CN103975053A - 核酸扩增用基材以及核酸扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸扩增用基材,其能够正确且高效地对作为检测对象的多个靶核酸序列进行扩增、检测。本发明的核酸扩增用基材具有阵列化的多个分区,在该分区中保持有亲水性凝胶,所述亲水性凝胶含有用于扩增核酸的不同种类的引物等。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增用基材及其制造方法、以及使用了该基材的核酸扩增方法等。
背景技术
以人为首的各种生物的基因组等的核酸序列解析正在全力推进中,近年来,大规模测序、基因筛选等基因解析技术也在迅速提高。此外,还鉴定出多种与疾病、药理相关的基因标记,利用这些基因标记的新的诊断、检查方法已经开始实用化。
这些基因解析、诊断/检查中,大多对作为解析对象的靶核酸序列进行扩增,作为扩增方法,通常使用PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)法、LAMP法(Loop-Mediated Isothermal Amplification,环介导等温扩增)等。
关于这些核酸扩增方法,为了应用于大规模测序、基因筛选等中,提出了用于独立且全面地扩增非特定序列的方法、设备。此外,为了提高检查及诊断等的效率,还提出了用于独立地扩增多种特定序列的方法、设备。
作为前者的例子,设计了在由贯穿微型板内外的毛细管形成的孔的内部实施PCR的方法(专利文献1)。根据本方法,将形成有多个毛细管状的孔的微型板浸渍在PCR溶液中,按照使各孔中包含的靶核酸为一分子的方式进行反应,从而能够在各个孔中独立地对一条靶核酸进行扩增。
此外,还提出了不使用微型板的方法(专利文献2)。该方法的特征在于,将实现了含有一分子靶核酸的、含有PCR溶液的多个微小液滴凝胶,以在油等疏水性溶剂中调制为胶乳的状态供于PCR扩增反应。
另一方面,作为后者的例子,可以列举多重PCR(Multiplex PCR)法。通常的PCR法中,在1种反应溶液中使用1种引物组来进行靶碱基序列的扩增,而多重PCR法中,在1个反应容器中使用扩增对象不同的多个引物组来进行多种靶碱基序列的扩增。
与此相反地,还提出了将多种引物对配置在各自独立的微细空间内、在该微细空间中分别进行PCR的方法(专利文献3)。根据本方法,准备排列有多根毛细管、滴加有多种引物对并使其干燥的基板,通过使该基板接触并吸入不含引物对的PCR溶液从而使引物对再溶解,能够在各毛细管中独立地进行使用不同种类引物的PCR。
进而,还设计了将多种引物对的末端固定在基板上并进行阵列化后,一次性进行多条靶核酸序列的扩增的方法(非专利文献1)。根据该方法,将在靶序列特异性引物的5’末端侧附加有任意的通用接头序列的引物组固定在基板上,进而在液相中添加该通用接头序列作为引物,从而对于本来仅通过固定在基板上的引物难以扩增的核酸也能够进行扩增及检测。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2002-335960号公报
专利文献2:日本特开2008-245612号公报
专利文献3:日本特开2008-154490号公报
非专利文献
非专利文献1:Nucleic Acids Research,2005,Vol.33,No.2e11
发明内容
发明所要解决的课题
但是,这些现有技术难以不使多种靶序列混合并高通量地进行扩增。
例如,专利文献1记载的技术中,由于无法在一种反应溶液中使用多种引物,因此难以对多种特定序列进行扩增。此外,使用的是在毛细管中吸上了PCR溶液的试样,在本来体积就微小的毛细管中会立即干燥,被认为结果的再现性不高。
专利文献2记载的技术中,虽然能够扩增的片段数极多,但与专利文献1记载的技术同样地无法在一种反应溶液中(一个微小液滴凝胶中)使用多个引物对。此外,不仅在扩增反应后进行检测时胶乳中的微小液滴凝胶的操作必须慎之又慎,而且各微小液滴凝胶中包含的扩增产物的种类也不明确,因此需要另外通过测序进行鉴定,因而需要高端的技术、昂贵的装置,因此难以实用化。
专利文献3记载的技术中,虽然能够使用多种引物对分别实施PCR,但是,引物本身仅仅简单地被干燥固着在各分区中,因此在接触PCR溶液时,毛细管的开放部通过水系溶液而被连接,溶解了的引物对发生混合,产生不希望的扩增产物的可能性很高。此外,在检测扩增产物时,需要从毛细管中回收PCR溶液。在无需回收的实验体系中,在检测时需要设法使PCR溶液不从毛细管泄露且不会干燥,诸如此类,操作繁杂。
