JP4022149B2 - ビニル化核酸の製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ビニル基を有するビニル化核酸の製造方法に関する。ビニル化核酸は、基盤等に固定し遺伝子発現、遺伝子変異等の検出ためのプローブに使用される。
背景技術
近年、ゲノム又は遺伝子情報を解析するための装置として、ＤＮＡマイクロアレイやマイクロ電気泳動装置等が開発されている。
例えば、本発明者らの一部も、ゲルを利用したＤＮＡマイクロアレイを開発し、出願している（日本国 特開２０００−２７０８７７号、特開２０００−２７０８７８号、特開２０００−２７０８７９号公報参照）。このＤＮＡマイクロアレイは、繊維に核酸固定化ゲルを保持した繊維配列体を作製し、配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより得られる。
ゲルに核酸を固定化する方法としては、例えば、ビニル化剤としてＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ａｃｒｙｄｉｔｅ ＴＭ）を用いて、末端ビニル化核酸を作成し、これをアクリルアミドモノマーと共重合させることにより核酸をポリアクリルアミド中に固定化する方法が知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２７．２６４９（１９９９）、ＷＯ９８／３９３５１号公報参照参照）。しかし、前記核酸へのビニル基の導入反応は、不安定であるため、収率よくビニル基を導入することができない（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：５９２−６０６（１９９９））。また、ホスホロアミダイト試薬が高価であることから、経済的ではない。
発明の開示
本発明は、効率よく且つ安価にビニル化核酸を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アミノ基を有する核酸と、ビニル化剤とを反応させ、必要に応じて、塩基性化合物存在下でビニル化反応を行うことにより、効率よく且つ安価にビニル化核酸が製造できることを見出し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、アミノ基修飾ヌクレオチドの共存下にＰＣＲを行って、得られたＰＣＲ増幅産物にビニル基を導入する方法、又はビニル基を有するヌクレオチド存在下にＰＣＲを行うことで、効率よく且つ安価にビニル化核酸を製造することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、（１）アミノ基を有する核酸をビニル化剤とビニル化反応させることを含むビニル化核酸の製造方法、（２）アミノ基を有する核酸がＰＣＲにより得られるものである（１）に記載のビニル化核酸の製造方法、（３）アミノ基を有する核酸が、アミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行い、得られるものである（１）に記載のビニル化核酸の製造方法、（４）ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドからなる群から選択される少なくとも１種である（１）〜（３）のいずれかに記載のビニル化核酸の製造方法、（５）塩基性化合物の存在下にビニル化反応を行う、（１）〜（４）のいずれかに記載のビニル化核酸の製造方法、（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法で得られるビニル化核酸をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物としてビニル化核酸を得ることを含むビニル化核酸の製造方法、（７）ビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下で、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物としてビニル化核酸を得ることを含むビニル化核酸の製造方法、（８）ビニル基で修飾したヌクレオチドが、アミノ基で修飾したヌクレオチドとビニル化剤をビニル化反応させて得られるものである（７）に記載のビニル化核酸の製造方法、（９）ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドからなる群から選択される少なくとも１種である（８）に記載のビニル化核酸の製造方法、（１０）塩基性化合物の存在下にビニル化反応を行う（８）又は（９）に記載のビニル化核酸の製造方法、である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において製造される「ビニル化核酸」とは、その核酸配列中にビニル基を有するヌクレオチドが１つ又は複数、組み込まれた核酸を表す。核酸配列中とは、核酸配列の内部及び／又は末端を意味する。また、「ＰＣＲ」とはポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
本発明のビニル化核酸は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの方法により製造される。
（Ａ）アミノ基を有する核酸をビニル化剤と反応させる。
（Ｂ）アミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下、ＰＣＲを実施した後、ＰＣＲ増幅産物をビニル化剤と反応させる。
（Ｃ）ビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下、ＰＣＲを実施する。
（Ａ）の方法において、「アミノ基を有する核酸」とは、例えば、アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、適当な塩基数の核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）のようなアミノ化試薬を反応させ、脱保護操作をすることにより合成することできる。この場合、アミノ基は核酸の末端に導入される。核酸の鎖長は、約１００配列である。
