JP3654894B2 - 生体関連物質固定化ゲル及び該ゲルを利用したマイクロアレイ - Google Patents
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Description
本発明は、生体関連物質固定化ゲル及びそれを用いた生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイに関する。該マイクロアレイは、遺伝子発現解析等に使用される。
背景技術
現在、ヒトゲノムの解読が進み、様々な疾病や体質と特定の遺伝子配列との因果関係が明らかにされつつある。このような遺伝子分析により、例えば、発病の予測、薬剤に対する副作用の予測等を行うことが考えられている。
遺伝子の分析手段としては、ゲルを媒体とした電気泳動法が古くから使用されている。近年では、微量の生物試料を短い時間で分離分析することを目的としたキャピラリーゲル電気泳動法が開発されている。キャピラリーゲル電気泳動では、アクリルアミド等のハイドロゲルが充填されたガラス製キャピラリーが使用されている。
また、多数の遺伝子の変異及び発現量を一括して検出できる有用なツールとしてDNA、蛋白質等のキャプチャープローブ(検出の目的とするDNAや蛋白質とハイブリダイズ又は結合することにより、相手のDNA又は蛋白質等を捕捉することができるプローブ)が複数、保持されたマイクロアレイが利用されている。そして、前記マイクロアレイには、ゲルを利用した各種形態のマイクロアレイが多数知られている。その内、キャプチャープローブの固定にゲルを利用したマイクロアレイとしては、例えば樹脂板等の基盤に複数の溝又は穴が形成され、該溝又は穴の内部にDNAを含むゲルが充填されたもの(特開2000-60554号公報参照)、平面基盤上にDNA等を含むゲルのスポットが配置されたもの(USP 5,770,721号公報参照)等が知られている。また、本発明者らの一部も中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲルを保持した中空繊維配列体を作製し、該配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより得られるマイクロアレイを開発し、出願している(特開2000-270877号、特開2000-270878号、特開2000-270879号公報参照)。
キャプチャープローブが固定されたマイクロアレイは、検体と共にハイブリダイゼーション操作を行うことにより、特定塩基配列の検出に用いられる。ハイブリッドの検出には、ハイブリッドを特異的に認識できることができる公知の手段、例えば蛍光検出により行われる。
しかし、ハイブリダイゼーション後、キャプチャープローブが固定された各区画の蛍光強度を測定すると、区画の外周部での蛍光強度が高く、区画の中央部の蛍光強度が低くなるという問題があった。
発明の開示
本発明は、マイクロアレイのハイブリダイゼーション反応後の検出において、区画内での蛍光強度の分布が均一であり、且つ各区画内の全体での蛍光強度の総和がより高い値、即ち高いハイブリダイゼーション効率を得られるゲル組成を得ることを目的とする。
本発明者らは上記問題を解決するために鋭意検討した結果、以下の性質を満たすゲルにキャプチャープローブを固定化することにより、区画内での蛍光強度の分布が均一となり、且つ区画の蛍光強度が高くなる、即ち高いハイブリダイゼーション効率が得られることを見出し本発明に至った。
すなわち、本発明は、N,N-ジメチルアクリルアミドを2〜7質量%含むゲルに生体関連物質が固定された生体関連物質固定化ゲルである。また、本発明は、以下の組成を含むゲルに生体関連物質が固定された生体関連物質固定化ゲルである。
(a) N,N-ジメチルアクリルアミド 2〜7質量%
(b) 架橋剤 0.1〜1.5質量%
上記生体関連物質固定化ゲルにおいて、生体関連物質としては、例えば核酸が挙げられる。また、架橋剤としては、少なくとも2つのエチレン性不飽和結合を持つ多官能単量体、例えばメチレンビスアクリルアミドを例示することができる。
さらに、本発明は、N,N-ジメチルアクリルアミドを2〜7質量%含むゲルに生体関連物質を固定することを特徴とする、生体関連物質固定化ゲルの製造方法である。本発明においては、ゲルは、N,N-ジメチルアクリルアミド2〜7質量%を架橋剤0.1〜1.5質量%の存在下で反応させて得ることが好ましい。
