CN1650164A

CN1650164A - 相关生物物质固定化凝胶以及利用该凝胶的微阵列

Info

Publication number: CN1650164A
Application number: CNA03810119XA
Authority: CN
Inventors: 长滨千秋; 伊藤千穗
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2003-04-03
Publication date: 2005-08-03
Anticipated expiration: 2023-04-03
Also published as: JPWO2003083475A1; EP1491888B1; US8802369B2; DE60323615D1; US20060084060A1; CN100334450C; US20120010088A1; US20090023601A1; ATE408451T1; KR20050008671A; AU2003236359A1; CA2481323C; EP1491888A1; EP1491888A4; JP3654894B2; KR100989196B1; CA2481323A1; IL164366A0; WO2003083475A1

Abstract

本发明提供在含有2～7质量的N，N－二甲基丙烯酰胺的凝胶中固定了相关生物物质的相关生物物质固定化凝胶。

Description

相关生物物质固定化凝胶以及利用该凝胶的微阵列

技术领域

本发明涉及相关生物物质固定化凝胶以及利用该凝胶的微阵列。该微阵列可以在基因表达解析等中使用。

背景技术

现在，随着人类基因组的破译，各种各样疾病和体质与特定的基因序列的因果关系正在被阐明。人们认为通过这样的基因分析，可以进行例如发病的预测、对药剂的副作用的预测等。

作为基因的分析手段，很早就开始使用以凝胶为介质的电泳法。近年来，开发了以在短时间内对微量的生物样品进行分离分析为目的的毛细管凝胶电泳法。在毛细管凝胶电泳中，使用填充了丙烯酰胺等水凝胶的玻璃制毛细管。

另外，作为一并可以检测多个基因的变异以及表达量的有用的工具，可以利用带有多个DNA、蛋白质等的捕捉探针(通过与检测的目的DNA或蛋白质杂交或结合，可以捕捉对方DNA或蛋白质等的探针)的微阵列。而在上述微阵列中，已经知道了许多利用凝胶的各种形态的微阵列。其中，作为在捕捉探针的固定中利用凝胶的微阵列，已知有在例如树脂板等基板中形成多个沟或穴，在该沟或穴的内部填充了含有DNA的凝胶的微阵列(参照特开2000-60554号公报)，在平面基板上配置了含有DNA等的凝胶的点的微阵列(参照USP 5,770,721号公报)。另外本发明人中的一部分还制作了在中空纤维的中空部保持含有捕捉探针的凝胶的中空纤维排列体，开发了通过在与该排列体的纤维轴交叉的方向进行切断得到的微阵列，并申请了专利(参照特开2000-270877号、特开2000-270878号、特开2000-270879号公报)。

固定了捕捉探针的微阵列通过与检体一起进行杂交操作，可以用于特定碱基序列的检测。在杂化体的检测中，可以通过能够特异识别杂化体的众所周知的手段、例如通过荧光检测进行。

然而，存在着杂交后，当对固定了捕捉探针的各区域的荧光强度进行测定时，区域的外周部的荧光强度高，而区域的中央部的荧光强度低的问题。

发明的公开

本发明的目的在于得到在微阵列的杂交反应后的检测中，可以获得在区域内的荧光强度的分布均一，而且各个区域内的总体的荧光强度的总和为更高的值，即高的杂交效率的凝胶组成。

本发明人为了解决上述问题，进行了专心研究，结果发现通过在满足以下性质的凝胶中固定捕捉探针，可以获得在区域内的荧光强度的分布均一，而且区域内的荧光强度升高，即高的杂交效率，直至完成了本发明。

即，本发明是一种在含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的凝胶中固定了相关生物物质的相关生物物质固定化凝胶。另外，本发明是在含有以下组成的凝胶中固定了相关生物物质的相关生物物质固定化凝胶。

(a)N，N-二甲基丙烯酰胺 2～7质量％

(b)交联剂 0.1～1.5质量％

在上述相关生物物质固定化凝胶中，作为相关生物物质可列举例如，核酸。而作为交联剂，可列举带有至少2个乙烯性不饱和键的多功能单体，例如，亚甲基双丙烯酰胺。

另外，本发明是一种相关生物物质固定化凝胶的制造方法，其特征是在含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺凝胶中固定相关生物物质。在本发明中，凝胶最好是在0.1～1.5质量％的交联剂存在下，使含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺反应后得到的凝胶。

