JP2014060954A

JP2014060954A - マルチ核酸反応具、その製造方法およびそれを用いる核酸を定量する方法

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Publication number: JP2014060954A
Application number: JP2012208122A
Authority: JP
Inventors: Madoka Takase; まどか高瀬; Keiko Ito; 桂子伊藤; Koji Hashimoto; 幸二橋本; Nobuhiro Motoma; 信弘源間; Masaru Nikaido; 勝二階堂
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2014-04-10

Abstract

【課題】１つの反応場で簡便に複数の増幅反応を行って、試料中の核酸量を決定できるマルチ核酸反応具、その製造方法及び核酸の定量方法を提供する。
【解決手段】液相の反応場を支持するよう構成された支持体２、液相により前記反応場が形成された際に反応場に接する支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数の増幅用試薬固定化領域４；複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域５；複数の増幅用試薬固定化領域に増幅効率毎に遊離可能に固定化され標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬；複数のプローブ固定化領域のそれぞれにハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化された標的配列と増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸７；を備えたマルチ核酸反応具１。
【選択図】図１

Description

本発明は、マルチ核酸反応具、その製造方法およびそれを用いる核酸を定量する方法に関する。

現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や衛生管理施設など、様々な場面で遺伝子検査が実施されている。これらの遺伝子検査では、複数の対象遺伝子を検出し、かつ、検体中に含まれる各遺伝子量を定量することで初めて有用なものとなる場合がある。たとえば、臨床現場における病原菌特定などの目的では、その症状から感染が疑われる複数種の細菌やウイルス、または各細菌やウイルスの型などを判定し、更に定量することが行われる。それらは、疾患の判定、病態の把握、薬物治療の効果判定などに利用される。そのため、複数の対象遺伝子を定量する技術は非常に重要である。

従来、複数の対象遺伝子を定量する場合、最初にある反応溶液中で各試料核酸を増幅した後に、その増幅産物の検出を更なる反応装置において行う。増幅は、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れ、マルチ核酸増幅反応を行なう方法、のいずれかが選択される。また、検出は、増幅産物をＤＮＡチップや電気泳動などにより一般的に行われる。

このような従来の方法では、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法の場合、対象遺伝子数の増加に伴って、必要な反応容器の数や、検査時の作業量が増加する。また、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れる場合、増幅反応効率に偏りが生じるなどの原因から、対象遺伝子数に限界がある。このような事情は検出工程においても同様である。更に、反応容器の数や増幅と検出を異なる反応容器において行う必要があるために、試料の取り違えが生じる可能性があり、また、取り違えが生じたとしても気が付かない危険性もある。また、少なくとも増幅工程と検出工程を行う必要があるために、検査には長い時間が必要とされる。

本発明が解決しようとする課題は、１つの反応場において、簡便に複数の増幅反応を行い、それによって試料中の核酸の量を決定することができるマルチ核酸反応具、その製造方法およびそれを用いる核酸を定量する方法を提供することである。

実施形態によれば、マルチ核酸反応具が提供される。マルチ核酸反応具は、液相の反応場を支持するように構成された支持体と、液相により前記反応場が形成された際に、反応場に接する支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数の増幅用試薬固定化領域と、複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、複数の増幅用試薬固定化領域に増幅効率毎に遊離可能に固定化され、標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬と、複数のプローブ固定化領域のそれぞれにハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化された、標的配列と増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸とを備える。

実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具の使用時の様子を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具とそれにより得られる検出信号の例を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。実施形態のチップ素材を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具の使用時の様子を示す図。実施形態に係るマルチ核酸反応具の使用時の様子を示す図。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

１．定義
「マルチ核酸増幅」とは、増幅されるべき複数種類の標的配列を同時に増幅することをいう。「増幅」とは、プライマーセットを用いて鋳型核酸を連続して複製する工程をいう。使用可能な増幅法は、プライマーセットを用いて標的核酸を増幅する方法であれはよく、これらに限定するものではないが、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＭＡＰ増幅、ＩＣＡＮ増幅、ＳＤＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、ＲＣＡ増幅、ＬＣＡ増幅、ＴＭＡ増幅、プライマーエクステンション（伸長）、Ｉｎｖａｄｅｒ、ｂＤＮＡ法およびＰＡＬＳＡＲ法などを含む。

「標的配列」とは、プライマーセットにより増幅しようとする配列をいい、使用されるプライマーが結合する領域をも含む。

「標的核酸」とは、標的配列を少なくとも含む配列であり、使用されるプライマーセットにより鋳型として使用される核酸であり、「鋳型核酸」とも称する。

「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。また例えば、プライマーエクステンション（伸長）の場合は、１種類の伸長用のプライマーを含めばよい。

「目的配列」とは、当該マルチ核酸反応具により検出されるべき配列をいう。検出されるべき目的核酸は「目的配列」を含む。目的配列からなる核酸、または目的配列を含む核酸を「目的配列鎖」という。目的配列鎖は、その相補配列を含むプローブ核酸とハイブリダイズし、このハイブリダイズの有無または量が検出されて、目的核酸の有無または量が検出または測定される。

「試料」とは、マルチ核酸反応具により増幅および／または検出されるべき核酸を含む物質であればよい。試料は、これらに限定するものではないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってよく、または何らかのそれ自身公知の手段によって、前記の何れかまたはその混合物から核酸成分に抽出されたものであってもよい。

「ハイブリダイズ信号」とは、プローブ核酸とその相補配列とのハイブリダイズにより生じる信号であり、当該マイクロアレイの検出方式により、例えば、電流値、蛍光光度、発光光度などとして検出される検出信号を総称するものである。

２．マルチ核酸反応具とそれを用いた目的核酸の検出方法
最初に目的核酸を検出するためのマルチ核酸反応具について説明する。

＜第１の実施形態＞
（１）マルチ核酸反応具
マルチ核酸反応具の１例を図１（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具１は、複数の目的配列とそれぞれの目的配列に相補的なプローブ核酸とのハイブリダイズを、ハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号を検出することによって検出し、それに基づいて、目的配列を含む標的配列を有する鋳型核酸を定量するためのものである。そのために、複数の種類の検出されるべき鋳型核酸について、それぞれの一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。更に、その標的配列の一部分を目的配列として設定し、その目的配列の相補配列を有するプローブ核酸を設計する。

図１（ａ）は、マルチ核酸反応具の１例の斜視図である。図１（ａ）に記載のマルチ核酸反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の内側底面３には、互いに独立した複数の増幅用試薬固定化領域４が配置される。複数の増幅用試薬固定化領域４の近傍に、またそれぞれの増幅用試薬固定化領域４に対応して複数のプローブ固定化領域５が配置される。互いに独立して配置された増幅用試薬固定化領域４に固定化された複数のプライマーセットは、それぞれのプライマーセットによる増幅反応が独立して行われる。例えば、互いに独立して複数のプライマーセットが固定化されているとき、それぞれのプライマーセットの遊離および拡散により規定される反応場は互いに独立して形成および維持される。

図１（ｂ）は増幅用試薬固定化領域４を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つの増幅用試薬固定化領域４には１つの種類のプライマーセット６が固定される。複数の増幅用試薬固定化領域４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット６がそれぞれ固定される。

プライマーセット６は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つの増幅用試薬固定化領域４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット６が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つの増幅用試薬固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つの増幅用試薬固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。

プライマーセット６は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態で増幅用試薬固定化領域４に固定される。プライマーセット６の増幅用試薬固定化領域４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つの増幅用試薬固定化領域４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他の増幅用試薬固定化領域４について、それぞれ所望のプライマーセット６を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセット６を支持体２に固定すればよい。これにより、支持体２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域４にプライマーセット６が固定される。しかしながら、プライマーセット６の固定化領域４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。

支持体２に配置される複数の増幅用試薬固定化領域４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット６毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合う増幅用試薬固定化領域４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプローブ核酸と同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。

例えば、隣り合う増幅用試薬固定化領域４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。

容器形態の支持体２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。

図１では、増幅用試薬固定化領域４が支持体２の内側底面３に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体２の内部側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、底面および内部側面、被覆体により規定される天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。

図１（ｃ）には、増幅用試薬固定化領域４の近傍に配置されたプローブ固定化領域５の拡大図である。プローブ固定化領域５には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸７が複数で固定される。

検出されるべき所望の配列は、目的配列であってよい。プローブ固定化領域５は、プローブ核酸７と目的配列鎖とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域５間で独立して検出されるように配置される。

プローブ核酸７のプローブ固定化領域５への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸７の固定した後にプライマーセット６を固定してもよく、プライマーセット６を固定した後にプローブ核酸７を固定してもよく、プライマーセット６の固定とプローブ核酸７の固定を同時に行ってもよい。

例えば、隣り合うプローブ固定化領域５の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

また例えば、プローブ固定化領域５と増幅用試薬固定化領域４の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。

例えば、プローブ固定化領域５と増幅用試薬固定化領域４の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域５と増幅用試薬固定化領域４は、支持体表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域５が増幅用試薬固定化領域４に含まれてもよく、増幅用試薬固定化領域４がプローブ固定化領域５に含まれてもよい。また、１つの増幅用試薬固定化領域４に対して複数のプローブ固定化領域５が配置されてもよい。

（２）マルチ核酸反応具を用いた核酸の増幅検出方法
図２には、第１の実施形態と同様のマルチ核酸反応具１を用いて行われた核酸増幅反応後の反応場の様子を示す模式図である。図２（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前のマルチ核酸反応具１である。支持体２の内側底面３に配置された複数の増幅用試薬固定化領域４の近傍にはプローブ固定化領域５が配置される。複数の増幅用試薬固定化領域４には、複数のプライマーセット６がそれぞれ固定されている。それぞれの増幅用試薬固定化領域４に対応して、それぞれの近傍に配置されたプローブ固定化領域５には、複数のプローブ核酸７が所望の種類毎に固定されている。

