KR20140142161A - 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 동일한 공간 내에서 실시간 PCR (Polymerase Chain Reaction) 및 DNA 마이크로어레이(microarray)가 통합적으로 수행됨으로써 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석이 가능한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법에 의하면, 유전자형에 따라 수개 ~ 수십개의 반응 용기(튜브)를 필요로 하던 종래 기술의 불편함 및 비경제성을 해소할 수 있다. 또한, 이는 정량 분석에 적용하기 어려운 DNA 마이크로어레이의 단점 역시 해소하는 것이다. 특히, 본 발명에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법은 반응 용기 안에서 실시간으로 DNA 칩 신호를 획득함으로써 정량 및 정성 분석이 용기 개봉 혹은 용기 세척 없이 가능하고, 감염성 질환 검사를 비롯, 약제내성, 체세포돌연변이, 단일염기변이 등 다양한 분자진단 영역에서 한 번에, 경제적이고 신뢰적으로 정량분석과 유전자형 검사를 동시에 수행할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법은 정량 분석이던, 유전자형이던, 검사 종류에 구애 받지 않고 분자진단 전 영역에서 쉽게 사용될 수 있는 장점이 있다.

Description

바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법{REAL TIME QUANTITATIVE AND QUALITATIVE ANALIZING METHOD}
본 발명은 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 동일한 공간 내에서 실시간 PCR (Polymerase Chain Reaction) 및 DNA 마이크로어레이(microarray)가 통합적으로 수행됨으로써 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석이 가능한 방법에 관한 것이다.
현재 분자진단에서 널리 시행되고 있는 분석물질의 타겟 유전자 검사방법은 크게 정량적 방법(quantitative method)과 정성적 방법(qualitative method)이 있다.
정량적 방법은 타겟 유전자의 발현 정도 및 유전자 개수(copy number)를 상대적 혹은 절대적으로 측정하는 방법이다. 반면, 정성적 방법은 타겟 유전자의 존재 유무 및 유전자형(genotyping)을 분석하는 방법이다.
정량적 검사의 방법으로 실시간 PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 이용한 방법이 있다. 실시간 PCR을 이용한 검사 방법은 정량분석이 가능하다는 장점과 시약 혼합 후 튜브 개봉 없이 유전자 증폭 신호를 획득하여 공기에 의한 오염 위험을 줄일 수 있다는 장점 때문에 널리 사용되어 왔다. 하지만, 한 튜브 내에서 동시에 확인 가능한 형광 수가 최대 6개 다른 종류 이상은 어려워 수십개의 유전자 변이 및 유전자형을 검사해야 하는 분야의 경우 여러 개의 튜브를 할당해 검사해야 하는 어려움이 있다.
정성적 검사의 대타겟인 방법으로 DNA 마이크로어레이를 이용한 방법이 있다. DNA 마이크로어레이를 이용한 검사 방법은 표면에 다수의 타겟 프로브를 고정하여, 한 번에 한 종류 형광으로 다양한 유전자형 검사가 가능하다는 장점은 있지만 정량 분석이 불가하다는 제약이 있다.
최근에는 이러한 정성적 검사 혹은 정량적 검사 각각의 단점을 보완한 정량 및 정성 검사 방법이 연구되고 있다. 이러한 연구의 일환으로, 하나의 용기 안에서 실시간 PCR로 정량분석을 하고, 증폭된 유전자를 같은 용기 고체 바닥에 고정한 프로브와 반응시켜 다중분석을 가능하게 하는 기술이 개발되었다. 그러나, 상기 기술의 경우, 프로브 신호를 획득하기 위해 용기 개봉 혹은 용기 세척 후 별도의 스캐너로 신호를 읽어야 하는 제약이 있다.
종래 기술로는 한국 공개특허공보 제10-2010-0102560호 (2010.09.24. 공개)가 있으며, 상기 문헌에는 실시간 핵산 분석 통합 장치 및 이를 이용한 타겟 핵산의 검출방법이 개시되어 있다.