さらに、本発明は、前記生体関連物質固定化ゲルが、中空管状体の中空部に充填されているゲル充填中空管状体である。中空管状体としては、例えば中空繊維が挙げられる。
さらに、本発明は、前記ゲル充填中空管状体を複数本集束し、該集束物を管状体の長手方向に交差する方向に切断することを特徴とする生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイの製造方法である。
さらに、本発明は、以下の工程を含む生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイの製造方法である。
(a)中空管状体を複数本集束する工程。
(b)得られた集束物の各管状体の中空部に前記生体関連物質固定化ゲルを充填する工程。
(c)集束物を管状体の長手方向に交差する方向に切断する工程。
さらに、本発明は、前記生体関連物質固定化ゲルが、複数の区画に配置された生体関連物質同定化ゲルマイクロアレイである。ここで、各区画の表面積は10-6m2以下であることが好ましい。また、生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイは、区画が溝又は貫通孔により形成されているものを使用することができる。
さらに、本発明は、前記ゲル充填中空管状体(例えば中空繊維)を複数本集束させた集束物を、中空管状体の長手方向に交差する方向に切断して得られる生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイである。
さらに、本発明は、検体を前記マイクロアレイと反応させ、検体中の測定対象(例えばDNAなどの核酸)を検出することを特徴とする測定対象の検出方法である。ここで、検出の測定対象がDNAである場合は、その長さが100塩基以下であることが好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体関連物質を固定化したゲル(生体関連物質固定化ゲル)であって、当該ゲルが、N,N-ジメチルアクリルアミド(2〜7質量%)の組成を含むものである。
本発明において、「生体関連物質」とは、キャプチャープローブとして使用しうる生物学的材料を意味し、例えばデオキシリボ核酸(DNA)や、リボ核酸(RNA)、蛋白質、脂質等が挙げられる。これら生体関連物質は、市販品又は生細胞等から得ることができる。
例えば、生細胞からのDNAの抽出は、Blinらの方法〔Nucleic.Acids.Res.3.2303(1976)〕等により、また、RNAの抽出は、Favaloroらの方法〔Methods.Enzymol.65.718(1980)〕等により実施することができる。
また、DNAとしては、鎖状若しくは管状のプラスミドDNA又は染色体DNAが用いられる。さらには、制限酵素若しくは化学的に切断したDNA断片、試験管内で酵素等により合成されたDNA又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
上記の方法等により調製された生体関連物質は、ゲル状物(以下、ゲル)に固定される。ここで「固定」とは、ゲル中に生体関連物質を保持させることを意味する。
当該ゲルの組成としては、N,N-ジメチルアクリルアミドをゲルの質量に対して2〜7質量%含むものであるが、以下の組成が好ましい。
(a) N,N-ジメチルアクリルアミド 2〜7質量%
(b) 架橋剤 0.1〜1.5質量%
さらにはN,N-ジメチルアクリルアミドは、下限値2.5〜5.0質量%であることが好ましい。
架橋剤は、エチレン性不飽和結合を少なくとも2個以上持つ多官能性単量体が好ましく、その量は、ゲル質量に対し0.1〜1.5質量%が好ましく、0.3〜0.7質量%がより好ましい。架橋剤は、上記多官能性単量体であれば特に限定されるものではなく、例えばメチレンビスアクリルアミド、ジビニルベンゼン、ポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
ゲルの作製方法は、N,N-ジメチルアクリルアミドと架橋剤とを水性媒体中で混合し、共重合する方法、あるいはN,N-ジメチルアクリルアミドを重合しプレポリマーとした後、架橋剤を混合し共重合する方法等が例示できる。
上述のゲルに生体関連物質を固定する方法としては、重合反応の際、末端にビニル基を導入した生体関連物質を加え、ゲルの構成成分と共重合させる方法(WO02/62817号公報参照)、ヒドラジン処理したゲルを準備し、アミノ基を有する生体関連物質を反応させる方法(特表平6-507486号公報参照)等が例示できる。