マルチ核酸反応具１に反応液８を添加し、それを収容した状態を図２（ａ−２）および（ｂ−２）に示す。

反応液８は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。

反応場への試料の添加は、マルチ核酸反応具１に反応液８を添加する以前に反応液８に予め添加することにより行ってもよく、反応液８をマルチ核酸反応具１に添加した後に行ってもよく、マルチ核酸反応具１に反応液８を添加する以前に試料をマルチ核酸反応具１に添加することにより行ってもよい。

図２（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように反応液８を添加された後のマルチ核酸反応具１では、図２（ａ−３）および（ｂ−３）に模式的に示すように、内側底面３に固定されたプライマーセット６が遊離し、徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域９で示す。遊離し、拡散していくプライマーセット６は、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、その後、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセット６は、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセット６を用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液８により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域９内のみで進行する場合には、領域９が反応領域と解される。図２（ａ−３）の図は、全ての増幅用試薬固定化領域４に固定されたプライマーセット６により増幅反応が生じた場合の模式図である。図２（ｂ−３）は、固定されたプライマーセット６により、内側底面３に固定された全ての増幅用試薬固定化領域のうちの一部分、図２（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じた場合の模式図である。

プローブ固定化領域５は、領域９において増幅された増幅産物中に目的配列を含む核酸が存在した場合、その核酸とハイブリダイズする。プローブ固定化領域５に固定されたプローブ核酸７は、対応する増幅用試薬固定化領域４における増幅産物とのみハイブリダイズするように固定される。即ち、１つのプローブ固定化領域５に固定されたプローブ核酸７は、対応する増幅用試薬固定化領域４における増幅産物とのみハイブリダイズするように距離を維持してそれぞれのプローブ固定化領域５および増幅用試薬固定化領域４が配置される。

プローブ核酸７と目的配列鎖とのハイブリダイズの検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段により行われてよい。例えば、予めプライマーセットに蛍光物質を付与してもよく、オキシヌクレオシド三リン酸などの基質に蛍光物質を付与してもよい。それらの蛍光物質からの蛍光強度を指標にハイブリダイズの有無および量が決定されてもよい。或いは、電気化学的手段によりハイブリダイズ信号が検出されてもよい。

ハイブリダイズの検出は、マルチ核酸反応具１内部の洗浄後に実行されてもよく、洗浄を行わずに実行されてもよい。電気化学的手段により検出する場合には、インタカレータを用いてハイブリダイズ信号を検出してもよい。この場合、例えば、予め反応液７８にインタカレータを含ませておいてもよく、ハイブリダイズ反応が開始する前、ハイブリダイズ反応中、ハイブリダイズ反応後に添加してもよい。これらの場合、何れもマルチ核酸反応具１内部の洗浄後に検出を行ってもよく、洗浄を行わずに検出を実行してもよい。ハイブリダイズ反応の開始、反応中、反応後の判定は、プライマー、プローブ核酸および鋳型核酸の配列、反応温度などの反応条件に応じて行ってもよく、予備実験により決定してもよい。

当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下、約２０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３〜４０塩基、約１０〜３０塩基などであってよい。

また、１つの支持体に同時に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーで異なっていてもよく、一部のプライマーが同じ長さであってもよく、一部のプライマーが異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎に異なってもよい。また、１つの領域に固定されるプライマーセットが、種類毎に異なる長さであってもよく、１つの領域に固定されるプライマーセットが全て同じ長さであってもよい。

プローブ核酸の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。プローブ核酸は、検出されるべき目的配列の相補配列を含む。プローブ核酸は、目的配列の相補配列に加えて更なる配列例えば、スペーサ配列などを含んでもよい。

標的配列の長さは、例えば、１０塩基〜１００塩基、１００塩基〜２００塩基、塩基２００〜３００塩基、３００塩基〜４００塩基、好ましくは１００塩基〜３００塩基であってよい。

目的配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。

１つの増幅用試薬固定化領域４に固定されるプライマーセット６の種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。

１つのプローブ固定化領域５に固定されるプローブ核酸７群の種類は、１種類の目的配列とハイブリダイズするための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。また、目的配列の部分が共通であり、更に他の目的配列とは異なる配列を含むプローブ核酸であってもよい。

１つのアレイ型マルチ核酸反応具１に配置される増幅用試薬固定化領域４の数の下限は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上であってよく、上限は、１００００以下、５０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下であってよく、これらの上限下限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。

１つのマルチ核酸反応具１に配置される増幅用試薬固定化領域４とプローブ固定化領域５の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全ての増幅用試薬固定化領域４に対応するように同数のプローブ固定化領域５が配置されてもよく、増幅用試薬固定化領域４の数がプローブ固定化領域５の数よりも多くてもよく、増幅用試薬固定化領域４の数がプローブ固定化領域５の数よりも少なくてもよい。また、増幅反応状態を確認するため、またはハイブリダイズ反応の状態を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセットおよび／またはプローブ核酸について設けてよい。

上記の例では、増幅用試薬固定化領域４にプライマーセット６のみが固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセット６が種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーセット６と共に支持体２に固定されてもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーセット６と一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなマルチ核酸反応具１において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。

支持体２は、容器形状に限定されるものではなく、上述したように、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよく、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。また、後述する第３の実施形態のように流路を有する基板を支持体７１として使用することは好ましい。

＜第2の実施形態＞
次に、目的核酸を定量的に検出するためのマルチ核酸反応具の原理について説明する。

マルチ核酸反応具の１例を図３を参照しながら説明する。

図３（ａ）に記載のマルチ核酸反応具１は、チップ型のマルチ核酸反応具、即ち、アレイ型プライマープローブチップ１である。このアレイ型プライマープローブチップ１は、１つの目的配列とプローブ核酸とのハイブリダイズを、ハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号を検出することによって検出し、それに基づいて、目的配列を含む標的配列を有する鋳型核酸を定量するためのものである。そのために、定量されるべき鋳型核酸の一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。更に、その標的配列の一部分を目的配列として設定し、その目的配列の相補配列を有するプローブ核酸を設計する。

アレイ型プライマープローブチップ１は、基板を支持体２として用いている。支持体２の１つの面３には、複数の増幅用試薬固定化領域４が互いに独立して配置される。それぞれの増幅用試薬固定化領域４に対応して、その近傍にプローブ固定化領域５が配置される。

増幅用試薬固定化領域４には、１つの増幅用試薬固定化領域４に対して１つの種類のプライマーセット６が固定される。特定の目的配列を定量するためには、その特定の目的配列を含む特定の標的配列を増幅するためのプライマーセット６が使用される。

図３に示すアレイ型プライマープローブチップ１に含まれる５つの増幅用試薬固定化領域４には、同じ鋳型核酸を増幅するために必要とされる同じ種類のプライマーセット６がそれぞれ固定化されている。ここにおいて、プライマーセット６の固定化される量は、増幅用試薬固定化領域毎に段階的に異なる。図３の場合、固定化される量は、増幅用試薬固定化領域４ａ＜増幅用試薬固定化領域４ｂ＜増幅用試薬固定化領域４ｃ＜増幅用試薬固定化領域４ｄ＜増幅用試薬固定化領域４ｅである。即ち、５つの増幅用試薬固定化領域４に固定化されるプライマーセット６の量は、増幅用試薬固定化領域４ａから増幅用試薬固定化領域４ｅに向けて段階的に大きくなる。増幅用試薬固定化領域４ａ、増幅用試薬固定化領域４ｂ、増幅用試薬固定化領域４ｃ、増幅用試薬固定化領域４ｄおよび増幅用試薬固定化領域４ｅに対してプライマーセット６ａ〜６ｅを固定化するための混合液をそれぞれ組成Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと示すと、組成Ａ、組成Ｂ、組成Ｃ、組成Ｄ、組成Ｅの順番で段階的に含まれるプライマーセットの量が多くなる。

このように増幅用試薬固定化領域４に固定化されるプライマーセット６の量を段階的に相違させることにより、試料中の鋳型核酸の量に依存して増幅反応が生じる大きさが変化する。更に、少ない量で固定化されたプライマーセット６については増幅が生じなくともよい。

プローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７には、１種類の目的配列に相補的な配列を含む複数のプローブ核酸７が固定化される。即ち、図３のアレイ型プライマープローブチップ１に含まれる５つのプローブ固定化領域５には、同じ目的配列を検出するために必要とされる同じ種類のプローブ核酸７がそれぞれ固定化されている。

このようなアレイ型プライマープローブチップ１の全ての増幅用試薬固定化領域４と全てのプローブ固定化領域５が含まれるように、アレイ型プライマープローブチップ１の面３を試料と接触させて増幅反応およびハイブリダイズの検出を行う。

例えば、平らな面の上にアレイ型プライマープローブチップ１を置き、アレイ型プライマープローブチップ１の面３に試料を載せることにより増幅反応およびハイブリダイズの検出を行ってもよい。或いは、例えば、このアレイ型プライマープローブチップ１を維持できる容器内に配置してもよい。その容器内に反応液を添加することにより反応場を形成する。

試料中の鋳型核酸が十分に存在する場合には、何れの量で固定化されたプライマーセット６についても良好な増幅効率が達成される。そのため、何れの量で固定化されたプライマーセット６についても検出に十分な増幅産物が生じる。従って、全ての増幅用試薬固定化領域４に対応するプローブ固定化領域５に固定化されたプローブ核酸７と増幅産物とのハイブリダイズが達成される。この場合に得られるハイブリダイズ信号は、何れのプローブ核酸７についても大きな信号となる。このような結果の例を図３（ｂ）に示す。この例ではハイブリダイズ信号の１例として電流値を使用している。