상술한 문제점들을 해결하기 위해, 본 발명은 하나의 단일 반응 용기 내에서 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 증폭된 반응 산물의 정량 및 정성 분석과 타겟 유전자를 감별하기 위한 프로브가 고정되어 있는 바이오칩으로부터 상기 반응 산물의 정량 및 정성 분석을 동시에 수행될 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상부에 개구부가 형성된 반응 용기; 및 상기 개구부를 통해 상기 반응 용기에 탈부착 가능한 소자부;를 포함하며, 여기서 상기 소자부는, 상기 반응 용기의 개구부에 결합되는 캡; 및 상기 캡의 하부로 연장되어 형성된 로드;를 포함하며, 상기 로드에는 표면에 제3 프로브가 고정된 바이오칩이 구비되어 있는, 바이오 물질 검출용 소자를 준비하는 단계; 상기 반응 용기 내로 제1 프로브-제2 프로브 복합체, 정방향(forward) 프라이머, 역방향(reverse) 프라이머, dNTP (deoxynucleotide triphosphate), 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소, 타겟 유전자를 포함하는 샘플 및 완충 용액을 포함하는 반응 용액을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 제1 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제1 형광체와 상기 제1 형광체를 소광시킬 수 있는 제1 소광체를 포함하며, 상기 제2 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않되, 상기 제3 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 상기 샘플 내 타겟 유전자를 증폭하기 위해 상기 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머이며; 상기 샘플 내 타겟 유전자의 변성 반응, 상기 샘플 내 타겟 유전자와 상기 복합체, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머의 혼성화 반응 및 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 상기 프라이머의 신장 반응을 포함하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계로서, 상기 혼성화 반응을 통해 상기 타겟 유전자와 상기 복합체 중 상기 제1 프로브 사이에서만 혼성화 반응이 수행되며, 상기 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 신장 반응을 수행하는 동안, 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브 및 상기 제1 형광체가 분해되어 방출되며; 상기 방출된 제2 프로브와 상기 바이오칩에 고정된 상기 제3 프로브가 혼성화한 후 상기 중합효소에 의해 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장되는 단계로서, 여기서 상기 제3 프로브는 제2 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제2 형광체와 상기 제2 형광체를 소광시킬 수 있는 제2 소광체를 포함하며, 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장됨에 따라 상기 제2 형광체로부터 상기 제2 소광체가 이격되어 발광이 일어나며; 및 상기 제1 형광체에 의한 제1 형광 신호 및 상기 제2 형광체에 의한 제2 형광 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법에 의하면, 유전자형에 따라 수개 ~ 수십개의 반응 용기(튜브)를 필요로 하던 종래 기술의 불편함 및 비경제성을 해소할 수 있다.
또한, 본 발명은 하나의 단일 반응 용기 내에서 실시간 PCR 및 DNA 마이크로어레이를 실시간으로 통합 수행함으로써 정량 및 정성 분석이 동시에 가능하도록 할 수 있다. 이는 정량 분석에 적용하기 어려운 DNA 마이크로어레이의 단점 역시 해소하는 것이다.
특히, 본 발명에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법은 반응 용기 안에서 실시간으로 DNA 칩 신호를 획득함으로써 정량 및 정성 분석이 용기 개봉 혹은 용기 세척 없이 가능하고, 감염성 질환 검사를 비롯, 약제내성, 체세포돌연변이, 단일염기변이 등 다양한 분자진단 영역에서 한 번에, 경제적이고 신뢰적으로 정량분석과 유전자형 검사를 동시에 수행할 수 있는 효과가 있다.