非专利文献1记载的技术中,虽然与使用固定有引物的载体的PCR相比扩增效率提高,但PCR初期的反应仅在固相中进行,因此与水相中的PCR相比,扩增效率低,反应需要更多时间。此外,由于在液相中使用通用引物,因此,样品中本来就大量存在的靶核酸序列的扩增使用了大量通用引物,存在无法对初始量少的靶核酸序列进行检测的可能性。即,根据数量比的不同,有可能存在没有被扩增的靶核酸序列。
因此,本发明的目的在于提供一种核酸扩增用基材以及使用了该基材的核酸扩增方法等,所述核酸扩增用基材能够正确且高效地对作为检测对象的多个靶核酸序列进行扩增、检测。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究,结果发现,使用下述基材能够正确且高效地对作为检测对象的多个靶核酸序列进行扩增、检测,从而完成了本发明,所述基材具有阵列化的多个分区,所述分区由通过加热而溶解的亲水性凝胶保持不同种类的核酸扩增用引物对和聚合酶及缓冲液成分。
即,本发明如下所述。
(I)一种核酸扩增用基材,其具有阵列化的多个分区,在该分区中保持有通过加热能够溶解的亲水性凝胶,所述亲水性凝胶含有用于扩增核酸的不同种类的引物对、聚合酶及缓冲液成分。
上述(I)所述的基材中,各分区中引物的浓度可以是例如1~1000fmol/μL。
此外,缓冲液成分可以含有例如选自由KCl、Tris-HCl、MgCl2、明胶及Triton X-100组成的组中的至少1种。
此外,亲水性凝胶(通过加热能够溶解的亲水性凝胶)可以是使用选自由琼脂糖、藻酸、葡聚糖、乙烯醇及乙二醇组成的组中的至少1种作为单体成分而调制的凝胶,特别优选为琼脂糖凝胶。这里,亲水性凝胶的浓度可以为例如0.5~2质量%。
上述(I)所述的基材中各分区的大小可以为例如该分区的形状的最大宽度为10μm~1000μm。
(II)一种上述(I)所述的核酸扩增用基材的制造方法,其包括下述工序。
(1)将多根中空纤维按照中空纤维的各纤维轴朝向同一方向的方式3维排列并将该排列用树脂固定,从而制造中空纤维束的工序
(2)将含有引物的凝胶前体溶液导入到预先加热的中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序
(3)使导入到中空纤维束的中空部的凝胶前体溶液反应,从而将含有引物的凝胶状物保持在中空纤维的中空部的工序
(4)在疏水性液体中将中空纤维束在与纤维的长度方向交叉的方向上切断,从而进行薄片化的工序
(III)一种核酸扩增用试剂盒,其含有上述(I)所述的核酸扩增用基材和模板供给用基材。
(IV)一种核酸扩增方法,其包括向上述(I)所述的核酸扩增用基材的各分区供给模板的工序和对该供给后的基材进行加热的工序。
发明的效果
根据本发明,能够不使因靶核酸序列而异的引物对相互混合地实施使用多种引物对的核酸扩增反应。
此外,由于引物没有被固定在固相上,因此在通过加热使凝胶液化时引物发生游离,能够以与液相中的核酸扩增反应同等的速度实施反应。由于凝胶所具有的保水力,即使为较小的体积也难以发生干燥,PCR的稳定性提高。
进而,由于不使用靶核酸序列通用的引物,因此不发生作为扩增反应对象的靶核酸序列之间的引物竞争,初始的靶核酸的数量比也不会对扩增结果产生影响。
附图说明
图1为核酸扩增用基材的概要图的一个例子。
图2为表示核酸扩增用基材的一个例子的剖面图。
图3为例示用片材将核酸扩增用基材的两端封闭的状态的剖面图。
图4为例示使用核酸扩增用基材进行核酸扩增反应时的一个方式的图。
图5为表示通过使用了核酸扩增用基材的PCR检测到的SybrGreen I的信号强度的图。
图6为表示本申请的实施例2的实验结果的图,具体而言,为表示通过切片而获得的核酸扩增反应用基材的各分区所负载的琼脂糖凝胶的比率(残存比率)的图。
具体实施方式
以下对本发明详细地进行说明。本发明的范围并不局限于这些说明,在不脱离本发明的主旨的范围内,除了以下的示例以外,还可以进行适当变更而实施。
此外,本说明书中包含作为本申请优先权主张的基础的日本特愿2011-263730号说明书等(2011年12月1日申请)的全部内容。此外,本说明书中引用的全部出版物如现有技术文献及公开公报、专利公报和其他专利文献均作为参考并入本说明书。
1.具有阵列化的多分区的核酸扩增用基材
本发明中使用的核酸扩增用基材(以下有时称为“基材”。)的材料(原料),由于用作进行加热处理的反应容器,因此优选在例如100℃以上的温度下也能够维持形状,更优选在110℃以上的温度下也能够维持形状。作为这样的材料,可以列举例如玻璃、硅、树脂等。作为树脂,可以使用环氧树脂、聚丙烯树脂、聚苯乙烯树脂、聚氨酯树脂等。
基材的形状没有特别限定。可以列举例如立方体、长方体(例如图1所例示的那种板状)、多角柱、三角柱、圆柱、椭圆柱等。从操作性、在反应、检测时与市售设备的适应性的观点出发,优选立方体或长方体。