それに対して、試料中の鋳型核酸の量が、組成Ｄおよび組成Ｅで増幅されるには十分であり、組成Ａ〜Ｃで増幅されるには不十分な量である場合、得られるハイブリダイズ信号は、図３（ｃ）に示すような結果となる。言い換えれば、このような図３（ｃ）のような結果が得られた場合には、試料中の鋳型核酸の量は、組成Ｄで示されるプライマーセットの量で増幅され、組成Ｃで示されるプライマーセットの量では増幅されない量であると判定することが可能である。

更に、予備試験を行うことにより、各組成により増幅される鋳型核酸の量を測定しておくことにより、このようなアレイ型プライマープローブチップ１を用いて試料中に含まれる鋳型核酸の実際の量を決定することも可能となる。

上記の実施形態においては、プライマーセット６の固定化が段階的に異なる例を示した。しかしながら、上述のようなアレイ型プライマープローブチップ１により鋳型核酸を定量するためには、それぞれの増幅用試薬固定化領域における増幅効率を段階的に変更すればよい。

このように設計することにより、アレイ型プライマープローブチップを用いて核酸を定量的に検出することが可能になる。

増幅効率を変えるための方法は、固定化される増幅用試薬の量を段階的に変えてもよく、固定化される増幅用試薬の構成（即ち、組み合わせ）を変えてもよく、固定化される増幅用試薬の種類を変えてもよく、或いは、固定化される増幅用試薬に対して増幅阻害剤を添加してもよい。また、固定化される増幅用試薬に対して増幅促進剤を添加してもよい。

次に、増幅効率を変化する方法について詳しく説明する。

上述したように試料に含まれる鋳型量を定量するために、増幅反応に関与する試薬、例えば、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素の固定化量を変えることにより増幅の効率を調節することができる。

増幅反応に関与する増幅用試薬は、例えば、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、硫酸アンモニウム、界面活性剤、塩類、ベタインなどであってもよい。また、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素の活性を保持するため、乾燥時にタンパク質の安定化剤を添加してもよい。安定化剤の存在により増幅酵素などのタンパク質が安定化され、安定化剤が存在しない反応領域に比べて増幅効率が高くなる。そのような安定化剤の例は、これに限定するものではないが、例えば、糖類、非イオン性界面活性剤、塩類、糖アルコール、高分子、アミノ酸、基質、オスモライトおよびBSA等のタンパク質であってもよく、好ましくはトレハロースである。ここで、固定化されるべき増幅反応試薬の種類および量は、核酸増幅を完全には阻害しない物質および濃度である必要がある。また、詳しくは後述するが増幅阻害剤を使用してもよい。

従って、固定化される増幅用試薬は、例えば、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、硫酸アンモニウム、界面活性剤、塩類、ベタイン、タンパク質安定化剤および増幅阻害剤、並びにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１であってよい。

増幅効率を変更するために固定化される増幅用試薬を固定化する方法は、例えば、固定化されるべき増幅用試薬または増幅用試薬の混合物を水または緩衝液などに溶解し、それぞれのプライマーセットの遊離および拡散により規定される反応領域に、例えば、増幅用試薬固定化領域またはその付近にスポットし、ゲル状に保持または乾燥すればよい。乾燥方法は、熱乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、自然乾燥などであってよいが、これらに限定されるものではない。

また、ここにおいて、固定化されるべき増幅用試薬は、鋳型核酸の増幅反応の効率に対して、反応領域毎に独立して寄与する。従って、増幅用試薬の固定化領域は、１つのプローブ領域に対して１つの増幅用試薬固定化領域が配置されても、複数の増幅用試薬固定化領域が配置されてもよい。即ち、増幅用試薬の固定化位置は、固定化されるべき増幅用試薬が増幅用試薬固定化領域毎に独立して生じるべき増幅反応に対して関与できる位置であればよい。

増幅用試薬の固定化量の変更は、例えば、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素の固定化量を、１倍、２倍、３倍と段階的に変えることにより行ってよい。それにより、各プライマーセットのための反応領域における増幅効率を段階的に変更することができる。そのように複数の領域に各々固定化することにより、鋳型量に依存して増幅可能な領域の数に差が出る。例えば、鋳型量が少ない場合は、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素の固定化量が３倍の領域でしか増幅が起こらないのに対し、鋳型量が多い場合は、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素の固定化量が、１倍、２倍、３倍の全ての領域で増幅が起こる。各増幅領域に隣接して存在するプローブ固定化領域には増幅産物に対応したプローブ核酸が固定化されているので、増幅産物が合成された場合には、プローブ核酸と結合して、ハイブリダイズ信号が得られる。従って、得られたシグナルの数によっても、検体に含まれる鋳型量を簡易に定量することが可能となる。

さらに、具体的なアレイ型プライマープローブチップの例は後述する第３の実施形態に示すが、検体に含まれる複数の種類の鋳型量を定量したい場合には、定量されるべき鋳型の数に合わせて、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素の固定化量を変え、複数の領域に各々固定化することで、一つのマルチ核酸反応具において、複数の種類の鋳型を定量することが可能となる。

反応場を提供するための液相は、増幅用試薬が遊離された後に、それと鋳型核酸との間で所望される増幅反応を開始および維持進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。この反応液は、増幅用試薬が固定化されている反応場（最初は空気で満たされている）に対し、増幅反応開始前に機械的に若しくは人為的に、何らかの手法で注入されればよい。

上述では、反応場に固定化する増幅用試薬の固定化量を変更することにより増幅効率を変更する方法を説明した。次に、増幅用試薬の固定化量を変えずに、固定化する増幅用試薬の種類を増幅領域毎に変更することにより、増幅効率を変更する方法について説明する。

増幅効率の変更は、固定されるプライマー、ＤＮＡ合成酵素および／または逆転写酵素などの増幅用試薬の種類を変えることにより行われてもよい。

固定化される増幅用試薬の種類は、上述した通りである。固定化する増幅用試薬の種類の選択は次のように行われる。例えば、プライマーの場合、互いに精製グレードが異なるプライマーを選択すること、１つの鋳型核酸に含まれるが互いに異なる領域を増幅するためのプライマーセットを選択することなどが可能である。１つの鋳型核酸に含まれるが互いに異なる領域を増幅するためのプライマーセットを選択する場合、検出効率には影響が出ないように同一の目的配列を設定できる領域が好ましい。例えば、ＤＮＡ合成酵素および逆転写酵素の場合、互いに異なる耐塩性、耐熱性および増幅効率などの性能を有するものを選択すればよい。また、それらの互いに異なる種類のプライマー、互いに異なる種類のＤＮＡ合成酵素および逆転写酵素を組み合わせて使用してもよい。そのような互いに種類の異なる増幅用試薬をそれぞれの反応領域に対して、増幅反応に関与できる位置に固定化することにより、それぞれの増幅用試薬固定化領域が含まれる反応領域における増幅効率が変更される。それにより、試料に含まれる鋳型核酸の量に依存して、得られる増幅産物の量が変化する。その結果、例えば、増幅可能な領域の数が変化する。例えば、鋳型核酸の量が少ない場合には、増幅効率の良い精製グレードのプライマー、耐塩性、耐熱性および増幅効率のよいＤＮＡ合成酵素および／または逆転写酵素が固定化してある領域においてのみ、増幅反応が起こる。これに対して、鋳型核酸の量が多い場合には、全ての種類の試薬が固定化された領域において増幅が起こる。そして、このような増幅産物の検出は、各増幅用試薬固定化領域に対応して固定化されたプローブ核酸と増幅産物との間のハイブリダイズ信号を検出することにより達成される。従って、得られたハイブリダイズ信号に基づいて、試料中の鋳型核酸の量を定量することが可能である。例えば、ハイブリダイズ信号が検出された領域の数によって、試料に含まれる鋳型核酸の量を判定することが可能である。このようにして、試料中の核酸を簡易に定量することが可能となる。

また、固定化する増幅用試薬の構成（即ち、組み合わせ）を増幅領域ごと変更することにより、増幅効率を段階的に変更することも可能である。以下に、増幅用試薬の構成（即ち、組み合わせ）を変えることにより、増幅効率を変更する例を説明する。

増幅効率を変更するために各プライマーセットのための反応領域に固定化される増幅用試薬の構成（即ち、組み合わせ）を変更してもよい。そのような増幅用試薬の異なる組み合わせは、例えば、異なる構成からなる組成１〜３を１つのアレイ型プライマープローブチップに固定化する。例えば、そのような組成は次の通りであってよい。即ち、組成１は、プライマーおよびＤＮＡ合成酵素からなる増幅用試薬、組成２は、プライマー、ＤＮＡ合成酵素および逆転写酵素からなる増幅用試薬、組成３は、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素およびｄＮＴＰからなる増幅用試薬であってもよい。これらの増幅用試薬を異なる増幅用試薬固定化領域に対して固定化する。異なる反応領域に対してこれらの構成からなる増幅用試薬を固定化することにより、各反応領域における増幅効率は互いに異なるものとなる。

例えば、鋳型量が少ない場合には、組成３、即ち、プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素およびｄＮＴＰが固定化してある領域でしか増幅が起こらないのに対し、鋳型量が多い場合は、全ての試薬の構成、即ち、組成１、２および３が固定化された反応領域において増幅が起こる。各反応領域、即ち、各増幅用試薬固定化領域には対応してプローブ核酸が固定化されているために、生じた増幅産物の存在および／または存在量に依存してハイブリダイズ信号が得られる、またはハイブリダイズ信号が得られない。得られたハイブリダイズ信号に基づいて、例えば、ハイブリダイズ信号が得られた領域の数により、試料中に含まれる鋳型核酸の量を簡易に定量することが可能となる。

増幅効率を増幅用試薬固定化領域毎に変更する方法は、次のように行ってもよい。即ち、増幅用試薬固定化領域毎に異なる増幅効率となるように、増幅阻害剤を異なる量で固定化してもよい。