另外，本发明是一种凝胶填充中空管状体，其中在中空管状体的中空部填充了上述相关生物物质固定化凝胶。作为中空管状体，可列举例如，中空纤维。

另外，本发明是一种相关生物物质固定化凝胶微阵列的制造方法，其特征是将数根上述凝胶填充中空管状体集束，在与管状体的纵向方向交叉的方向将该集束物切断。

另外，本发明是一种包括以下工序的相关生物物质固定化凝胶微阵列的制造方法。

(a)将数根中空管状体集束的工序。

(b)向得到的集束物的各个管状体的中空部填充上述相关生物物质固定化凝胶的工序。

(c)在与管状体的纵向方向交叉的方向将集束物切断的工序。

另外，本发明是一种在多个区域配置了上述相关生物物质固定化凝胶的相关生物物质固定化凝胶微阵列。其中各区域的表面积最好在10^-6m²或其以下。而相关生物物质固定化凝胶微阵列可以使用区域由沟或贯通孔形成的微阵列。

另外，本发明是一种在与中空管状体的纵向方向交叉的方向将集束了数根上述凝胶填充中空管状体(例如中空纤维)的集束物切断后得到的相关生物物质固定化凝胶微阵列。

另外，本发明是一种测定对象的检测方法，其特征是使检体与上述微阵列反应，对检体中的测定对象(例如DNA等核酸)进行检测。当检测的测定对象是DNA时，其长度优选是在100个碱基或其以下。

以下对本发明进行详细说明。

本发明是对相关生物物质进行了固定化的凝胶(相关生物物质固定化凝胶)，而该凝胶是含有N，N-二甲基丙烯酰胺(2～7质量％)组成的凝胶。

在本发明中，所谓「相关生物物质」，指的是可以作为捕捉探针使用的生物学上的材料，例如脱氧核糖核酸(DNA)，或核糖核酸(RNA)、蛋白质、脂质等。这些相关生物物质可以从市售商品或活细胞中得到。

例如，从活细胞提取DNA可以通过Blin等人的方法[Nucleic.Acids.Res.3.2303(1976)]等实施，而RNA的提取可以通过Favaloro等人的方法[Methods.Enzymol.65.718(1980)]等实施。

另外，作为DNA，可以使用链状或环状的质粒DNA或染色体DNA。而且也可以使用经限制酶或化学方法切断的DNA片段、在试管内利用酶等合成的DNA或化学合成的寡核苷酸等。

利用上述方法等制备的相关生物物质被固定在凝胶状物(以下，称为凝胶)。这里所谓「固定」指的是使相关生物物质保持在凝胶中。

作为该凝胶的组成，虽然是含有相对于凝胶质量2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的组成，但优选以下组成。

(a)N，N-二甲基丙烯酰胺 2～7质量％

(b)交联剂 0.1～1.5质量％

另外，N，N-二甲基丙烯酰胺优选其下限值是2.5～5.0质量％。

交联剂优选是带有至少2个乙烯性不饱和键的多功能性单体，其量相对于凝胶质量优选0.1～1.5质量％，更优选0.3～0.7质量％。交联剂只要是上述多功能性单体，则没有特别限制，可列举例如，亚甲基双丙烯酰胺、二乙烯基苯、聚二(甲基)丙烯酸乙二醇酯等。

凝胶的制作方法，可列举例如，在水性溶剂中将N，N-二甲基丙烯酰胺和交联剂混合，进行共聚合的方法，或对N，N-二甲基丙烯酰胺进行聚合，作为预聚合物后与交联剂混合进行共聚合的方法等。

作为在上述凝胶中固定相关生物物质的方法，可列举例如，在进行聚合反应时，加入在末端导入了乙烯基的相关生物物质，使其与凝胶的构成成分进行共聚合的方法(参照WO02/62817号公报)、准备经肼处理的凝胶，使其与含有氨基的相关生物物质反应的方法(参照特表平6-507486号公报)等。