１００配列以上の長鎖のアミノ基を有する核酸を得たい場合、ＰＣＲによる調製が有効となる。まず、適当な鎖長の末端にアミノ基を有する核酸をＤＮＡ自動合成装置等により調製し、ＰＣＲの際のプライマーとして使用することで、長鎖の末端にアミノ基を有する核酸を合成することができる。ＰＣＲは、常法に従って行えばよい。
上述の末端にアミノ基を有する核酸を、ビニル化剤と反応させることにより、末端にビニル化が導入された核酸（末端ビニル化核酸ともいう）を得ることができる。
ビニル化剤は、アミノ基を有する核酸の良溶媒である極性溶媒、例えばジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）等との反応性及び核酸塩基中のアミノ基との反応性を考慮し選択する。好ましいビニル化剤としては、アクリル基、メタクリル基等を含む化合物である。具体的には、アクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド）、メタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−メタクリロイルオキシスクシンイミド）等である。
反応に使用するビニル化剤の量は、反応率を考慮して設定する。経済性を考慮すると、末端にアミノ基を有する核酸に対して等モル〜５０倍モルが好ましい。
ビニル化における反応温度は、反応速度、反応率等を考慮して任意に設定する。好ましくは１０℃〜３０℃である。
また、アミノ基を有する核酸のビニル化反応に際し、塩基性化合物を触媒として使用することにより、ビニル化反応の反応速度、反応収率等が飛躍的に向上する。
塩基性化合物としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ（土類）金属、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ（土類）金属炭酸化合物、ナトリウムメチラート、マグネシウムメチラート等のアルカリ（土類）金属アルコキシ化合物、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水素化物、さらにはトリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン等の有機３級アミン等が挙げられる。また、それらを組み合わせて用いることも可能である。好ましくは、安価な炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができる。また、使用量は末端にアミノ基を有する核酸に対して等モル〜１００倍モルの範囲が好ましい。
（Ｂ）の方法において、「アミノ基で修飾したヌクレオチド」とは、アミノ基を有するヌクレオチドを表す。アミノ基としては脂肪族アミノ基が挙げられ、具体的には、５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェート等の化合物を用いることができる。
上述のアミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む混合物）の存在下でＰＣＲを実施することにより、ＰＣＲ増幅産物として内部にアミノ基を有する核酸を取得することができる。
また、ＰＣＲに使用する１対のプライマーの両方又は片方に、例えば（Ａ）の方法で合成したアミノ基を有する核酸を使用することにより、核酸配列の内部及び末端にアミノ基を有する核酸を取得することもできる。
得られたＰＣＲ増幅産物は、上述のように、ビニル化剤と反応させることにより核酸配列の内部及び／又は末端にビニル基が導入された核酸となる。
核酸配列中のビニル基の数は、ＰＣＲの際に添加するアミノ基で修飾したヌクレオチドの量により任意に設定することができる。ＰＣＲの際に添加するアミノ基で修飾したヌクレオチドの量は、経済性を考慮すると少ない量が好ましく、ｄＮＴＰに対して１．０〜１０．０質量％がさらに好ましい。
（Ｃ）の方法において、「ビニル基で修飾したヌクレオチド」とは、例えば、５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェートのアクリル化物、５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェートのメタクリル化物を示すことができる。ビニル基で修飾したヌクレオチドは、アミノ基で修飾したヌクレオチドを上述のビニル剤と反応させることにより得ることができる。
上述のビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む混合物）の存在下でＰＣＲを実施することにより、ＰＣＲ増幅産物として内部にアミノ基を有する核酸を取得することができる。
また、ＰＣＲに使用する１対のプライマーの両方又は片方に、例えば（Ａ）の方法で合成したビニル化核酸を使用することにより、核酸配列の内部及び末端にビニル基が導入された核酸を取得することもできる。
核酸中のビニル基の数は、上述の（Ｂ）の方法と同様、ＰＣＲの際に添加するビニル基を有するヌクレオチドの量により任意に設定することができる。ＰＣＲの際に添加するビニル基を有するヌクレオチドの量は、経済性を考慮すると少ない量が好ましく、ｄＮＴＰに対して１．０〜１０．０質量％がさらに好ましい。
本発明において、核酸にビニル基が導入されたことは、ビニル化核酸とアクリルアミド等の重合性モノマーを反応させ共重合物を作成し、該共重合物を電気泳動に供することにより確認することができる。
ビニル化核酸はアクリルアミド等のモノマーと共重合するため、電気泳動により移動しない。
このようにアクリルアミド等の重合性モノマーとの共重合物に固定された核酸は、遺伝子発現、遺伝子変異等の検出ためのプローブとして使用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、ａｔｇｃの核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を反応させ、脱保護操作を行うことにより５’−Ｏ−アミノヘキシル−ａｔｇｃを合成した。
末端にアミノ基を有する核酸として、１ｍＭの５’−Ｏ−アミノヘキシル−ａｔｇｃ水溶液１０μｌ、ビニル化剤として８０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間、ビニル化反応を行った。末端にアミノ基を有する核酸とメタクリル酸無水物のモル比は、１：４０である。