对于基材的大小也没有特别限定。例如,从高通量性方面出发,在使用市售的热循环仪等加热设备时,优选为可以在该仪器内设置24枚以上,更优选为可以设置96枚以上的大小。因此,如果设为正方形或长方形的板状结构,则优选一条边(长方形的情况下为较长的边)为4~14mm的矩形,更优选一条边为6~12mm的矩形。
关于基材的厚度也没有特别限定,优选为可以在市售热循环仪等加热仪器中使用的厚度。例如,优选为1μm~5000μm,更优选为10μm~2000μm,进一步优选为100μm~500μm,根据情况也优选为100μm~250μm。
本发明的基材具有多个分区。分区的形状没有特别限定,可以列举例如立方体、长方体、圆柱、椭圆柱、三角锥、四角锥、半球等形状。其中,从作业性的优良性、制造的容易性等观点出发,优选立方体、长方体、圆柱等。
分区的大小也没有限定,例如,可以根据基材的大小、基材中所设的分区数等适当选择。例如,关于分区的形状,该形状的最大宽度(具体而言,圆柱的情况下为内径、立方体的情况下为一条边的长度、长方体的情况下为长边的长度)分别优选为10μm~1000μm左右,更优选为90μm~500μm左右,进一步优选为150μm~180μm左右。
分区的深度也没有特别限定,可以根据基材的厚度等适当选择。例如,优选为1μm~5000μm,更优选为10μm~2000μm,进一步优选为100μm~500μm,根据情况也优选为100μm~250μm。
本发明的基材中,分区可以如图2的剖面图所例示的那样贯穿基材,也可以不贯穿。在分区贯穿基材的情况下,分区的深度与基材的厚度相等。而在分区不贯穿基材的情况下,分区的深度比基材的厚度小。
为了用一枚基材一次性扩增较多靶核酸序列,优选在基材中设置尽量多的分区。优选为50个以上,更优选为100个以上,进一步优选为200个以上。
本发明中,基材具有的多个分区被阵列化。阵列化的含义包括例如哪种引物对包含在(配置在)哪个分区中是明确的。
在能够实施核酸扩增反应的范围内,基材表面可以进行各种处理。例如,可以通过在基材的平面上涂覆憎水性树脂来实施憎水加工,也可通过等离子处理进行亲水化,还可以通过γ-射线照射等进行灭菌处理。
2.亲水性凝胶
对于本发明的基材的分区中所保持的凝胶的种类,只要能够进行核酸扩增反应就没有限定。由于需要进行酶反应,因此优选使用亲水性凝胶。亲水性凝胶中,优选通过加热能够溶解的凝胶,具体而言,优选在室温附近(优选为25℃以下,更优选为30℃以下,进一步优选为35℃以下)以凝胶形式存在、在实施核酸扩增反应的温度(例如,在优选为60℃以上、更优选为50℃以上、进一步优选为40℃以上的加热条件下)时为液相(溶液状)的凝胶。这是因为,在核酸扩增反应时,该反应在溶液中(通过加热而溶解的亲水性凝胶中)高效进行,而在其他时间则由于形成凝胶而容易操作。
这种亲水性凝胶中,优选使用琼脂糖、藻酸、葡聚糖、乙烯醇、乙二醇等作为单体成分而调制的凝胶。这些单体成分可以单独使用,也可以2种以上组合使用。
此外,优选凝胶本身为不会阻碍核酸扩增反应的反应的材料。从这样的观点出发,例如,特别优选以宝生物(公司)制的Agarose LO3为首的琼脂糖凝胶。
本发明中使用的凝胶的浓度优选为0.5~2质量%,更优选为0.7~1.8质量%,进一步优选为0.9~1.6质量%。设为0.5质量%以上是为了避免凝胶强度明显下降。设为2质量%以下是由于在升高温度时能够容易地使凝胶再度溶解。
本发明的基材中,上述亲水性凝胶与后述含有核酸扩增用引物等的核酸扩增反应溶液一起被保持在各分区中。即,该保持后的各分区中的亲水性凝胶为含有核酸扩增反应溶液的状态。
3.用于扩增核酸的引物等
为了扩增多种靶核酸序列,阵列化的多个分区中,每个分区需要搭载有不同种类的引物对。引物本身可以是由DNA形成的寡核苷酸,在不影响特异性及反应性的范围内,也可以使用RNA、PNA、LNA等。
在能够确保靶核酸序列的扩增所需的特异性的范围内,期望这些不同种类的引物对分别设计成通过对GC含量、序列长度进行调整,从而引物间的核酸扩增反应的反应条件相同。这是由于考虑到,例如,当退火温度、作为靶序列的扩增产物的长度明显不同时,各个分区中合适的反应温度、时间会有所不同,存在难以同时进行反应的可能性。这种引物设计可以由本领域技术人员适当实施。
一组引物对可以仅包含在一个分区中,也可以包含在多个分区中。通过将同一引物对搭载在多个分区中,不仅可以验证再现性,还可以根据确认到扩增的分区与未确认到扩增的分区个数进行靶核酸的定量。
引物只要能够用于核酸扩增反应即可,即使进行了氨基化、生物素化、荧光标记等修饰也无妨。此外,根据目的,1个分区中包含2种以上的引物对也无妨。
对于各分区中包含的引物的浓度并没有特别限定,可以根据靶核酸的种类、扩增反应中使用的酶的种类等适当选择。例如,优选为1~1000fmol/μL,更优选为10~100fmol/μL,进一步优选为20~50fmol/μL。通过设为1fmol/μL以上,可以高效地扩增靶核酸序列。此外,通过设为1000fmol/μL以下,可以抑制非特异性扩增、引物二聚体的形成。