따라서, 본 발명에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법은 정량 분석이던, 유전자형이던, 검사 종류에 구애받지 않고 분자진단 전 영역에서 쉽게 사용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질 검출 소자의 반응 용기를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질 검출 소자의 소자부를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 반응 용기와 소자부가 결합된 바이오 물질 검출 소자를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질 검출 소자 내 반응을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 중합효소의 활성 온도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 수행되는 실시간 PCR의 신장 온도 조건을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 제3 소자부와 관련하여 온도의 변화에 따른 제2 형광 신호의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 제3 소자부와 관련하여 시간 변화에 따른 제2 형광 신호의 변화를 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11 내지 도 13은 형광 신호 검출 방법의 예들을 나타낸 것으로, 도 11은 직선형(trans type) 형광 신호 검출 방법, 도 12는 경사형(oblique type) 형광 신호 검출 방법, 도 13은 측면형(epi type) 형광 신호 검출 방법을 나타낸 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명에 개시된 임의의 방법을 이루는 각 단계들은 명시적으로 다르게 설명되지 않는 한 반드시 기재된 순서에 따라 정확히 수행되어야만 하는 것은 아니며, 본 발명의 목적의 달성을 위해 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다양하게 수정 및 변경될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질의 정량 및 정성 분석 방법을 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 상부에 개구부가 형성된 반응 용기; 및 상기 개구부를 통해 상기 반응 용기에 탈부착 가능한 소자부;를 포함하며, 여기서 상기 소자부는, 상기 반응 용기의 개구부에 결합되는 캡; 및 상기 캡의 하부로 연장되어 형성된 로드;를 포함하며, 상기 로드에는 표면에 제3 프로브가 고정된 바이오칩이 구비되어 있는, 바이오 물질 검출용 소자를 준비하는 단계; (b) 상기 반응 용기 내로 제1 프로브-제2 프로브 복합체, 정방향(forward) 프라이머, 역방향(reverse) 프라이머, dNTP (deoxynucleotide triphosphate), 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소, 타겟 유전자를 포함하는 샘플 및 완충 용액을 포함하는 반응 용액을 첨가하는 단계로서, 여기서 상기 제1 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제1 형광체와 상기 제1 형광체를 소광시킬 수 있는 제1 소광체를 포함하며, 상기 제2 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않되, 상기 제3 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 상기 샘플 내 타겟 유전자를 증폭하기 위해 상기 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머이며; (c) 상기 샘플 내 타겟 유전자의 변성 반응, 상기 샘플 내 타겟 유전자와 상기 복합체, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머의 혼성화 반응 및 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 상기 프라이머의 신장 반응을 포함하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계로서, 상기 혼성화 반응을 통해 상기 타겟 유전자와 상기 복합체 중 상기 제1 프로브 사이에서만 혼성화 반응이 수행되며, 상기 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 신장 반응을 수행하는 동안, 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브 및 상기 제1 형광체가 분해되어 방출되며; (d) 상기 방출된 제2 프로브와 상기 바이오칩에 고정된 상기 제3 프로브가 혼성화한 후 상기 중합효소에 의해 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장되는 단계로서, 여기서 상기 제3 프로브는 제2 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제2 형광체와 상기 제2 형광체를 소광시킬 수 있는 제2 소광체를 포함하며, 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장됨에 따라 상기 제2 형광체로부터 상기 제2 소광체가 이격되어 발광이 일어나며; 및 (e) 상기 제1 형광체에 의한 제1 형광 신호 및 상기 제2 형광체에 의한 제2 형광 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법이 제공될 수 있다.
우선, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법에 사용되기 위한 바이오 물질 검출용 소자를 준비하는 단계(단계 (a))가 개시된다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 상기 바이오 물질 검출용 소자(200)는 상부에 개구부가 형성된 반응 용기(210) 및 상기 개구부를 통해 상기 반응 용기(210)에 탈부착 가능한 소자부(220)를 포함하며, 여기서 상기 소자부(220)는, 상기 반응 용기(210)의 개구부에 결합되는 캡(221) 및 상기 캡(221)의 하부로 연장되어 형성된 로드(222)를 포함하며, 상기 로드에는 표면에 제3 프로브가 고정된 바이오칩(223)이 구비되어 있다.
이 때, 상기 로드(222)는 이 후의 단계 (b)에서 반응 용액이 상기 반응 용기(210) 내로 첨가될 때, 상기 로드(222)의 표면에 구비된 상기 바이오칩(223)이 상기 반응 용액에 잠길 수 있는 길이를 가지도록 하부로 연장 형성된다.
상기 바이오칩(223)은 상기 로드(222)의 외주면 및 하부로부터 선택된 적어도 하나의 영역에 구비될 수 있으며, 여기서 상기 바이오칩(223)이 구비되는 적어도 하나의 영역은 상기 반응 용액에 잠길 수 있는 위치에 존재한다.