在本发明中制作的相关生物物质固定化凝胶的透水率优选在1.0×10^{- 5}m³·m/m²/hr/Mpa或其以上。该凝胶的透水率由透过凝胶的水的透过量计算。透水实验定义为利用以下方法测定的值。

制作厚度1mm、直径20mm的凝胶，摞在支撑滤膜(MilliporeSMWP04700)上，安装在过滤用储蓄器(ADVANTEC制UHP-43K)上，储蓄器内灌满水。然后用氮压对过滤用储蓄器加压，在滤液的出口连上直径2mm的PE管，从滤液的前端移动到管中的一定距离(40cm)时需要的时间估算透水量，算出透水率。

而该凝胶的形态保持率优选在0.4或其以上。更优选在0.6或其以上。所谓凝胶的形态保持率定义为用以下方法测定的值。

在直径13mm、长4cm圆柱状的容器中制作凝胶。从容器中取出凝胶，测定在25℃下，于密闭容器内放置24小时后的凝胶的高度。然后通过以下式子算出形态保持率。

形态保持率＝24小时放置后的凝胶的高度mm/13mm(初期凝胶的直径)

通过上述方法制作的相关生物物质固定化凝胶作为保持捕捉探针的凝胶，作为基因解析的工具使用。

例如，通过将上述凝胶填充到中空管状体的中空部，做成凝胶填充中空管，可以作为基因等的解析工具使用该管状体。而凝胶向中空部的导入可以利用与制作在毛细管凝胶电泳中使用的毛细管柱时同样的方法填充。

另外，本发明的凝胶也可以作为微阵列的构成构件使用。例如，通过在平面基板上配置上述捕捉探针的凝胶(以下称为固定化凝胶)，可以制作在平面基板上的多个区域配置了固定化凝胶的微阵列(参照特表平6-507486号，USP5,770,721号公报)。作为平面基板，也可以使用具有多个沟或贯通孔的基板。此时，可以通过向由沟或贯通孔形成的区域添加含有聚合前或刚开始聚合的相关生物物质的单体溶液，在区域内实施聚合反应，进行交联，由此制作在基板上配置了相关生物物质固定化凝胶的微阵列(相关生物物质固定化凝胶微阵列)(参照特开2000-60554号公报)。

保持在各区域内的相关生物物质的种类在每个区域也可以不同。另外，也可以将同一种类的固定化凝胶多个、形成组后配置在微阵列上。另外，可以通过在区域内保持固定了代替相关生物物质的例如色素的凝胶，决定区域的座标。

各个区域的表面积通常在10^-6m²或其以下。下限只要是可检测相关生物物质，则没有特别限制。

在本发明中，中空管状体可列举例如，玻璃管、不锈钢管、中空纤维等。如果考虑到加工性、处理容易，优选使用中空纤维。作为在本发明中可以使用的纤维，可列举合成纤维、半合成纤维、再生纤维、无机纤维那样的化学纤维以及天然纤维等(特开2000-270878号公报)。作为合成纤维的代表，可列举例如使用尼龙6、尼龙66、芳香族聚酰胺等聚酰胺系的各种纤维、聚对苯二甲酸乙二(醇)酯、聚对苯二甲酸丁二(醇)酯、聚乳酸、聚二(元)醇酸等聚酯系的各种纤维、聚丙烯腈等丙烯酸系的各种纤维、聚乙烯或聚丙烯等聚烯烃系的各种纤维、聚乙烯醇系的各种纤维、聚偏氯乙烯系的各种纤维、聚氯乙烯系纤维、聚氨酯系的各种纤维、苯酚系纤维、由聚偏氟乙烯或聚四氟乙烯等构成的氟系纤维、聚亚烷基对羟基苯甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等(甲基)丙烯酸酯系树脂的纤维等。

作为半合成纤维的代表例，可列举，以二醋酸酯、三醋酸酯、甲壳质、脱乙酰壳多糖等为原料的纤维素系衍生物系的各种纤维、称为プロミツクス的蛋白质系的各种纤维等。作为再生纤维的代表例，如通过粘胶法或铜-氨法、或有机溶剂法得到的纤维素系的各种再生纤维(人造纤维、铜氨纤维、高湿模量粘胶(纤维)等)等。

