JP2002335960A - Ｐｃｒ用マイクロプレート及びそれを用いたｐｃｒ法 - Google Patents
Ｐｃｒ用マイクロプレート及びそれを用いたｐｃｒ法Info
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- JP2002335960A JP2002335960A JP2001144118A JP2001144118A JP2002335960A JP 2002335960 A JP2002335960 A JP 2002335960A JP 2001144118 A JP2001144118 A JP 2001144118A JP 2001144118 A JP2001144118 A JP 2001144118A JP 2002335960 A JP2002335960 A JP 2002335960A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】マイクロプレートに高密度でウェルを形成して
も、ＰＣＲ反応液の分注及び増幅されたＤＮＡの回収が
極めて容易で、しかも、回収時にコンタミネーションを
起こさないようにする。 【解決手段】目的とする鋳型ＤＮＡ含むＰＣＲ反応液を
導入してＤＮＡ増幅を行わせる多数のウェル（３…）
を、プレート本体（２）の表裏を貫通して毛細管状に形
成した。
も、ＰＣＲ反応液の分注及び増幅されたＤＮＡの回収が
極めて容易で、しかも、回収時にコンタミネーションを
起こさないようにする。 【解決手段】目的とする鋳型ＤＮＡ含むＰＣＲ反応液を
導入してＤＮＡ増幅を行わせる多数のウェル（３…）
を、プレート本体（２）の表裏を貫通して毛細管状に形
成した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡを酵素を用
いて大量増幅する際に用いるＰＣＲ用マイクロプレート
及びそれを用いたＰＣＲ法に関する。
いて大量増幅する際に用いるＰＣＲ用マイクロプレート
及びそれを用いたＰＣＲ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ（polymerase chain reaction）
法は、目的とするＤＮＡ領域を挟む２種のプライマを用
いて、特定のＤＮＡ断片を酵素を用いて無生物的に数十
万〜数百万倍以上に増幅する手法であり、ヒトゲノム解
析などの大規模クローニング、シークエンスには欠かせ
ない技術となっている。また、遺伝子診断、犯罪捜査、
化石の遺伝子解析など、応用範囲もきわめて広い。
法は、目的とするＤＮＡ領域を挟む２種のプライマを用
いて、特定のＤＮＡ断片を酵素を用いて無生物的に数十
万〜数百万倍以上に増幅する手法であり、ヒトゲノム解
析などの大規模クローニング、シークエンスには欠かせ
ない技術となっている。また、遺伝子診断、犯罪捜査、
化石の遺伝子解析など、応用範囲もきわめて広い。
【０００３】具体的には、まず、合成素材となる４種類
のｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡプライマー、
緩衝液、水、塩化マグネシウム等からなるＰＣＲ溶液で
鋳型ＤＮＡを希釈してＰＣＲ反応液を作り、ＰＣＲ用マ
イクロプレートに多数形成されたウェル（穴）の一つ一
つに分注する。
のｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡプライマー、
緩衝液、水、塩化マグネシウム等からなるＰＣＲ溶液で
鋳型ＤＮＡを希釈してＰＣＲ反応液を作り、ＰＣＲ用マ
イクロプレートに多数形成されたウェル（穴）の一つ一
つに分注する。
【０００４】次いで、この微小試験管やＰＣＲ用マイク
ロプレートを、変性（２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離さ
せる９１℃以上の温度）−会合（１本鎖ＤＮＡにＤＮ
Ａプライマーをアニールさせる５０℃前後の温度）−
伸長（ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための７２
℃程度の温度）の３ステップの温度プロフィールを１サ
イクルとし、これを数１０サイクル繰り返すことにより
増幅を行なうものである。
ロプレートを、変性（２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離さ
せる９１℃以上の温度）−会合（１本鎖ＤＮＡにＤＮ
Ａプライマーをアニールさせる５０℃前後の温度）−
伸長（ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための７２
℃程度の温度）の３ステップの温度プロフィールを１サ
イクルとし、これを数１０サイクル繰り返すことにより
増幅を行なうものである。
【０００５】一方、近年、バイオテクノロジーを含め多
岐の分野にわたり、莫大なサンプルの中から望ましい性
質をもつ分子（遺伝子）などをセレクションまたはスク
リーニングするコンビナトリアルライブラリと呼ばれる
手法が定着している。
岐の分野にわたり、莫大なサンプルの中から望ましい性
質をもつ分子（遺伝子）などをセレクションまたはスク
リーニングするコンビナトリアルライブラリと呼ばれる
手法が定着している。
【０００６】このライブラリの構築には、選択した分子