일 실시예에 있어서, 상기 캡(221)은 광투과율이 50% 이상인 물질로 형성될 수 있다. 이 경우, 직선형(trans type) 형광 신호 검출 방법과 같이 캡을 개방하지 않은 상태에서 상기 캡(221) 상부 방향으로 형광 신호의 검출이 가능하다. 보다 상세하게는 상기 캡(221)은 유리, 쿼츠, 흄드 실리카, 아크릴, 폴리카보네이트, 사이클로올레핀 공중합체(COC) 및 사이클로올레핀 중합체(COP) 중에서 선택되는 재질로 형성될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 경사형(oblique type) 형광 신호 검출 방법 또는 측면형(epi type) 형광 신호 검출 방법과 같이 상기 캡(221)의 상부 방향으로 형광 신호를 검출하지 않는 경우, 상기 캡(221)의 광투과율이 반드시 50% 이상일 필요는 없다.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 로드(222)는 9.0 x 10-6/m·K 이하의 낮은 열팽창계수를 가지는 물질로 형성될 수 있다. 상기 로드(222)의 열팽창계수가 9.0 x 10-6/m·K를 초과하는 경우, 전체적인 소자부의 내구성이 저하되며, 고장이 발생할 수 있다. 바람직하게는, 상기 로드(222)는 5.5 x 10-7/m·K ~ 9.0 x 10-6/m·K의 열팽창계수를 갖는 물질로 형성될 수 있다. 이는 로드의 열팽창계수가 지나치게 낮을 경우, 온도 변화에 따라서 다른 소재들의 열팽창계수와의 차이로 인하여 정확한 형광 검출이 어려워질 수 있는 점을 고려한 것이다. 이러한 열팽창계수를 갖는 재질의 비제한적인 예로서 쿼츠, 흄드 실리카, COC 및 COP로부터 선택되는 적어도 하나의 고분자가 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 로드(222)에는 이의 표면에 상기 제3 프로브가 고정된 바이오칩(223)이 구비된다. 이 때, 상기 제3 프로브는 이의 5' 말단 또는 3' 말단의 고분자 물질에 의해 상기 바이오칩(223)에 직접적 또는 간접적으로 고정될 수 있다. 바람직하게는 상기 제3 프로브의 5'말단 또는 3' 말단의 고분자 물질은 폴리-T 테일 또는 폴리 A-테일일 수 있다. 또한, 상기 고분자 물질의 말단, 즉 상기 바이오칩(223)에 고정되는 부분, 은 상기 바이오칩(223)의 특성에 따라 특정 작용기로 개질되어 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 바이오칩(223)이 알데하이드(CHO) 코팅 기판, 아이소싸이오사이아네이트(NCS) 코팅 기판, 에폭사이드 코팅 기판, 카복실화 기판 또는 인산화 기판으로 구성된 경우, 상기 제3 프로브의 폴리-T 테일 또는 폴리 A-테일의 말단, 즉 상기 바이오칩(223)에 고정되는 부분, 을 아민화하여 상기 기판에 고정시킬 수 있다. 반면, 상기 바이오칩(223)이 아민화 기판으로 구성된 경우, 상기 제3 프로브의 폴리-T 테일 또는 폴리 A-테일의 말단, 즉 상기 바이오칩(223)에 고정되는 부분, 을 카복실화 또는 인산화하여 상기 기판에 고정시킬 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 있어서 단계 (a)는 하나의 단일 반응 용기 내에서 실시간 PCR 및 DNA 마이크로어레이를 실시간으로 통합 수행함으로써 정량 및 정성 분석이 동시에 가능하도록 할 수 있는 바이오 물질 검출용 소자(200)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 바이오 물질 검출용 소자(200)를 사용할 경우, 상기 반응 용기(210)에 상기 소자부(220)가 결합된 상태, 즉 상기 바이오 물질 검출용 소자(200)가 개방되지 않은 상태, 에서 실시간 PCR 및 DNA 마이크로어레이를 실시간으로 통합 수행할 수 있다. 또한, 상기 바이오 물질 검출용 소자(200)는 복수회의 반복 사이클로서 실시간 PCR 및 DNA 마이크로어레이가 수행되는 동안에도 상기 반응 용기(210)에 상기 소자부(220)가 결합된 상태, 즉 상기 바이오 물질 검출용 소자(200)가 개방되지 않은 상태, 로 존재하기 때문에, 외부의 오염 인자로부터 차단될 수 있어 상기 바이오 물질 검출용 소자(200)를 반복적으로 세척할 필요성을 제거할 수 있다.