液体クロマトグラフィーを使用し、以下に示す分析条件で反応率を測定したところ、反応率は１００％であった。
〈液体クロマトグラフィー分析条件〉
カラム：カプセルパック Ｃ１８ ＳＧ３００（４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ，５μｍ）
移動相：Ａ：５ｍＭ トリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．５）
Ｂ：アセトニトリル ０→２０％（４０ｍｉｎ）
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
実施例２〜５
実施例１において、メタクリル酸無水物溶液の濃度を表１に示す値に変更した以外は、同様に操作した。結果は表１に示した。
比較例１
メタクリル酸無水物の変わりに１００ｍＭのメタクリル酸水溶液を使用した以外は実施例１と同様に操作を行った。反応終了後、液体クロマトグラフィーを使用し、反応率を測定したところ、反応率は０％であった。
実施例６〜１０
実施例１〜５において、メタクリル酸無水物を、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミドに変えた以外は同様に操作し、反応率を求めた。
実施例１１
アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ（配列番号１）の核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を反応させ、脱保護操作を行うことにより、５’−Ｏ−アミノヘキシル−ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃを合成した。
末端にアミノ基を有する核酸として、０．５ｍＭの５’−Ｏ−アミノヘキシル−ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ水溶液１０μｌ、ビニル化剤として２０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。
実施例１と同様の条件で、液体クロマトグラフィーで反応率を測定したところ、反応率は１００％であった。
実施例１２
本実施例は、末端ビニル化核酸を使用したＰＣＲによる、末端ビニル化核酸の製造方法に関する。
（１）鋳型（染色体）の調製
ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株を栄養培地（グルコース１５ｇ、酵母エキス１ｇ、グルタミン酸ナトリウム１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌで３０℃、３日培養し、集菌した。この菌体から染色体を調製し、ＰＣＲの鋳型に用いた。なお、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株はＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に昭和６２年９月１８日に寄託されている。（２）ＰＣＲ
実施例１１で作製した末端ビニル化核酸及びａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）をプライマーとして使用し、（１）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行った。ａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）はアマシャムファルマシア社に合成を依頼した。
ＰＣＲは、Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造社製）の仕様書に従い、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬを用いて行った。反応は１００μｌで行い、温度条件は９３℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分を１サイクルとし、３０サイクル行った。この反応によって５１２塩基の長鎖の５’末端ビニル化核酸（配列番号３）が増幅された。
実施例１３
本実施例は、末端ビニル化核酸のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価に関する。
表３に示したゲル前駆体水溶液を調製し、室温で２時間放置し核酸固定化アクリルアミドゲルを製造した。得られた核酸固定化ゲル１を２０ｍｇ切り出した。核酸固定化ゲル１ ２０ｍｇ中には、５ｎｍｏｌの核酸が存在している。
次に４つのウェル（容量約５０μｌ）を含む電気泳動用ゲル２〔ポリマー濃度５％（アクリルアミド／メチレンビスアクリルアミド＝９５／５（ｗｔ／ｗｔ））〕を作製した。
ウェル１１に、前記切り出した核酸固定化ゲル１を添加した。ウェル１２〜１４には、末端ビニル化核酸（実施例１１記載）の量が順に５ｎｍｏｌ，２．５ｎｍｏｌ，０．５ｎｍｏｌとなるように溶液で添加した（図１参照）。
次いで、サブマリン型電気泳動装置（アトー社製ＡＥ−６１１０）を用いて、５０Ｖ １５分間電気泳動を行った。
アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイドで染色し、電気泳動で移動した核酸のバンドの蛍光強度を目視で測定した。ウェル１１から、移動した核酸（つまり、共重合しなかったビニル化核酸）のバンドの蛍光強度は、ウェル１４の蛍光強度よりも低いことが確認された。
以上の結果から、末端ビニル化核酸のアクリルアミドゲルへの固定化率は９０％以上であることを確認した。
実施例１４
本実施例は、長鎖の末端ビニル化核酸（配列番号３）のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価に関する。
４つのウェルを１つのウェルに変更した以外は実施例１３と同様に電気泳動用ゲルを作成した。
前記ゲルのウェル部分に表４の組成からなる長鎖の末端ビニル化核酸（配列番号３）を含むゲル前駆体溶液を添加し、室温で２時間放置した。
得られたゲルを、縦型電気泳動装置を用いて、５０Ｖ，１時間電気泳動を行い、その後エチジウムブロマイドで染色した。