作为无机纤维的代表例，可列举例如，玻璃纤维、碳纤维等。作为天然纤维的代表例，可列举例如，棉、亚麻、苧麻、黄麻等植物纤维、羊毛、丝等动物纤维、石棉等矿物纤维等。

天然纤维以外的中空纤维可以使用特殊的喷嘴通过众所周知的方法制造。聚酰胺、聚酯、聚烯烃等优选熔融纺丝法，作为喷嘴可以使用马蹄型或C型喷嘴、2重管喷嘴等。

在不能熔融纺丝的合成高分子、半合成纤维或再生纤维中使用的高分子纺丝优选使用溶剂纺丝。此时与熔融纺丝一样可以使用2重管喷嘴，作为芯材将合适的液体填充到中空部的同时，进行纺丝，由此可以得到具有连续的中空部的中空纤维。

象上述那样制备的中空管状体可以作为保持本发明的相关生物物质固定化凝胶的基本单位。使用中空管状体时，例如通过将数根上述中空管状体集束，在该集束物的各个中空管状体的中空部内填充相关生物物质固定化凝胶，在与相对于管状体的纵向方向交叉的方向将集束物切断，切的要领是切成圆片，可以制作微阵列(相关生物物质固定化凝胶微阵列)(参照WO 00/53736号公报)。而在本发明中，也可以使凝胶填充到各个中空管后进行集束。

此时，通过使中空管状体有规则地排列后，用粘接剂进行固定，可以得到例如，纵横方向中空管状体有规则地排列的排列体。所谓「有规则」指的是使集束物有序排列，使得在一定大小的框中含有的中空管状体的根数一定。

排列体的制作例如可以象以下那样进行。即，准备2块形成有规则孔的多孔板，使中空管状体穿过两块板的孔，要使一块多孔板的孔的位置与另一块多孔板的孔的位置对应。然后调整该多孔板之间的间隔。也可以将中空管状体穿过孔的作业和调整多孔板之间的间隔的作业的顺序反过来进行。然后赋予中空管状体张力，在赋予张力的状态下，将树脂填充到中空管状体间(管状体集束物的间隙)，对集束的管状体进行固定，得到排列体(特开2001-239594号公报)。

排列体的断面形状没有特别限定，例如通过使中空管状体有规则地排列使断面形成正方形或长方形都可以，也可以使中空管排列成同心圆状，使断面形成圆形。

在本发明中，通过在与纵向方向(中空管状体的轴方向)交叉的方向、优选是垂直于纵向方向切断上述排列体，得到薄片。作为切断方法，可列举例如，使用切片机从排列体切薄片的方法等。薄片的厚度可以任意调整，但通常为1～5,000μm，优选是10～2,000μm。

得到的薄片可以作为保持固定化了相关生物物质的凝胶的微阵列使用。

固定在微阵列中的凝胶上的相关生物物质可以起到作为与该相关生物物质杂交或结合的核酸或蛋白质等(这些物质称为测定对象)的捕捉探针的功能。因此，本发明的微阵列可以作为用于检测测定对象(核酸或蛋白质等)的试剂盒使用。

制备含有作为检测目的的相关生物物质(例如DNA等的核酸)的检体，将检体添加到微阵列中，使其与固定于微阵列的凝胶中的相关生物物质反应。例如，对成为测定对象的DNA预先进行荧光标识，使其与微阵列中的DNA杂交。然后进行清洗，除去未反应的DNA，对荧光强度进行检测。荧光强度可以使用任意装置(例如市售的DNA检测器)进行检测。本发明的「含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的凝胶中固定了相关生物物质的相关生物物质固定化凝胶」反应性良好，微阵列的每一区域的荧光强度均一。其结果可以获得高灵敏度的检测结果。

附图的简单说明

图1是表示使用本发明的微阵列对DNA进行检测的结果的照片。

图2是表示使用本发明的微阵列对DNA进行检测的结果的照片。

实施发明的最佳方式

通过以下实施例对本发明进行更详细地说明。但是本发明并不限定于这些实施例。

<实施例1>

(1)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制中空纤维的制作

将由单体组成比为甲基丙烯酸甲酯(MMA)/丙烯酸甲酯(MA)＝82/18构成的质量分子量约为9万的丙烯树脂作为原料，使用挤出机由具有环状吐出口的纺丝喷嘴进行熔融挤出。其结果可以得到外径为0.3mm、内径为0.2mm、长为600mm的中空纤维。