固定化される増幅阻害剤は、それ自身公知の何れの増幅阻害剤であってもよく、例えば、ヘパリン、エタノール、尿素、DMSO、DMF、ホルムアミド、SDS、塩類、糖類、界面活性剤および色素などであってもよい。これらの増幅阻害剤の固定化は、固定化されるべきプライマーセットを含む溶液に添加し、それをスポッティングして、乾燥することにより行われてもよい。増幅阻害剤と組み合わせて、上述の何れかの増幅用試薬が固定化されてもよい。

固定化される増幅阻害剤の量は、完全には増幅が抑制されない量である必要がある。

異なる量で増幅阻害剤を固定化することにより、それぞれの増幅用試薬固定化領域における増幅効率に違いが生じる。それにより、生じる増幅産物の量に違いが生じ、その結果、各反応領域のために固定化されたプローブ核酸とのハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号にも違いが生じる。その違いを検出することにより、試料中の核酸を定量することが可能となる。

上述した他の場合とように、増幅阻害剤を使用した場合であっても、鋳型核酸の量が少ない場合には、固定化された増幅阻害剤の量が少ない領域でのみ増幅が起こらないのに対し、鋳型核酸の量が多い場合には、全ての領域、即ち、固定化された増幅阻害剤の量が少ない領域においても、多い領域においても増幅が生じる。その結果、試料中の鋳型核酸の量に依存して、得られるハイブリダイズ信号の大きさや、ハイブリダイズ信号の得られるプローブ固定化領域の数に差が生じる。このようなハイブリダイズ信号の大きさやプローブ固定化領域の数に基づいて、試料中の鋳型核酸の量を決定することが可能である。

＜第３の実施形態＞
複数の標的配列を有する鋳型核酸を定量するためのマルチ核酸反応具１の例を図４を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具１は、複数の目的配列と、それらにそれぞれ相補的なプローブ核酸とのハイブリダイズを、ハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号を検出することによって検出し、それに基づいて、目的配列を含む標的配列を有する複数の鋳型核酸を定量するためのものである。そのために、定量されるべき複数の鋳型核酸について、それぞれの一部の配列を標的配列として設定し、その標的配列を増幅するためのプライマーセットを設計する。更に、それぞれの標的配列の一部分を目的配列として設定し、それらの目的配列の相補配列をそれぞれ有するプローブ核酸を設計する。

図４（ａ）は、マルチ核酸反応具の１例の斜視図である。図４（ａ）に記載のマルチ核酸反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の内側底面３には、互いに独立した複数の増幅用試薬固定化領域４が配置される。複数の増幅用試薬固定化領域４の近傍に、またそれぞれの増幅用試薬固定化領域４に対応して複数のプローブ固定化領域５が配置される。

図５（ｂ）は増幅用試薬固定化領域４を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つの増幅用試薬固定化領域４には１つの種類のプライマーセット６が固定される。複数の増幅用試薬固定化領域４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット６がそれぞれ固定される。

プライマーセット６は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。更に、１つの標的核酸について定量するために、複数の増幅用試薬固定化領域４が設定される。１つの標的核酸の定量のための複数の増幅用試薬固定化領域４（これを「１つのシリーズ」と称す）には、同じ種類のプライマーセット６がそれぞれ固定される。１つのシリーズのために固定化されるプライマーセット６は、第２の実施形態において説明されたように、増幅用試薬固定化領域４毎に、即ち、反応領域毎に増幅効率を変更する。増幅効率の変更は、第２の実施形態において説明されたように、プライマーセット６の濃度を変更すること、プライマーセット６と共に増幅用試薬を固定化すること、固定化される増幅用試薬の種類、濃度および／または構成を変更すること、並びに増幅阻害剤および／またはタンパク質安定化剤を使用することなどによって行われる。

１つの増幅用試薬固定化領域４にプライマーセット６を固定する場合、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット６が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つの増幅用試薬固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つの増幅用試薬固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。

図４（ｃ）には、増幅用試薬固定化領域４の近傍に配置されたプローブ固定化領域５の拡大図である。プローブ固定化領域５には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸７が複数で固定される。

図４（ｄ）に固定化されたプライマーセット６とプローブ核酸７の種類について模式的に示した。このマルチ核酸反応具１には、第１のシリーズ、第２のシリーズおよび第３のシリーズのプライマーセット６が固定化される。第１のシリーズは、第１の標的核酸を定量するために、同じ種類のプライマーセット６が固定化され、且つそれにより生じる増幅が互いに異なる増幅効率により行われるように固定化される試薬の組成が設計されている。第２のシリーズは、第２の標的核酸を定量するために、同じ種類のプライマーセット６が固定化され、且つそれにより生じる増幅が互いに異なる増幅効率により行われるように固定化される試薬の組成が設計されている。第３のシリーズは、第３の標的核酸を定量するために、同じ種類のプライマーセット６が固定化され、且つそれにより生じる増幅が互いに異なる増幅効率により行われるように固定化される試薬の組成が設計されている。

第１のシリーズ、第２のシリーズおよび第３のシリーズのプライマーセット６がそれぞれ固定化される増幅用試薬固定化領域４に対応した位置には、シリーズ毎に異なる配列を有するプローブ固定化領域５が配置される。即ち、第１のシリーズのためのプローブ核酸７は、第１の標的核酸の少なくとも一部の配列である第１の目的配列に相補的な配列を有する。第２のシリーズのためのプローブ核酸７は、第２の標的核酸の少なくとも一部の配列である第２の目的配列に相補的な配列を有する。第３のシリーズのためのプローブ核酸７は、第３の標的核酸の少なくとも一部の配列である第３の目的配列に相補的な配列を有する。

第１の標的核酸を増幅するためのプライマーセット６ａ_１、６ｂ_１および６ｃ_１は、図４（ｄ）に示されるように同じ列に配置された増幅用試薬固定化領域４に固定される。これらに対応するプローブ固定化領域５には、第１の標的核酸が増幅されて生じる増幅産物に含まれる少なくとも一部の配列を目的配列とし、その目的配列に相補的な配列を含むプローブ核酸７ａが固定化される。増幅用試薬固定化領域４に固定化されるプライマーセット６ａ_１、６ｂ_１および６ｃ_１は、それぞれ異なる組成Ａ、ＢおよびＣを有する。それにより、それぞれのプライマーセットにより生じる増幅効率が変更されている。また、プライマーセット６ａ_１、６ｂ_１および６ｃ_１の順番で段階的に増幅効率が大きくなるようにその組成が互いに異なる。これらのプライマーセット６ａ_１、６ｂ_１および６ｃ_１は、何れも増幅された第１の標的核酸を定量するために使用される１つのシリーズ（第１のシリーズ）である。

第１のシリーズの増幅用試薬固定化領域４に対応するプローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７は、何れも同じ目的配列を検出するためのものである。従って、それらのプローブ固定化領域５に固定化されるプローブ核酸７は１つの目的配列（第１の目的配列）に相補的な配列を含む。

同様に第２のシリーズに含まれる複数の増幅用試薬固定化領域４には、第２の標的核酸を増幅するためのプライマーセット６ａ_２、６ｂ_２および６ｃ_２が固定化される。プライマーセット６ａ_２、６ｂ_２および６ｃ_２によりそれぞれの反応領域で生じる増幅効率は、それぞれ異なるように調整されている。増幅効率の変更は、プライマーセット６の量および／または種類、共に固定化される増幅用試薬の量、種類および／または構成、並びに増幅阻害剤および／またはタンパク質安定化剤の使用などの変更によって異なる。そのために、第２のシリーズに含まれる複数の増幅用試薬固定化領域４に固定される試薬の組成は、互いに異なる組成Ａ、ＢおよびＣを有する。

更に、第３のシリーズに含まれる複数の増幅用試薬固定化領域４には、第３の標的核酸を増幅するためのプライマーセット６ａ_３、６ｂ_３および６ｃ_３が固定化される。プライマーセット６ａ_３、６ｂ_３および６ｃ_３によりそれぞれの反応領域で生じる増幅効率は、それぞれ異なるように調整されている。増幅効率の変更は、プライマーセット６の量および／または種類、共に固定化される増幅用試薬の量、種類および／または構成、並びに増幅阻害剤および／またはタンパク質安定化剤の使用などの変更によって異なる。そのために、第３のシリーズに含まれる複数の増幅用試薬固定化領域４に固定される試薬の組成は、それぞれ異なる組成Ａ、ＢおよびＣを有する。

このようなマルチ核酸反応具１を使用する３種類の鋳型核酸を定量する方法は、次のように行われる。マルチ核酸反応具１に試料と、任意の更なる増幅用試薬を含む反応液を添加する。その後増幅反応を行い、生じた増幅産物とプローブ核酸７との間のハイブリダイズ反応を行う。次に、生じたハイブリダイズ信号を検出する。

試料中の３種類のそれぞれの鋳型核酸の量と、１つのシリーズに含まれる３つのプローブ固定化領域５に対応する反応領域における増幅効率とに依存して、ある領域ではハイブリダイズ信号が得られず、ある領域ではハイブリダイズ信号が得られる。得られたハイブリダイズ信号が得られた数により、それぞれの鋳型核酸の量を判定してもよい。或いは、それぞれの領域において得られるハイブリダイズ信号の有無および大きさからそれぞれの鋳型核酸の量が判定されてもよい。

以上の例では、マルチ核酸反応具１により定量される鋳型核酸の数を３つとした。しかしながら、増幅用試薬固定化領域およびプローブ固定化領域の数を変更してもよく、定量される鋳型核酸が１種類以上、２種類以上または３種類以上であってもよい。それにより所望の数の核酸の定量を１つのマルチ核酸反応具により行うことが可能になる。