の再現性が必要であり、再現性を確保するためには、分
子の機能及び性質が分子の構造を示す情報と１対１に対
応しなければならない。そして、タンパク質ライブラリ
を構築する場合、ＤＮＡを介してこの対応関係を明確化
させることができる。
の再現性が必要であり、再現性を確保するためには、分
子の機能及び性質が分子の構造を示す情報と１対１に対
応しなければならない。そして、タンパク質ライブラリ
を構築する場合、ＤＮＡを介してこの対応関係を明確化
させることができる。
【０００７】すなわち、多数（１０９〜１０１２分子）
の変異ＤＮＡから、１分子のＤＮＡを取り出して増幅
し、その一部を鋳型として in vitro の遺伝子発現系で
タンパク質を合成すれば、鋳型ＤＮＡと合成されたタン
パク質は１対１の対応関係があるので、そのタンパク質
の機能をアッセイすることによりタンパク質ライブラリ
が構築できる。
の変異ＤＮＡから、１分子のＤＮＡを取り出して増幅
し、その一部を鋳型として in vitro の遺伝子発現系で
タンパク質を合成すれば、鋳型ＤＮＡと合成されたタン
パク質は１対１の対応関係があるので、そのタンパク質
の機能をアッセイすることによりタンパク質ライブラリ
が構築できる。
【０００８】このようにＤＮＡを増幅する手法の一つと
してＰＣＲ法が用いられる。そして、１分子のＤＮＡを
増幅する場合は、マイクロプレートに形成された個々の
ウェルに注入される容量中に鋳型ＤＮＡが１分子だけ存
在する濃度にＰＣＲ反応液を希釈する。
してＰＣＲ法が用いられる。そして、１分子のＤＮＡを
増幅する場合は、マイクロプレートに形成された個々の
ウェルに注入される容量中に鋳型ＤＮＡが１分子だけ存
在する濃度にＰＣＲ反応液を希釈する。
【０００９】次いで、このＰＣＲ反応液をマイクロプレ
ートに分注すれば、多少のばらつきはあっても確率的に
は各ウェルにＤＮＡが１分子ずつ存在することになり、
このマイクロプレートを、変性（９１℃以上）−会合
（約５０℃）−伸長（７２℃）の３ステップの温度プロ
フィールを１サイクルとして、所定回数繰り返す。この
とき、ＤＮＡは１サイクルで倍に増幅されることから、
２０サイクル繰り返せば、１分子のＤＮＡが計算上は１
千万倍に増幅されることになる。
ートに分注すれば、多少のばらつきはあっても確率的に
は各ウェルにＤＮＡが１分子ずつ存在することになり、
このマイクロプレートを、変性（９１℃以上）−会合
（約５０℃）−伸長（７２℃）の３ステップの温度プロ
フィールを１サイクルとして、所定回数繰り返す。この
とき、ＤＮＡは１サイクルで倍に増幅されることから、
２０サイクル繰り返せば、１分子のＤＮＡが計算上は１
千万倍に増幅されることになる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】ところで、ＰＣＲ法を
利用してタンパク質ライブラリを構築しようとする場
合、多種類のＤＮＡを短時間且つ低コストで増幅するこ
とが要求される。
利用してタンパク質ライブラリを構築しようとする場
合、多種類のＤＮＡを短時間且つ低コストで増幅するこ
とが要求される。
【００１１】ＰＣＲ法では、マイクロプレートのウェル
の数に応じた種類のＤＮＡを同時に増幅することができ
るので、個々のウェルの容量を小さくしてその密度を増
やせば、処理数を増大させることができる。同時に、１
ウェルあたりのＰＣＲ反応液の使用量を少なくすること
ができ、ＰＣＲ反応液は非常に高価であることから低コ
スト化を図ることができる。
の数に応じた種類のＤＮＡを同時に増幅することができ
るので、個々のウェルの容量を小さくしてその密度を増
やせば、処理数を増大させることができる。同時に、１
ウェルあたりのＰＣＲ反応液の使用量を少なくすること
ができ、ＰＣＲ反応液は非常に高価であることから低コ
スト化を図ることができる。
【００１２】現在市販されているマイクロプレートは、
８ｃｍ×１０ｃｍ程度のプラスチックプレートに多くて
も１６×２４＝３８４穴のウェルが形成されており、そ
の密度は約４.８ウェル／ｃｍ２、各ウェルに注入され
るＰＣＲ反応液の容量は約１０μｌである。この場合
に、ＰＣＲ反応液の一回使用分（４０００μｌ）のコス
トは５〜１０万円もするので、各ウェルの容量を小さく
して小ピッチで配列形成することにより、全体としてＰ
ＣＲ反応液の使用量を抑えることができれば、その分、
大幅なコスト削減につながる。
８ｃｍ×１０ｃｍ程度のプラスチックプレートに多くて
も１６×２４＝３８４穴のウェルが形成されており、そ
の密度は約４.８ウェル／ｃｍ２、各ウェルに注入され
るＰＣＲ反応液の容量は約１０μｌである。この場合
に、ＰＣＲ反応液の一回使用分（４０００μｌ）のコス
トは５〜１０万円もするので、各ウェルの容量を小さく
して小ピッチで配列形成することにより、全体としてＰ
ＣＲ反応液の使用量を抑えることができれば、その分、
大幅なコスト削減につながる。
【００１３】このような問題を解決するために、ウェル
の高密度化を図ること自体は技術的に困難ではないが、
現実にはウェルを小さくすればするほどＰＣＲ反応液の
分注及び増幅されたＤＮＡの回収が困難になる。すなわ
ち、通常は分注操作も回収操作もニードルを使用してい
るため、ウェルの内径をニードルの外形より小さくする
ことはできないし、ウェルを小さくすればニードルの位
置決め精度もシビアになる。