本発明において作製された生体関連物質固定化ゲルの透水率は、1.0×10-5m3・m・/m2/hr/MPa以上が好ましい。該ゲルの透水率は、ゲルを透過する水の透過量から計算する。透水実験は以下の方法で測定した値と定義する。
厚さ1mm、直径20mmのゲルを作製し、サポートフィルター(Millipore SMWPO4700)に重ね、濾過用ホルダー(ADVANTEC製 UHP-43K)にセットし、ホルダー内に水を満たす。次に濾過用ホルダーを窒素圧で加圧し、ろ液の出口に直径2mmのPEチューブを繋ぎ、ろ液の先端がチューブ中の一定距離(40cm)を移動するのに要する時間から透水量を見積もり、透水率を算出する。
また該ゲルの形態保持率は0.4以上が好ましい。より好ましくは0.6以上である。ゲルの形態保持率とは、以下の方法で測定した値と定義する。
直径13mm、長さ4cmの円柱状の容器に、ゲルを作製する。容器からゲルを取り出し、25℃、密閉容器内で24時間放置したゲルの高さを測定する。そして、以下の式により形態保持率を算出する。
形態保持率=24時間放置後のゲルの高さmm/13mm(初期のゲルの直径)
上記の方法により作製された生体関連物質固定化ゲルは、キャプチャープローブを保持するゲルとして、遺伝子解析のツールとして使用される。
例えば、上述のゲルを中空管状体の中空部に充填し、ゲル充填中空管状体を作製することにより、その管状体を遺伝子などの解析ツールとして使用することができる。なお、ゲルの中空部への導入は、キャピラリーゲル電気泳動に使用されるキャピラリーカラムを作製する場合と同様の方法で充填される。
また、本発明のゲルは、マイクロアレイの構成部材としても使用できる。例えば、平面基盤上に上述のキャプチャープローブが固定されたゲル(以下、固定化ゲル)を配置することにより、平面基盤上の複数の区画に固定化ゲルが配置されたマイクロアレイを製造することができる(特表平6-507486号、USP 5,770,721号公報参照)。平面基盤としては、複数の溝又は貫通孔を有するものを使用することもできる。その場合、溝又は貫通孔によって形成された区画に、重合前又は重合開始直後の生体関連物質を含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施させ、架橋することにより、基盤上に生体関連物質固定化ゲルを配置させたマイクロアレイ(生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイ)を作製することできる(特開2000-60554号公報参照)。
各区画に保持される生体関連物質の種類は、区画毎に異なっていてもよい。また、同一種類の固定化ゲルを複数個、グループ化してマイクロアレイ上に配置しても良い。また、生体関連物質のかわりに、例えば色素が固定されたゲルを区画に保持することにより、区画の座標を決定することができる。
各区画の表面積は、通常、10-6m2以下である。下限は生体関連物質の検出が可能能である限り特に制限されるものではない。
本発明において、中空管状体は、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等が例示できる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。本発明において用いることができる繊維としては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる(特開2000-270878号公報)。合成繊維の代表例としては、ナイロン6、ナイロン66、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系繊維、ポリメチルメタクリレートなどの(メタ)アクリル系樹脂を用いた繊維等が挙げられる。
半合成繊維の代表例としては、ジアセテート、トリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系誘導体系各種繊維、プロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維などが挙げられる。再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、あるいは有機溶剤法により得られるセルロース系の各種再生繊維(レーヨン、キュプラ、ポリノジック等)などが挙げられる。