アクリルアミドゲルの試料添加用のウェル部分（ゲルに固定化された末端ビニル化長鎖核酸）の蛍光強度と、泳動によって移動した核酸（ゲルに固定化されなかった末端ビニル化長鎖核酸）のバンドの蛍光強度を比較すると、ウェル部分の蛍光強度が１０倍程度高いことが目視によって確認された。
また、末端ビニル化核酸のかわりに、末端にアミノ基を有する核酸（５’−Ｏ−アミノヘキシル−ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ：実施例１１参照）を用いた以外は、実施例１２（２）と同様にＰＣＲを実施し、ＰＣＲ増幅産物を得た。このＰＣＲ増幅産物を、表４のビニル化核酸（配列番号３）のかわりに使用し、上述と同様の実験を行ったところ、ウェル部分はエチジウムブロマイドによって染色されず、電気泳動によって移動したバンドのみが強く染色された。
以上の結果により、末端ビニル化核酸をプライマーとして用い、ＰＣＲを行い、得られた長鎖の末端ビニル化核酸（配列番号３）についても、高効率でアクリルアミドゲルに固定化できることを確認した。
実施例１５
本実施例は、アミノ基で修飾されたヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でのＰＣＲによるビニル化核酸の製造方法に関する。
（１）ＰＣＲ
実施例１２（１）で調製した鋳型と、プライマーとしてｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ（配列番号１）及びａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）を用い、ＰＣＲを行った。ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ（配列番号１）とａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）はアマシャムファルマシア社に合成を依頼した。
ＰＣＲは、ヌクレオチドとしてｄＮＴＰ１に対して５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェートを０．０５の割合で加えた以外は、実施例１２と同様に行った。その結果、配列の内部にアミノ基で修飾されたヌクレオチドを含む、５１２塩基の長鎖の核酸（配列番号４）が増幅された。
（２）ビニル基の導入
アミノ基を有する核酸として、（１）で得られた核酸（配列番号４）（１ｎｍｏｌ／ｍｌ）１０μｌ、ビニル化剤として５０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３水溶液５μｌと混合し、室温で２時間反応させた。
（３）ビニル化核酸のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価
ビニル化核酸として、（２）で得られたビニル化核酸を使用した以外は実施例１４と同様に操作した。
アクリルアミドゲルの試料添加用のウェル部分（ゲルに固定化されたビニル化核酸）の蛍光強度と、泳動によって移動した核酸（ゲルに固定化されなかったビニル化核酸）のバンドの蛍光強度を比較すると、ウェル部分の蛍光強度が１０倍程度高いことが目視によって確認された。
実施例１６
本実施例は、ビニル基で修飾されたヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でのＰＣＲによるビニル化核酸の製造方法に関する。
（１）ビニル基で修飾したヌクレオチドの合成
アミノ基で修飾したヌクレオチドとして、５０ｍＭの５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェート１０μｌ（ＤＭＳＯに溶解）、ビニル化剤として５０ｍＭのメタクリル酸無水物（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを使用した。これらを１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３ ５μｌと混合し、室温で２時間反応させた。
（２）ＰＣＲ
ｄＮＴＰ１に対して（１）で合成したヌクレオチドを０．０５の割合で加えて、ＰＣＲを行った以外は、実施例１５と同様にＰＣＲを行った。その結果、配列の内部にビニル基で修飾されたヌクレオチドを含む、５１２塩基の長鎖の核酸（配列番号５）が増幅された。
（３）ビニル化核酸（配列番号５）のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価
ビニル化核酸として、（２）で得られたビニル化核酸（配列番号５）を使用した以外は実施例１４と同様に操作した。
アクリルアミドゲルの試料添加用のウェル部分（ゲルに固定化されたビニル化核酸）の蛍光強度と、泳動によって移動した核酸（ゲルに固定化されなかったビニル化核酸）のバンドの蛍光強度を比較すると、ウェル部分の蛍光強度が１０倍程度高いことが目視によって確認された。
産業上の利用可能性
本発明によって、アミノ基を有する核酸をビニル化剤とビニル化反応を実施することにより、効率良く且つ安価にビニル化核酸を製造することができる。また、アミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行って、得られたＰＣＲ増幅産物にビニル基を導入する方法、又はビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行う方法により、ビニル化核酸を効率良く且つ安価に製造することができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、電気泳動用ゲル及びそれを用いたビニル化核酸の確認方法を示す。図中、符号１は核酸固定化ゲルを、符号２電気泳動用ゲルを、符号１１〜１４は核酸固定化ゲル又は核酸溶液添加用ウェルを示す。
本発明は、ビニル基を有するビニル化核酸の製造方法に関する。ビニル化核酸は、基盤等に固定し遺伝子発現、遺伝子変異等の検出ためのプローブに使用される。
背景技術
近年、ゲノム又は遺伝子情報を解析するための装置として、ＤＮＡマイクロアレイやマイクロ電気泳動装置等が開発されている。