の高密度化を図ること自体は技術的に困難ではないが、
現実にはウェルを小さくすればするほどＰＣＲ反応液の
分注及び増幅されたＤＮＡの回収が困難になる。すなわ
ち、通常は分注操作も回収操作もニードルを使用してい
るため、ウェルの内径をニードルの外形より小さくする
ことはできないし、ウェルを小さくすればニードルの位
置決め精度もシビアになる。
【００１４】さらに、回収操作は、ＤＮＡが大量に増幅
されているウェル内にニードルを挿入して吸い込んで行
なうため、他のウェルのＤＮＡとコンタミネーションを
起こさないように一のウェルの回収操作が終了するたび
に、そのニードルをきれいに洗浄しなければならない。
されているウェル内にニードルを挿入して吸い込んで行
なうため、他のウェルのＤＮＡとコンタミネーションを
起こさないように一のウェルの回収操作が終了するたび
に、そのニードルをきれいに洗浄しなければならない。
【００１５】しかし、ニードルをどんなにきれいに洗浄
しても、分子レベルの付着物の有無を確認することは極
めて困難であるので、コンタミネーションを完全に防止
することはできなかった。
しても、分子レベルの付着物の有無を確認することは極
めて困難であるので、コンタミネーションを完全に防止
することはできなかった。
【００１６】そこで本発明は、マイクロプレートに６０
〜１００ウェル／ｃｍ２程度若しくはそれ以上の高密度
でウェルを形成しても、ＰＣＲ反応液の分注及び増幅さ
れたＤＮＡの回収が極めて容易で、しかも、回収時にコ
ンタミネーションを起こさないようにすることを技術的
課題としている。
〜１００ウェル／ｃｍ２程度若しくはそれ以上の高密度
でウェルを形成しても、ＰＣＲ反応液の分注及び増幅さ
れたＤＮＡの回収が極めて容易で、しかも、回収時にコ
ンタミネーションを起こさないようにすることを技術的
課題としている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】この課題を解決するため
に、請求項１のＰＣＲ用マイクロプレートは、目的とす
る鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を導入してＤＮＡ増幅
を行わせる多数のウェルが、プレート本体の表裏を貫通
して毛細管状に形成されたことを特徴とする。
に、請求項１のＰＣＲ用マイクロプレートは、目的とす
る鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を導入してＤＮＡ増幅
を行わせる多数のウェルが、プレート本体の表裏を貫通
して毛細管状に形成されたことを特徴とする。
【００１８】請求項１の発明によれば、例えば、直径
０.５ｍｍの毛細管状のウェルを、厚さ２ｍｍのプレー
ト本体の表裏に貫通させ、１ｍｍピッチで縦横に２１×
２１＝４４１個配列形成すると、密度は１００ウェル／
ｃｍ２程度になる。
０.５ｍｍの毛細管状のウェルを、厚さ２ｍｍのプレー
ト本体の表裏に貫通させ、１ｍｍピッチで縦横に２１×
２１＝４４１個配列形成すると、密度は１００ウェル／
ｃｍ２程度になる。
【００１９】そして、各ウェルにＰＣＲ反応液を分注す
る場合は、従来のようにニードルで各ウェルに注入して
いくのではなく、請求項４に記載されているように、プ
レート本体をＰＣＲ反応液に浸漬させると、ＰＣＲ反応
液は毛細管現象により全てのウェルに一斉に吸い上げら
れて導入されるので、４４１個のウェルの分注時間は１
秒もあれば十分である。
る場合は、従来のようにニードルで各ウェルに注入して
いくのではなく、請求項４に記載されているように、プ
レート本体をＰＣＲ反応液に浸漬させると、ＰＣＲ反応
液は毛細管現象により全てのウェルに一斉に吸い上げら
れて導入されるので、４４１個のウェルの分注時間は１
秒もあれば十分である。
【００２０】毛細管現象によりウェルに吸い上げられた
ＰＣＲ反応液は、主成分が水であるのでウェルの内壁と
の接触角が鋭角となり、その表面張力によりがウェル内
に留まろうとする力が作用する。したがって、ウェルが
ＰＣＲ用マイクロプレートに貫通形成されていても、Ｐ
ＣＲ反応液が流れ落ちることなく、ウェル内に保持され
る。
ＰＣＲ反応液は、主成分が水であるのでウェルの内壁と
の接触角が鋭角となり、その表面張力によりがウェル内
に留まろうとする力が作用する。したがって、ウェルが
ＰＣＲ用マイクロプレートに貫通形成されていても、Ｐ
ＣＲ反応液が流れ落ちることなく、ウェル内に保持され
る。
【００２１】このとき、各ウェルの容量は約０.４μｌ
であるが、実際にはＰＣＲ反応液の表面張力が作用する
ため、せいぜい０.２〜０.３μｌ程度である。したがっ
て、全てのウェルにＰＣＲ反応液を注入しても、一回の
使用量は０.３×４４１＝１３２μｌ程度で足り、一回
に約４０００μｌものＰＣＲ反応液を使用する従来のマ
イクロプレートの１／３０程度で足りる。
であるが、実際にはＰＣＲ反応液の表面張力が作用する
ため、せいぜい０.２〜０.３μｌ程度である。したがっ
て、全てのウェルにＰＣＲ反応液を注入しても、一回の
使用量は０.３×４４１＝１３２μｌ程度で足り、一回
に約４０００μｌものＰＣＲ反応液を使用する従来のマ
イクロプレートの１／３０程度で足りる。
【００２２】なお、請求項２の発明のように、プレート
本体の表裏両面に撥水加工を施し、各ウェルの内壁に親