此外,在与前述亲水性凝胶一起保持于分区中的核酸扩增反应溶液中,可以预先含有上述引物以外的各种成分,例如dNTP、缓冲液成分、DNA聚合酶等,根据情况,也可以使其预先含有SYBR Green I、EtBr、PicoGreen等双链核酸特异性嵌入剂。为了提高凝胶的保水性,还可以含有甘油。除对多种样品进行操作的情况外,也可以预先导入模板溶液。
这里,对于缓冲液成分没有限定,例如,可以优选列举50mM KCl、10mMTris-HCl(pH8.4~9.0、25℃)、1.5mm MgCl2、0.01%明胶或0.01%Triton X-100的混合物等。
此外,对于DNA聚合酶没有限定,例如,可以优选列举pol I型耐热性DNA聚合酶如Taq聚合酶、Tth聚合酶,或者α型耐热性聚合酶如Pfu聚合酶、KOD聚合酶等。
4.本发明的基材的制造
本发明的核酸扩增反应用基材既可以在制作基材后形成分区,也可以使用中空的管、纤维制造基材。例如,可以通过包括以下工序的方法廉价且大量地制造。
(1)将多根中空纤维按照中空纤维的各纤维轴朝向同一方向的方式3维排列并将该排列用树脂固定,从而制造中空纤维束的工序
(2)将含有引物对的凝胶前体溶液导入到预先加热的中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序
(3)使导入到中空纤维束的中空部的凝胶前体溶液反应,从而将含有引物对的凝胶状物保持在中空纤维的中空部的工序
(4)在疏水性液体中将中空纤维束在与纤维的长度方向交叉的方向上切断,从而进行薄片化的工序。
作为本方法中可以使用的纤维,可以列举合成纤维、半合成纤维、再生纤维、天然纤维等。作为合成纤维的代表例,可以列举:尼龙6、尼龙66、芳香族聚酰胺等各种纤维,聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚碳酸酯等聚酯系的各种纤维,聚丙烯腈等丙烯酸系的各种纤维,聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃系的各种纤维,聚乙烯醇系的各种纤维,聚偏二氯乙烯系的各种纤维,聚氯乙烯系纤维,聚氨酯系的各种纤维,酚醛系纤维,聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯等形成的氟系纤维,聚亚烷基对氧基苯甲酸酯(polyalkylene paraoxybenzoate)系的各种纤维等。作为半合成纤维的例子,可以列举以二醋酸酯、三醋酸酯、几丁质、壳聚糖等为原料的纤维素系的各种再生纤维(人造丝、铜氨纤维、波里诺西克纤维(Polynosic)等)等。作为天然纤维的代表例,可以列举棉、亚麻等植物纤维,羊毛、蚕丝等动物纤维,石棉等矿物纤维等。
作为纤维的形态,可以使用公知的中空纤维。纤维的直径优选为1mm以下、数十微米以上。此外,以这种方式制作而成的分区的内壁也可以用BSA等具有抑制蛋白质的吸附的作用的物质覆盖,从而防止聚合酶等吸附。也可以用放射线处理等进行灭菌、用等离子处理等进行亲水化。
所谓通过凝胶保持生物相关物质,是指例如下述状态:当纤维为中空纤维时,凝胶利用化学或物理性相互作用被保持在中空部中,生物相关物质利用化学或物理性相互作用被保持在所保持的凝胶中。本方法中可以使用的凝胶并没有特别限制,可以使用例如琼脂糖、藻酸、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇等。
下面对包埋有多根纤维的中空纤维束进行说明。
为了使多根纤维按照各纤维轴大致相同的方式整齐排列,可以使用例如WO00/53736号中记载的排列治具来规整地排布。关于构成排列的纤维根数,可以按照每1cm2为10~1,000,000根进行排列。该纤维根数可以根据本发明的基材的分区数适当选择。
为了将前述排列好的纤维固定,将包埋剂均匀地注入呈排列状态的纤维之间并使其固化。包埋剂的种类可以列举包含交联性预聚物的包埋剂、包含聚合低聚物与催化剂的包埋剂以及热塑性聚合物等。
作为包含交联性预聚物的包埋剂,可以列举聚氨酯树脂。聚氨酯树脂可通过将固化剂添加到作为主剂的交联性预聚物即聚异氰酸酯中而制作。作为固化剂的例子,可以列举醇类、酮类、酰胺类、酯类、蓖麻油系多元醇等。其中,特别优选沸点为60℃以上的物质,作为具体例子,可以列举甘油、聚乙二醇、甲基乙基酮、乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯等。此外,除聚氨酯树脂外,还可利用环氧树脂、硅树脂等。