例えば、本発明者らの一部も、ゲルを利用したＤＮＡマイクロアレイを開発し、出願している（日本国 特開２０００−２７０８７７号、特開２０００−２７０８７８号、特開２０００−２７０８７９号公報参照）。このＤＮＡマイクロアレイは、繊維に核酸固定化ゲルを保持した繊維配列体を作製し、配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより得られる。
ゲルに核酸を固定化する方法としては、例えば、ビニル化剤としてＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ａｃｒｙｄｉｔｅ ＴＭ）を用いて、末端ビニル化核酸を作成し、これをアクリルアミドモノマーと共重合させることにより核酸をポリアクリルアミド中に固定化する方法が知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２７．２６４９（１９９９）、ＷＯ９８／３９３５１号公報参照参照）。しかし、前記核酸へのビニル基の導入反応は、不安定であるため、収率よくビニル基を導入することができない（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：５９２−６０６（１９９９））。また、ホスホロアミダイト試薬が高価であることから、経済的ではない。
発明の開示
本発明は、効率よく且つ安価にビニル化核酸を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アミノ基を有する核酸と、ビニル化剤とを反応させ、必要に応じて、塩基性化合物存在下でビニル化反応を行うことにより、効率よく且つ安価にビニル化核酸が製造できることを見出し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、アミノ基修飾ヌクレオチドの共存下にＰＣＲを行って、得られたＰＣＲ増幅産物にビニル基を導入する方法、又はビニル基を有するヌクレオチド存在下にＰＣＲを行うことで、効率よく且つ安価にビニル化核酸を製造することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、（１）アミノ基を有する核酸をビニル化剤とビニル化反応させることを含むビニル化核酸の製造方法、（２）アミノ基を有する核酸がＰＣＲにより得られるものである（１）に記載のビニル化核酸の製造方法、（３）アミノ基を有する核酸が、アミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行い、得られるものである（１）に記載のビニル化核酸の製造方法、（４）ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドからなる群から選択される少なくとも１種である（１）〜（３）のいずれかに記載のビニル化核酸の製造方法、（５）塩基性化合物の存在下にビニル化反応を行う、（１）〜（４）のいずれかに記載のビニル化核酸の製造方法、（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法で得られるビニル化核酸をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物としてビニル化核酸を得ることを含むビニル化核酸の製造方法、（７）ビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下で、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物としてビニル化核酸を得ることを含むビニル化核酸の製造方法、（８）ビニル基で修飾したヌクレオチドが、アミノ基で修飾したヌクレオチドとビニル化剤をビニル化反応させて得られるものである（７）に記載のビニル化核酸の製造方法、（９）ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドからなる群から選択される少なくとも１種である（８）に記載のビニル化核酸の製造方法、（１０）塩基性化合物の存在下にビニル化反応を行う（８）又は（９）に記載のビニル化核酸の製造方法、である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において製造される「ビニル化核酸」とは、その核酸配列中にビニル基を有するヌクレオチドが１つ又は複数、組み込まれた核酸を表す。核酸配列中とは、核酸配列の内部及び／又は末端を意味する。また、「ＰＣＲ」とはポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
本発明のビニル化核酸は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの方法により製造される。
（Ａ）アミノ基を有する核酸をビニル化剤と反応させる。
（Ｂ）アミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下、ＰＣＲを実施した後、ＰＣＲ増幅産物をビニル化剤と反応させる。
（Ｃ）ビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下、ＰＣＲを実施する。
（Ａ）の方法において、「アミノ基を有する核酸」とは、例えば、アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、適当な塩基数の核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）のようなアミノ化試薬を反応させ、脱保護操作をすることにより合成することできる。この場合、アミノ基は核酸の末端に導入される。核酸の鎖長は、約１００配列である。
１００配列以上の長鎖のアミノ基を有する核酸を得たい場合、ＰＣＲによる調製が有効となる。まず、適当な鎖長の末端にアミノ基を有する核酸をＤＮＡ自動合成装置等により調製し、ＰＣＲの際のプライマーとして使用することで、長鎖の末端にアミノ基を有する核酸を合成することができる。ＰＣＲは、常法に従って行えばよい。
上述の末端にアミノ基を有する核酸を、ビニル化剤と反応させることにより、末端にビニル化が導入された核酸（末端ビニル化核酸ともいう）を得ることができる。