다음으로, 상기 반응 용기(210) 내로 반응 용액을 첨가하는 단계(단계 (b))가 개시된다. 이 때, 상기 단계 (b)에서는 상기 로드(222)에 구비된 상기 바이오칩(223), 보다 구체적으로 상기 바이오칩(223)에 고정(또는 부착)된 제3 프로브가 상기 반응 용액에 충분히 잠길 수 있도록 상기 반응 용액을 첨가한다.
또한, 상기 바이오칩(223)이 상기 로드(222)의 외주면 및 하부로부터 선택된 적어도 하나의 영역에 복수개로서 구비될 경우, 상기 바이오칩(223)이 구비되는 적어도 하나의 영역, 보다 구체적으로 상기 적어도 하나의 영역에 구비되는 상기 복수개의 바이오칩(223)에 고정(또는 부착)된 모든 제3 프로브가 상기 반응 용액에 충분히 잠길 수 있도록 상기 반응 용액을 첨가한다. 여기서, 상기 반응 용액(수용성상) 내에서는 실시간 PCR 반응이 수행되며, 상기 바이오칩(223)에 고정된 제3 프로브(고체 표면상)에서는 DNA 마이크로어레이가 수행된다.
상기 반응 용액은 제1 프로브-제2 프로브 복합체, 정방향(forward) 프라이머, 역방향(reverse) 프라이머, dNTP (deoxynucleotide triphosphate), 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소, 타겟 유전자를 포함하는 샘플 및 완충 용액을 포함한다.
상기 제1 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제1 형광체와 상기 제1 형광체를 소광시킬 수 있는 제1 소광체를 포함한다.
상기 제2 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않되, 상기 제3 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
이 때, 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브의 길이는 각각 타겟 유전자 및 제3 프로브와 적절한 이합체(dimer)를 형성할 수 있는 정도의 길이라면, 그 길이는 무방하다 할 것이다. 예를 들어, 상기 프로브의 사이즈는 15 mer ~ 50 mer 사이에서 적절히 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브는 서로 동일 또는 상이한 타겟 유전자를 타겟으로 설정함으로써, 서로 다른 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브로 구성될 수 있다. 즉, 상기 타겟 유전자의 단일 또는 복수의 타겟 영역을 목표로 하거나 복수의 타겟 유전자의 단일 또는 복수의 타겟 영역을 목표로 하는 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브로 이루어진 서로 다른 복합체를 사용할 수 있다.
예를 들어, 제1 프로브(X)는 제2 프로브(X)와 복합체를 형성하되, 제1 프로브(Y)는 제2 프로브(Y)와 복합체를 형성할 수 있다. 여기서, 상기 제1 프로브(X)는 상기 타겟 유전자의 상보적인 타겟 영역(X)과 혼성화할 수 있으며, 상기 제1 프로브(Y)는 상기 타겟 유전자의 상보적인 타겟 영역(Y)과 혼성화할 수 있다. 또한, 상기 제1 프로브(X)에 포함된 상기 제1 형광체(X)와 상기 제1 프로브(Y)에 포함된 상기 제1 형광체(Y)는 서로 다른 파장대에서 검출되는 형광 신호를 발생시키는 형광 물질을 포함할 수 있다.
추가적으로, 상기 제3 프로브 역시 복수로 사용될 수 있다. 즉, 제3 프로브(X)는 상기 제2 프로브(X)와 혼성화될 수 있으며, 제3 프로브(Y)는 상기 제2 프로브(Y)와 혼성화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로브" 는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
여기서, 상기 반응 용액 내 제1 프로브 및 상기 제2 프로브는 복합체 상태로 존재한다. 상기 복합체는 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브가 직접적으로 결합되거나 적합한 링커를 통해 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브가 연결된 형태일 수 있다.