作为包含聚合性低聚物与催化剂的包埋剂,可以列举含有(甲基)丙烯酸酯〔A〕、和可溶于〔A〕成分的(甲基)丙烯酸系聚合物或共聚物〔B〕的丙烯酸系浆液作为例子。
作为上述〔A〕成分的具体例子,可以列举例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯等丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸十三烷基酯、甲基丙烯酸硬脂酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸烯丙酯等甲基丙烯酸酯,它们可以使用1种或将2种以上混合使用。
在单独(仅一种)将上述任意单体作为〔A〕成分使其固化而获得的树脂的玻璃化温度(由硬的状态变为软化状态的温度)低时,趋向于变软,如果玻璃化温度高,则获得的固化物趋向于变硬。因此,为了使其表现出理想的包埋剂硬度,优选基于该〔A〕成分的均聚物的玻璃化温度来适当选择并使用〔A〕成分。
可以作为上述〔B〕成分使用的(甲基)丙烯系聚合物必须可溶于〔A〕成分。予以说明,“可溶”也包括分散状态。作为〔B〕成分的具体例子,可以列举例如选自甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯等中的单体的均聚物或共聚物。它们可以使用1种或将2种以上混合而使用。关于〔A〕成分和〔B〕成分的使用比率,在将包含〔A〕成分和〔B〕成分的丙烯酸(酯)系浆液设为100质量份时,〔A〕成分在40~80质量份的范围、〔B〕成分在20~60质量份的范围,优选〔A〕成分在40~70质量份的范围、〔B〕成分在30~60质量份的范围。
此外优选在进行薄片化后,在包含〔A〕成分和〔B〕成分的丙烯酸系浆液中适当添加氨基甲酸酯低聚物、氨基甲酸酯聚合物或其它橡胶成分。作为丙烯酸系浆液的聚合引发剂,可以使用能够溶解于所使用的溶剂的偶氮系、过氧化物系、氧化还原系等引发剂。作为例子,可以列举2,2’-偶氮双异丁腈、2,2’-偶氮双(2-甲基丁腈)异丁腈、过氧化苯甲酰、或过氧化苯甲酰-二甲基苯胺系等。
作为属于热塑性聚合物的包埋剂,可以列举聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、ABS树脂、甲基丙烯酸树脂、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚缩醛、PBT树脂、聚苯硫醚、聚芳酯、聚砜、聚醚砜、聚醚醚酮、聚甲基戊烯、聚醚酰亚胺等。
被前述包埋剂包埋的包埋物在作为核酸扩增反应用基材使用时,有时要求其在生物相关物质的检测中荧光强度低。此时,优选在前述包埋剂中添加炭黑、淬灭剂等。此外,优选根据所使用的纤维种类考虑纤维与包埋剂的密合性从而选择包埋剂。例如,对于聚甲基丙烯酸甲酯中空纤维而言,优选由丙烯酸酯系浆液形成的包埋剂。
前述包埋剂的固化温度优选在纤维材料的玻璃化温度以下。进一步优选在100℃以下。通过对这样的包埋有多根纤维的包埋物在硬度为70~95(基于JISK7215测定)的状态下在与纤维交叉的方向上进行薄片化,能够获得薄片的表面平滑且不存在纤维脱落的、保持有生物相关物质的纤维排列体薄片。包埋剂的硬度是指基于JIS K7215测定的硬度,是指从加压面密合于包埋物起5秒后所测定的硬度。
在将凝胶保持在使用前述中空纤维的具有分区的基材中时,可以在将凝胶前体溶液填充到预先加热的前述中空纤维束内后,使其在中空纤维束内凝胶化,从而得以保持。这里,凝胶前体溶液是指含有引物对的未凝胶化的溶液。此外,上述中空纤维束预先加热到的温度可以根据所填充的凝胶前体溶液的种类等适当设定,没有限定,例如,优选为50~90℃,更优选为60~80℃,进一步优选为70~75℃。通过预先加热中空纤维束,可以获得使凝胶前体溶液向中空纤维束内的导入极其顺利地进行等效果。此后,将保持有凝胶状物的中空纤维束在疏水性液体中在与纤维的长度方向交叉的方向上切断,进行薄片化(即,在垂直于中空纤维束的贯通孔的取向方向的方向上进行薄片化),从而可以获得保持有凝胶的核酸扩增反应用基材。这里,对所谓疏水性液体没有限定,可以优选例示例如矿物油及液体石蜡等。通过在疏水性液体中进行上述薄片化,可以获得即使在薄片化后凝胶状物也被充分保持在中空纤维内的状态的高品质基材。
关于将凝胶前体溶液填充到中空纤维束内的方法,例如,可以通过将前述溶液抽吸到具有微细的针的注射器中,将针插入到各中空纤维的中空部从而进行导入。