(2)中空纤维排列体的制作

将作为具有直径为0.32mm的孔，孔的中心距离为0.42mm的多孔板，纵横各3列合计9个排列的厚度为0.1mm的多孔板重叠，使上述中空纤维9根通过这两个多孔板的各个孔。2块多孔板的的间隔做成50mm，在使丝拉直的状态下，对离中空纤维的一端的50mm的位置和100mm的位置的两个地方进行固定。

然后，使树脂原料流入2块多孔板之间。作为树脂，使用聚氨酯树脂粘合剂(日本聚氨酯工业(株)ニツポラン4276、コロネ-ト4403)。而相对于该粘合剂的总重量，使用添加了2.5质量％的炭黑的粘合剂。于室温下，静置1周，使树脂固化。然后除去多孔板，得到中空纤维排列。

(3)末端含有乙烯基的寡核苷酸(末端乙烯基化寡核苷酸)的制备

寡核苷酸的合成使用自动合成仪DNA/RNA合成仪(PEBiosystems公司生产model 394)进行。在合成的最终步骤，向5’末端导入氨基[HN2(CH₂)₆-]，合成以下所示的寡核苷酸A(序列编号1)。同样合成寡核苷酸B(序列编号2)(但，5’末端不导入氨基)。5’末端氨基的导入使用氨基接头II^TM(Applied Biosystem公司生产)。

这些寡核苷酸通过一般的手法进行脱保护和纯化后使用。

[寡核苷酸A(序列编号1)]

caaccaacca caactacata cacatac

寡核苷酸B(序列编号2)]

gtactttaga caactctca agcgt

然后，将5μl的寡核苷酸A(500nmol/ml)和0.5μl甲基丙烯酸缩水甘油基酯混合，于70℃下反应2小时。反应结束后，加水将总量调到25μl，得到100nmol/ml的末端带有甲基丙烯酸酯基的寡核苷酸(GMA改性寡核苷酸A)。

(4)末端导入乙烯基的寡核苷酸的PCR反应

在100mlYPD培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取液10g/L、多胨20g/LpH6.0)于30℃下对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JCM7255培养1天后，收集菌。收集的菌体利用常规方法制备染色体DNA，用作PCR的模板。

GMA改性寡核苷酸A和寡核苷酸B用灭菌水分别稀释到50μM和5μM。使用上述寡核苷酸作为引物，使用上述制备的模板，进行聚合酶链式反应(以下称为PCR)。

PCR的条件按照Ex-Taq(宝酒造)的说明书，使用TaKaRa PCR热循环仪PERSONAL进行。反应于100μl中进行，温度条件为93℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟，共进行30循环。通过PCR，末端乙烯化核酸(捕捉探针A：序列编号3)被扩增。

(5)单体液以及聚合引发剂液的制备

制备由表1所示组成构成的聚合液1和聚合液2。单体液A和聚合引发剂液象下述那样制备。

[单体液A]

将二甲基丙烯酰胺0.45g以及亚甲基双丙烯酰胺0.05g溶解于甘油/纯水＝50/50(质量比)混合溶剂，将总量调到10ml。

[聚合引发剂液]

将2，2-偶氮双(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二盐酸盐1g溶解于纯水中，将总量调到10ml。

表1

	聚合液1	聚合液2
	聚合液1	聚合液2	单体溶液A	1000μl	1000μl
引发剂溶液	10μl	10μl	单体溶液A	1000μl	1000μl
引发剂溶液	10μl	10μl	捕捉探针A	5μl	0

(6)薄片的制造

将聚合液1填充到(2)中得到的中空纤维排列体的中央列的3根中空纤维的中空部，其余的中空纤维的中空部填充聚合液2。填充了聚合液1和聚合液2。移至内部被水蒸气饱和的密闭玻璃容器中，通过于55℃下放置1小时，进行聚合反应。