水加工を施しておけば、プレート本体の表裏に付着した
ＰＣＲ反応液を撥じいて、ウェル内にのみ取り込むこと
ができるので、ＰＣＲ反応液の無駄をより少なくするこ
とができる。
本体の表裏両面に撥水加工を施し、各ウェルの内壁に親
水加工を施しておけば、プレート本体の表裏に付着した
ＰＣＲ反応液を撥じいて、ウェル内にのみ取り込むこと
ができるので、ＰＣＲ反応液の無駄をより少なくするこ
とができる。
【００２３】また、請求項３の発明は、プレート本体の
片面側に密接させた状態で、各ウェルの開口位置に対応
する位置にウェルより大きな開口径を有する凹部又は透
孔が形成された伝熱面を有する伝熱プレートを備えてい
る。
片面側に密接させた状態で、各ウェルの開口位置に対応
する位置にウェルより大きな開口径を有する凹部又は透
孔が形成された伝熱面を有する伝熱プレートを備えてい
る。
【００２４】この請求項３の発明によれば、ＰＣＲ反応
液の分注後にプレート本体の裏面又は表裏両面に伝熱プ
レートを装着することにより、ウェルの開口部と伝熱プ
レートの間に隙間が生じるので、ＰＣＲ用マイクロプレ
ートに振動など多少の外力が作用して液面が動いても、
ウェル内に保持されているＰＣＲ反応液が漏れ出しにく
くなる。
液の分注後にプレート本体の裏面又は表裏両面に伝熱プ
レートを装着することにより、ウェルの開口部と伝熱プ
レートの間に隙間が生じるので、ＰＣＲ用マイクロプレ
ートに振動など多少の外力が作用して液面が動いても、
ウェル内に保持されているＰＣＲ反応液が漏れ出しにく
くなる。
【００２５】そして、請求項５の発明のように、予め設
定された温度サイクルでＰＣＲ用マイクロプレートの温
度を所定回数繰返し昇降温させてＤＮＡを増幅させた
後、各ウェル内のＤＮＡを回収する際に、貫通形成され
た各ウェルの一方の開口部から個別にエアを吹き付け、
当該ウェル内で増幅されたＤＮＡを他方の開口部からエ
アで順次圧し出して、これをマイクロチューブ（微小試
験管）等に回収すれば、非接触で各ウェル内のＤＮＡを
回収できるので、異なるウェルで増殖されたＤＮＡ同士
がコンタミネーションを起こすこともない。
定された温度サイクルでＰＣＲ用マイクロプレートの温
度を所定回数繰返し昇降温させてＤＮＡを増幅させた
後、各ウェル内のＤＮＡを回収する際に、貫通形成され
た各ウェルの一方の開口部から個別にエアを吹き付け、
当該ウェル内で増幅されたＤＮＡを他方の開口部からエ
アで順次圧し出して、これをマイクロチューブ（微小試
験管）等に回収すれば、非接触で各ウェル内のＤＮＡを
回収できるので、異なるウェルで増殖されたＤＮＡ同士
がコンタミネーションを起こすこともない。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
に基づいて具体的に説明する。図１は本発明に係るＰＣ
Ｒ用マイクロプレートの一例を示す説明図、図２〜図４
はその使用状態を示す概念図である。
に基づいて具体的に説明する。図１は本発明に係るＰＣ
Ｒ用マイクロプレートの一例を示す説明図、図２〜図４
はその使用状態を示す概念図である。
【００２７】本例のＰＣＲ用マイクロプレート１は、正
方形のプレート本体２に、ＰＣＲ反応液を導入してＤＮ
Ａ増幅を行わせる多数のウェル３…が、その表裏を貫通
して毛細管状に形成されると共に、プレート本体２の表
裏に装着される一対の伝熱プレート４、４を備えてい
る。
方形のプレート本体２に、ＰＣＲ反応液を導入してＤＮ
Ａ増幅を行わせる多数のウェル３…が、その表裏を貫通
して毛細管状に形成されると共に、プレート本体２の表
裏に装着される一対の伝熱プレート４、４を備えてい
る。
【００２８】本例では、直径０.５ｍｍのウェル３…
が、厚さ２ｍｍの正方形のプレート本体２に、１ｍｍピ
ッチで縦横に２１×２１＝４４１個形成され、密度は１
００ウェル／ｃｍ２程度になる。このとき、ウェル３の
容量は約０.４μｌであるが、実際にはＰＣＲ反応液の
表面張力が作用するため、実質的に０.２〜０.３μｌ程
度となり、全てのウェル３にＰＣＲ反応液を分注して
も、一回の使用量は０.３×４４１＝１３２μｌ程度と
極めて少量でたりる。
が、厚さ２ｍｍの正方形のプレート本体２に、１ｍｍピ
ッチで縦横に２１×２１＝４４１個形成され、密度は１
００ウェル／ｃｍ２程度になる。このとき、ウェル３の
容量は約０.４μｌであるが、実際にはＰＣＲ反応液の
表面張力が作用するため、実質的に０.２〜０.３μｌ程
度となり、全てのウェル３にＰＣＲ反応液を分注して
も、一回の使用量は０.３×４４１＝１３２μｌ程度と
極めて少量でたりる。
【００２９】また、プレート本体２は、ポリプロピレ
ン、ポリカーボネート、アルミ、カーボン−アルミコン
ポジット等任意の材料を使用しうるが、１００℃程度に
耐える耐熱性を有し、熱伝導率がなるべく高いものが望
ましい。そして、プレート本体２の表面２ａ及び裏面２
ｂに撥水性樹脂をコーティングすることにより撥水加工
が施されると共に、各ウェル３…の内壁３ａに親水性樹
脂をコーティングしたり、プラズマ処理をしたりするこ
とにより親水加工が施されている。
ン、ポリカーボネート、アルミ、カーボン−アルミコン
ポジット等任意の材料を使用しうるが、１００℃程度に
耐える耐熱性を有し、熱伝導率がなるべく高いものが望
ましい。そして、プレート本体２の表面２ａ及び裏面２
ｂに撥水性樹脂をコーティングすることにより撥水加工