此外,在使用以树脂将中空纤维固定从而制造的中空纤维束时,当中空纤维束的一个端部未被固定时,也可以通过下述方法将凝胶前体溶液导入到中空纤维内。首先,将中空纤维束的已被固定的端部的中空部封闭,使未被固定的另一个端部的中空部开放。然后,调制含有引物对的凝胶前体溶液,将该凝胶前体溶液及前述中空纤维束置于干燥器内,接着,将中空纤维束的中空纤维未被固定的端部浸入该溶液中,使干燥器内处于减压状态后再恢复至常压,从而可以将该溶液由中空纤维的浸入到溶液中的端部导入至中空纤维中空部。
使导入到中空纤维的中空部的凝胶前体溶液凝胶化,从而将引物对保持在中空纤维的中空部。凝胶化条件没有特别限定,可以根据所使用的凝胶前体的种类等适当选择。例如,若为琼脂糖,则可以通过使预先加热而成为液体的凝胶前体溶液冷却至凝胶化温度以下来进行凝胶化。
接着,对排列有纤维的包埋物的薄片化进行说明。
在进行薄片化时,将包埋物在与该包埋物的纤维轴交叉的方向上切断。切断的角度没有限定,可以根据实验等的目的适当选择。例如,相对于纤维轴为45~90°、优选为60~90°、进一步优选为垂直的方向(相对于纤维轴为90°)。
切断所使用的刀具的刀尖角度优选为20°以下,进一步优选为15°以下。作为刀具的材质,可以例示例如碳钢、SUS、超硬合金等。此外,作为装置,还可以使用市售的切片机实施薄片化。薄片的厚度如上所述。
这样制作的薄片可以作为用于扩增多条靶核酸序列的核酸扩增反应用基材使用。
5.本发明的基材的使用
关于使用本发明的核酸扩增反应用基材对核酸进行扩增和检测的方法,只要是使用引物的方法即可,既可以是施加热循环的PCR法,也可以是等温反应的LAMP法。这些方法中,本领域技术人员可以适当实施核酸扩增反应的条件设定、引物设计等。不过,反应时的温度必须为核酸扩增反应用基材中的凝胶的熔点以上。
作为将核酸扩增用基材用于核酸扩增反应的方法,可以为以下所示的方法。
模板的供给
首先,在反应开始前,将作为样品的包含靶碱基序列的核酸(以下称为“模板”。)供给至本发明的基材中的各分区。该模板可以以例如粉末状等固体的形式供给,也可以作为溶液供给。
关于模板,只要是通常的核酸扩增反应中所使用的作为模板的核酸,就可以使用任意的核酸。通常,为了研究其中所含有的核酸而使用来源于天然物质的样品,但也可以使用由其精制的核酸,根据用途还可以使用细胞、组织的破碎液及其上清。此外,还可以使用人工合成的核酸作为模板。也可以以mRNA的逆转录产物作为模板。
模板可以以溶液形式使用移液器那样的分注器具供给至各分区。这样可以防止分注至各分区的引物的游离和混合。还可以使用阵列点样仪(arrayer)、操作器(manipulator)等装置供给至基材的各分区。
另一方面,通过将滴加模板溶液并使其干燥从而将其涂布在模板供给用材料上的产物粘贴在基材表面上,可以一次性将模板供给至各分区。此时,模板的形状可以为板状,也可以为片状或薄膜状。
在以将模板供给用材料粘贴在本发明的基材上的状态供于反应时,模板供给用材料也必须具有能够在核酸扩增反应中使用的程度的耐热性,为了直接对扩增产物进行检测,期望是不会阻碍所适用的检测方法的材质。此外,为了使用方便,期望模板供给用材料可以压接在除了凝胶以外的基板表面上。
作为这样的模板供给用材料,可以列举聚烯烃制的薄膜等。此外,还可以使用实时PCR等中用于孔的密封的那种薄膜。
作为将模板涂布在模板供给用材料上的方法,可以使用移液器等液体操作器具,也可以是用吸附有样品溶液的棉棒、笔、纸尖(paper point)等在薄膜上涂抹的方法。为了均匀地进行涂布,还可以以滴加到薄膜上的模板溶液为中心部分使该溶液旋转从而进行涂布。
在供给模板溶液时,在分区并未贯穿基材的情况下,可以使含有模板的模板供给用材料在与分区接触的面上进行接触。此外,在如图2的剖面图所示那样分区贯穿基材的情况下,可以使含有模板的模板供给用材料接触基材的两个面,也可以使含有模板的模板供给用材料接触任意一个面、而另一个面接触不含模板的材料(图3)。
模板供给用材料可以根据需要实施各种表面处理。例如,通过用鲑鱼精DNA等封闭剂包覆(处理),还可以防止作为模板的核酸固着在模板供给用基材表面。也可以用放射线处理等进行灭菌、用等离子处理等进行亲水化。
对于如上所述地接触过模板的核酸扩增反应用基材,可以用热源夹持基材的一面或两面,从而实施核酸扩增反应。此时,为了使分区内的凝胶、凝胶的溶解物不发生泄露,需要对分区的末端进行密封。
此外,例如,还可以如图4所示那样将核酸扩增反应用基材包埋(浸渍)在矿物油等使凝胶内容物不会泄露的疏水性液体中后,再实施核酸扩增反应。矿物油与凝胶溶液之间形成边界,因此无需对分区的末端进行密封。此外,此时也可以在将用于使核酸扩增反应用基材与模板接触的薄膜剥离后供于核酸扩增反应。
反应时,还可以通过加入对于核酸双链特异性地发出荧光的嵌入剂,使用市售的荧光检测器、荧光显微镜等简便地对扩增的有无进行确认。
进而,也可以通过在扩增后与矿物油一起离心而取出内部的凝胶。还可以使取出的凝胶溶解而获得内部的扩增核酸。还可以通过预先密封获得目标的分区以外的分区而仅获得作为目标的凝胶。