상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 상기 샘플 내 타겟 유전자를 증폭하기 위해 상기 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucloetide)이며 단일쇄이다.
상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머(프라이머쌍)는 중합효소의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 변화가 있지만 일반적으로 15 mer ~ 50 mer 사이에서 적절히 선택될 수 있다.
상기 프라이머쌍은 타겟-특이적 서열(타겟-혼성화 올리고뉴클레오타이드 서열)을 포함하며, 여기서 타겟-특이적 서열이란, 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 서열을 의미하며, 상기 프라이머쌍 내에서 3' 방향에 위치한다.
본원에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
상기 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소는 바람직하게는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 중합효소이다. 여기서, 열안정성이란 고온의 중합 조건 하에서 상기 중합효소가 변성 없이 안정한 것을 의미하며, 보다 구체적으로 50 ℃ ~ 65 ℃의 온도 범위 내에서 상기 중합효소의 안정성을 유지할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 상기 열안정성 중합효소는 50 ℃ ~ 65 ℃의 온도 범위 내에서 활성화된 상태이다(도 5 참조).
상기 열안정성 중합효소는 열안정성 (DNA) 중합효소를 얻을 수 있는 박테리아로부터 분리되어 사용될 수 있으며, 상기 박테리아로는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 및 Pyrococcus furiosus (Pfu) 등이 있다. 보다 더 바람직하게는 상기 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소는 바람직하게는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 Taq 중합효소이다.
상기 샘플은 타겟 유전자를 포함하고 있는 용액, 체액, 혈액, 세포, 조직 및 기관 등을 포함하며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 용액 중 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소는 반응당 0.1 단위(unit) ~ 1 단위(unit)의 범위 내에서 선택되는 양으로 사용될 수 있으며, 상기 반응 용액 중 제1 프로브-제2 프로브 복합체는 반응당 0.5 pmole ~ 10 pmole의 범위 내에서 선택되는 양으로 사용될 수 있다. 상기 중합효소 및 상기 복합체 각각에 대하여 사용량을 점차 증가시킴에 따라 반응성은 가우시안(Gaussian) 형태의 그래프를 나타내게 되며, 상술한 범위 내에 실시간 PCR의 반응성이 최대한으로 유지될 수 있다.
또한, 상기 반응 용액 중 상기 정방향(forward) 프라이머 및 상기 역방향(reverse) 프라이머는 대칭 또는 비대칭 농도로 사용될 수 있다.
다음으로, 상기 샘플 내 타겟 유전자를 증폭하기 위한 실시간 PCR 단계(단계 (c))가 개시된다. 상기 실시간 PCR 단계는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 변성 반응, 상기 샘플 내 타겟 유전자와 상기 복합체, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머의 혼성화 반응 및 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 상기 프라이머의 신장 반응을 포함하는 중합효소연쇄반응을 포함한다.
여기서 상기 변성 반응, 혼성화 반응 및 신장 반응이 순차적으로 1회 수행되는 것을 1 사이클이라 하며, 상기 실시간 PCR 단계는 상기 변성 반응, 혼성화 반응 및 신장 반응이 순차적으로 복수회(n) 수행될 수 있다(n 사이클).
상기 단계 (c)에 따른 실시간 PCR 단계는 상기 바이오 물질 검출용 소자(200) 내 반응 용액에서 수행된다.
먼저, 상기 샘플 내 타겟 유전자의 변성 반응은 상기 타겟 유전자의 이중가닥(double strand) 형태의 주형 DNA를 단일가닥(single strand) 형태로 분리시켜 각각의 단일가닥 형태의 주형 DNA가 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머에 대한 주형(template)로서 역할을 수행하도록 하는 반응이다. 상기 변성 반응은 92 ℃ ~ 98 ℃의 온도 범위 내에서 수행될 수 있다.
상기 이중가닥 형태의 주형 DNA가 단일가닥 형태의 주형 DNA로 변성된 경우, 이어서 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 각각의 단일가닥 형태의 주형 DNA와 혼성화(또는 어닐링)되며, 상기 제1 프로브-제2 프로브 역시 상기 각각의 단일가닥 형태의 주형 DNA의 일 영역에 혼성화된다.
본원에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
이 때, 상기 혼성화 반응을 통해 상기 타겟 유전자와 상기 복합체 중 상기 제1 프로브 사이에서만 혼성화 반응이 수행되며, 상기 제2 프로브는 상기 제1 프로브에는 결합되어 있되, 상기 타겟 유전자에는 혼성화되지 않은 상태로 존재한다.
이어서, 상기 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 중합효소에 의해 상기 프라이머의 신장 반응이 수행된다. 이 때, 상기 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 중합효소에 의한 신장 반응이 수행되는 동안, 상기 타겟 유전자와 혼성화되어 있는 상기 복합체에 상기 중합효소가 도달한 경우, 상기 중합효소는 자신의 활성을 통해 상기 복합체를 분해하면서 신장 반응을 수행하게 된다. 이 때, 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브 및 상기 제1 형광체가 분해되어 상기 반응 용액 내로 방출된다.
분해되기 전 상기 복합체 내 상기 제1 형광체는 상기 제1 소광체에 의해 소광되어 있는 상태이다. 다만, 상기 복합체가 상기 중합효소에 의해 분해됨에 따라 상기 제1 형광체가 방출되면, 상기 제1 형광체는 소광 상태로부터 벗어나 해당하는 파장대에서 제1 형광 신호을 발생시키게 된다.
따라서, 상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않을 경우, 상기 반응 용액 내 분해되어 방출된 제2 프로브 및 제1 형광체는 존재하지 않는다. 또한, 상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않을 경우, 상기 제1 형광체는 제1 소광체에 의해 소광되어 있으며, 이에 따라 상기 제1 형광체에 의한 제1 형광 신호는 발생하지 않는다.
반면, 상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재할 경우, 상기 타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성이 일어난 후, 상기 제1 프로브-제2 프로브 복합체 중 제1 프로브와 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 상기 타겟 유전자 중 상보적인 위치에 혼성화되며, 상기 제2 프로브는 상기 제1 프로브에는 결합되어 있되, 상기 타겟 유전자에는 혼성화되지 않은 상태로 존재하게 된다.
이어서, 상기 프라이머의 신장 온도 하에서 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의해 상기 프라이머의 신장 반응이 수행되며, 상기 프라이머의 신장 반응이 수행되는 동안, 상기 타겟 유전자 중 상보적인 위치에 혼성화되어 있는 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브 및 상기 제1 형광체가 상기 중합효소에 의해 분해되어 방출된다.
여기서, 상기 중합효소에 의한 상기 프라이머의 신장은 50 ℃ ~ 70 ℃, 바람직하게는 55 ℃ ~ 68 ℃, 보다 바람직하게는 60 ℃의 온도 범위 내에서 수행될 수 있다. 상기 프라이머의 신장 온도는 상기 프라이머의 신장 효율과 직접적인 연관성이 있다(도 6 참조).
상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않거나, 상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하되, 상기 타겟 유전자 중 상보적인 위치에 상기 복합체가 혼성화되어 있지 않은 경우, 상기 복합체는 상기 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의해 분해되지 않는다. 따라서, 상기 반응 용액 내 분해되어 방출된 제2 프로브 및 제1 형광체가 존재하지 않는다. 즉, 상기 타겟 유전자와 상기 복합체의 혼성화는 상기 반응 용액 내 유리(free) 상태의 제2 프로브와 제1 형광체의 존재 여부에 대한 전제 조건이 된다.
따라서, 상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재할 경우, 상기 타겟 유전자는 상기 단계 (c)에 따른 실시간 PCR의 반복 횟수(사이클)에 따라 점차적으로 증폭될 것이며, 상기 타겟 유전자의 증폭과 동시에 상기 반응 용액 내 유리(free) 상태의 제2 프로브와 제1 형광체의 양 역시 증가하게 된다.
상기 반응 용액 내 증가된 제1 형광체의 양은 제1 형광 신호의 세기를 증가시키게 된다.