ビニル化剤は、アミノ基を有する核酸の良溶媒である極性溶媒、例えばジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）等との反応性及び核酸塩基中のアミノ基との反応性を考慮し選択する。好ましいビニル化剤としては、アクリル基、メタクリル基等を含む化合物である。具体的には、アクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド）、メタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−メタクリロイルオキシスクシンイミド）等である。
反応に使用するビニル化剤の量は、反応率を考慮して設定する。経済性を考慮すると、末端にアミノ基を有する核酸に対して等モル〜５０倍モルが好ましい。
ビニル化における反応温度は、反応速度、反応率等を考慮して任意に設定する。好ましくは１０℃〜３０℃である。
また、アミノ基を有する核酸のビニル化反応に際し、塩基性化合物を触媒として使用することにより、ビニル化反応の反応速度、反応収率等が飛躍的に向上する。
塩基性化合物としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ（土類）金属、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ（土類）金属炭酸化合物、ナトリウムメチラート、マグネシウムメチラート等のアルカリ（土類）金属アルコキシ化合物、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水素化物、さらにはトリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン等の有機３級アミン等が挙げられる。また、それらを組み合わせて用いることも可能である。好ましくは、安価な炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができる。また、使用量は末端にアミノ基を有する核酸に対して等モル〜１００倍モルの範囲が好ましい。
（Ｂ）の方法において、「アミノ基で修飾したヌクレオチド」とは、アミノ基を有するヌクレオチドを表す。アミノ基としては脂肪族アミノ基が挙げられ、具体的には、５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェート等の化合物を用いることができる。
上述のアミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む混合物）の存在下でＰＣＲを実施することにより、ＰＣＲ増幅産物として内部にアミノ基を有する核酸を取得することができる。
また、ＰＣＲに使用する１対のプライマーの両方又は片方に、例えば（Ａ）の方法で合成したアミノ基を有する核酸を使用することにより、核酸配列の内部及び末端にアミノ基を有する核酸を取得することもできる。
得られたＰＣＲ増幅産物は、上述のように、ビニル化剤と反応させることにより核酸配列の内部及び／又は末端にビニル基が導入された核酸となる。
核酸配列中のビニル基の数は、ＰＣＲの際に添加するアミノ基で修飾したヌクレオチドの量により任意に設定することができる。ＰＣＲの際に添加するアミノ基で修飾したヌクレオチドの量は、経済性を考慮すると少ない量が好ましく、ｄＮＴＰに対して１．０〜１０．０質量％がさらに好ましい。
（Ｃ）の方法において、「ビニル基で修飾したヌクレオチド」とは、例えば、５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェートのアクリル化物、５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェートのメタクリル化物を示すことができる。ビニル基で修飾したヌクレオチドは、アミノ基で修飾したヌクレオチドを上述のビニル剤と反応させることにより得ることができる。
上述のビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む混合物）の存在下でＰＣＲを実施することにより、ＰＣＲ増幅産物として内部にアミノ基を有する核酸を取得することができる。
また、ＰＣＲに使用する１対のプライマーの両方又は片方に、例えば（Ａ）の方法で合成したビニル化核酸を使用することにより、核酸配列の内部及び末端にビニル基が導入された核酸を取得することもできる。
核酸中のビニル基の数は、上述の（Ｂ）の方法と同様、ＰＣＲの際に添加するビニル基を有するヌクレオチドの量により任意に設定することができる。ＰＣＲの際に添加するビニル基を有するヌクレオチドの量は、経済性を考慮すると少ない量が好ましく、ｄＮＴＰに対して１．０〜１０．０質量％がさらに好ましい。
本発明において、核酸にビニル基が導入されたことは、ビニル化核酸とアクリルアミド等の重合性モノマーを反応させ共重合物を作成し、該共重合物を電気泳動に供することにより確認することができる。
ビニル化核酸はアクリルアミド等のモノマーと共重合するため、電気泳動により移動しない。
このようにアクリルアミド等の重合性モノマーとの共重合物に固定された核酸は、遺伝子発現、遺伝子変異等の検出ためのプローブとして使用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、ａｔｇｃの核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を反応させ、脱保護操作を行うことにより５’−Ｏ−アミノヘキシル−ａｔｇｃを合成した。
末端にアミノ基を有する核酸として、１ｍＭの５’−Ｏ−アミノヘキシル−ａｔｇｃ水溶液１０μｌ、ビニル化剤として８０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間、ビニル化反応を行った。末端にアミノ基を有する核酸とメタクリル酸無水物のモル比は、１：４０である。
液体クロマトグラフィーを使用し、以下に示す分析条件で反応率を測定したところ、反応率は１００％であった。
〈液体クロマトグラフィー分析条件〉
カラム：カプセルパック Ｃ１８ ＳＧ３００（４．６ｍｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ，５μｍ）
移動相：Ａ：５ｍＭ トリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．５）
Ｂ：アセトニトリル ０→２０％（４０ｍｉｎ）