基材的加热
通过对供给模板后的基材进行加热来进行核酸扩增反应。扩增核酸时的反应条件(加热条件)没有限定,可以根据所使用的酶(聚合酶等)、模板等适当选择。例如,在进行PCR法的情况下,可以例示重复进行30个循环左右的作为热循环的下述工序等:为了使双链核酸解离,在98℃加热10秒;为了进行退火,在55℃加热30秒;为了进行核酸的延伸反应,在72℃加热1分钟。本领域技术人员可以适当选择各工序的温度、时间及循环数。此外,在进行LAMP法的情况下,可以例示在例如50~70℃进行等温加热,本领域技术人员可以适当选择加热时间。
6.试剂盒
本发明的基材还能够作为核酸扩增用试剂盒使用。试剂盒中优选含有本发明的基材和模板供给用基材。
以下列举实施例更具体地对本发明进行说明,但本发明不限于这些实施例。
实施例1
树脂块的制作
使用2块在板的中央部以0.42mm间隔呈格子状排列有19×12、即228个直径为0.32mm的孔的、厚度为0.1mm的多孔板,使以炭黑着色的聚碳酸酯制中空纤维(三菱丽阳株式会社制,外径0.28mm、内径0.18mm,长度500mm)通过该多孔板的所有孔,使这2块通过有纤维的多孔板间隔50mm,在间隔开的多孔板间填充以炭黑着色的聚氨酯树脂(日本聚氨酯工业株式会社制,Nippolan4276及Coronate4403),从而获得在长度为50mm、7×12mm见方的棱柱状的两端具有未被树脂固定的部分的树脂块。
PCR溶液的调制
准备检测对象不同的3种引物对、即共6种引物(下述的A1(序列号1)、A2(序列号2)、B1(序列号3)、B2(序列号4)、C1(序列号5)、C2(序列号6)),使其浓度各为10pmol/μL,使用含有dNTP、缓冲液、DNA聚合酶的PCR预混合物(宝生物株式会社PremixTaq)、琼脂糖(宝生物株式会社LO3)、SYBR Green I(LifeTechnologies公司)、Streptavidin-Cy5(GEHealthcare公司)、超纯水,调制对应于引物对的3种核酸扩增反应溶液(参照下表1)。
引物A1:caggcagacggaagagttcg(序列号1)
引物A2:ttatcacgtccttcttcgcc(序列号2)
引物B1:cagatatttgacataactagggaag(序列号3)
引物B2:ctttcgcttgaccatattattgtcc(序列号4)
引物C1:gaaactatatagtagaacaaacaag(序列号5)
引物C2:atcggctcttactacctaggc(序列号6)
[表1]
核酸扩增反应溶液向树脂块的导入
将所调制的3种核酸扩增反应溶液用加热块在80℃加热5分钟,使琼脂糖溶解。在琼脂糖已溶解的核酸扩增反应溶液中,各浸渍5根预先加热至65℃的树脂块的、从末端探出的中空纤维,从该中空纤维的另一端抽吸凝胶溶液,从而将核酸扩增反应溶液导入树脂块内。
将树脂块冷却至室温,从而使内部的核酸扩增反应溶液凝胶化。
通过切片获得核酸扩增反应用基材
使用切片机,将上述获得的填充有由包含3种引物对的核酸扩增反应溶液形成的凝胶的树脂块切成250μm的厚度,获得纵向12×横向19的共计228个孔规则地排列的核酸扩增反应用基材。为了防止干燥,将获得的核酸扩增反应用基材的两面用玻璃纸胶带密封。
向片材涂布模板溶液
作为模板溶液,准备1amol/μL浓度的包含仅能通过引物A1和A2的组合扩增的靶核酸序列A(序列号7)的DNA。
靶核酸序列A:
caggcagacggaagagttcgctatagctcagttggttagagcgctacactgataatgtagaggtcggcagttcaactctgggcgaagaaggacgtgataa(序列号7)。
将10μL的模板溶液滴加在切成1cm见方的压接用片材(LifeTechnologies公司Micro Optical Adhensive film)上,用移液器的尖端涂布在片材上,室温下静置,使其干燥。
核酸扩增反应用基材与涂布了模板的片材的接触
剥掉核酸扩增反应用基材一面的玻璃纸胶带,将涂布有模板溶液的片材压接在该面上。然后,剥掉相反侧的玻璃纸胶带,浸渍在装有50μL矿物油(QIAGEN公司)的样品管中。
PCR实施前的检测
在实施PCR前,使用荧光显微镜通过透镜单元(奥林巴斯WIB-UMWIB3)检测特异性地嵌入双链核酸中的SYBR Green I的荧光,用CCD相机拍照后,对各孔中的荧光强度通过图像处理软件(Media Cybernetics公司ImagePro)进行数值化(图5)。由于没有实施PCR反应,因此尚未生成双链核酸,这里所获得的信号可以被视为背景。
PCR的实施