聚合后，用切片机在与中空纤维的纵向方向垂直交叉的方向反复切中空纤维排列体。结果得到厚度约为500μm的薄片。

(7)杂交

制备含有与捕捉探针A的碱基序列的一部分(序列编号3的241～339位)互补的200fmol/ml的寡核苷酸C(序列编号4)的杂交溶液。

寡核苷酸C通过与(3)所述同样方法，使用DNA自动合成仪合成，在5’末端导入了Cy5。合成结束后，使用通过一般手法进行脱保护和纯化后的寡核苷酸。

[寡核苷酸C(序列编号4)]

gccaacaatg gaatgttgat tgggcccaaa ccaccttcct ttcttgggat attggtccat

gccaaaaggg atattcgga gtcagtggag gcgaaaaga

<杂交溶液组成>

5×SSC(0.75mol/L氯化钠、0.075mol/L柠檬酸钠、pH7.0)

0.02％SDS(十二烷基硫酸钠)

将(6)中得到的薄片和上述杂交溶液1ml注入杂交盒中，将盒的上端进行热密封。杂交于65℃下进行20小时。

(8)清洗

从杂交盒中取出薄片，按照表2所示条件依次进行清洗。清洗溶液的容量为10ml。

表2

清洗液组成		清洗温度	清洗时间
清洗液组成		清洗温度	清洗时间	2×SSC	0.2％SDS	25℃	20分
0.2×SSC	0.2％SDS	25℃	20分	2×SSC	0.2％SDS	25℃	20分
0.2×SSC	0.2％SDS	25℃	20分	0.2×SSC	0.2％SDS	55℃	20分
0.2×SSC	0.2％SDS	55℃	20分	0.2×SSC	0.2％SDS	55℃	20分
0.2×SSC	0.2％SDS	55℃	20分	0.2×SSC	0.2％SDS	25℃	20分

(9)检测

将洗净后的薄片放到无荧光的载玻片上，向薄片上滴数滴灭菌水，盖上盖片。将载玻片放到DNA芯片检测器(GeneTac V：Genomic Solutions公司生产)，使用Cy5用激光进行检测。图像设定为1小网格10μm大小。

(10)荧光强度的测定

将区域中央部周边分为80个小网格的荧光强度的总和作为区域的强度算出。图1给出了荧光强度以及洗净后的中空纤维周边的图像。区域中央部任意决定。结果表明进行杂交的区域的荧光强度的分布是均一的。

<比较例1>

除了将单体液A变更为单体液B以外，其他与实施例1同样操作。

[单体液B]

将丙烯酰胺0.475g以及亚甲基双丙烯酰胺0.025g溶解于甘油/纯水＝50/50(质量比)混合溶剂，将总量调到10ml。

荧光强度以及洗净后的中空纤维周边的图像如图1所示。

进行杂交的中空部的荧光强度的分布是均一的，但荧光强度比实施例1低。

<比较例2>

除了将单体液A变更为单体液C以外，其他与实施例1同样操作。

[单体液C]

将丙烯酰胺0.76g以及亚甲基双丙烯酰胺0.04g溶解于甘油/纯水＝50/50(质量比)混合溶剂，将总量调到10ml。荧光强度以及洗净后的中空纤维周边的图像如图1所示。

荧光强度比实施例1低，中空部的荧光强度在周边部高，在中心部低。

<实施例2>

除了将单体液A变更为单体液D，捕捉探针A变更为捕捉探针B(序列编号5)以外，其他与实施例1同样操作，制备薄片。而捕捉探针B在5’末端导入氨基，然后与甲基丙烯酸缩水甘油基酯反应，做成末端带有甲基丙烯酸酯的构造。

[单体液D]

将二甲基丙烯酰胺0.27g以及亚甲基双丙烯酰胺0.03g溶解于甘油/纯水＝50/50(质量比)混合溶剂，将总量调到10ml。

[捕捉探针B(序列编号5)]

aaatacgcct gcaggcggag atcttccagg cccgcctcaa gggctggttc gagccaatag

tggaagcat

杂交以及清洗用以下方法进行。

(1)杂交

制备含有在一部分(序列编号6的16～85位)含有与捕捉探针B的碱基序列互补的互补序列的1pmol/ml的寡核苷酸E(序列编号6)的杂交溶液。

寡核苷酸E用DNA自动合成装置合成，在5’末端导入Cy5。合成结束后，使用通过一般的手法脱保护和纯化后的寡核苷酸E。

[寡核苷酸E(序列编号6)]

gcccactggc gatgcatgtc ttccactatt ggctcgaacc agcccttgag gcgggcctgg

aagatctccg cctgcaggcg tatttgctgg gtctgttcc

[杂交溶液组成]