が施されると共に、各ウェル３…の内壁３ａに親水性樹
脂をコーティングしたり、プラズマ処理をしたりするこ
とにより親水加工が施されている。
【００３０】伝熱プレート４は、金属ブロックヒータ
（図示せず）などに接触されてその熱をプレート本体２
に伝えるもので、その外面は、金属ブロックヒータの熱
を受ける平面状の受熱面５に形成され、内面側には、こ
れを２枚を合せたときにプレート本体２の格納空間を形
成するキャビティ６が形成され、その側面には、２枚の
伝熱プレート４を合せた状態でクリップ７で挟み付けて
固定するためのフランジ８が形成されている。材質とし
ては、熱伝導率の高い材質が好ましく、例えば、アルミ
やアルミ−カーボンコンポジットなどの金属が用いられ
る。
（図示せず）などに接触されてその熱をプレート本体２
に伝えるもので、その外面は、金属ブロックヒータの熱
を受ける平面状の受熱面５に形成され、内面側には、こ
れを２枚を合せたときにプレート本体２の格納空間を形
成するキャビティ６が形成され、その側面には、２枚の
伝熱プレート４を合せた状態でクリップ７で挟み付けて
固定するためのフランジ８が形成されている。材質とし
ては、熱伝導率の高い材質が好ましく、例えば、アルミ
やアルミ−カーボンコンポジットなどの金属が用いられ
る。
【００３１】そして、キャビティ６の底面がプレート本
体２の表面２ａ、裏面２ｂに密接される伝熱面９ａとな
り、キャビティ６の内壁面がプレート本体２の周面２ｃ
に密接される伝熱面９ｂとなる。
体２の表面２ａ、裏面２ｂに密接される伝熱面９ａとな
り、キャビティ６の内壁面がプレート本体２の周面２ｃ
に密接される伝熱面９ｂとなる。
【００３２】また、底面側の伝熱面９ａには各ウェル３
…の開口位置に対応する夫々の位置に、各ウェル３…よ
り大きな開口径を有する凹み１０…が形成され、伝熱プ
レート４、４をプレート本体２に装着したときに、前記
凹み１０により伝熱面９ａと各ウェル３…の開口部との
間に隙間が形成される。
…の開口位置に対応する夫々の位置に、各ウェル３…よ
り大きな開口径を有する凹み１０…が形成され、伝熱プ
レート４、４をプレート本体２に装着したときに、前記
凹み１０により伝熱面９ａと各ウェル３…の開口部との
間に隙間が形成される。
【００３３】以上が本発明に係るＰＣＲ用マイクロプレ
ートの構成例であって、次に、本発明に係るＰＣＲ法に
ついて説明する。まず、厚さ２ｍｍの正方形のプレート
本体２に直径０.５ｍｍの毛細管状のウェル３…を、１
ｍｍピッチで縦横に２１列づつ合計４４１個形成した本
発明のＰＣＲ用マイクロプレート１を用いて、各ウェル
３…に目的とする鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を導入
する分注操作を行い、次に、予め設定された所定の温度
サイクルに従い昇降温させてＤＮＡ増幅させる増幅操作
を行い、最後に、各ウェル３…内で増幅されたＤＮＡを
回収する回収操作を行なう。
ートの構成例であって、次に、本発明に係るＰＣＲ法に
ついて説明する。まず、厚さ２ｍｍの正方形のプレート
本体２に直径０.５ｍｍの毛細管状のウェル３…を、１
ｍｍピッチで縦横に２１列づつ合計４４１個形成した本
発明のＰＣＲ用マイクロプレート１を用いて、各ウェル
３…に目的とする鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を導入
する分注操作を行い、次に、予め設定された所定の温度
サイクルに従い昇降温させてＤＮＡ増幅させる増幅操作
を行い、最後に、各ウェル３…内で増幅されたＤＮＡを
回収する回収操作を行なう。
【００３４】まず、分注操作は、図２（ａ）に示すよう
に、目的とする鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液に、プレ
ート本体２を浸漬させることにより行なう。
に、目的とする鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応液に、プレ
ート本体２を浸漬させることにより行なう。
【００３５】ＰＣＲ反応液は、ＤＮＡポリメラーゼ、合
成素材となる４種類のｄＮＴＰ、ＤＮＡプライマー、緩
衝液、水、塩化マグネシウムからなるＰＣＲ溶液により
鋳型ＤＮＡを希釈したもので、一つのウェル３に蓄えら
れるＰＣＲ反応液の容量中にＤＮＡが一分子存在する割
合に希釈しておく。
成素材となる４種類のｄＮＴＰ、ＤＮＡプライマー、緩
衝液、水、塩化マグネシウムからなるＰＣＲ溶液により
鋳型ＤＮＡを希釈したもので、一つのウェル３に蓄えら
れるＰＣＲ反応液の容量中にＤＮＡが一分子存在する割
合に希釈しておく。
【００３６】このＰＣＲ反応液を１ｍｍ程度の深さでシ
ャーレ１１に溜めておき、ＰＣＲ用マイクロプレート１
を浸漬すると、プレート本体２には毛細管状のウェル３
…が表裏に貫通して形成されているので、毛細管現象に
より全てのウェル３…内にＰＣＲ反応液が一斉に吸い上
げられて一瞬で導入される。
ャーレ１１に溜めておき、ＰＣＲ用マイクロプレート１
を浸漬すると、プレート本体２には毛細管状のウェル３
…が表裏に貫通して形成されているので、毛細管現象に
より全てのウェル３…内にＰＣＲ反応液が一斉に吸い上
げられて一瞬で導入される。
【００３７】ＰＣＲ反応液は主成分が水であるので、プ
レート本体２を引き上げると、図２（ｂ）に示すよう
に、ウェル３…の内壁との接触角θが鋭角となり、その
表面張力によりＰＣＲ反応液がウェル３…内に留まろう
とする力が作用し、その液面がプレート本体２の内側に
凹んだ凹面となる。したがって、ウェル３…がプレート
本体２に貫通形成されていても、ＰＣＲ反応液が流れ落
ちることなく、各ウェル３内に保持される。
レート本体２を引き上げると、図２（ｂ）に示すよう
に、ウェル３…の内壁との接触角θが鋭角となり、その
表面張力によりＰＣＲ反応液がウェル３…内に留まろう
とする力が作用し、その液面がプレート本体２の内側に
凹んだ凹面となる。したがって、ウェル３…がプレート
本体２に貫通形成されていても、ＰＣＲ反応液が流れ落
ちることなく、各ウェル３内に保持される。
【００３８】しかも、本例では、プレート本体２の表面
２ａ及び裏面２ｂに撥水加工が施され、各ウェル３の内
壁に親水加工が施されているので、プレート本体２を引
き上げたときに、その表面２ａ及び裏面２ｂに付着した
余分なＰＣＲ反応液は撥じかれてシャーレ１１内に回収
され、必要な分だけウェル３…内に取り込まれる。
２ａ及び裏面２ｂに撥水加工が施され、各ウェル３の内
壁に親水加工が施されているので、プレート本体２を引
き上げたときに、その表面２ａ及び裏面２ｂに付着した
余分なＰＣＲ反応液は撥じかれてシャーレ１１内に回収
され、必要な分だけウェル３…内に取り込まれる。
【００３９】このように各ウェル３…に分注されたＰＣ
Ｒ反応液には表面張力が作用するため、その容量は、せ
いぜい０.２〜０.３μｌ程度であり、したがって、１枚
当たり０.３×４４１＝１３２μｌ程度で足り、一回に
約４０００μｌものＰＣＲ反応液を使用する従来のマイ
クロプレートの１／３０程度に過ぎない。
Ｒ反応液には表面張力が作用するため、その容量は、せ
いぜい０.２〜０.３μｌ程度であり、したがって、１枚
当たり０.３×４４１＝１３２μｌ程度で足り、一回に
約４０００μｌものＰＣＲ反応液を使用する従来のマイ
クロプレートの１／３０程度に過ぎない。
【００４０】次いで、増幅操作は、ＰＣＲ反応液を分注
したプレート本体２に伝熱プレート４，４を装着して、
予め設定された所定の温度サイクルに従い昇降温させる
ことによりＤＮＡ増幅させる。このとき、図３に示すよ
うに、プレート本体２の表面２ａ及び裏面２ｂに伝熱プ
レート４，４を装着してＰＣＲ用マイクロプレート１を
組み立て、プレート本体２をキャビティ６内に格納した
状態で、伝熱プレート４，４のフランジ８をクリップ７
で止めると、各伝熱プレート４の伝熱面９ａ、９ｂがプ
レート本体２の表面２ａ，裏面２ｂ，周面２ｃに密接す
る。
したプレート本体２に伝熱プレート４，４を装着して、
予め設定された所定の温度サイクルに従い昇降温させる
ことによりＤＮＡ増幅させる。このとき、図３に示すよ
うに、プレート本体２の表面２ａ及び裏面２ｂに伝熱プ
レート４，４を装着してＰＣＲ用マイクロプレート１を
組み立て、プレート本体２をキャビティ６内に格納した
状態で、伝熱プレート４，４のフランジ８をクリップ７
で止めると、各伝熱プレート４の伝熱面９ａ、９ｂがプ
レート本体２の表面２ａ，裏面２ｂ，周面２ｃに密接す
る。
【００４１】また、伝熱面９ａには、夫々のウェル３の
開口位置に対応して凹み１０が形成されているので、図
３の拡大図に示すように、ウェル３の開口部と伝熱面９
ａの間に隙間が生じることとなる。したがって、プレー
ト本体２に振動などの外力が作用して、ウェル３内に保
持されているＰＣＲ反応液の液面が揺れてウェル３の開
口部まで動いても、伝熱面９ａに付着しにくく、また、
プレート本体２の表面２ａ及び裏面２ｂと伝熱面９ａの
間にＰＣＲ反応液が染み込むこともない。
開口位置に対応して凹み１０が形成されているので、図
３の拡大図に示すように、ウェル３の開口部と伝熱面９
ａの間に隙間が生じることとなる。したがって、プレー
ト本体２に振動などの外力が作用して、ウェル３内に保
持されているＰＣＲ反応液の液面が揺れてウェル３の開
口部まで動いても、伝熱面９ａに付着しにくく、また、
プレート本体２の表面２ａ及び裏面２ｂと伝熱面９ａの
間にＰＣＲ反応液が染み込むこともない。
【００４２】ここで、予め変性用金属ブロックヒータを
９１℃以上の所定の温度（９４℃）に設定し、会合用金
属ブロックヒータを５０℃に設定し、伸長用金属ブロッ
クヒータを７２℃に設定し、夫々の温度に保持してお
く。そして、まず、ＰＣＲ用マイクロプレート１を変性
用金属ブロックヒータに１５秒程度挟み付けて「変性」
させ、次いで、会合用金属ブロックヒータに１５秒程度
挟み付けて「会合」させ、さらに、伸長用金属ブロック
ヒータに６０秒程度挟み付けて「伸長」させ、これを１
サイクルとして、数十回繰り返し、増幅操作を完了す
る。
９１℃以上の所定の温度（９４℃）に設定し、会合用金
属ブロックヒータを５０℃に設定し、伸長用金属ブロッ
クヒータを７２℃に設定し、夫々の温度に保持してお
く。そして、まず、ＰＣＲ用マイクロプレート１を変性
用金属ブロックヒータに１５秒程度挟み付けて「変性」
させ、次いで、会合用金属ブロックヒータに１５秒程度
挟み付けて「会合」させ、さらに、伸長用金属ブロック
ヒータに６０秒程度挟み付けて「伸長」させ、これを１
サイクルとして、数十回繰り返し、増幅操作を完了す
る。
【００４３】最後に、このようにして各ウェル３…内で
増幅されたＤＮＡを回収する回収操作を行なう。この回
収操作は、図４に示すように、伝熱プレート４、４を外
してプレート本体２を取り出し、ウェル３…と同数のマ
イクロチューブ１２…を並べたマイクロチューブアレイ
の上にセットし、一のウェル３をマイクロチューブ１２
の上に位置決めした状態で、そのウェル３の真上にエア
ノズル１３をセットする。そして、ウェル３の一方の開
口部から個別にエアを吹き付けると、夫々のウェル３内
で増幅されたＤＮＡがそのエアにより他方の開口部から
各マイクロチューブ１３内に順次押し出される。
増幅されたＤＮＡを回収する回収操作を行なう。この回
収操作は、図４に示すように、伝熱プレート４、４を外
してプレート本体２を取り出し、ウェル３…と同数のマ
イクロチューブ１２…を並べたマイクロチューブアレイ
の上にセットし、一のウェル３をマイクロチューブ１２
の上に位置決めした状態で、そのウェル３の真上にエア
ノズル１３をセットする。そして、ウェル３の一方の開
口部から個別にエアを吹き付けると、夫々のウェル３内
で増幅されたＤＮＡがそのエアにより他方の開口部から
各マイクロチューブ１３内に順次押し出される。
【００４４】このように、ウェル３はプレート本体２に
貫通形成されているので、エアによりＤＮＡを非接触で
押し出すことができ、したがって、ニードルで吸い込ん
で回収する場合と異なり、ウェル３で増幅されたＤＮＡ
同士がコンタミネーションを起こすこともない。
貫通形成されているので、エアによりＤＮＡを非接触で
押し出すことができ、したがって、ニードルで吸い込ん
で回収する場合と異なり、ウェル３で増幅されたＤＮＡ
同士がコンタミネーションを起こすこともない。
【００４５】なお、伝熱プレート４、４は、プレート本
体２の表面２ａ及び裏面２ｂの双方に装着する場合に限
らず、裏面２ｂのみに装着する場合でもよく、さらに場
合によっては装着しなくても良い。
体２の表面２ａ及び裏面２ｂの双方に装着する場合に限
らず、裏面２ｂのみに装着する場合でもよく、さらに場
合によっては装着しなくても良い。
【００４６】また、プレート本体２の形状及び大きさは
任意であり、方形に形成する場合に限らず、多角形や円
形でも良く、ウェル３…の配列も縦横に配列する場合に
限らず任意である。例えば、たとえば同心円状や枢密六
角状に配しても良い。
任意であり、方形に形成する場合に限らず、多角形や円
形でも良く、ウェル３…の配列も縦横に配列する場合に
限らず任意である。例えば、たとえば同心円状や枢密六
角状に配しても良い。
【００４７】
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、ウ
ェルがプレート本体の表裏を貫通して毛細管状に形成さ
れているのでウェルを高密度に形成することができるだ
けでなく、プレート本体をＰＣＲ反応液に浸漬するだけ
で毛細管現象により全てのウェルに同時に吸い上げられ
るので極めて短時間で分注することができ、さらに、ウ
ェルが貫通形成されていることから増幅されたＤＮＡを
そのエアにより非接触で押しだすことができ、コンタミ
ネーションを確実に防止することができるという大変優
れた効果を奏する。
ェルがプレート本体の表裏を貫通して毛細管状に形成さ
れているのでウェルを高密度に形成することができるだ
けでなく、プレート本体をＰＣＲ反応液に浸漬するだけ
で毛細管現象により全てのウェルに同時に吸い上げられ
るので極めて短時間で分注することができ、さらに、ウ
ェルが貫通形成されていることから増幅されたＤＮＡを
そのエアにより非接触で押しだすことができ、コンタミ
ネーションを確実に防止することができるという大変優
れた効果を奏する。
【図１】本発明に係るＰＣＲ用マイクロプレートの一例
を示す説明図。
を示す説明図。
【図２】その使用状態を示す説明図。
【図３】その使用状態を示す説明図。
【図４】その使用状態を示す説明図。
１………ＰＣＲ用マイクロプレート ２………プレート本体 ２ａ……表面 ２ｂ……裏面 ３………ウェル ３ａ……内壁 ４………伝熱プレート ９ａ、９ｂ………伝熱面 １０………凹み
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 CA20 HA11 4B029 AA07 AA08 AA23 BB20 CC01 FA12 FA15 GA03 GB01 GB02 GB05 GB10
Claims (5)
- 【請求項１】目的とする鋳型ＤＮＡ含むＰＣＲ反応液を
導入してＤＮＡ増幅を行わせる多数のウェル（３…）
が、プレート本体（２）の表裏を貫通して毛細管状に形
成されたことを特徴とするＰＣＲ用マイクロプレート。 - 【請求項２】前記プレート本体の表裏両面（２ａ、２
ｂ）に撥水加工が施されると共に、各ウェル（３）の内
壁（３ａ）に親水加工が施されてなる請求項１記載のＰ
ＣＲ用マイクロプレート。 - 【請求項３】前記プレート本体（２）に密接される伝熱
面（９ａ、９ｂ）が形成された伝熱プレート（４）を備
えると共に、前記伝熱面（９ａ、９ｂ）には前記各ウェ
ル（３）の開口位置に対応する夫々の位置に、当該各ウ
ェル（３）より大きな開口径を有する凹み（１０）又は
透孔が形成された請求項１又は２記載のＰＣＲ用マイク
ロプレート。 - 【請求項４】ＰＣＲ用マイクロプレート（１）に形成さ
れた多数のウェル（３…）に、目的とする鋳型ＤＮＡを
含むＰＣＲ反応液を導入し、予め設定された所定の温度
サイクルに従い昇降温させてＤＮＡ増幅させた後、各ウ
ェル（３）内で増幅されたＤＮＡを回収するＰＣＲ法に
おいて、 前記ウェル（３…）がＰＣＲ用マイクロプレート（１）
を構成するプレート本体（２）の表裏を貫通して毛細管
状に形成され、前記プレート本体（２）をＰＣＲ反応液
に浸漬させて、ＰＣＲ反応液を各ウェルに毛細管現象に
より導入することを特徴とするＰＣＲ法。 - 【請求項５】ＰＣＲ用マイクロプレート（１）に形成さ
れた多数のウェル（３…）に、目的とする鋳型ＤＮＡを
含むＰＣＲ反応液を導入し、予め設定された所定の温度
サイクルに従い昇降温させてＤＮＡ増幅させた後、各ウ
ェル（３）内で増幅されたＤＮＡを回収するＰＣＲ反応
方法において、 前記ウェル（３…）がＰＣＲ用マイクロプレート（１）
を構成するプレート本体（２）の表裏を貫通して毛細管
状に形成され、当該各ウェル（３）内でＤＮＡを増幅さ
せた後、各ウェル（３）の一方の開口部から個別にエア
を吹き付け、当該ウェル（３）内で増幅されたＤＮＡを
他方の開口部からそのエアで圧し出して回収することを
特徴とするＰＣＲ法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001144118A JP2002335960A (ja) | 2001-05-15 | 2001-05-15 | Ｐｃｒ用マイクロプレート及びそれを用いたｐｃｒ法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001144118A JP2002335960A (ja) | 2001-05-15 | 2001-05-15 | Ｐｃｒ用マイクロプレート及びそれを用いたｐｃｒ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002335960A true JP2002335960A (ja) | 2002-11-26 |
Family
ID=18990119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001144118A Pending JP2002335960A (ja) | 2001-05-15 | 2001-05-15 | Ｐｃｒ用マイクロプレート及びそれを用いたｐｃｒ法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002335960A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013080941A1 (ja) | 2011-12-01 | 2013-06-06 | 三菱レイヨン株式会社 | 核酸増幅用基材及び核酸増幅方法 |
| JP2015512508A (ja) * | 2012-03-16 | 2015-04-27 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 生物学的反応システムのための被覆されている基材 |
| US10173182B2 (en) | 2013-08-08 | 2019-01-08 | Panasonic Corporation | Nucleic acid amplification device, nucleic acid amplification apparatus, and nucleic acid amplification method for transporting reaction solution including target nucleic acid via capillary force to amplify target nucleic acid |
-
2001
- 2001-05-15 JP JP2001144118A patent/JP2002335960A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013080941A1 (ja) | 2011-12-01 | 2013-06-06 | 三菱レイヨン株式会社 | 核酸増幅用基材及び核酸増幅方法 |
| JP2015512508A (ja) * | 2012-03-16 | 2015-04-27 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 生物学的反応システムのための被覆されている基材 |
| US10173182B2 (en) | 2013-08-08 | 2019-01-08 | Panasonic Corporation | Nucleic acid amplification device, nucleic acid amplification apparatus, and nucleic acid amplification method for transporting reaction solution including target nucleic acid via capillary force to amplify target nucleic acid |
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