将浸渍有核酸扩增反应用基材的Eppendorf管置于热循环仪中,以98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟作为1个循环,反复进行30个该循环。
扩增产物的检测
使用荧光显微镜,通过透镜单元(奥林巴斯WIB-UMWIB3)检测特异性地嵌入双链核酸中的SYBR Green I的荧光,用CCD相机拍照后,对各孔中的荧光强度通过图像处理软件(Media Cybernetics公司ImagePro)进行数值化,结果3种引物组中,仅在导入有引物对A的分区中确认到信号强度的显著增强。
因此可知,保持在所使用的核酸扩增用基材中的3种引物对中,仅在保持有引物对A的凝胶中进行了特异性扩增(图5)。
实施例2
通过与实施例1记载的方法相同的方法调制树脂块及核酸扩增反应溶液。不过,在本实施例中,核酸扩增反应溶液不含引物,该溶液设为单一组成。
核酸扩增反应溶液向树脂块的导入
将所调制的核酸扩增反应溶液用加热块在80℃加热5分钟,使琼脂糖溶解。将加热块及树脂块等全部放入70℃环境的恒温装置中,在该温度条件下,将各19根从树脂块的末端探出的中空纤维浸渍在琼脂糖已溶解的核酸扩增反应溶液中,从该中空纤维的另一端抽吸凝胶溶液,重复进行12次该操作,从而将核酸扩增反应溶液导入树脂块内。
将树脂块体冷却至室温,使内部的核酸扩增反应溶液凝胶化。
通过切片获得核酸扩增反应用基材
用切片机,在用矿物油(QIAGEN公司)包覆树脂块表面及切片刀的条件下(具体而言,在将树脂块体浸渍在矿物油中的状态下),将上述获得的填充有由核酸扩增反应溶液形成的凝胶的树脂块切成500μm的厚度,获得15片纵向12×横向19的共计228个孔规则地排列的核酸扩增反应用基材。
此外,用切片机在不使用矿物油的条件下使用同样的树脂块切出500μm的厚度,获得15片同样的核酸扩增反应用基材。
关于通过切片获得的核酸扩增反应用基材,分别用光学显微镜进行观察,调查树脂块中的中空纤维内所负载的琼脂糖凝胶的比率(残存比率),结果如图6所示。
即已经获知:在将琼脂糖凝胶以点(spot)的形态进行使用时,通过在矿物油等疏水性液体中对填充有凝胶的树脂块进行切片,可以获得品质稳定的核酸扩增反应用基材。
产业可利用性
通过使用本发明的基材及方法,可以显著提高作为检测对象的生物相关物质的扩增效率或检测效率。
序列表自由文本
序列号1:引物
序列号2:引物
序列号3:引物
序列号4:引物
序列号5:引物
序列号6:引物
序列号7:模板
Claims (10)
1.一种核酸扩增用基材,其具有阵列化的多个分区,在该分区中保持有通过加热能够溶解的亲水性凝胶,所述亲水性凝胶含有用于扩增核酸的不同种类的引物对、DNA聚合酶及缓冲液成分。
2.根据权利要求1所述的基材,各分区中引物的浓度为1~1000fmol/μL。
3.根据权利要求1或2所述的基材,缓冲液成分包含选自由KCl、Tris-HCl、MgCl2、明胶及Triton X-100组成的组中的至少1种。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的基材,亲水性凝胶为使用选自由琼脂糖、藻酸、葡聚糖、乙烯醇及乙二醇组成的组中的至少1种作为单体成分而调制的凝胶。
5.根据权利要求1~3的任一项所述的基材,亲水性凝胶为琼脂糖凝胶。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的基材,亲水性凝胶的浓度为0.5~2质量%。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的基材,各分区的大小是该分区的形状的最大宽度为10μm~1000μm。
8.一种权利要求1所述的核酸扩增用基材的制造方法,其包括下述工序,
(1)将多根中空纤维按照中空纤维的各纤维轴朝向同一方向的方式3维排列并将该排列用树脂固定,从而制造中空纤维束的工序,
(2)将含有引物的凝胶前体溶液导入到预先加热的中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序,
(3)使导入到中空纤维束的中空部的凝胶前体溶液反应,从而将含有引物的凝胶状物保持在中空纤维的中空部的工序,
(4)在疏水性液体中将中空纤维束在与纤维的长度方向交叉的方向上切断,从而进行薄片化的工序。
9.一种核酸扩增用试剂盒,其含有权利要求1~7的任一项所述的基材和模板供给用基材。
10.一种核酸扩增方法,其包括对权利要求1~7的任一项所述的基材的各分区供给模板的工序和对该供给后的基材进行加热的工序。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140806 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |