de sección transversal (en la vista del plano)
incluyendo, cuadrada, redonda, hexagonal y combinaciones de las
mismas. Los pocillos se pueden producir en cualquier forma de
sección transversal (en la vista vertical) incluyendo, paredes
verticales deslizantes con fondos redondos o lisos, paredes cónicas
con fondos lisos o redondos y paredes verticales curvadas con fondos
lisos o redondos y combinaciones de las mismas. En aplicaciones de
la presente invención que pueden utilizar luz enfocada, la
cicloolefina se puede utilizar para formar una lente que es parte
del fondo del pocillo. La lente variará en espesor y curvatura
dependiendo de la aplicación.
Los materiales para la producción de la placa
serán típicamente poliméricos, ya que estos materiales se prestan a
las técnicas de producción en serie. Los materiales poliméricos
pueden facilitar particularmente la producción de placa mediante
procedimientos de moldeo conocidos en la técnica y desarrollados en
el futuro. Los polímeros que son compatibles con la cicloolefina se
deberían utilizar en regiones de la placa en contacto físico con la
cicloolefina. En algunas formas de realización, los pocillos de la
placa se pueden producir con un material diferente de un polímero
de cicloolefina y la cicloolefina unida, soldada o fundida de
cualquier otra manera al segundo material. Se pueden seleccionar
para la producción de pocillos y de otras porciones de la placa los
polímeros con temperatura de transición de vidrio adecuados para la
fusión inducida por calor con cicloolefina. Preferentemente, los
polímeros se seleccionan con fluorescencia baja u otras propiedades
descritas en la presente memoria. La placa entera, excepto el
fondo, se puede producir a partir de un segundo polímero y a
continuación soldarla por calor a una película de cicloolefina de
dimensiones adecuadas utilizando procedimientos como los conocidos
en la técnica o los desarrollados en el futuro. Se prefiere asimismo
producir una porción sustancial o la placa entera de cicloolefina.
Tales utilizaciones de segundos polímeros se pueden utilizar
asimismo como una guía para formar otras formas de realización de
la presente invención.
Ya que la mayoría de las mediciones no
requerirán típicamente que la luz pase a través de la pared del
pocillo, los polímeros pueden incluir pigmentos que oscurezcan las
paredes del pocillo o absorban luz. Tal aplicación de pigmentos
ayudará a reducir la fluorescencia de base. Los pigmentos se pueden
introducir mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal
como el revestimiento o la mezcla durante los procedimientos de
polimerización. La selección del pigmento se puede basar en una
mezcla de pigmentos para que humecten todo el fondo inherente al
polímero, o un pigmento único o un conjunto de los pigmentos
seleccionados para filtrar o absorber luz a las longitudes de onda
deseadas. Los pigmentos pueden incluir negro carbón. Tal
pigmentación no se desea por lo general en formas de realización en
las que la luz se dirige a través de las paredes del pocillo como
un procedimiento para la iluminación de los contenidos de los
pocillos. Tales técnicas se pueden aplicar asimismo para formas de
realización de plataformas de la presente invención.
El espesor de la cicloolefina que comprende el
fondo de la placa puede variar dependiendo del conjunto de
propiedades requeridas del fondo de la placa que se puede imponer
por una aplicación particular. Tales propiedades incluyen la
cantidad de fluorescencia intrínseca, rigidez, resistencia a la
rotura y requisitos de producción relacionados con la cicloolefina
utilizada en la placa. Las capas de cicloolefina del fondo de los
pocillos presentan un espesor típicamente de entre aproximadamente
30 a 500 micrómetros de grueso, y preferentemente aproximadamente
de 50 a 300 micrómetros de grueso. Tales valores de espesor se
pueden utilizar asimismo como una guía para formar otras formas de
realización de la presente invención.
Una de las características destacadas de las
placas multipocillo de la presente invención es su baja
fluorescencia intrínseca. La capa del fondo que comprende la
cicloolefina produce típicamente aproximadamente de 400 por ciento
a 200 por ciento o menos de la fluorescencia comparada con la de la
sílice fundida de 150 micrómetros de espesor. El vidrio de sílice
fundida se utiliza típicamente como un "patrón oro" para la
comparación de fluorescencia relativa. La fluorescencia y la
fluorescencia relativa se pueden medir utilizando cualquiera de las
técnicas fiables conocidas o desarrolladas en la técnica, se
utilizan preferentemente las técnicas descritas en la presente
memoria. Preferentemente, el estándar de sílice fundida utilizado en
la presente memoria para mostrar la sorprendente baja fluorescencia
de la cicloolefina se utiliza como un estándar. Preferentemente, la
capa del fondo que comprende la cicloolefina produce típicamente de
aproximadamente 100 a 50 por ciento o menos de la fluorescencia
comparada con la de la sílice fundida de aproximadamente 150
micrómetros de espesor. La cantidad de fluorescencia intrínseca se
puede imponer, en parte, por el espesor de la capa. En algunas
aplicaciones que pueden tolerar particularmente capas delgadas,
tales aplicaciones en las que la capa no requiere una resistencia
estructural significativa, el espesor de la capa puede ser bastante
delgado (por ejemplo, de 20 a 80 micrómetros) para reducir la
fluorescencia que surge de la capa. La delgadez de una capa está
asimismo por lo general bastante equilibrada contra la dificultad
de una soldadura uniforme o de la generación de capas más delgadas
en los procedimientos de producción. La baja fluorescencia relativa
de los dispositivos de cicloolefina está presente por lo general a
unas longitudes de onda de excitación de entre aproximadamente 300 a
400 nm y a unas longitudes de onda de emisión de entre
aproximadamente 300 a 800 nm. Tales valores de fluorescencia
relativa se pueden utilizar asimismo como una guía para formar otras
formas de realización de la presente invención.
Las placas multipocillo de la presente invención
pueden comprender revestimientos o modificaciones de la superficie
para facilitar las diversas aplicaciones de la placa según se ha
descrito en la presente memoria y las conocidas o las desarrolladas
en la técnica relevante. Los revestimientos se pueden introducir
utilizando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica,
incluyendo la impresión, la pulverización, la energía radiante, las
técnicas de ionización o de inmersión. Las modificaciones de
superficie se pueden introducir asimismo derivatizando
adecuadamente un polímero antes o después del procedimiento de
producción e incluyendo un polímero derivatizado adecuado en la
capa de cicloolefina. El polímero derivatizado puede a continuación
hacerse reaccionar con una mitad química que se utiliza en una
aplicación de la placa. Antes de la reacción con una mitad química,
tal polímero puede proporcionar a continuación sitios de unión
covalente o no covalente sobre la cicloolefina. Tales sitios en o
sobre la superficie de la cicloolefina se pueden utilizar para unir
mitades, tales como los componentes de ensayo (por ejemplo, un
miembro de una pareja de enlace), componentes de reacción química
(por ejemplo, componentes de síntesis sólida para las síntesis de
aminoácidos o de ácidos nucleicos) y los componentes de cultivo
celular (por ejemplo, proteínas que facilitan el crecimiento o la
adhesión). Los ejemplos de polímeros derivatizados incluyen los
descritos por la patente US nº 5.583.211 (Coassin et al.).
Las formas de realización preferidas se basan particularmente en
derivados de polietileno y de polipropileno que se pueden incluir
como copolímeros de cicloolefinas.
La capa de cicloolefina puede incluir asimismo
una pluralidad de células vivas. Tales formas de realización son
útiles para los ensayos basados en células descritos en la presente
memoria y para las células en crecimiento utilizando procedimientos
de cultivo. Las placas de la presente invención pueden incluir un
revestimiento (por ejemplo, polilisina) para intensificar la unión
de las células.
Los usos de las placas multipocillo son
conocidos en las técnicas relevantes e incluyen ensayos de
diagnóstico, ensayos de unión química o bioquímica, ensayos de
filtración, sitios de síntesis química, sitios de almacenamiento y
similares. Tales usos se pueden aplicar asimismo a la presente
invención. Se reconocerá que algunos tipos de placas multipocillo
para las mediciones espectroscópicas se pueden utilizar a menudo
para otras aplicaciones de placa multipocillo. Típicamente, una
placa multipocillo se utiliza para detectar una señal de una
muestra. Se describen en la presente memoria diferentes tipos de
mediciones de señal.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona una placa multipocillo para las mediciones
espectroscópicas, que comprende una pluralidad de pocillos y cada
pocillo comprende una pared y un fondo con una porción de baja
fluorescencia y de elevada transmitancia que comprende un copolímero
de cicloolefina, y un armazón, en el que los pocillos se disponen
en un armazón. La placa multipocillo se puede utilizar para
detectar una señal de una muestra. La placa multipocillo en algunas
formas de realización carece de la huella de una placa de
microvaloración de 96 pocillos estándar (es decir, "huellas no
estándar"). La huella de una placa de microvaloración de 96
pocillos estándar es de una longitud de 12,7 cm y de una anchura de
8,5 cm. La huella estándar aceptada por lo general para una placa
de microvaloración de 96 pocillos estándar para aplicaciones
robóticas es de 12,77 \pm 0,25 cm de longitud y de 8,55 \pm 0,25
cm de ancho (ver T. Astle, Standards in Robotics and
Instrumentation, J. of Biomolecular Screening, vol. 1, páginas
163-168 (1996)). En ningún caso la huella estándar
será mayor o menor que el intervalo de longitudes y anchuras
presentadas en la Tabla 1, que es un máximo de 12,83 cm y un mínimo
de 12,63 cm para la longitud y un máximo de 8,63 cm y un mínimo de
8,37 cm para la anchura. En huellas no estándar, la placa
multipocillo puede poseer 864 o más pocillos (por ejemplo, 1.536,
3.456 y 9.600).
Típicamente, la placa multipocillo posee
pocillos con una distancia de centro de pocillo a centro de pocillo
inferior a aproximadamente 9 a 6 mm, preferentemente inferior a 3 mm
y algunas veces inferior a aproximadamente 1 mm. Se prefieren las
distancias de centro de pocillo a centro de pocillo más pequeñas
para los volúmenes más pequeños. Tales placas poseen típicamente un
espesor de polímero de cicloolefina de entre aproximadamente 20 y
200 micrómetros de espesor, preferentemente aproximadamente de 30 a
80 micrómetros. Preferentemente, el polímero de cicloolefina posee
baja fluorescencia a partir de una luz de excitación de
aproximadamente 300 a 500 nm y la porción de baja fluorescencia y
de elevada transmitancia es sustancialmente el fondo completo. A
menudo los pocillos y opcionalmente el armazón están compuestos de
un copolímero de cicloolefina, que ayuda a reducir la
fluorescencia.
La presente invención incluye opcionalmente la
salvedad de que cuando la placa multipocillo es una placa de
microvaloración con una huella de una placa de microvaloración de 96
pocillos estándar y que posee pocillos de microvaloración, el
número de los pocillos de microvaloración no excederá 864 pocillos
de microvaloración.
Las plataformas de la presente invención
comprenden una placa, o ventana, de baja fluorescencia y de elevada
transmitancia, que comprende por lo general un polímero de
cicloolefina u otro material de baja fluorescencia, y un andamiaje
o armazón para sostener, o formar, la capa. La ventana posee una
dimensión determinada previamente y se puede disponer como una
pluralidad de ventanas en el armazón en cualquier disposición
geométrica, incluyendo disposiciones en dos dimensiones. En algunas
formas de realización, la ventana permite la detección de eventos
espectroscópicos, en los que la luz a menudo pasa a través de la
ventana. En otras formas de realización, la ventana es básicamente
una reacción o un sitio de ensayo que puede permitir la detección de
una reacción o ensayo químico, por ejemplo mediante la medición de
la refracción o reflectancia de la luz. Cuando la ventana es un
sitio de ensayo o de reacción, la luz no tiene que pasar
necesariamente a través de la ventana.
La cicloolefina comprende por lo general por lo
menos una porción de la ventana. En muchas formas de realización,
para facilitar la facilidad de producción, la cicloolefina
comprenderá sustancialmente la ventana entera y la plataforma. La
cicloolefina se puede utilizar asimismo para formar el andamiaje o
armazón que forma la plataforma, que es una segunda manera de
reducir la fluorescencia inherente de una placa. En algunas formas
de realización moldeadas, de la presente invención, la cicloolefina
comprenderá opcionalmente cualquier porción de una plataforma,
incluyendo el fondo de la plataforma, paredes, miembros
estructurales entre ventanas que interconectan los pocillos,
laterales de la plataforma, superficies superiores o inferiores de
la plataforma, además de las tapas de la plataforma. Otros
polímeros se pueden sustituir por cicloolefina dependiendo de los
requisitos espectroscópicos u otros del ensayo o de la reacción.
En una forma de realización, la plataforma
comprende un andamiaje para una matriz de sitios de ensayo
determinados previamente espacialmente sobre la capa, y el
andamiaje no interfiere sustancialmente con la detección de una
señal a partir de los sitios de ensayo. La capa posee típicamente un
espesor de aproximadamente 40 a 300 micrómetros de espesor. Los
sitios de ensayo son típicamente de aproximadamente 10 micrómetros
cuadrados a 200 micrómetros cuadrados de área, aunque se tienen en
cuenta sitios mayores de 200 micrómetros (por ejemplo, de 500 a
2.000 micrómetros o mayores) y sitios más pequeños de 10 micrómetros
(por ejemplo, de 5 a 0,5 micrómetros o menores). La capa se puede
derivatizar para la unión de entidades químicas según se ha descrito
en la presente memoria. Los sitios de ensayo se pueden imprimir
asimismo sobre la capa. Tales plataformas se pueden utilizar y
producir en muchos casos como las placas multipocillo descritas en
la presente memoria. Preferentemente, la plataforma comprende un
copolímero de cicloolefina.
Las formas de realización de la presente
invención no incluyen medios ópticos, de grabación de información,
típicamente utilizados para el almacenamiento y la búsqueda
selectiva de la información (por ejemplo, CD (discos compactos)
para grabaciones de audio o de datos de ordenador). Tales medios de
grabación ópticos poseen una capa de grabación. La capa de
grabación comprende por lo general o 1) deformaciones físicas
determinadas previamente (por ejemplo, hoyos o concavidades) sobre
la superficie de la capa de grabación formada por irradiación de la
capa de grabación en los sitios determinados previamente precisos o
2) sitios determinados previamente de índice de refracción o
reflectancia alterados sobre la superficie de la capa de grabación
formada por irradiación de la capa de grabación en los sitios
determinados previamente. Las capas de grabación se componen
típicamente de un metal de punto de fusión bajo (por ejemplo, Te) y
pueden contener otros elementos para las propiedades deseadas (por
ejemplo, Cr, C y H). La capa de grabación se deposita por lo general
sobre el sustrato que comprende un polímero, tal como una
cicloolefina. En contraste, la presente invención se dirige hacia
los medios de grabación de información, no ópticos y la utilización
de cicloolefinas de baja fluorescencia y de elevada transmitancia
para utilizar en las técnicas químicas y biológicas, como opuesto a
las técnicas informáticas o de audio. En muchas de estas formas de
realización la luz pasará a menudo a través de la capa de
cicloolefina a diferencia de los medios de grabación de información
ópticos, en los que la luz "rebota" sobre la capa de
grabación. Los medios de grabación de información, ópticos,
convencionales son diferentes asimismo de la presente invención
porque las capas de grabación de tales medios contienen una capa de
metal blando. La capa de metal blando es normalmente una
característica desventajosa par la medición de los eventos químicos
o biológicos. En muchos casos, tal capa de grabación no será
compatible con muchas reacciones químicas o mitades biológicas. Se
entiende, sin embargo, que algunas formas de realización de la
presente invención pueden contener o almacenar información, además
de proporcionar que los sitios de eventos químicos o biológicos
tengan lugar en un formato de CD o en uno modificado, siendo el
formato de CD según las dimensiones y otras características de la
presente invención. En algunos casos, tal producto químico de
eventos biológicos puede proporcionar una señal que se puede medir
como un cambio en la refracción o en la reflexión de la luz. Se
entiende asimismo que algunas formas de realización de la presente
invención pueden incluir sitios para eventos químicos o biológicos
que pueden ser capaces de almacenar y buscar selectivamente la
información en un formato que parece formato de disco compacto
convencional. Ni la presente invención incluye cicloolefinas
producidas como bolsas de ampollas ni como material envasado.
Esta sección describe materiales, criterios de
selección y ensayos rápidos para facilitar la elección de una
cicloolefina para placas y plataformas multipocillo descritas en la
presente memoria.
Los presentes inventores llevaron a cabo una
investigación exhaustiva sobre diferentes polímeros en búsqueda de
polímeros que ofreciesen las propiedades adecuadas para la detección
de señales espectroscópicas, particularmente señales de
fluorescencia. Los materiales utilizados en la presente invención no
se han utilizado en las placas disponibles comercialmente listadas
en la tabla 1. Sorprendentemente, estos materiales ofrecen
propiedades excepcionales, incluyendo la baja fluorescencia
intrínseca, lo que se ha demostrado en la presente memoria por
primera vez. Las "cicloolefinas" se refieren por lo general a
polímeros de cicloolefinas, a menos que se modifique de otra manera
en el contexto de su utilización, e incluye copolímeros tales como
los especificados en la presente memoria. Los "copolímeros de
cicloolefinas" se refieren por lo general a copolímeros de
cicloolefina, a menos que se modifique de otra manera en el
contexto de su utilización.
Típicamente, las cicloolefinas se utilizan como
películas o resinas para producir diversas formas de realización de
la presente invención. Las resinas y las películas basadas en
polímeros de cicloolefinas se pueden utilizar en procedimientos de
producción diversos conocidos en la técnica relevante y descritos en
la presente memoria. Los criterios de selección para las películas
o resinas de cicloolefina se describen de forma muy completa a
continuación. Por lo general, no se prefieren las películas o
resinas de cicloolefina que contienen absorbentes de rayos UV,
mitades aromáticas y mitades de estireno.
Las cicloolefinas adecuadas para muchas formas
de realización de la presente invención incluyen las descritas en
las patentes US nº 5.278.238 (Lee B. L. et al); nº 4.874.808
(Minami et al); nº 4.918.133 (Moriya et al); nº
4.935.475 (Kishimura et al); nº 4.948.856 (Minchak et
al); nº 5.115.052 (Wamura et al); nº 5.206.306 (Shen);
nº 5.270.393 (Sagane et al); nº 5.272.235 (Wakatsuru et
al); nº 5.278.214 (Moriya et al); nº 5.534.606 (Bennett
et al); nº 5.532.030 (Hirose et al); nº 4.689.380
(Nahm et al); y nº 4.899.005 (Lane et al). Se
prefieren las cicloolefinas disponibles de Hoechst, especialmente
la cicloolefina (por ejemplo, ciclopenteno, ciclohexano y
ciclohepteno) y sus copolímeros de polietileno, además de los
polímeros de olefina termoplásticos de estructura amorfa (línea
TOPAS).
Se prefieren los laminados de multicapa cuando
los múltiples requisitos funcionales son difíciles de obtener a
partir de un laminado único (por ejemplo, capa o película). Las
propiedades de transmitancia, rigidez, sellado al calor,
fluorescencia, penetración húmeda se pueden mezclar mediante la
utilización de películas de diferentes resinas. Las resinas
mezcladas conocidas en la técnica y desarrolladas en el futuro se
pueden utilizar cuando las películas multilaminadas o las resinas
mezcladas poseen propiedades consecuentes con las de la presente
invención. Por ejemplo, la patente US nº 5.532.030 (Hirose et
al) describe la producción de ciertas películas de
cicloolefinas, tanto únicas como multilaminadas, que se pueden
adaptar a la utilización en los dispositivos descritos en la
presente memoria.
Las propiedades deseadas para las películas de
cicloolefina y las resinas utilizadas en la presente invención
variarán dependiendo del tipo de placa o plataforma multipocillo
deseada. Por lo general, los materiales se seleccionan para
proporcionar un producto final con baja fluorescencia, elevada
transmitancia, rigidez suficiente para resistir la deformidad y
para permitir el plano único sustancialmente (especialmente para las
formas de realización espectroscópicas), buena inertidad química,
citotoxicidad relativamente baja, baja absorción de agua,
resistencia al calor/desviación de hasta aproximadamente 150ºC y la
resistencia a ácidos y bases. Se desean particularmente los
materiales de partida con buenas propiedades de moldeo.
Se puede medir fácilmente la fluorescencia de
las películas o del producto final. Tales mediciones se llevan a
cabo rápidamente y se pueden ensayar un número de películas (por
ejemplo de 20 a 80 películas) o los productos de prototipo
rápidamente en cuestión de horas o días, por lo general menos de una
semana persona. En consecuencia, las películas o resinas utilizadas
para llevar a cabo los productos finales se pueden seleccionar
rápidamente para las propiedades deseadas que son importantes en
una aplicación particular. Las mediciones de fluorescencia se
pueden utilizar según se ha descrito anteriormente o las conocidas
en la técnica, siempre que las mediciones sean comparables (o
mejores) en sensibilidad a las mediciones descritas anteriormente en
la presente memoria. Un punto de referencia estándar para la
fluorescencia relativa, tal como el estándar descrito en la presente
memoria, es particularmente útil para la comparación de diferentes
cicloolefinas diferentes y para la determinación de su
aplicabilidad a ciertas aplicaciones. Se desean particularmente las
propiedades de fluorescencia relativa descritas en la presente
memoria. De forma similar, la transmitancia se puede medir
utilizando las técnicas conocidas en la técnica relevante.
\newpage
En el producto final, los espesores de capa de
por lo general, aproximadamente 20 a 500 micrómetros, son muy
probablemente para impartir las propiedades deseadas para utilizar
en los dispositivos descritos anteriormente en la presente memoria,
especialmente la baja fluorescencia y la elevada transmitancia.
Aunque se pueden utilizar las películas más delgadas o más gruesas,
tales como aproximadamente de 10 a 1.500 micrómetros, en
aplicaciones en las que las demandas para las películas de
extremada baja fluorescencia y de elevada transmitancia son menos
severas, o cuando existe un poco pérdida en las propiedades deseadas
como una función del espesor de película. Preferentemente, el
espesor de película está comprendido entre aproximadamente 30 y 200
micrómetros para las aplicaciones de placa multipocillo, y más
preferentemente entre aproximadamente 80 y 200 micrómetros y más
preferentemente entre 80 a 200 micrómetros. Preferentemente, el
espesor de la película está comprendido entre aproximadamente 30 y
600 micrómetros para las aplicaciones de andamiaje en las que las
películas contribuyen típicamente a una función estructural en el
dispositivo que demanda por lo general más resistencia o rigidez,
más preferentemente entre aproximadamente 100 y 500 micrómetros y
más preferentemente entre aproximadamente 120 y 200 micrómetros.
Preferentemente, el espesor de la película está entre
aproximadamente 75 a 600 micrómetros para las regiones más delgadas
de las aplicaciones moldeadas de inyección en las que la película
contribuye típicamente a una función estructural y más
preferentemente entre aproximadamente 100 a 500 micrómetros y más
preferentemente entre aproximadamente de 120 a 200 micrómetros. El
espesor de la película se refiere al espesor de la película
utilizada (o espesor del material). El espesor de la capa es por lo
general aproximadamente de 100 a 200 por ciento del espesor de la
película, preferentemente aproximadamente de 100 a 150 por ciento
del espesor de la película y más preferentemente aproximadamente de
100 a 125 por ciento del espesor de la película.
En el producto final, las tensiones de rotura
(Kg/cm^{2} a 22ºC) por lo general, aproximadamente de 400 a 3.000
Kg/cm^{2} son más probable que impartan las propiedades deseadas
para utilizar en los dispositivos descritos en la presente memoria,
especialmente dispositivos rígidos de baja fluorescencia y de
elevada transmitancia. Aunque las películas más débiles o más
fuertes, tales como aproximadamente 200 a 3.500 Kg/cm^{2} se
pueden utilizar en diferentes aplicaciones basadas en las demandas
para la resistencia a la rotura del dispositivo. Por ejemplo, la
resistencia a la rotura de la película, por lo general, no necesita
ser tan grande para los fondos de las placas multipocillo como para
las aplicaciones en las que la película es parte del armazón, en
una placa multipocillo o en una plataforma de reacción
sustancialmente compuesta de la película en si misma.
Preferentemente, la tensión de rotura está entre aproximadamente 500
a 2.000 Kg/cm^{2} para las aplicaciones de placa multipocillo, y
más preferentemente entre aproximadamente 800 a 1.600 Kg/cm^{2} y
más preferentemente entre aproximadamente 900 a 1.400 Kg/cm^{2}.
Preferentemente, la tensión de rotura para las aplicaciones de
plataforma/andamiaje es aproximadamente de 15 a 60 por ciento
superior a la de las aplicaciones de placa multipocillo. Las
tensiones de rotura se pueden medir mediante técnicas estándar
conocidas en la técnica.
La presente invención incluye un procedimiento
para producir placas y plataformas multipocillo basadas en
cicloolefina. Se pueden utilizar una variedad de procedimientos
incluyendo la soldadura en caliente, el moldeo por inserción, el
moldeo por inyección y otros procedimientos descritos en la presente
memoria y conocidos en la técnica. Un procedimiento comprende la
soldadura en caliente a una plataforma de polímero de una capa con
baja fluorescencia y elevada transmitancia, que comprende un
copolímero de cicloolefina. Los procedimientos utilizan típicamente
un copolímero de cicloolefina seleccionado de entre el grupo
constituido por copolímero de ciclopenteno y polietileno,
copolímero de ciclohexano y polietileno, y copolímero de
ciclohepteno y polietileno. El procedimiento puede de forma
alternativa, u opcionalmente, comprender la etapa que consiste en
exponer la capa y el polímero a una cantidad suficiente de energía
de radiofrecuencia para promover el calentamiento interno de la
capa y el polímero, o la soldadura ultrasónica.
De forma alternativa, el procedimiento puede
llevar consigo el calentamiento de la capa y el polímero que forma
los pocillos hasta aproximadamente 320ºC durante una cantidad
suficiente de tiempo para que permita la fusión de los polímeros.
La presión se puede aplicar para aumentar el procedimiento de
soldadura (por ejemplo, aproximadamente 6,89-68,9
bar (100 y 1.000 psi) de presión a la capa y el polímero para
procedimientos de baja presión utilizando soluciones de monómero de
baja viscosidad y aproximadamente 689-1.724 bar
(10.000 a 25.000 psi) para procedimientos de elevada presión tales
como el moldeo por inserción).
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona un procedimiento para la producción de las
placas multipocillo mediante moldeo por inyección o moldeo por
inserción. Se pueden aplicar las técnicas de moldeo por inyección
conocidas en la técnica o desarrolladas en el futuro. El
procedimiento comprende el moldeo por inserción por lo menos de un
pocillo en un fondo del pocillo de la placa multipocillo, en la que
el fondo es un copolímero de cicloolefina. Utilizando este
procedimiento las películas de cicloolefina se pueden fundir
básicamente por calor para sostener la estructura (por ejemplo, las
paredes del pocillo) para producir una placa. El pocillo o placa
enteras se pueden producir asimismo a partir de una cicloolefina. El
moldeo por inserción se puede llevar a cabo entre aproximadamente
195 y 350ºC grados, preferentemente las resinas se calientan desde
260º hasta 320ºC. Las presiones utilizadas son típicamente entre
689-1.724 bar (10.000 y 25.000 psi) y
preferentemente aproximadamente entre 1.034-1.517
bar (15.000 a 22.000 psi).
Se han descrito procedimientos para la
preparación de cicloolefinas y sus polímeros. Los procedimientos y
cicloolefinas más antiguos se describieron en las patentes US nº
4.002.815; nº 4.069.376; nº 4.110.528; nº 4.262.103 y nº 4.380.617
(por Robert J. Minchak y colaboradores). Se puede utilizar un número
de catalizadores en la producción de cicloolefinas tal como se
conoce en la técnica o los desarrollados en un futuro y se pueden
utilizar para la producción de materiales para diversas formas de
realización de la presente invención. Tales catalizadores incluyen
los descritos en las patentes US nº 5.278.238 (Lee et al) y
5.278.214 (Moriya et al). A pesar del tipo exacto del
sistema de catalizador utilizado, los monómeros de cicloolefina se
pueden polimerizar en presencia de un catalizador y los copolímeros
funcionales basados en etileno para producir formas de realización
de la presente invención adecuadas para el moldeo por inyección. La
polimerización puede llevarse a cabo preferentemente en masa. La
polimerización en masa incluye el moldeo por inyección de reacción
(RIM), moldeo por inyección líquida (LIM), moldeo por inyección de
reacción reforzada RRIM, y moldeo por transferencia de resina (RTM)
y combinaciones de las mismas son conocidas en la técnica además de
las desarrolladas en el futuro. La polimerización en masa es una
polimerización que se lleva a cabo en ausencia de un disolvente o
diluyente. El moldeo por inyección de reacción es un tipo de
polimerización en masa en la que un monómero en estado líquido se
transfiere o se inyecta en un molde en el que tiene lugar la
polimerización del monómero en presencia de un sistema de
catalizador. RIM no es un moldeo por inyección convencional para
polímeros fundidos y se distingue fácilmente de los mismos.
RIM es una mezcla e inyección de dos o más
componentes líquidos a baja presión, en una etapa o en una sola
vez, en un molde cerrado en el que ocurre la polimerización rápida
resultando en un producto plástico moldeado. RIM se diferencia de
un moldeo por inyección convencional en un número de aspectos
importantes. El moldeo por inyección convencional se lleva a cabo a
presiones de aproximadamente 689-1.379 bar (10.000 a
20.000 psi) en la cavidad de molde fundiendo una resina sólida y
transportándola a un molde mantenido a una temperatura inferior a
la temperatura de fusión de la resina. A una temperatura de
inyección de aproximadamente 150º a 350ºC, la viscosidad de la
resina fundida en un procedimiento de moldeo por inyección
convencional está por lo general en el intervalo de 50.000 a
1.000.000 y típicamente es aproximadamente 200.000 cps. En el
procedimiento de moldeo por inyección, la solidificación de la
resina ocurre en aproximadamente 10 a 90 segundos, dependiendo del
tamaño del producto moldeado, y a continuación, el producto moldeado
se extrae del molde. No ocurre reacción química en un procedimiento
de inyección por moldeo convencional cuando la resina se introduce
en un molde.
En un procedimiento RIM, la viscosidad de los
materiales alimentados a una cámara de mezcla es de aproximadamente
1 a 10.000 cps, preferentemente de 1 a aproximadamente 1.500 cps, a
temperaturas de inyección que varían de entre temperatura ambiente
a aproximadamente 100ºC, para los diferentes sistemas de monómero de
cicloolefinas. Las temperaturas de moldeo en un procedimiento RIM
están en el intervalo de aproximadamente 50ºC a 150ºC y las
presiones en el molde están por lo general en el intervalo de
aproximadamente 3,45-10,3 bar (50 a 150 psi). Por
lo menos un componente en la formulación RIM es un monómero que se
polimeriza a polímero en el molde. La principal distinción entre
moldeo por inyección convencional y RIM reside en el hecho de que en
RIM, se inicia una reacción química en el mezclado, con
calentamiento opcional, y se completa en el molde para transformar
monómeros a un estado polimérico. Para objetivos prácticos, la
reacción química debe tener lugar rápidamente en menos de
aproximadamente 2 minutos. El moldeo por inyección convencional se
puede utilizar asimismo para llevar a cabo diversas formas de
realización de la presente invención. El término moldeo por
inyección se refiere a tanto el moldeo por inyección convencional
como a otros tipos de moldeo por inyección descritos en la presente
memoria y conocidos o desarrollados en la técnica.
Un procedimiento LIM es similar a un sistema RIM
excepto que por lo general no se utiliza una fuente de choque. En
su lugar, se utiliza un mezclador simple tal como un mezclador
estático, un mezclador de agitación y similares. Además, en un
sistema LIM, el ciclo de moldeo por inyección se lleva a cabo
durante un periodo más largo de tiempo y de este modo la reacción
química puede tener lugar en un periodo de aproximadamente hasta 5 o
10 minutos.
Se pueden utilizar asimismo diversas partículas
reforzadoras, que se inyectan con la solución cuando se utiliza el
procedimiento RIM o el LIM. De una manera práctica, el procedimiento
RIM no siempre es adecuado y por lo tanto las partículas
reforzadoras se utilizan por lo general solo en un procedimiento
LIM, que es un procedimiento de moldeo por inyección de líquido
reforzado. Otra alternativa es utilizar un material que ya exista en
un molde, por ejemplo, un material de fibra de vidrio, o similar.
En consecuencia, tales sistemas se denominan RMRIM, RMLIM o RTM.
Debido a los tiempos de curado de reacción además de los tiempos de
moldeo de inyección, el sistema RMLIM se prefiere por lo general
para algunas operaciones, y para otras RMRIM y RTM.
Por lo tanto, se pueden utilizar las mezclas o
aleaciones de cicloolefinas y copolímeros adecuados en cualquiera
de los sistemas de polimerización en masa descritos anteriormente
además de las variaciones de los mismos. En cuanto a que los
sistemas anteriores son por lo general convencionales o conocidos en
la técnica además de en la literatura, no se han descrito en
detalle en la presente memoria, sino que se han descrito brevemente
con brevedad.
La patente US nº 4.426.502 de Minchak describe
la polimerización en masa (por ejemplo, RIM) de cicloolefinas
modificadas utilizando un cocatalizador modificado con un
catalizador por medio del cual la polimerización de los monómeros
de cicloolefinas se puede llevar a cabo en ausencia de un disolvente
o de un diluyente. El cocatalizador de haluro de alquilaluminio se
modifica mediante la reacción previa con un alcohol o un compuesto
que contiene hidroxilo activo para formar un haluro de
alquioxialquilaluminio o un haluro de ariloxialquilaluminio que se
utiliza a continuación en la reacción de polimerización. La reacción
previa se puede llevar a cabo utilizando oxígeno, un alcohol o un
fenol. Tal modificación del cocatalizador resulta en la disminución
del potencial reductor del catalizador.
A pesar de si se utiliza el sistema de
catalizador de metátesis de haluro o de metátesis libre de halógeno,
la velocidad de reacción se disminuye por lo general mediante la
utilización de los alcoholes descritos anteriormente. De este modo,
dependiendo de si se utiliza poco o ningún alcohol, el sistema de
catalizador de metátesis de haluro puede curar las diversas
cicloolefinas en cuestión de minutos e incluso segundos. Si se
utilizan cantidades elevadas de alcohol, la cura puede ser una
cuestión de horas e incluso días.
Es importante disminuir el poder reductor del
cocatalizador del sistema de metátesis para hacer que tales
reacciones de polimerización en masa resulten prácticas. Cuando un
monómero diluido con un cocatalizador de alquilaluminio no
modificado se mezcla con un catalizador diluido con un monómero para
polimerizar una cicloolefina, la reacción es muy rápida. En tales
sistemas, la polimerización es por lo general inaceptable porque el
polímero formado en las interfases o en las dos corrientes durante
la entremezcla evitan el mezclado total y resulta en conversiones
pobres. La modificación del cocatalizador mediante la reacción
previa con materiales que contienen hidroxilo reduce la actividad
del cocatalizador al punto en el que puede ocurrir la mezcla
adecuada de componentes líquidos y se pueden producir productos
poliméricos aceptables. Algunas veces, un monómero de cicloolefina
contendrá diversas impurezas que reducirán naturalmente la actividad
del cocatalizador. En tales casos, no es necesario añadir los
materiales que contienen hidroxilo activo para reducir la actividad
del cocatalizador. Con el cocatalizador modificado, se puede llevar
a cabo el mezclado de las cicloolefinas, y de otros componentes, a
temperaturas inferiores, tales como a temperatura ambiente, sin
iniciar inmediatamente la polimerización. El cocatalizador se puede
formular para permitir una vida útil razonable a temperatura
ambiente y la activación térmica en el molde de los componentes
líquidos mezclados. El cocatalizador se puede formular asimismo para
proporcionar sistemas RIM iniciados por mezcla.
Cuando se utiliza un procedimiento de
polimerización en masa, la mezcla de los monómeros de cicloolefina y
los copolímeros funcionales basados en etileno además del
catalizador y de cualesquiera otros aditivos opcionales del mismo
se pueden añadir al molde de polimerización en masa que posee una
temperatura buena inferior a la Tg de los polímeros de cicloolefina
polimerizados. Esto se desea especialmente ya que la reacción es
exotérmica por lo general y puede resultar en un incremento de
temperatura del molde de hasta aproximadamente 120ºC. La
temperatura del molde final es de este modo desde aproximadamente
50ºC a aproximadamente 200ºC, por lo general desde aproximadamente
50ºC a aproximadamente 150ºC y preferentemente desde aproximadamente
50ºC a aproximadamente 90ºC. Por supuesto, tales temperaturas
variarán dependiendo del tipo específico del sistema de catalizador
utilizado, del tipo específico de monómeros de cicloolefina, y
similares. Cuando se utilizan los sistemas de catalizador descritos
anteriormente en la presente memoria la mezcla del monómero de
cicloolefina y el copolímero funcional basado en etileno posee una
buena vida útil de almacenamiento que es hasta aproximadamente 24
horas. Serían deseables tiempos mayores, el sistema de catalizador
no se añade a la mezcla pero se mantiene separado. De este modo,
del punto en el tiempo de llevar a cabo la polimerización de los
monómeros de cicloolefina, el sistema de catalizador se añade a la
mezcla y se polimeriza en masa. Un procedimiento preferido de
polimerización incluye el procedimiento RIM indicado
anteriormente.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la detección de una señal, que comprende poner
en contacto una muestra con un dispositivo para mediciones
espectroscópicas, que comprende: una capa con baja fluorescencia y
elevada transmitancia, que comprende un copolímero de cicloolefina y
una plataforma para sostener la capa en la que la plataforma es
para la detección de una señal a partir de una muestra y con la
condición de que la plataforma sea una placa de microvaloración con
una huella de una placa de microvaloración de 96 pocillos estándar
que posea pocillos de microvaloración, el número de pocillos de
microvaloración no excederá 864 pocillos de microvaloración y que
detecte una señal a partir de la muestra. Preferentemente la
detección comprende la detección de epifluorescencia a partir de
debajo de la placa multipocillo o de la plataforma. La etapa de
detección puede utilizar asimismo una disposición óptica que
corresponde a la densidad y a la disposición de los pocillos en la
placa multipocillo. Se pueden utilizar diversos marcadores en los
ensayos utilizando la presente invención. A menudo se deseará
proporcionar los sitios de unión en una placa o plataforma
multipocillo para utilizarlos como parte del sistema de ensayo.
Tales marcadores se pueden unir directa o indirectamente a la
superficie del polímero. Se pueden utilizar técnicas
espectroscópicas diferentes con la presente invención, tales como
procedimientos colorimétricos, espectrofotométricos, de
luminiscencia y de fluorescencia. Se pueden utilizar procedimientos
no espectroscópicos basados en la luz tales como los procedimientos
de refracción y de reflectancia.
Se reconoce que se pueden utilizar diferentes
tipos de sistemas de monitorización de fluorescencia para la
práctica de la presente invención con sondas fluorescentes, tales
como colorantes o sustratos fluorescentes. Preferentemente, se
utilizan sistemas especializados en una selección de elevado
rendimiento, por ejemplo, placas de microvaloración de 96 pocillos
o mayores. Los procedimientos para llevar a cabo ensayos sobre
materiales fluorescentes son bien conocidos en la técnica y se
describen por ejemplo en Lakowicz, J.R., Principles of
Fluorescence Spectroscopy, Nueva York: Plenum Press (1983);
Herman, B., Resonance Energy Transfer Microscopy, en:
Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture,
Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor,
D.L. & Wang, Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), págs.
219-243; Turro, N.J., Modern Molecular
Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col,
Inc. (1978), págs. 296-361 y el Molecular Probes
Catalog (1997), OR, US.
La fluorescencia en una muestra se puede medir
utilizando un detector descrito en la presente memoria o conocido
en la técnica para placas multipocillo. En general, la radiación de
excitación, a partir de una fuente de excitación que posee una
primera longitud de onda, pasa opcionalmente a través de la óptica
de excitación. La óptica de excitación causa la radiación de
excitación para excitar la muestra. En respuesta, las sondas
fluorescentes de la muestra emiten una radiación que posee una
longitud de onda que es diferente de la longitud de onda de
excitación. La óptica de captación capta a continuación la luz
emitida de la muestra. El dispositivo puede incluir un controlador
de temperatura para mantener la muestra a una temperatura específica
mientras se explora. Según una forma de realización, una etapa de
traducción multiaxial (por ejemplo, un posicionador X, Y
especializado) mueve una placa de microvaloración que contiene una
pluralidad de muestras para colocar pocillos diferentes que se van
a exponer. Se pueden llevar a cabo mediante un ordenador digital
programado adecuadamente la etapa de traducción multiaxial, el
controlador de temperatura, la característica de autoenfoque y la
electrónica asociada con la formación de imagen y la recolección de
datos. El ordenador puede transformar asimismo los datos recogidos
durante el ensayo en otro formato para su presentación.
Preferentemente, FRET (la transferencia de
energía de resonancia por fluorescencia) se utiliza como una manera
de monitorizar sondas en una muestra (celular o bioquímica). El
grado de FRET se puede determinar por cualquier característica de
tiempo de vida espectral o de fluorescencia de la construcción
excitada, por ejemplo, por la determinación de la intensidad de la
señal de la fluorescencia del donador, la intensidad de la señal de
fluorescencia del aceptor, la proporción de las amplitudes de
fluorescencia cerca de la máxima emisión del aceptor a las
amplitudes de fluorescencia cerca de la máxima emisión del donador o
el tiempo de vida del estado excitado del donador. Por ejemplo, la
escisión del enlazador aumenta la intensidad de fluorescencia del
donador, disminuye la intensidad de la fluorescencia del aceptor,
disminuye la proporción de amplitudes de fluorescencia del aceptor
a las del donador, y aumenta el tiempo de vida de estado excitado
del donador.
Preferentemente, los cambios en la señal se
determinan como la proporción de fluorescencia a las dos longitudes
de onda de emisión diferentes, un procedimiento referido como
"relacionar". Las diferencias en la cantidad absoluta de sonda
(o sustrato), células, intensidad de excitación y turbidez y otras
absorbancias de base entre los pocillos direccionables pueden
afectar la señal de fluorescencia. Por lo tanto, la proporción de
las dos intensidades de emisión es una medición más robusta y
preferida de la actividad que la intensidad de la emisión sola.
Se puede utilizar en la presente invención un
sistema de sonda fluorescente medida en proporciones. Por ejemplo,
el sistema informador descrito en la publicación PCT WO/30540
(Tsien) posee ventajas significativas sobre informadores existentes
para el análisis de integración de genes, ya que permite una
detección sensible y el aislamiento de tanto las células vivas
única expresadas y no expresadas. Este sistema de ensayo utiliza un
sustrato fluorescente no tóxico, no polar que se carga fácilmente y
a continuación se atrapa intracelularmente. La escisión del
sustrato fluorescente por la \beta-lactamasa
proporciona un cambio de emisión fluorescente en cuanto el sustrato
se convierte en producto. Ya que la lectura de salida informadora de
la \beta-lactamasa se mide en proporciones, es
único entre los ensayos de genes informadores en los que ella
controla las variables tales como la cantidad de sustrato cargado en
los pocillos individuales. La lectura de salida intracelular,
estable, fácilmente detectada, simplifica los procedimientos de
ensayo mediante la eliminación de la necesidad de las etapas de
lavado, lo que facilita la selección con pocillos utilizado la
presente invención.
En una forma de realización la presente
invención proporciona un detector para monitorizar los eventos
espectroscópicos con las placas o plataformas multipocillo.
Preferentemente, el detector es un detector de fluorescencia y más
preferentemente del tipo que se puede utilizar para la
epifluorescencia. Para algunas formas de realización de la presente
invención, particularmente para las placas con 96, 192, 384 y 864
pocillos por placa están disponibles un número de detectores. Tales
detectores se describen en la patente US nº 5.589.351 (Harootunian),
patente US nº 5.355.215 (Schroeder) y la solicitud de patente PCT
WO 93/13423 (Akong). De forma alternativa, una placa entera se
puede "leer" utilizando un formador de imagen, tal como un
Molecular Dynamics Fluor-Imager 595. Para las
aplicaciones de plataforma de la presente invención se pueden
adaptar lectores de disco óptico convencionales como los conocidos
en la técnica relevante para el análisis espectroscópico, además de
para la medición de la luz refractada o reflejada.
El detector es capaz preferentemente de llevar a
cabo las mediciones de emisión de fluorescencia que están en el
intervalo de 400 a 800 nm. Típicamente, el detector comprende un
medio para la excitación de la fluorescencia en el intervalo de 350
a 800 nm. El detector es capaz a menudo de llevar a cabo muchos
modos de funcionamiento diferentes que facilitan los requisitos de
ensayo de descubrimiento de fármaco. Estos modos de funcionamiento
pueden incluir: longitud de onda de excitación única con detección
de longitud de onda de emisión única, longitud de onda de
excitación única, detección de longitud de onda de emisión dual,
longitud de onda de excitación dual secuencial con detección de
longitud de onda de emisión dual y la determinación de la medición
de la proporción, longitud de onda de excitación dual secuencial con
cuatro detecciones de longitud de onda de emisión y determinaciones
de la medición de la proporción, fluorescencia en tiempo resuelto
homogénea con longitud de onda de excitación única y detección de la
longitud de onda de emisión única, fluorescencia en tiempo resuelto
homogénea con longitud de onda de excitación única y detección de
longitud de onda de emisión dual y medición de la determinación de
la proporción, fluorescencia en tiempo resuelto homogénea con
longitud de onda de excitación dual secuencial y detección de la
longitud de onda de emisión dual y medición de la determinación de
proporción, longitudes de onda de excitación secuenciales duales y
detección de la longitud de onda de emisión única con medición de
la determinación de la proporción, medición de luminiscencia a una
longitud de onda única con medición de la luminiscencia a longitudes
de onda duales, medición de luminiscencia a longitudes de onda
duales con una determinación de la proporción, y emisión de
fluorescencia en tiempo resuelto (propiedades de colorante
intrínsecas con o sin un evento de enlace). El detector funciona
preferentemente en el modo de epifluorescencia en el que la
iluminación preferida es desde el fondo de la placa y la captura
preferida es asimismo desde el fondo de la placa. El detector puede
funcionar en todos los modos mencionados anteriormente con la vista
del fondo de la placa.
El modo de proporción del detector posibilita
cambios en los niveles de señal con respecto a los niveles de señal
relativos que se van a observar sin la calibración del complejo. El
modo de proporción del detector tolera diferencias en las
cantidades de los objetivos aislados, células o carga de colorante
en las células. Por lo tanto, las diferencias entre los pocillos
pueden existir para las células y los niveles de colorantes, pero
dentro de un pocillo único, estas diferencias se pueden normalizar a
un cambio relativo en las intensidades. Sin la detección de la
medición de las proporciones, los niveles de señal absolutos pueden
oscurecer los ligeros cambios dentro de cada pocillo.
La selección de diferentes modos de
funcionamiento del detector se basa a menudo en el tipo de ensayo
que se va a llevar a cabo. De este modo, el detector se diseña por
lo general con numerosos modos de funcionamiento para proporcionar
la flexibilidad en la detección. Cada modo se selecciona basándose
en su compatibilidad con un conjunto particular de sondas y
reactivos fluorescentes. La detección se hace a medida a
continuación para satisfacer los requisitos de ensayo y de la
sonda.
La presente invención proporciona asimismo un
sistema para las mediciones espectroscópicas. El sistema comprende
reactivos para 1) un ensayo, 2) un dispositivo, que comprende una
capa con baja fluorescencia y elevada transmitancia, que comprende
un copolímero de cicloolefina y una plataforma para sostener la
capa. El sistema puede comprender además un detector.
Para investigar las propiedades de fluorescencia
de películas seleccionadas diferentes, se ensayaron con emisión de
fluorescencia a unas longitudes de onda de excitación determinadas
previamente diferentes películas poliméricas y se compararon con
los dos tipos de láminas de vidrio de sílice fundida (estándar).
Estos experimentos se llevaron a cabo utilizando un fluorímetro
SPEX Fluorolog 111 con longitudes de onda de excitación entre 315 y
425 nm. Las películas y los materiales de vidrio se dispusieron en
un soporte. La muestra se colocó con el haz de excitación
perpendicular a la cara de la muestra. La emisión de fluorescencia
de la muestra se capturó en un ángulo de aproximadamente 12,5
grados. La emisión de fluorescencia del material se reflejó en un
espejo y sobre un monocrómetro. La radiación de emisión se
seleccionó mediante una rejilla de difracción monocromática y se
detectó mediante un tubo fotomultiplicador del instrumento. El
fluorímetro SPEX Fluorolog 111 utiliza líneas de radiación Raman de
agua para calibrar y corregir la línea de base de las mediciones del
instrumento del día a día. Esta corrección de la línea de base se
llevó a cabo cada día antes de la utilización del instrumento para
la calibración. El archivo de la calibración se almacena con las
mediciones realizadas ese día y a continuación las mediciones
posteriores con el instrumento SPEX se pueden comparar directamente
y corregir para la fluctuación del instrumento.
Los materiales ensayados fueron 1) láminas de
sílice fundida (cubreobjeto nº 1 Corning Glass Works (número de
catálogo 2935/583331), 2) películas de poliestireno (ps1, ps2 (de
Plastic Suppliers) y ps3 (de Dow Chemical Company), 3) películas de
policarbonato (pc1 (de General Electric Corporation) y pc2 (de
Plastic Suppliers); 4) polímeros de alquilo, no aromáticos (nap;
obtenido de Mobil Oil Company), 5) película de copolímero de
cicloolefina (coc; obtenida de Hoechst, Topas) y 6) Aclar (un
material fluorocarbonado de Allied Signal).
La tabla 2 muestra los datos de emisión
normalizada de fluorescencia durante 400 a 650 nm a tres longitudes
de onda de excitación diferentes. Los datos se normalizan a sílice
fundida y para corregir la fluctuación de la instrumentación. El
poliestireno, que a menudo se utiliza como un componente de placas
multipocillo (ver tabla 1), generó elevados niveles de
fluorescencia de base, consecuentes con su estructura aromática.
Sorprendentemente, el policarbonato, que a menudo es un polímero
compatible, fue generalmente mejor que el poliestireno,
especialmente a longitudes de onda superiores. Sorprendentemente, el
polímero alquilo, no aromático, fue por lo general el segundo mejor
polímero en todo el intervalo de longitudes de onda ensayadas.
Además sorprendentemente, el copolímero de cicloolefina produjo los
mejores resultados y casi se aproximó a los niveles extremadamente
bajos de fluorescencia de la sílice fundida.
Para investigar más sobre las propiedades de
fluorescencia de películas seleccionadas diferentes, se ensayaron
películas poliméricas diferentes con emisión de fluorescencia a unas
longitudes de onda de excitación determinadas previamente y se
compararon con los dos tipos de láminas de vidrio de sílice fundida
(estándar). Estos experimentos se llevaron a cabo para simular
ensayos bioquímicos o basados en células que implican un medio
acuoso. Por lo tanto, las películas se montaron sobre un soporte de
plástico horizontal para permitir la adición de una gota de medio
acuoso. Se distribuyeron tres mililitros de agua sobre la película y
se grabó la fluorescencia utilizando un microscopio de
fluorescencia invertido Zeiss. Se grabó la línea de base en ausencia
de una película y se restó de las señales en presencia de una
película.
Los materiales ensayados fueron 1) láminas de
sílice fundida (cubreobjeto número 1 Fisher (número de catálogo
Fisher 12-542B (1996)), 2) películas de poliestireno
(ps1, ps2 (de Plastic Suppliers) y ps3 (a partir de Dow Chemical
Company), 3) películas de policarbonato (pc1 (de General Electric
Corporation) y pc2 (de Plastic Suppliers); 4) polímeros alquilo, no
aromáticos (obtenidos de Mobil), 5) película de copolímero de
cicloolefina (coc; obtenida a partir de Hoechst, Topas), 6) Aclar
(un material fluorocarbonado de Allied Signal) y 7) Syran Wrap.
La tabla 3 muestra los datos de emisión
normalizada de fluorescencia a 460 nm, a 350 nm y a 405 nm
(longitudes de onda de excitación). Los datos se normalizaron a
sílice fundida. El poliestireno, que a menudo se utiliza como un
componente de placas multipocillo (ver tabla 1), generó niveles
elevados de fluorescencia de base, consecuentes con su estructura
aromática como en el ejemplo 1. A diferencia del ejemplo 1, el
policarbonato, que a menudo es un polímero biocompatible, fue peor
que el poliestireno, especialmente a longitudes de onda superiores.
Consecuente por lo general con el ejemplo 1, el polímero alquilo, no
aromático, fue mejor por lo general que el poliestireno en todo el
intervalo de longitudes de onda ensayadas. Consecuente por lo
general con el ejemplo 1, el copolímero de cicloolefina produjo los
mejores resultados y sorprendentemente mejoró los niveles de
fluorescencia extremadamente bajos de sílice fundida. La película de
Aclar produjo sorprendentemente valores de fluorescencia bajos o
extremadamente bajos relativos a la sílice fundida.
Se evaluó la citotoxicidad de la cicloolefina
incubando células en placas multipocillo de cicloolefina durante 60
horas a 37ºC. Se colocaron en placas multipocillo de cicloolefina
volúmenes de 1,8 \mul de medio que contenía aproximadamente 90
ovarios de hámster chino (CHO) utilizando una pipeta graduada. Se
colocó una tapa de vidrio sobre los pocillos para evitar la
evaporación. Las células se incubaron durante 60 horas al 5% de
CO_{2}, a 37ºC y en un incubador al 90% de HR.Las células se
ensayaron a continuación para su viabilidad mediante la carga con
el colorante vital calceína. Las células CHO se cargaron mediante
incubación en una solución que contenía calceína/AM 4 \muM
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se
inspeccionaron utilizando tanto el microscopio de contraste de fase
para determinar el número total de células como la microscopía de
fluorescencia para determinar el número de células vivas.
Aproximadamente, más del 95% de células estaban vivas según como
indicó la carga con el colorante calceína (aproximadamente 200
células/pocillo).
Para investigar las propiedades citotóxicas de
las cicloolefinas, se ensayaron películas de cicloolefinas
utilizando un ensayo de viabilidad celular. La CCF2, un colorante
vital, según se ha descrito en la publicación PCT WO96/30540
(Tsien), se difunde en las células y se captura por las células
vivas que poseen actividad de esterasa que escinde los grupos éster
sobre las moléculas lo que resulta en un molécula cargada
negativamente que se atrapa en el interior de la célula. El
colorante capturado aparece verde dentro de las células vivas. El
CCF2 se incubó con células Jurkat durante 1 hora en un pocillo de 1
microlitro que poseía paredes negras y un fondo de cicloolefina, y
se monitorizó adecuadamente la fluorescencia. Estas células Jurkat
fueron constitutivamente expresando la
\beta-lactamasa. Las células se cultivaron durante
60 horas en las condiciones del ejemplo 3. Después de 60 horas, se
midió la actividad de la \beta-lactamasa
utilizando CCF2. Las células aparecieron azules lo que indicaba que
la \beta-lactamasa era de hecho activa en estas
células, que normalmente no contienen
\beta-lactamasa. Estos resultados demuestran que
se pueden utilizar las cicloolefinas con ensayos de fluorescencia
sensibles porque las películas proporcionan fondos de baja
fluorescencia. Esto es particularmente beneficioso porque permite
volúmenes de ensayo más pequeños (por ejemplo, 2 microlitros o
menos) y la medición de señales más pequeñas (por ejemplo, a partir
de pocas células o de un número menor de objetivos bioquímicos
aislados).
Todas la publicaciones, incluyendo los
documentos de patentes y los artículos científicos, a los que se
hace referencia en la presente solicitud, se incorporan como
referencia en su totalidad para todos los objetivos en la misma
medida que si cada publicación individual se incorporara
individualmente como referencia.
Todos los títulos son para conveniencia del
lector y no se deberían utilizar para limitar el significado del
texto que sigue al título, a menos que se especifique así.
Claims (38)
1. Dispositivo para mediciones espectroscópicas,
que comprende:
una plataforma; y
una capa de polímero con baja fluorescencia y
elevada transmitancia, depositada separadamente sobre dicha
plataforma,
en el que dicha capa de polímero produce
aproximadamente 400 por ciento o menos de fluorescencia comparada
con la sílice fundida de aproximadamente 150 micrómetros de espesor
a unas longitudes de onda de excitación de entre 300 a 400 nm y a
unas longitudes de onda de emisión de entre aproximadamente 300 a
800 nm, y en el que dicha capa de polímero comprende un polímero
basado en una cicloolefina.
2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que dicha plataforma es una placa de microvaloración con una huella
de una placa de microvaloración de 96 pocillos estándar y que
presenta pocillos de microvaloración.
3. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que dicha plataforma es una placa multipocillo para la detección de
una señal a partir de una muestra y dicha capa forma por lo menos
una porción de una superficie del fondo de un pocillo de dicha
placa multipocillo.
4. Dispositivo según la reivindicación 3, en el
que dicha placa multipocillo presenta entre aproximadamente 96 y
aproximadamente 3.456 pocillos.
5. Dispositivo según la reivindicación 4, en el
que dicha placa multipocillo comprende paredes del pocillo
realizadas en un material distinto al polímero de cicloolefina.
6. Dispositivo según la reivindicación 5, en el
que dicha capa comprende una soldadura por fusión con calor con
dichos pocillos.
7. Dispositivo según la reivindicación 6, en el
que dicha capa presenta un espesor de aproximadamente 50 a 300
micrómetros de espesor.
8. Dispositivo según la reivindicación 6, en el
que dicha capa produce aproximadamente 200 por ciento o menos de la
fluorescencia comparada con el vidrio de sílice fundida de 100
micrómetros de espesor a las longitudes de onda de excitación de
entre aproximadamente 300 a 400 nm y a unas longitudes de onda de
emisión de entre aproximadamente 300 a 800 nm.
9. Dispositivo según la reivindicación 4, en el
que dicha placa multipocillo comprende pocillos realizados en un
copolímero de cicloolefina.
10. Dispositivo según la reivindicación 9, en el
que dicha capa comprende una soldadura por fusión con calor con
dichos pocillos.
11. Dispositivo según la reivindicación 9, en el
que dicha capa presenta un espesor de aproximadamente 50 a 200
micrómetros de espesor.
12. Dispositivo según la reivindicación 9, en el
que dicha capa produce aproximadamente 200 por ciento o menos de la
fluorescencia comparada con el vidrio de sílice fundida de 100
micrómetros de espesor a unas longitudes de onda de excitación de
entre aproximadamente 300 a 400 nm y a unas longitudes de onda de
emisión de entre aproximadamente 300 a 800 nm.
13. Dispositivo según la reivindicación 4, en el
que dicha capa presenta un espesor de aproximadamente 20 a 300
micrómetros de espesor.
14. Dispositivo según la reivindicación 13, en
el que dicha placa multipocillo comprende además un pigmento para
la reducción de fondo.
15. Dispositivo según la reivindicación 13, en
el que dicha capa comprende además un miembro de un par de
enlace.
16. Dispositivo según la reivindicación 13, en
el que dicha capa comprende además una pluralidad de células
vivas.
17. Dispositivo según la reivindicación 15, en
el que dicha capa comprende además un revestimiento para aumentar
la unión de las células.
\newpage
18. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que dicha plataforma es un andamiaje para una matriz de sitios de
ensayo determinados previamente espacialmente sobre dicha capa y
dicho andamiaje no interfiere sustancialmente con la detección de
una señal de dichos sitios de ensayo.
19. Dispositivo según la reivindicación 18, en
el que dicha capa presenta un espesor de aproximadamente 40 a 300
micrómetros de espesor.
20. Dispositivo según la reivindicación 19, en
el que dichos sitios de ensayo son de aproximadamente 10 micrómetros
cuadrados a 200 micrómetros cuadrados de área.
21. Dispositivo según la reivindicación 19, en
el que dicha capa se derivatiza para la unión de entidades
químicas.
22. Dispositivo según la reivindicación 20, en
el que dichos sitios de ensayo están impresos sobre dicha capa.
23. Dispositivo según la reivindicación 20, en
el que dichos sitios de ensayo comprenden un miembro de un par de
enlace.
24. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que dicha plataforma comprende un copolímero de cicloolefina.
25. Procedimiento para producir un dispositivo
para mediciones espectroscópicas según la reivindicación 1, que
comprende: depositar separadamente una capa de polímero con baja
fluorescencia y elevada transmitancia sobre una plataforma de
polímero, en el que dicha capa de polímero comprende un polímero
basado en cicloolefina.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que dicha plataforma es una placa de microvaloración con una
huella de una placa de microvaloración de 96 pocillos estándar que
presenta pocillos de microvaloración.
27. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que dicho polímero se selecciona de entre el grupo de copolímero
de polietileno ciclopenteno, copolímero de polietileno y ciclohexano
y copolímero de polietileno y ciclo-
hepteno.
hepteno.
28. Procedimiento según la reivindicación 25,
que comprende además la etapa que consiste en exponer dicha capa y
dicho polímero a una cantidad suficiente de energía de
radiofrecuencia para promover el calentamiento interno de dicha
capa y de dicho polímero.
29. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que dicho depósito comprende soldaduras por calor de dicha capa
de polímero a dicha plataforma de polímero a una temperatura de 320
grados.
30. Procedimiento según la reivindicación 25,
que comprende además la etapa que consiste en aplicar entre
aproximadamente 1.034 y 1.517 bar (15.0000 y 22.000 psi) de presión
a dicha capa y a dicho polímero.
31. Sistema para mediciones espectroscópicas,
que comprende:
unos reactivos para un ensayo, y
un dispositivo según la reivindicación 1
en el que dicha plataforma es para la detección
de una señal a partir de una muestra.
32. Sistema según la reivindicación 31, en el
que dicha plataforma presenta una huella de una placa de
microvaloración de 96 pocillos estándar que presenta pocillos de
microvaloración.
33. Sistema según la reivindicación 31, que
comprende además un detector.
34. Procedimiento para la detección de una
señal, que comprende:
poner en contacto una muestra con el dispositivo
según la reivindicación 1
en el que dicha plataforma es para la detección
de una señal a partir de dicha muestra, y
detectar una señal a partir de dicha
muestra.
35. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que dicha plataforma es una placa de microvaloración con una
huella de una placa de microvaloración de 96 pocillos estándar que
presenta pocillos de microvaloración.
36. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que dicha detección comprende detectar la epifluorescencia de
debajo de dicha plataforma.
\newpage
37. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que dicha plataforma es una placa multipocillo y dicho detector
comprende la detección con una disposición óptica que corresponde a
la densidad de pocillos en dicha placa multipocillo.
38. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que dicha capa de polímero produce de aproximadamente 100 a 50 por
ciento o menos de la fluorescencia comparada con la sílice fundida
de aproximadamente 150 micrómetros de espesor.
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