このようなマルチ核酸反応具により、簡便に複数の核酸を定量的に検出することが可能になる。

＜第４の実施形態＞
マルチ核酸反応具の更なる１例を、図５を参照しながら説明する。

図５は、マルチ核酸反応具の更なる１例を示す平面図である。図５に記載のマルチ核酸反応具１は、基板を支持体２として用いる例である。支持体２の１つの面３には、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域４が配置されている。複数の増幅用試薬固定化領域４は、具体的には９行６列で整列して配置されている。それぞれの増幅用試薬固定化領域４の近傍に対応するプローブ固定化領域５が配置されている。プローブ固定化領域５も９行６列で整列して配置されている。

このマルチ核酸反応具１は、９種類の核酸、即ち、第１の核酸〜第９の核酸を定量するためものである。従って、これらの９種類の核酸を検出するために、９種類のプライマーセット６が用意される。

また、これらの９種類の核酸を定量するために９種類のプライマーセット６は、複数種類の組成で用意される。９つの組成は、互いに異なる増幅効率を得るために設計される。異なる増幅効率を得るために、例えば、プライマーセット６の種類および量、他の増幅用試薬の使用の有無、使用される他の増幅用試薬の種類、量および組み合わせ、増幅阻害剤の使用の有無、使用される増幅阻害剤の種類、量および組み合わせ、並びにタンパク質安定化剤の使用の有無、使用されるタンパク質安定剤の種類、量および組み合わせなどが組成間で変更される。

９種類のプライマーセット６は、マルチ核酸反応具１の長手方向に沿って固定化される。マルチ核酸反応具１の長手方向に直交する方向に沿って異なる組成のプライマーセット６およびその他の任意の増幅用試薬が固定化される。即ち、マルチ核酸反応具１の長手方向に直交する方向に沿って、１つの標的配列を増幅するための複数の組成を有する複数のプライマーセット６からなる１つのシリーズが固定化される。

プローブ核酸７は、９種類の核酸、即ち、第１の核酸〜第９の核酸にそれぞれ鋳型として増幅された９種類の増幅産物を検出するために、９種類用意される。これらの９種類のプローブ核酸７は、マルチ核酸反応具１の長手方向に沿って固定化されている。同じシリーズに含まれるプライマーセット６が固定化された領域４に対応するプローブ固定化領域５には、同じ種類のプローブ核酸７が固定化されている。

この実施形態を用いる核酸の検出は、少なくとも支持体２のプライマーセット６、増幅用試薬５１が固定化された領域に対して、反応液を載せることにより反応場を形成すればよい。或いは、核酸の検出が、反応液を含む容器にマルチ核酸反応具を浸漬することにより行われてもよい。

増幅用試薬固定化領域４およびプローブ固定化領域５は、支持体２の表面に予め形成された凹部面、または凹部により形成される流路の内壁に配置されてもよい。

基板を支持体として使用する場合、その材質は、それ自身反応に関与しない材質であればより、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてもよい。また、支持体へのプライマー、増幅用試薬の固定化は、第1の実施形態と同様に行えばよい。

また、支持体２の両面にプライマーセット６、プローブ核酸７および任意の増幅用試薬３４を固定してもよい。この側面において、マルチ核酸増幅反応具は、少なくとも１表面に複数のプライマーセットおよび任意の増幅用試薬が独立して固定化された支持体であればよい。従って、支持体の形状は、それが可能であればどのような形状であってもよく、例えば、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってもよい。

＜第５の実施形態＞
マルチ核酸反応具の更なる１例を、図６を参照しながら説明する。図６に示すマルチ核酸反応具１は、流路を有する支持体を使用する例である。図６（ａ）はマルチ核酸反応具１の平面図であり、図６（ｂ）は、線ｍ−ｍ’で切断したマルチ核酸反応具１の断面図である。

マルチ核酸反応具１は、支持体２の内部に形成された流路４１と、流路４１の底面４２に配置された互いに独立した複数の増幅用試薬固定化領域５０と、そこに種類毎に遊離可能に固定化された複数のプライマーセット６と他の任意の増幅用試薬５１と、複数の増幅用試薬固定化領域５０と同じ位置に配置されたプローブ固定化領域５と、そこに固定化されたプローブ核酸７とを含む。

マルチ核酸反応具１は、５種類の核酸を検出および定量するためのものである。従って、５種類の核酸それぞれの少なくとも一部分を増幅するための５種類のプライマーセット６が用意される。更に、５種類のプライマーセット６により規定される反応領域における増幅効率が異なるように、１種類のプライマーセット６について、複数種類の組成が用意される。これらの組成は、互いに異なる増幅効率を得るために設計される。異なる増幅効率を得るために、例えば、プライマーセット６の種類および量、増幅用試薬の使用の有無、使用される増幅用試薬の種類、量および組み合わせ、増幅阻害剤の使用の有無、使用される増幅阻害剤の種類、量および組み合わせ、並びにタンパク質安定化剤の使用の有無、使用されるタンパク質安定剤の種類、量および組み合わせなどが組成間で変更される。

５種類のプライマーセット６は、増幅されるべき標的核酸の種類毎にマルチ核酸反応具１の流路４１の流れ方向に沿って固定化される。１つの標的配列を増幅するための複数の組成を有する複数のプライマーセット６と任意の増幅用試薬５１からなる１つのシリーズについてもマルチ核酸反応具１の流路４１の流れ方向に沿って固定化される。即ち、第１の標的核酸を増幅するための第１のプライマーセットからなる第１のシリーズは、増幅用試薬固定化領域５０Ａに固定化され、第２の標的核酸を増幅するための第２のプライマーセットからなる第２のシリーズは、増幅用試薬固定化領域５０Ｂに固定化され、第３の標的核酸を増幅するための第３のプライマーセットからなる第３のシリーズは、増幅用試薬固定化領域５０Ｃに固定化され、第４の標的核酸を増幅するための第４のプライマーセットからなる第４のシリーズは、増幅用試薬固定化領域５０Ｄに固定化され、第５の標的核酸を増幅するための第５のプライマーセットからなる第５のシリーズは、増幅用試薬固定化領域５０Ｅに固定化される。複数の領域からなる増幅用試薬固定化領域５０Ａのそれぞれには、１つのシリーズに含まれる互いに異なる増幅効率を有する複数のプライマーセット６および任意の増幅用試薬５１が固定化される。

プローブ核酸７は、５種類の核酸をそれぞれ鋳型として増幅された９種類の増幅産物を検出するために、５種類用意される。これらの５種類のプローブ核酸７は、対応する増幅用試薬固定化領域５０と同じ位置に、マルチ核酸反応具１の流路４１の流れ方向に沿って固定化されている。同じシリーズに含まれるプライマーセット６が固定化された領域４に対応するプローブ固定化領域５には、同じ種類のプローブ核酸７が固定化されている。

上述したように、この実施形態では、同じ位置にプローブ核酸７と、プライマーセット６およびその他の増幅用試薬５１とが固定化されている。この場合、プローブ核酸７は反応液の添加から検出終了時まで支持体２に固定化されたままであり、プライマーセット６および増幅用試薬５１は、添加された反応液と接触することにより遊離されるように固定化される必要がある。そのためには、例えば、プローブ核酸７を先に支持体２に固定化し、その後プライマーセット６および任意の増幅用試薬５１を遊離可能に固定化すればよい。

このマルチ核酸反応具は、例えば、第１の基板と第２の基板を用いて製造される。まず、第１の基板の予め決定されたプローブ固定化領域５に複数種類のプローブ核酸７が固定化される。次に増幅用試薬固定化領域５０に、複数のプライマーセット６および任意の増幅用試薬５１が遊離可能に固定化される。プライマーセット６および任意の増幅用試薬５１はプライマーの種類毎および組成の種類毎に固定化される。

一方で、第２の基板には、所望の流路４１に形状に対応させて凹部４３を形成する。凹部４３の形成は、使用される基板の材質に応じてそれ自身公知の方法により行うことが可能である。また、増幅用試薬固定化領域５０およびプローブ固定化領域５が配置される位置は、第２の基板に形成された凹部４３および凹部４３に対向する第２の基体の表面により形成される流路内に含まれるように決定される。

次に、第１の基板と第２の基板を一体化する。一体化により、凹部４３の内壁と第１の基板の面とにより流路４１が形成される。この流路４１は、流路形状の反応部である。２つの基板の一体化は、第２の基板の凹部４３が第１の基板側を向くように行われる。また、第２の基板の凹部４３の端部に対応する部分に貫通孔７２および７３が設けられてもよい。この貫通孔７２および７３は、流路４１への反応液などの出し入れ口として利用されてよい。

第１の基板の材質と第２の基板の材質は同じであっても、異なってよい。また、第１の基板および第２の基板の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。

この実施形態では、流路を有した支持体の流路底面にプライマーセットを固定した例を示したが、流路の配置および形状はこれに限定されるものではない。また、プローブセットを固定化する面は流路を規定する何れの面であってもよく、流路を規定する全ての面にプローブセットが固定されてもよく、また複数の面に固定されてもよい。

或いは、予め凹部または溝を形成することにより流路を形成した第１の基板に、その流路の一部の壁面に配置された増幅用試薬固定化領域に対して、複数のプライマーセット、増幅用試薬を独立して固定してもよい。その後、シリコンゴムなどの蓋体を取り付けることにより、マルチ核酸反応具が製造されてもよい。

第５の実施形態に従うマルチ核酸反応具１を使用する核酸の定量は、各反応領域において生じる増幅の有無および／または程度を、そこにおいて生じる増幅産物とプローブ核酸７とのハイブリダイゼーションの有無および／または程度をハイブリダイズ信号を指標に判定することにより行われてよい。例えば、各シリーズにおいて行われる１つの標的配列についての異なる増幅効率での増幅によって得られるハイブリダイズ信号の有無および／または程度に基づいて判定される。或いは、ハイブリダイズ信号が得られた反応領域の数から、検出されるべき核酸の試料中の量を判定してもよい。

このようなマルチ核酸反応具およびそれを用いた核酸の検出方法により、複数の核酸を簡便に定量することが可能となる。

＜第６の実施形態＞
第６の実施形態のアレイ型プライマープローブチップについて図７〜図１０を参照しながら説明する。このアレイ型プライマープローブチップは、試料中の特定の２種類の核酸を検出するためのものである。

（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するアレイ型プライマープローブチップのチップ素材の構成および製造方法の１例について図７（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図７（ａ）は、チップ素材の平面図であり、図７（ｂ）は、図７（ａ）のチップ素材の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

チップ素材１１１は、矩形状の基板１１２上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを備えている。各電極１１３ａ〜１１３ｄは、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極１１３ａ〜１１３ｄは大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。絶縁膜１１９は、各電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に被覆されている。円形窓１２０は、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。矩形窓１２１は、小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に開口されている。電極１１３ａの円形窓１２０ａから露出する大矩形部１１６は第１の作用極１２２ａとして機能する。電極１１３ｂの円形窓１２０ｂから露出する大矩形部１１６は第２の作用極１２２ｂとして機能する。電極１１３ｃの円形窓１２０ｃから露出する大矩形部１１６は対極１２３として機能する。電極１１３ｄの円形窓１２０ｄから露出する大矩形部１１６は参照極１２４として機能する。また、電極１１３ａ〜１１３ｄの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７はプローバー接触部として機能する。

このようなチップ素材は、次のような方法により作製することができる。

まず、基板１１２上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン１１４および第２の金属薄膜パターン１１５をこの順序で積層した、例えば４つの電極１１３ａ〜１１３ｄを基板１１２の長手方向に沿って形成する。これらの電極１１３ａ〜１１３ｄは、大矩形部１１６と小矩形部１１７を細線１１８で連結した形状を有する。

次いで、電極１１３ａ〜１１３ｄを含む基板１１２上に、絶縁膜１１９を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極１１３ａ〜１１３ｄの大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分をレジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部１１６に対応する絶縁膜１１９部分に円形窓１２０を、および小矩形部１１７に対応する絶縁膜１１９部分に矩形窓１２１を開口する。それにより前述したチップ素材１１１を作製する。

基板１１２は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。

第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板１１２に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。

第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。

絶縁膜１１９は、例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜を挙げることができる。

絶縁膜１１９をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。

（２）アレイ型プライマープローブチップ
次に、上記（１）において製造されたチップ素材１１１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したアレイ型プライマープローブチップの構成および製造方法の１例を図８（ａ）および図８（ｂ）を参照しながら説明する。図８（ａ）はアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図８（ｂ）は図８（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

チップ素材１１１上に形成された電極１１３ａの第１の作用極１２２ａを第１のプローブ固定化領域２０１ａとし、この第１のプローブ固定化領域２０１ａに第１の目的配列の相補配列を含む第１のプローブ核酸２０２ａを固定する。固定される第１のプローブ核酸２０２ａは、その複数本で１つのプローブ核酸群として固定される。同様に、電極１１３ｂの第２の作用極１２２ｂを第２のプローブ固定化領域２０１ｂとし、この第２のプローブ固定化領域２０１ｂに第１の目的配列とは異なる第２の目的配列の相補配列を含む第２のプローブ核酸２０２ｂを固定する。

プローブ核酸２０２ａおよび２０２ｂをプローブ固定化領域２０１に固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材１１１については３’末端にチオール基を第１のプローブ核酸２０２ａに導入する方法などが含まれる。

次いで、第１の作用極１２２ａの近傍に第１の増幅用試薬固定化領域２０３ａを、第２の作用極１２２ｂの近傍に第２の増幅用試薬固定化領域２０３ｂを配置する。この第１の増幅用試薬固定化領域２０３ａ上に第１のプライマーセット２０４ａを、第２の増幅用試薬固定化領域２０３ｂ上に第２のプライマーセット２０４ｂを固定する。それによりアレイ型プライマープローブチップ１を作製する。

第１のプライマーセット２０４ａは第１の標的配列を増幅するように設計された配列を有し、第２の増幅用試薬固定化領域２０４ｂは第１の標的配列とは異なる配列からなる第２の標的配列を増幅するように設計された配列を有する。

第１および第２のプライマーセット２０４ａおよび２０４ｂをそれぞれ第１および第２の増幅用試薬固定化領域２０３ａおよび２０３ｂへの固定化は例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセット２０３を含ませて滴下して、その後、例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間、例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。

（３）使用時のアレイ型プライマープローブチップ
上記（２）において作製されたアレイ型プライマープローブチップ１の使用方法について図９および図１０を参照しながら説明する。

図９（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図１３（ｂ）は、図９（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。

本実施形態のアレイ型プライマープローブチップ１を使用する場合、電極１１３ａ〜１１３ｄにそれぞれ形成された第１の作用極１２２ａ、第２の作用極１２２ｂ、対極１２３および参照極１２４、並びに第１の増幅用試薬固定化領域２０３ａおよび第２の増幅用試薬固定化領域２０３ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、被覆体３０１が、アレイ型プライマープローブチップ１の使用前にアレイ型プライマープローブチップ１上に装着される。被覆体３０１は、中空でその１つの面が開放した直方体である。被覆体３０１は、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を用いて、そのような樹脂を、例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または例えば、接着剤による各部材の接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法によって形成される。被覆体３０１が装着された後に、反応液３０２がアレイ型プライマープローブチップ１と被覆体３０１とにより規定された空間に添加される。反応液３０２は、鋳型核酸３０３を含む。

被覆体３０１が装着されたアレイ型プライマープローブチップ１において、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７は露出している。

被覆体３０１をアレイ型プライマープローブチップ１に装着する方法の例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。

反応液３０２は被覆体３０１がアレイ型プライマープローブチップ１に装着された後に添加される。

アレイ型プライマープローブチップ１と被覆体３０１とにより形成される空間に反応液などの液体を添加する方法の例は、例えば、被覆体３０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加すること、または先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用い、その針で被覆体３０１を穿孔し、被覆体３０１の一部に針を差し込んで添加することなどが挙げられる。

反応液３０２は、試料と、増幅用試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含む。検査されるべき試料中に特定の増幅用試薬固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在した場合、その増幅用試薬固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応領域において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図１０に示す。

図１０（ａ）は、反応場である反応液３０２の領域４０１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図１０（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップ１の平面図であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のアレイ型プライマープローブチップ１の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図１０において添加された試料中には、第２のプライマーセット２０４ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図１０（ａ）および図１０（ｂ）に示すように、第２のプライマーセット２０４ｂは領域４０１に遊離および拡散し、鋳型核酸３０３と出会った後に増幅反応が生じ、増幅産物が形成される。第２のプライマーセット２０４ｂによる増幅産物は、第２の増幅用試薬固定化領域２０３ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域２０１ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸２０２ｂと増幅産物とがハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液３０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。

ハイブリダイズ信号は、例えば、電極１１３ａ〜１１３ｄのそれぞれの矩形窓１２１から露出する小矩形部１１７にプローバーを接触させ、ヘキスト３３２５８のようなインタカレータの電流応答を測定することにより行われる。

電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる目的核酸の検出を行うことが可能である。

このアレイ型プライマープローブチップは、試料中の特定の２種類の核酸を増幅し、検出するためのデバイスであり、そのために電極を２つ備える。しかしながら、電極の数を増やしてプローブ固定化領域を増やし、それに対応する増幅用試薬固定化領域を増やすことにより、２種類以上の核酸についても同様に増幅し、検出することが可能である。また、更に、同じ標的核酸がプライマーセットにより増幅される複数の反応領域間での増幅効率を互いに異ならせることにより、特定の核酸について試料中の存在量を決定することが可能である。その場合において、増幅効率を変更する方法は、上述した通りである。

このような実施形態により、簡便に複数の核酸を検出および定量することが可能となる。

＜マルチ核酸反応具の製造方法＞
また、更なる実施形態としてマルチ核酸反応具の製造方法も提供される。１つの例として製造方法は、以下を含む；
液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域に、標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記標的配列と前記増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること。

また更なる例として、マルチ核酸反応具の製造方法は以下を含む；
液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域に、複数種類の標的配列のそれぞれについて、互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記複数の標的配列と増幅用試薬とによりそれぞれ生じた複数種類の増幅産物のそれぞれの少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
を含むマルチ核酸反応具の製造。

ここにおいて、特定の標的配列を増幅すべき増幅用試薬が固定化された領域と同じ位置またはその近傍に、前記特定の標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸が固定化される。即ち、増幅されるべき標的核酸を増幅するための増幅用試薬が固定化された位置と同じ位置またはその近傍に、標的核酸を鋳型として得られた増幅産物に含まれる目的配列とハイブリダイズすることにより検出するためのプローブ核酸が固定化される。言い換えれば、１つの反応領域における増幅により生じた増幅産物は、それを検出できるプローブ核酸が同じ反応領域に存在して初めて検出される。従って、互いに対応する増幅用試薬とプローブ核酸とは同じ反応領域に存在できるように固定化されている。

このような製造方法により、１つの反応場において複数の増幅反応を達成し、生じた増幅産物を検出することにより、試料中の核酸を定量することができるデバイスが提供される。

＜核酸の検出方法＞
例として上述したようなマルチ核酸反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅して、ハイブリダイズ信号を指標として核酸を定量する方法も更なる実施形態として提供される。核酸を定量する方法は、次の工程を含んでよい；
（ａ）液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
（ｂ）前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数の増幅用試薬固定化領域に、標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、
（ｄ）前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記標的配列と前記増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部の配列からなる目的配列に相補的な配列を含むプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
（ｅ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｆ）反応場に試料を持ち込むことと、
（ｇ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと、
（ｈ）前記増幅反応により得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズの有無または量を、前記プライマーセットのそれぞれにより得られる増幅産物について独立して検出すること、および
（ｉ）前記（ｈ）の結果に基づいて、前記目的配列を含む核酸の試料中に存在する量を決定すること。

更なる実施形態として提供される核酸を定量する方法は、次の工程を含んでよい；
（ａ）液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
（ｂ）前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数の増幅用試薬固定化領域に、複数種類の標的配列のそれぞれについて、互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、
（ｄ）前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記複数の標的配列と増幅用試薬とによりそれぞれ生じた複数種類の増幅産物のそれぞれの少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
（ｅ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｆ）反応場に試料を持ち込むことと、
（ｇ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと、
（ｈ）前記増幅反応により得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズの有無または量を、前記プライマーセットのそれぞれにより得られる増幅産物について独立して検出すること、および
（ｉ）前記（ｈ）の結果に基づいて、前記目的配列を含む核酸の試料中に存在する量を決定すること。

ここにおいて、特定の標的配列を増幅すべき増幅用試薬が固定化された領域と同じ位置またはその近傍に、前記特定の標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸が固定化される。

このような検出方法により、簡便に試料中の核酸を定量することが可能となる。

反応液は、マルチ核酸反応具において増幅反応およびそれに続くハイブリダイゼーションに必要な液体であればよい。増幅反応に必要な液体は、固定化されたプライマーセットと固定化された増幅用試薬のみで増幅反応が可能である場合には、水であってもよい。必要に応じて、反応液には、増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでもよい。

試料の反応場への持ち込みは、反応液に対して予め添加し、その後、マルチ核酸反応具の反応部に添加されてもよい。或いは、反応液をマルチ核酸反応具の反応部に添加する前または後に、試料を反応部に添加してもよい。

また必要に応じて、例えば、当該プライマーが固定された支持体を加熱または冷却することによって、反応部内の温度調節を行ってもよい。更に、必要に応じて増幅反応を開始および／または維持するための条件を満たす操作を行ってもよい。

増幅産物の検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号を検出する方法、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよい。

例として実施形態に示したマルチ核酸反応具によれば、異なる配列による干渉を受けずに複数種類の標的配列についての増幅を反応領域毎に独立して同時に行うことができる。また、増幅反応と同時または増幅反応に引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応領域において、増幅反応により生じた増幅産物について目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。

従来の技術では、複数種類のプライマーを１つの容器内で使用してマルチプレックス増幅を行った場合、反応効率に偏りが生じ、種類の数に限りがあることが問題となっている。即ち、異なる種類のプライマー間で、必要な酵素やｄＮＴＰの取り合いが生じることがある。また、標的配列の配列やプライマーの配列により、反応特異性および／または反応効率に違いがでることもある。その場合、プライマーの種類によって増幅反応開始点が異なること、一部のプライマーセットについての増幅のみが開始され進行されること、或いは、一部のプライマーセットについての増幅が十分に達成されないことなどの問題が生じてしまう。このような従来の問題も、本明細書において開示される実施形態により解決される。

即ち、実施形態を例に示したマルチ核酸反応具を使用して増幅反応を行うと、固定化された増幅用試薬付近でのみ増幅反応が進行するため、同一容器中および／または同一溶液中でありながら、互いの増幅反応に干渉せず、複数の反応条件で増幅反応を独立に進行させることが可能である。更に、そのような増幅反応と同時または引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応容器において目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。それにより、簡便に、複数の増幅を行うことが可能であり、且つそれぞれの反応により生じた増幅産物を独立して検出することが可能である。従って、簡便に核酸の定量を行うことが可能である。

［例］
例１
電極の数を除いて、第６の実施形態と同様の電気化学的検出用のマルチ核酸反応具を作製し、反応領域間での増幅用試薬の固定化量を調整することによって増幅効率を変更する方法を用いた。以下に、複数の検査対象種を１つのデバイス上で簡易定量することが可能なマルチ核酸反応具の例を記載する。

（１）チップ素材の作製
図７に示すようなマルチ核酸反応具用のチップ素材を形成した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極、即ち、作用極、対極、参照極およびプローブ用電極を露出させた。これをマルチ核酸反応具のためのチップ素材とした。

（２）マルチ核酸反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列を表１に示す。

配列番号１、２に示す２種類のプローブＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）を上記のように作製したチップ素材に固定化した。プローブＤＮＡをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液の１００ｎＬを作用極上に種類毎にスポットした。４０℃で乾燥後、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、プローブＤＮＡがチップ素材の電極に固定化されたＤＮＡチップを作製した。

次に上記でシリコンゴム板製の被覆体を用意した。被覆体の一面には、プローブ固定化領域に対応する位置に溝が形成されている。

被覆体の溝の底面に対して、プライマーセット、ＤＮＡ合成酵素、トレハロースを固定した。これらの試薬は予め混合した後に固定化しても、別々に固定化することも可能である。上記試薬の固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。

まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列を表２に示す。

プライマーＤＮＡ（セットＡ）、（セットＢ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦをそれぞれ準備した。各プライマー、ＤＮＡ合成酵素、トレハロースの混合溶液の組成を表３、表４、表５に示す。組成（１）は、鋳型量１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ以上検出用、組成（２）は、鋳型量１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ以上検出用、組成（３）は、鋳型量１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ以上検出用であり、各水溶液を０．３μＬずつ、被覆体であるシリコンゴムの溝部の底面に固定した。

具体的には、用意したそれぞれ０．３μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ核酸反応具を得た。このマルチ核酸反応具は、マルチ簡易定量用のアレイ型プライマープローブチップである。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。

（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を表６、表７、表８に示す。

組成（ａ）、（ｂ）、（ｃ）には、共通して、ＬＡＭＰ反応に必要となるデオキシリボ核酸等のリアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。

組成（ａ）には、鋳型Ａおよび鋳型Ｂが各々１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ含まれる。

鋳型Ａは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（１）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｂ）には、１×１０^２ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ａが含まれることから、試薬組成（１）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。

鋳型Ｂは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（１）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ａ）には、１×１０^２ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ｂが含まれることから、試薬組成（１）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。

組成（ｂ）には、鋳型Ａおよび鋳型Ｂが各々１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ含まれる。

鋳型Ａは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（１）、（２）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｂ）には、１×１０^４ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ａが含まれることから、試薬組成（１）、（２）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。

鋳型Ｂは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（１）、（２）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｂ）には、１×１０^４ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ｂが含まれることから、試薬組成（１）、（２）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。

組成（ｃ）には、鋳型Ａおよび鋳型Ｂが各々１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ含まれる。

鋳型Ａは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（１）、（２）、（３）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｃ）には、１×１０^６ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ａが含まれることから、試薬組成（１）、（２）、（３）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。

鋳型Ｂは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（１）、（２）、（３）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｃ）には、１×１０^６ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ｂが含まれることから、試薬組成（１）、（２）、（３）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。

鋳型Ａおよび鋳型Ｂの塩基配列を表９に示す。

（４）マルチ核酸反応具上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
被覆体であるシリコンゴム板に設けられた２つの貫通孔のうちの一方を流入口とした。シリコンゴム板に設けられた溝部とチップ素材の一面とにより構成される流路を反応部として、そこにおいて反応を行った。流入口から反応部にＬＡＭＰ反応溶液を注入した。その後速やかに、ＤＮＡ自動検査装置内にマルチ核酸反応具を設置した。ＤＮＡ自動検査装置内のペルチェ上で６４℃６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。

６０分間のＬＡＭＰ反応の後、４５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、３０℃で３分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、２０μＭヘキスト３３２５８溶液を流入口から注入した。

各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、ＳＩＣＥＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌ，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ａｎｄＳｙｓｔｅｍＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．３，ｐｐ．２６６−２７０，２００８に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。

（５）検出結果
検出結果を表１０に示した。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（ａ）の結果］
鋳型Ａおよび鋳型Ｂが各々１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（ａ）を添加した場合の結果は次の通りである。

固定化試薬組成（１）の近傍領域に存在するプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている２種類の検査対象に対する固定化試薬（１）の試薬組成についてＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が近傍に存在するプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、２種類の鋳型が各々１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ程度含まれていたことを判定することが可能である。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（ｂ）の結果］
鋳型Ａおよび鋳型Ｂが各々１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（ｂ）を添加した場合の結果は次の通りである。

固定化試薬組成（１）、（２）の近傍領域に存在するプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている２種類の検査対象に対する固定化試薬（１）、（２）の試薬組成についてＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が近傍に存在するプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、２種類の鋳型が各々１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ程度含まれていたことを判定することが可能である。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（ｃ）の結果］
鋳型Ａおよび鋳型Ｂが各々１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（ｃ）を添加した場合の結果は次の通りである。

固定化試薬組成（１）、（２）、（３）の近傍領域に存在する全てのプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている２種類の検査対象に対する固定化試薬（１）、（２）、（３）の全ての試薬組成についてＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が近傍に存在するプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、２種類の鋳型が各々１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ程度含まれていたことを判定することが可能である。

以上の結果から、本実施例に記載したプライマー、ＤＮＡ合成酵素、トレハロース固定化アレイ型プライマープローブチップを用いて、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる鋳型に対し、簡易定量が可能であることが示された。さらに、ＬＡＭＰ反応溶液中に複数種類の鋳型が含まれている場合も、マルチで簡易定量が可能であることが示された。

例２
電極の数除いて、第６の実施形態と同様の電気化学的検出用のマルチ核酸反応具を作製し、そこにおいて増幅効率を変更する方法として増幅用試薬の種類を変える方法を用いた。以下に、複数の検査対象種を１つのデバイス上で簡易定量することが可能なマルチ核酸反応具の例を記載する。

（２）マルチ核酸反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列は表１に示されたもの同じ配列を使用した。

被覆体の溝の底面に対して、プライマーセット、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、トレハロースを固定した。これらの試薬は予め混合した後に固定化しても、別々に固定化することも可能である。上記試薬の固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。

まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列は表２に示された配列と同じ配列を使用した。

プライマーＤＮＡ（セットＡ）、（セットＢ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦをそれぞれ準備した。各プライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、トレハロースの混合溶液の組成を表１１、表１２、表１３に示す。

組成（４）は、ＤＮＡ鋳型量１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ以上、ＲＮＡ鋳型量１×１０^３ｃｏｐｉｅｓ以上検出用、組成（５）は、ＤＮＡ鋳型量１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ以上、ＲＮＡ鋳型量１×１０^５ｃｏｐｉｅｓ以上検出用、組成（６）は、ＤＮＡ鋳型量１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ以上、ＲＮＡ鋳型量１×１０^７ｃｏｐｉｅｓ以上検出用である。これらの水溶液を０．３μＬずつ、被覆体であるシリコンゴムの溝部の底面に固定した。

具体的には、用意したそれぞれ０．３μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ簡易定量用アレイ型プライマープローブチップを得た。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。

（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を表１４、表１５、表１６に示す。

組成（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）には、共通して、ＬＡＭＰ反応に必要となるデオキシリボ核酸等のリアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。

組成（ｄ）には、鋳型Ａが各々１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ、鋳型Ｃが１×１０^３ｃｏｐｉｅｓ含まれる。

鋳型Ａは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（４）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｄ）には、１×１０^２ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ａが含まれることから、試薬組成（４）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。

鋳型Ｃは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（４）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｄ）には、１×１０^３ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ｃが含まれることから、試薬組成（４）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。

組成（ｅ）には、鋳型Ａが各々１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ、鋳型Ｃが１×１０^５ｃｏｐｉｅｓ含まれる。

鋳型Ａは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（４）、（５）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｅ）には、１×１０^４ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ａが含まれることから、試薬組成（４）、（５）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。

鋳型Ｃは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（４）、（５）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｅ）には、１×１０^５ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ｃが含まれることから、試薬組成（４）、（５）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。

組成（ｆ）には、鋳型Ａが各々１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ、鋳型Ｃが１×１０^７ｃｏｐｉｅｓ含まれる。

鋳型Ａは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（４）、（５）、（６）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｆ）には、１×１０^６ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ａが含まれることから、試薬組成（４）、（５）、（６）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。

鋳型Ｃは、被覆体の溝部に乾燥固定した試薬組成（４）、（５）、（６）によりＬＡＭＰ増幅される。組成（ｆ）には、１×１０^７ｃｏｐｉｅｓの鋳型Ｃが含まれることから、試薬組成（４）、（５）、（６）のスポット箇所で増幅が起こり、それにより生じる増幅産物は、増幅領域近傍に存在するプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。

鋳型Ａおよび鋳型Ｃの塩基配列は表９に示される配列と同じ配列を使用した。

（５）検出結果
検出結果を表１７に示した。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（ｄ）の結果］
鋳型Ａが１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ、鋳型Ｃが１×１０^３ｃｏｐｉｅｓ含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（ｄ）を添加した場合の結果は次の通りである。

固定化試薬組成（４）の近傍領域に存在するプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている２種類の検査対象に対する固定化試薬（４）の試薬組成についてＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が近傍に存在するプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、Ａの鋳型が１×１０^２ｃｏｐｉｅｓ程度、Ｃの鋳型が１×１０^３ｃｏｐｉｅｓ程度含まれていたことを判定することが可能である。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（ｅ）の結果］
鋳型Ａが１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ、鋳型Ｃが１×１０^５ｃｏｐｉｅｓ含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（ｅ）を添加した場合の結果は次の通りである。

固定化試薬組成（４）、（５）の近傍領域に存在するプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている２種類の検査対象に対する固定化試薬（４）、（５）の試薬組成についてＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が近傍に存在するプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、Ａの鋳型が１×１０^４ｃｏｐｉｅｓ程度、Ｃの鋳型が１×１０^５ｃｏｐｉｅｓ程度含まれていたことを判定することが可能である。

［ＬＡＭＰ反応溶液組成（ｆ）の結果］
鋳型Ａが１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ、鋳型Ｃが１×１０^７ｃｏｐｉｅｓ含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（ｆ）を添加した場合の結果は次の通りである。

固定化試薬組成（４）、（５）、（６）の近傍領域に存在するプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている２種類の検査対象に対する固定化試薬（４）、（５）、（６）の試薬組成についてＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が近傍に存在するプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。

この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、Ａの鋳型が１×１０^６ｃｏｐｉｅｓ程度、Ｃの鋳型が１×１０^７ｃｏｐｉｅｓ程度含まれていたことを判定することが可能である。

以上の結果から、本実施例に記載したプライマー、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、トレハロース固定化アレイ型プライマープローブチップを用いて、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる鋳型に対し、簡易定量が可能であることが示された。さらに、ＬＡＭＰ反応溶液中に複数種類の鋳型が含まれている場合も、マルチで簡易定量が可能であることが示された。

Claims

液相の反応場を支持するように構成された支持体と、
前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数の増幅用試薬固定化領域と、
前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、
前記複数の増幅用試薬固定化領域に増幅効率毎に遊離可能に固定化され、標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬と、
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれにハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化された、前記標的配列と前記増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸と、
を具備するマルチ核酸反応具。
液相の反応場を支持するように構成された支持体と、
前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面の互いに独立して配置された複数の増幅用試薬固定化領域と、
前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、
前記複数の増幅用試薬固定化領域に増幅効率毎に遊離可能に固定化され、複数種類の標的配列のそれぞれについて、互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬と、
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれにハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化された、前記複数の標的配列と増幅用試薬とによりそれぞれ生じた複数種類の増幅産物のそれぞれの少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸と、
を具備するマルチ核酸反応具であって、
特定の標的配列を増幅すべき増幅用試薬が固定化された領域と同じ位置またはその近傍に、前記特定の標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸が固定化されているマルチ核酸反応具。
前記増幅用試薬が、プライマーセットを含む、請求項１または２に記載のマルチ核酸反応具。
前記増幅用試薬が、更に、ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、緩衝剤、ｄＮＴＰ、硫酸アンモニウム、界面活性剤、塩類、ベタイン、タンパク質安定化剤および増幅阻害剤、並びにその組み合わせからなる群より選択される少なくとも１を含む請求項３に記載のマルチ核酸反応具。
前記支持体が容器形態または流路を有する支持体であり、前記容器内または流路内が反応場である請求項１〜４に記載のマルチ核酸反応具。
液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域に、標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記標的配列と前記増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
を含むマルチ核酸反応具の製造方法。
液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
前記複数の増幅用試薬固定化領域に、複数種類の標的配列のそれぞれについて、互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、および
前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記複数の標的配列と増幅用試薬とによりそれぞれ生じた複数種類の増幅産物のそれぞれの少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
を含むマルチ核酸反応具の製造であって、
特定の標的配列を増幅すべき増幅用試薬が固定化された領域と同じ位置またはその近傍に、前記特定の標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸が固定化されるマルチ核酸反応具の製造方法。
前記支持体に前記増幅用試薬を固定化することが、増幅用試薬を媒体に溶解し、得られた液体を前記支持体に滴下した後に、熱乾燥法、真空乾燥法、凍結乾燥法および自然乾燥法からなる群より選択される乾燥法により乾燥されることにより行われる請求項６または７に記載の方法。
（ａ）液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
（ｂ）前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数の増幅用試薬固定化領域に、標的配列を互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、
（ｄ）前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記標的配列と前記増幅用試薬とにより生じた増幅産物の少なくとも一部の配列からなる目的配列に相補的な配列を含むプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
（ｅ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｆ）反応場に試料を持ち込むことと、
（ｇ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと、
（ｈ）前記増幅反応により得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズの有無または量を、前記プライマーセットのそれぞれにより得られる増幅産物について独立して検出すること、および
（ｉ）前記（ｈ）の結果に基づいて、前記目的配列を含む核酸の試料中に存在する量を決定すること、
を含む核酸を定量する方法。
（ａ）液相の反応場を支持するように構成された支持体において、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に、互いに独立して複数の増幅用試薬固定化領域を配置すること、
（ｂ）前記複数の増幅用試薬固定化領域のそれぞれと同じ位置またはその近傍に、複数のプローブ固定化領域を配置すること、
（ｃ）前記複数の増幅用試薬固定化領域に、複数種類の標的配列のそれぞれについて、互いに異なる増幅効率で増幅するように設計された互いに異なる組成を有する複数の増幅用試薬を増幅効率毎に遊離可能に固定化すること、
（ｄ）前記複数のプローブ固定化領域のそれぞれに、前記複数の標的配列と増幅用試薬とによりそれぞれ生じた複数種類の増幅産物のそれぞれの少なくとも一部に相補的な配列を含む複数種類のプローブ核酸を、ハイブリダイズ信号を独立して検出可能に固定化すること、
（ｅ）前記支持体に対して核酸増幅を行うための反応液を添加して１つの反応場を形成すること、
（ｆ）反応場に試料を持ち込むことと、
（ｇ）前記１つの反応場において前記複数種類の標的核酸について増幅反応をそれぞれ行うこと、
（ｈ）前記増幅反応により得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズの有無または量を、前記プライマーセットのそれぞれにより得られる増幅産物について独立して検出すること、および
（ｉ）前記（ｈ）の結果に基づいて、前記目的配列を含む核酸の試料中に存在する量を決定すること、
を含む核酸を定量する方法であって、
特定の標的配列を増幅すべき増幅用試薬が固定化された領域と同じ位置またはその近傍に、前記特定の標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むプローブ核酸が固定化される方法。