6×SSC(0.75mol/L氯化钠、0.075mol/L柠檬酸钠、pH7.0)

0.02％SDS(十二烷基硫酸钠)

将得到的薄片和上述杂交溶液1ml注入杂交盒中，将盒的上端进行热密封。杂交于37℃下进行16小时。

(2)清洗

从杂交盒中取出薄片，按照表3所示条件依次进行清洗。清洗的温度为45℃。清洗溶液的容量为10ml。

表3

0.2×SSC	0.1％SDS	20分钟
0.2×SSC	0.1％SDS	20分钟	0.2×SSC	0.1％SDS	20分钟
0.2×SSC		20分钟	0.2×SSC	0.1％SDS	20分钟

(3)检测

将洗净后的薄片放到无荧光的载玻片上，向薄片上滴数滴灭菌水，盖上盖片。将载玻片放到DNA芯片检测器(GeneTac V：Genomic Solutions公司生产)，使用Cy5用激光进行检测。图像设定为1个小网格10μm大小。

(4)荧光强度的测定

将区域中央部周边分为200小网格的荧光强度的平均值作为区域强度算出。

图2给出了荧光强度以及洗净后的中空纤维周边的图像。区域中央部任意决定。结果表明进行杂交的区域的荧光强度的分布是均一的。

<实施例3>

除了将单体液D变更为单体液A以外，其他与实施例2同样操作。荧光强度以及洗净后的中空纤维周边的图像如图2所示。区域中央部任意决定。结果表明进行杂交的区域的荧光强度的分布是均一的。

<比较例3>

除了将单体液A变更为单体液E以外，其他与实施例2同样操作。

[单体液E]

将N，N-二甲基丙烯酰胺0.72g以及亚甲基双丙烯酰胺0.08g溶解于甘油/纯水＝50/50(质量比)混合溶剂，将总量调到10ml。

荧光强度以及洗净后的中空纤维周边的图像如图2所示。荧光强度比实施例2低，中空部的荧光强度在周边部高，在中心部低。

<比较例4>

除了将单体液A变更为单体液F以外，其他与实施例2同样操作。

[单体液F]

将N，N-二甲基丙烯酰胺0.18g以及亚甲基双丙烯酰胺0.02g溶解于甘油/纯水＝50/50(质量比)混合溶剂，将总量调到10ml。

薄片化的芯片凝胶脱落，没有填充到中空部(图2)。

产业上的利用可能性

本发明提供固定了相关生物物质的凝胶。通过使用本发明的凝胶，由于可以得到区域内的荧光强度均一，更高的杂交效率，所以在DNA等基因检测中是有用的。

序列表简述

序列编号1：合成DNA

序列编号2：合成DNA

序列编号3：合成DNA

序列编号4：合成DNA

序列编号5：合成DNA

序列编号6：合成DNA

序列表

<110>三菱丽阳株式会社

<120>相关生物物质固定化凝胶以及利用该凝胶的微阵列

<130>P03-0047PCT

<150>JP2002-101675

<151>2002-04-03

<160>6

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>1

caaccaacca caactacata cacatac 27

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>人工序列的描述：合成DNA

<223>Description of Artificial Sequence：SYNTHETIC DNA

<400>2

gtcatttaga caactctgca agcgt 25

<210>3

<211>651

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>3

caaccaacca caactacata cacatacata cacaatggtc gctcaagttc aaaagcaagc 60

tccaactttt aagaaaactg ccgtcgtcga cggtgtcttt gacgaagtct ccttggacaa 120

atacaagggt aagtacgttg tcctagcctt tattccattg gccttcactt tcgtctgtcc 180

aaccgaaatc attgctttct cagaagctgc taagaaattc gaagaacaag gcgctcaagt 240

tcttttcgcc tccactgact ccgaatactc ccttttggca tggaccaata tcccaagaaa 300

ggaaggtggt ttgggcccaa tcaacattcc attgttggct gacaccaacc actctttgtc 360

cagagactat ggtgtcttga tcgaagaaga aggtgtcgcc ttgagaggtt tgttcatcat 420

cgacccaaag ggtgtcatta gacacatcac cattaacgat ttgccagtcg gtagaaacgt 480

tgacgaagcc ttgagattgg ttgaagcctt ccaatggacc gacaagaacg gtactgtctt 540

gccatgtaac tggactccag gtgctgctac catcaagcca accgttgaag actccaagga 600

atacttcgaa gctgccaaca aataagacgc ttgcagagtt gtctaaatga c 651

<210>4

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>4

gccaacaatg gaatgttgat tgggcccaaa ccaccttcct ttcttgggat attggtccat 60

gccaaaaggg agtattcgga gtcagtggag gcgaaaaga 99

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>人工序列的描述：合成DNA

<223>Description of Artificial Sequence：SYNTHETIC DNA

<400>5

aaatacgcct gcaggcggag atcttccagg cccgcctcaa gggctggttc gagccaatag 60

tggaagacat 70

<210>6

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>6

gcccactggc gatgcatgtc ttccactatt ggctcgaacc agcccttgag gcgggcctgg 60

aagatctccg cctgcaggcg tatttgctgg gtctgttcc 99

Claims

1、一种在含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺凝胶中固定了相关生物物质的相关生物物质固定化凝胶。

2、在含有以下组成的胶中固定了相关生物物质的相关生物物质固定化凝胶。

(a)N，N-二甲基丙烯酰胺 2～7质量％

(b)交联剂 0.1～1.5质量％

3、如权利要求1或2所述的相关生物物质固定化凝胶，其中相关生物物质是核酸。

4、如权利要求2或3所述的相关生物物质固定化凝胶，其中交联剂是带有至少2个乙烯性不饱和键的多功能单体。

5、如权利要求4所述的相关生物物质固定化凝胶，其中交联剂是亚甲基双丙烯酰胺。

6、一种相关生物物质固定化凝胶的制造方法，其特征是在含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的凝胶中固定相关生物物质。

7、如权利要求6所述的方法，其中，凝胶是在0.1～1.5质量％的交联剂存在下，使含有2～7质量％的N，N-二甲基丙烯酰胺反应后得到的凝胶。

8、一种在中空管状体的中空部填充了权利1～5中任一项中所述的相关生物物质固定化凝胶的凝胶填充中空管状体。

9、如权利要求8所述的凝胶填充中空管状体，其中中空管状体是中空纤维。

10、一种相关生物物质固定化凝胶微阵列的制造方法，其特征是将数根权利要求8或9所述的凝胶填充中空管状体集束，在与管状体的纵向方向交叉的方向将得到的集束物切断。

11、一种包括以下工序的相关生物物质固定化凝胶微阵列的制造方法，

(1)将数根中空管状体集束的工序，

(2)向得到的集束物的各个管状体的中空部填充权利1～5中任一项中所述的相关生物物质固定化凝胶的工序，

(3)在与管状体的纵向方向交叉的方向将集束物切断的工序。

12、一种在多个区域配置了权利1～5中任一项中所述的相关生物物质固定化凝胶的相关生物物质固定化凝胶微阵列。

13、如权利要求12所述的相关生物物质固定化凝胶微阵列，其中各区域的表面积在10^-6m²或其以下。

14、如权利要求12或13所述的相关生物物质固定化凝胶微阵列，区域由沟或贯通孔形成。

15、一种在与中空管状体的纵向方向交叉的方向将集束了数根权利要求8或9所述的凝胶填充中空管状体的集束物切断后得到的相关生物物质固定化凝胶微阵列。

16、如权利要求15所述的相关生物物质固定化凝胶微阵列，其中中空管状体是中空纤维。

17、一种测定对象的检测方法，其特征是使检体与权利要求12～16任一项所述的微阵列反应，对检体中的测定对象进行检测。

18、权利要求17所述的方法，其中测定对象是核酸。

19、权利要求18所述的方法，其中核酸是具有100个碱基或其以下长度的核酸。