無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、炭素繊維などが挙げられる。天然繊維の代表例としては、綿、亜麻、苧麻、黄麻などの植物繊維、羊毛、絹などの動物繊維、石綿などの鉱物繊維などが挙げられる。
天然繊維以外の中空繊維は、特殊なノズルを用いて公知の方法で製造することができる。ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィン等は溶融紡糸法が好ましく、ノズルとしては馬蹄型やC型ノズル、2重管ノズルなどを使用することができる。
溶融紡糸ができない合成高分子、半合成繊維又は再生繊維に用いられる高分子の紡糸は溶剤紡糸が好ましく用いられる。この場合も、溶融紡糸と同じく2重管ノズルを用いて、中空部に芯材として適切な液体を充填しながら紡糸することにより連続した中空部を有する中空繊維を得る。
上記の通り調製された中空管状体は、本発明の生体関連物質固定化ゲルを保持する基本単位とすることができる。中空管状体を使用する場合、例えば、上記の中空管状体を複数本集束し、該集束物の各中空管状体の中空部に生体関連物質固定化ゲルを充填し、管状体の長手方向に対して交差する方向に集束物を輪切りする要領で切断することにより、マイクロアレイ(生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイ)を作製することができる(WO 00/53736号公報参照)。なお、本発明においては、個々の中空管状体にゲルを充填させた後に集束しても良い。
この際、中空管状体を規則的に配列させて接着剤等で固定することにより、例えば縦横に中空管状体が規則的に配列した配列体を得ることができる。「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれる中空管状体の本数が一定となるように、集束物を順序よく配列させることをいう。
配列体の作製は、例えば以下の通り行う。すなわち、規則的に孔を形成する多孔板を2枚用意して、一方の多孔板の孔の位置と他方の多孔板の孔の位置とが対応するように両方の孔に中空管状体を通す。次に、当該多孔板同士の間隔を調整する。但し、中空管状体を孔に通す作業と多孔板同士の間隔を調整する作業の順序は逆でもよい。そして、中空管状体に張力を与え、張力を与えた状態で中空管状体間(管状体集束物の隙間)に樹脂を充填して集束した管状体を固定し、配列体を得る(特開2001-239594号公報)。
配列体の断面形状は特に限定されるものではなく、例えば、中空管状体を規則的に配列させることにより断面を正方形又は長方形に形成してもよく、中空管状体を同心円状に配列させて断面を円形に形成してもよい。
本発明においては、上述の配列体を長手方向(中空管状体の軸方向)と交差する方向、好ましくは長手方向に対して垂直方向に切断することにより、薄片を得る。切断方法として、例えばミクロトームを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常1〜5,000μm、好ましくは10〜2,000μmである。
得られた薄片は、生体関連物質を固定化したゲルを保持するマイクロアレイとして使用する。
マイクロアレイ中のゲルに固定されている生体関連物質は、該生体関連物質とハイブリダイズ又は結合する核酸又は蛋白質など(これらを測定対象という)のキャプチャープローブとして機能する。従って、本発明のマイクロアレイは、測定対象(核酸や蛋白質等)を検出するためのキットとして使用することができる。
検出の目的とする生体関連物質(例えばDNAなどの核酸)を含む検体を調製し、これをマイクロアレイに添加してマイクロアレイのゲルに固定されている生体関連物質と反応させる。例えば、測定対象となるDNAを蛍光標識しておいて、マイクロアレイ中のDNAとハイブリダイズさせる。その後洗浄を行って未反応のDNAを除去し、蛍光強度を検出する。蛍光強度は、任意の装置(例えば市販のDNA検出器)を用いて検出することができる。本発明の「N,N-ジメチルアクリルアミドを2〜7質量%含むゲルに生体関連物質が固定された生体関連物質固定化ゲル」は、反応性が良好であり、マイクロアレイの一区画あたりの蛍光強度が均一になる。その結果、高感度な検出結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のマイクロアレイを用いてDNAを検出した結果を示す写真である。
図2は、本発明のマイクロアレイを用いてDNAを検出した結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