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
実施例２〜５
実施例１において、メタクリル酸無水物溶液の濃度を表１に示す値に変更した以外は、同様に操作した。結果は表１に示した。
メタクリル酸無水物の変わりに１００ｍＭのメタクリル酸水溶液を使用した以外は実施例１と同様に操作を行った。反応終了後、液体クロマトグラフィーを使用し、反応率を測定したところ、反応率は０％であった。
実施例６〜１０
実施例１〜５において、メタクリル酸無水物を、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミドに変えた以外は同様に操作し、反応率を求めた。
アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ（配列番号１）の核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を反応させ、脱保護操作を行うことにより、５’−Ｏ−アミノヘキシル−ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃを合成した。
末端にアミノ基を有する核酸として、０．５ｍＭの５’−Ｏ−アミノヘキシル−ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ水溶液１０μｌ、ビニル化剤として２０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液５μｌと混合し、室温で１時間反応を行った。
実施例１と同様の条件で、液体クロマトグラフィーで反応率を測定したところ、反応率は１００％であった。
実施例１２
本実施例は、末端ビニル化核酸を使用したＰＣＲによる、末端ビニル化核酸の製造方法に関する。
（１）鋳型（染色体）の調製
ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株を栄養培地（グルコース１５ｇ、酵母エキス１ｇ、グルタミン酸ナトリウム１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌで３０℃、３日培養し、集菌した。この菌体から染色体を調製し、ＰＣＲの鋳型に用いた。なお、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株はＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に昭和６２年９月１８日に寄託されている。（２）ＰＣＲ
実施例１１で作製した末端ビニル化核酸及びａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）をプライマーとして使用し、（１）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行った。ａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）はアマシャムファルマシア社に合成を依頼した。
ＰＣＲは、Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造社製）の仕様書に従い、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬを用いて行った。反応は１００μｌで行い、温度条件は９３℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分を１サイクルとし、３０サイクル行った。この反応によって５１２塩基の長鎖の５’末端ビニル化核酸（配列番号３）が増幅された。
本実施例は、末端ビニル化核酸のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価に関する。
表３に示したゲル前駆体水溶液を調製し、室温で２時間放置し核酸固定化アクリルアミドゲルを製造した。得られた核酸固定化ゲル１を２０ｍｇ切り出した。核酸固定化ゲル１ ２０ｍｇ中には、５ｎｍｏｌの核酸が存在している。
ウェル１１に、前記切り出した核酸固定化ゲル１を添加した。ウェル１２〜１４には、末端ビニル化核酸（実施例１１記載）の量が順に５ｎｍｏｌ，２．５ｎｍｏｌ，０．５ｎｍｏｌとなるように溶液で添加した（図１参照）。
次いで、サブマリン型電気泳動装置（アトー社製ＡＥ−６１１０）を用いて、５０Ｖ １５分間電気泳動を行った。
アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイドで染色し、電気泳動で移動した核酸のバンドの蛍光強度を目視で測定した。ウェル１１から、移動した核酸（つまり、共重合しなかったビニル化核酸）のバンドの蛍光強度は、ウェル１４の蛍光強度よりも低いことが確認された。
以上の結果から、末端ビニル化核酸のアクリルアミドゲルへの固定化率は９０％以上であることを確認した。
実施例１４
本実施例は、長鎖の末端ビニル化核酸（配列番号３）のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価に関する。
４つのウェルを１つのウェルに変更した以外は実施例１３と同様に電気泳動用ゲルを作成した。
前記ゲルのウェル部分に表４の組成からなる長鎖の末端ビニル化核酸（配列番号３）を含むゲル前駆体溶液を添加し、室温で２時間放置した。
アクリルアミドゲルの試料添加用のウェル部分（ゲルに固定化された末端ビニル化長鎖核酸）の蛍光強度と、泳動によって移動した核酸（ゲルに固定化されなかった末端ビニル化長鎖核酸）のバンドの蛍光強度を比較すると、ウェル部分の蛍光強度が１０倍程度高いことが目視によって確認された。
また、末端ビニル化核酸のかわりに、末端にアミノ基を有する核酸（５’−Ｏ−アミノヘキシル−ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ：実施例１１参照）を用いた以外は、実施例１２（２）と同様にＰＣＲを実施し、ＰＣＲ増幅産物を得た。このＰＣＲ増幅産物を、表４のビニル化核酸（配列番号３）のかわりに使用し、上述と同様の実験を行ったところ、ウェル部分はエチジウムブロマイドによって染色されず、電気泳動によって移動したバンドのみが強く染色された。