<実施例1>
(1)ポリメチルメタクリレート(PMMA)製中空繊維の作製
単量体組成比がメチルメタクリレート(MMA)/メチルアクリレート(MA)=82/18からなる、質量分子量約9万のアクリル樹脂を原料として、環状吐出口を有する紡糸ノズルから押出機を使用して溶融押出を行った。その結果、外径が0.3mm、内径が0.2mm、長さが600mmの中空繊維を得た。
(2)中空繊維配列体の作製
直径0.32mmの孔を有し、孔の中心間距離が0.42mmの多孔板であって、縦横各3列に合計9個配列された厚さ0.1mmの多孔板2枚を重ね、これらの多孔板の各孔に、前記中空繊維9本を通過させた。2枚の多孔板の間隔を50mmとし、糸を張った状態で中空繊維の一方の端部から50mmの位置と100mmの位置の2ヶ所を固定した。
次に、樹脂原料を2枚の多孔板の間に流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)ニッポラン4276、コロネート4403)を使用した。またこの接着剤の総重量に対し、2.5重量%のカーボンブラックを添加したものを使用した。室温で1週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板を取り除き、中空繊維配列体を得た。
(3)末端にビニル基を有するオリゴヌクレオチド(末端ビニル化オリゴヌクレオチド)の調製
オリゴヌクレオチドの合成は、自動合成機DNA/RNA synthesizer(PEバイオシステムズ社製 model 394)を用いて行った。合成の最終ステップで5’末端にアミノ基〔NH2(CH2)6-〕を導入し、以下に示すオリゴヌクレオチドA(配列番号1)を合成した。同様にオリゴヌクレオチドB(配列番号2)を合成した(但し、5’末端にアミノ基は導入していない)。5’末端のアミノ基の導入は、アミノリンクIITM(アプライドバイオシステム社製)を使用した。
これらのオリゴヌクレオチドは、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
〔オリゴヌクレオチドA (配列番号1)〕
caaccaacca caactacata cacatac
〔オリゴヌクレオチドB (配列番号2)〕
gtcatttaga caactctgca agcgt
次に、オリゴヌクレオチドA(500nmol/ml)5μlとグリシジルメタクリレート0.5μlを混合し、70℃で2時間反応させた。反応終了後、水を加えて全量を25μlとし、100nmol/mlの末端にメタクリレート基を有するオリゴヌクレオチド(GMA変性オリゴヌクレオチド)を得た。
(4)末端ビニル基導入オリゴヌクレオチドのPCR反応
サッカロマイセス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)JCM7255をYPD培地(グルコース20g/L、酵母エキス10g/L、ポリペプトン20g/L pH6.0)100mlで30℃、1日培養を行った後、集菌した。集菌した菌体から定法により染色体DNAを調製し、PCRの鋳型に用いた。
GMA変性オリゴヌクレオチドA及びオリゴヌクレオチドBを滅菌水で、それぞれ50μM及び5μMに希釈した。前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、上述で調製した鋳型を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(以下、PCR)を行った。
PRC条件は、Ex-Taq(宝酒造)の仕様書に従い、TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONALを用いて行った。反応は100μlで行い、温度条件は93℃30秒、65℃30秒、72℃2分を30サイクル行った。PCRによって末端ビニル化核酸(キャプチャープローブA:配列番号3)が増幅された。
(5)モノマー液及び重合開始剤液の調製
表1に示す組成からなる重合液1及び重合液2を調製した。モノマー液A及び重合開始剤液は、下記のとおり調製した。
〔モノマー液 A〕
ジメチルアクリルアミド0.45g及びメチレンビスアクリルアミド0.05gをグリセリン/純水=50/50(質量比)混合溶媒に溶解し全量を10mlとした。
〔重合開始剤液〕
2,2'-アゾビス(2-イニダゾリン-2-イル)プロパン)ジヒドロクロライド1gを純水に溶解し、全量を10mlとした。
(6)薄片の製造
(2)で得られた中空繊維配列体の中央列の3本の中空繊維の中空部に重合液1を充填し、残りの中空繊維の中空部には、重合液2を充填した。重合液1及び重合液2を充填した。内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、55℃で1時間放置することにより重合反応を行った。
重合後、中空繊維配列体を、ミクロトームを用いて、中空繊維の長手方向と垂直に交差する方向で切断を繰り返した。その結果、厚さ約500μmの薄片を得た。
(7)ハイブリダイゼーション
キャプチャープローブAの塩基配列の一部(配列番号3の241〜339番目)に相補である200fmol/mlのオリゴヌクレオチドC(配列番号4)を含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。
オリゴヌクレオチドCは(3)に記載の方法と同様にDNA自動合成装置を用いて合成し、5’末端にCy5を導入した。合成終了後、一般的手法により脱保護及び調製したものを使用した。
〔オリゴヌクレオチドC(配列番号4)〕
gccaacaatg gaatgttgat tgggcccaaa ccaccttcct ttcttgggat attggtccat gccaaaaggg agtattcgga gtcagtggag gcgaaaaga
<ハイブリダイゼーション溶液組成>
5×SSC(0.75mol/L塩化ナトリウム、0.075mol/lクエン酸ナトリウム、pH7.0)
0.02% SDS(ラウリル硫酸ナトリウム)
ハイブリパックに(6)で得られた薄方及び前記ハイブリダイゼーション溶液1mlをそそぎ込み、パックの上端を熱シールした。ハイブリダイゼーションは65℃で20時間行った。
(8)洗浄
ハイブリパックから、薄片を取り出し、表2に示す条件で順に洗浄を行った。洗浄溶液の容量は10mlとした。
(9)検出
洗浄後の薄片を、無蛍光スライドガラスにのせ、数滴滅菌水を薄片上に滴下し、カバーガラスをかぶせた。スライドガラスをDNAチップ検出器(GeneTac V:Genomic Solutions社製)にセットし、Cy5用レーザーを用いて検出した。画像は1ピクセル10μmの大きさに設定した。
(10)蛍光強度の測定
区画中央部周辺80ピクセル分の蛍光強度の総和を区画の強度とし、算出した。蛍光強度及び洗浄後の中空繊維周辺の画像を図1に示した。区画の中央部は任意に決定した。その結果、ハイブリダイゼーションした区画の蛍光強度の分布は均一であった。
<比較例1>
モノマー液 Aをモノマー液 Bに変更した以外は、実施例1と同様に操作を行った。
〔モノマー液 B〕
アクリルアミド0.475g、メチレンビスアクリルアミド0.025gをグリセリン/純水=50/50(質量比)混合溶媒に溶解し、全量を10mlとした。
蛍光強度及び洗浄後の中空繊維周辺の画像を図1に示した。
ハイブリダイゼーションした中空部の蛍光強度の分布は均一であるが、蛍光強度が実施例1と比較して低下していた。
<比較例2>
モノマー液 Aをモノマー液 Cに変更した以外、実施例1と同様に操作を行った。
〔モノマー液 C〕
アクリルアミド0.76g、メチレンビスアクリルアミド0.04gをグリセリン/純水=50/50(質量比)混合溶媒に溶解し、全量を10mlとした。蛍光強度及び洗浄後の中空繊維周辺の画像を図1に示した。
蛍光強度は実施例1より低く、中空部での蛍光強度は周辺部で高く、中心部で低くなっていた。
<実施例2>
モノマー液 Aをモノマー液 D、キャプチャープローブAをキャプチャープローブB(配列番号5)に変えた以外は、実施例1と同様に操作を行い、薄片を調製した。なお、キャプチャープローブBは、5'末端にアミノ基を導入し、その後、グリシジルメタクリレートと反応させ、末端にメタクリレート基を有する構造とした。
〔モノマー液 D〕
ジメチルアクリルアミド0.27g及びメチレンビスアクリルアミド0.03gをグリセリン/純水=50/50(質量比)混合溶媒に溶解し、全量を10mlとした。
〔キャプチャープローブB(配列番号5)〕
aaatacgcct gcaggcggag atcttccagg cccgcctcaa gggctggttc gagccaatag tggaagacat
ハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の方法で行った。
(1)ハイブリダイゼーション
キャプチャープローブBの塩基配列に対する相補配列を一部(配列番号6の16〜85番目)に含む1pmol/mlのオリゴヌクレオチドE(配列番号6)を含むハイブリダイゼーション溶液を調製した。
オリゴヌクレオチドEはDNA自動合成装置を用いて合成し、5’末端にCy5を導入した。合成終了後、一般的手法により脱保護及び精製したものを使用した。
〔オリゴヌクレオチドE(配列番号6)〕
gcccactggc gatgcatgtc ttccactatt ggctcgaacc agcccttgag gcgggcctgg aagatctccg cctgcaggcg tatttgctgg gtctgttcc
〔ハイブリダイゼーション溶液組成〕
6×SSC(0.75mol/L塩化ナトリウム、0.075mol/lクエン酸ナトリウム、pH7.0)、
0.02% SDS(ラウリル硫酸ナトリウム)
ハイブリパックに得られた薄片及び前記ハイブリダイゼーション溶液1mlをそそぎ込み、パックの上端を熱シールした。ハイブリダイゼーションは37℃で16時間行った。
(2)洗浄
ハイブリパックから、薄片を取り出し、表3に示す条件で順に洗浄を行った。洗浄温度は45℃とした。洗浄溶液の容量は10mlとした。
(3)検出
洗浄後の薄片を、無蛍光スライドガラスにのせ、数滴滅菌水を薄片上に滴下し、カバーガラスをかぶせた。スライドガラスを、DNAチップ検出器(GeneTac IV:Genomic Solutions社製)にセットし、Cy5用レーザーを用いて検出した。画像は1ピクセル10μmの大きさに設定した。
(4)蛍光強度の測定
区画中央部周辺の200ピクセル分の、蛍光強度の平均値を区画強度とし、算出した。
蛍光強度及び洗浄後の中空繊維周辺の画像を図2に示した。区画の中央部は任意に決定した。その結果、ハイブリダイゼーションした区画の蛍光強度の分布は均一であった。
<実施例3>
モノマー液Dをモノマー液 Aに変えた以外は、実施例2と同様に操作を行った。区画の蛍光強度及び洗浄後の中空繊維周辺の画像を図2に示した。区画の中央部は任意に決定した。その結果、ハイブリダイゼーションした区画の蛍光強度の分布は均一であった。
<比較例3>
モノマー液Aをモノマー液Eに変更した以外は実施例2と同様に操作を行った。
〔モノマー液 E〕
N,N-ジメチルアクリルアミド0.72g、メチレンビスアクリルアミド0.08gをグリセリン/純水=50/50(質量比)混合溶媒に溶解し、全量を10mlとした。
蛍光強度及び洗浄後の中空繊維周辺の画像を図2に示した。蛍光強度は実施例2より低く、中空部での蛍光強度は周辺部で高く、中心部で低くなっていた。
<比較例4>
モノマー液 Aをモノマー液 Fに変更した以外は実施例2と同様に操作を行った。
〔モノマー液 F〕
N,N-ジメチルアクリルアミド0.18g、メチレンビスアクリルアミド0.02gをグリセリン/純水=50/50(質量比)混合溶媒に溶解し、全量を10mlとした。
薄片化したチップは、ゲルが脱落し、中空部に充填されていなかった(図2)。
産業上の利用可能性
本発明により、生体関連物質が固定されたゲルが提供される。本発明のゲルを使用することにより、区画内の蛍光強度が均一で、より高いハイブリダイゼーション効率が得られるため、DNAなどの遺伝子検出に有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号1:合成DNA
配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA
配列番号4:合成DNA
配列番号5:合成DNA
配列番号6:合成DNA
【配列表】
Claims (5)
- N,N-ジメチルアクリルアミドを2〜7質量%含むゲルに生体関連物質が固定された生体関連物質固定化ゲル。
- 請求項1記載の生体関連物質固定化ゲルが、中空管状体の中空部に充填されているゲル充填中空管状体。
- 請求項1記載の生体関連物質固定化ゲルが、複数の区画に配置された生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイ。
- 以下の工程を含む生体関連物質固定化ゲルマイクロアレイの製造方法。
(1)中空管状体を複数本集束する工程。
(2)得られた集束物の各管状体の中空部に請求項1記載の生体関連物質固定化ゲルを充填する工程。
(3)集束物を管状体の長手方向と交叉する方向で切断する工程。 - 検体を請求項3記載のマイクロアレイと反応させ、検体中の測定対象を検出することを特徴とする測定対象の検出方法。
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