以上の結果により、末端ビニル化核酸をプライマーとして用い、ＰＣＲを行い、得られた長鎖の末端ビニル化核酸（配列番号３）についても、高効率でアクリルアミドゲルに固定化できることを確認した。
実施例１５
本実施例は、アミノ基で修飾されたヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でのＰＣＲによるビニル化核酸の製造方法に関する。
（１）ＰＣＲ
実施例１２（１）で調製した鋳型と、プライマーとしてｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ（配列番号１）及びａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）を用い、ＰＣＲを行った。ｔｇｃｇｔｃｇａｔｃｔｃ（配列番号１）とａａａｃｃｃｔｇａｃｃｔ（配列番号２）はアマシャムファルマシア社に合成を依頼した。
ＰＣＲは、ヌクレオチドとしてｄＮＴＰ１に対して５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェートを０．０５の割合で加えた以外は、実施例１２と同様に行った。その結果、配列の内部にアミノ基で修飾されたヌクレオチドを含む、５１２塩基の長鎖の核酸（配列番号４）が増幅された。
アミノ基を有する核酸として、（１）で得られた核酸（配列番号４）（１ｎｍｏｌ／ｍｌ）１０μｌ、ビニル化剤として５０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを用いた。これらを１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３水溶液５μｌと混合し、室温で２時間反応させた。
（３）ビニル化核酸のアクリルアミドゲルへの固定化及び評価
ビニル化核酸として、（２）で得られたビニル化核酸を使用した以外は実施例１４と同様に操作した。
アクリルアミドゲルの試料添加用のウェル部分（ゲルに固定化されたビニル化核酸）の蛍光強度と、泳動によって移動した核酸（ゲルに固定化されなかったビニル化核酸）のバンドの蛍光強度を比較すると、ウェル部分の蛍光強度が１０倍程度高いことが目視によって確認された。
実施例１６
本実施例は、ビニル基で修飾されたヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でのＰＣＲによるビニル化核酸の製造方法に関する。
（１）ビニル基で修飾したヌクレオチドの合成
アミノ基で修飾したヌクレオチドとして、５０ｍＭの５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン ５’−トリホスフェート１０μｌ（ＤＭＳＯに溶解）、ビニル化剤として５０ｍＭのメタクリル酸無水物（ＤＭＳＯに溶解）５μｌを使用した。これらを１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３ ５μｌと混合し、室温で２時間反応させた。
（２）ＰＣＲ
ｄＮＴＰ１に対して（１）で合成したヌクレオチドを０．０５の割合で加えて、ＰＣＲを行った以外は、実施例１５と同様にＰＣＲを行った。その結果、配列の内部にビニル基で修飾されたヌクレオチドを含む、５１２塩基の長鎖の核酸（配列番号５）が増幅された。
ビニル化核酸として、（２）で得られたビニル化核酸（配列番号５）を使用した以外は実施例１４と同様に操作した。
アクリルアミドゲルの試料添加用のウェル部分（ゲルに固定化されたビニル化核酸）の蛍光強度と、泳動によって移動した核酸（ゲルに固定化されなかったビニル化核酸）のバンドの蛍光強度を比較すると、ウェル部分の蛍光強度が１０倍程度高いことが目視によって確認された。
産業上の利用可能性
本発明によって、アミノ基を有する核酸をビニル化剤とビニル化反応を実施することにより、効率良く且つ安価にビニル化核酸を製造することができる。また、アミノ基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行って、得られたＰＣＲ増幅産物にビニル基を導入する方法、又はビニル基で修飾したヌクレオチド及びｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを行う方法により、ビニル化核酸を効率良く且つ安価に製造することができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、電気泳動用ゲル及びそれを用いたビニル化核酸の確認方法を示す。図中、符号１は核酸固定化ゲルを、符号２電気泳動用ゲルを、符号１１〜１４は核酸固定化ゲル又は核酸溶液添加用ウェルを示す。
Claims (9)
- アミノ基を有する核酸をビニル化剤とビニル化反応させ、そのアミノ基をビニル化することを含むビニル化核酸の製造方法。
- アミノ基を有する核酸がPCRにより得られるものである請求項１記載のビニル化核酸の製造方法。
- アミノ基を有する核酸が、アミノ基で修飾したヌクレオチド及びdNTPの存在下でPCRを行い、得られるものである請求項１記載のビニル化核酸の製造方法。
- ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載のビニル化核酸の製造方法。
- 塩基性化合物の存在下にビニル化反応を行う、請求項１〜４のいずれかに記載のビニル化核酸の製造方法。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の方法で得られるビニル化核酸をプライマーとして用いてPCRを行い、PCR増幅産物としてビニル化核酸を得ることを含むビニル化核酸の製造方法。
- ビニル基で修飾したヌクレオチド及びdNTPの存在下で、PCRを行い、PCR増幅産物としてビニル化核酸を得ることを含むビニル化核酸の製造方法であって、ビニル基で修飾したヌクレオチドが、アミノ基で修飾したヌクレオチドとビニル化剤をビニル化反応させ、そのアミノ基をビニル化することにより得られるものであるビニル化核酸の製造方法。
- ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項７に記載のビニル化核酸の製造方法。
- 塩基性化合物の存在下にビニル化反応を行う、請求項７又は８に記載のビニル化核酸の製造方法。
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