다음으로, 상기 실시간 PCR 반응 결과 상기 반응 용액 내로 방출된 상기 제2 프로브에 의한 상기 바이오칩(223)에서의 DNA 마이크로어레이 단계(단계 (d))가 개시된다.
상술한 바와 같이 상기 바이오칩(223)의 표면에는 상기 제3 프로브가 고정되어 있다. 이 때, 상기 제3 프로브는 제2 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제2 형광체와 상기 제2 형광체를 소광시킬 수 있는 제2 소광체를 포함한다. 여기서, 상기 제3 프로브에 포함된 상기 제2 형광체와 상기 제2 소광체는 서로 인접한 위치에 배치됨으로써, 상기 제2 소광체에 의해 상기 제2 형광체가 소광될 수 있는 2차 구조(예를 들어, 루프(loop) 또는 헤어핀(hairpin))의 형태로 존재할 수 있다(분자 비콘(molecular beacon).
이 때, 상술한 바와 같이, 상기 타겟 유전자의 복수의 타겟 영역을 목표로 하는 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브로 이루어진 서로 다른 복합체를 사용할 경우, 상기 샘플 내 제1 프로브(X) 및 제1 프로브(Y)와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재할 경우, 상기 단계 (c)에 따른 실시간 PCR 결과, 상기 복수의 복합체로부터 상기 제2 프로브(X) 및 제2 프로브(Y)는 상기 복합체로부터 분해되어 상기 반응 용액 내로 방출되며, 상기 제2 프로브(X) 및 제2 프로브(Y)는 복수의 제3 프로브, 즉 제3 프로브(X) 및 제3 프로브(Y)와 혼성화될 수 있다.
상기 단계 (d)는 상기 단계 (c)에서 방출된 상기 제2 프로브와 상기 바이오칩에 고정된 상기 제3 프로브가 혼성화한 후 상기 중합효소에 의해 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장되는 단계로서, 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장됨으로써 상기 제3 프로브의 2차 구조를 풀리게 되며, 이에 따라 상기 제2 형광체는 상기 제2 소광체에 의한 소광 상태로부터 벗어나게 된다.
상기 단계 (d)에 대하여 보다 상세히 설명하기 위해 상기 단계 (c)와 단계 (d)의 관계에 대하여 설명하면, 상기 단계 (c)에 따른 실시간 PCR과 상기 단계 (d)에 따른 DNA 마이크로어레이는 하나의 단일(동일한) 바이오 물질 검출용 소자(200) 내에서 복수회의 반복 사이클로서 순차적 또는 독립적으로 수행될 수 있다. 즉, 상기 단계 (c)와 단계 (d)는 반드시 순차적으로 수행될 필요가 없다.
즉, 첫 번째 사이클에서의 단계 (c)에 의해 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브가 분해되어 상기 반응 용액 내로 방출된 후, 상기 제2 프로브는 두 번째 사이클에서의 단계 (c)의 혼성화 반응 온도 하에서 상기 바이오칩(223)에 고정된 상기 제3 프로브와 혼성화된다.
실시간 PCR의 첫 번째 사이클이 완료되어 상기 제2 프로브가 상기 반응 용액 내로 방출된 상태에서 실시간 PCR의 두 번째 사이클이 시작되며, 상기 두 번째 사이클의 변성 반응(타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성)이 일어나는 온도 조건 하에서 상기 제3 프로브는 자신의 2차 구조가 풀린 상태로 존재하게 된다. 즉, 상기 두 번째 사이클의 변성 반응이 일어나는 온도 조건 하에서 상기 제3 프로브에 포함된 상기 제2 형광체는 상기 제2 소광체에 의해 소광되지 않은 상태로 존재한다.
이 후, 상기 실시간 PCR의 두 번째 사이클의 혼성화 반응이 일어나는 온도 조건 하에서 상기 제2 프로브는 상기 제3 프로브의 상보적인 영역에 혼성화되고, 상기 중합효소에 의한 신장 반응이 일어나는 온도 조건 하에서 상기 제2 프로브가 상기 제3 프로브 상에서 신장되며, 이에 따라 상기 제3 프로브는 2차 구조가 풀린 상태로 유지될 수 있다.
상술한 바에 따르면, 상기 단계 (c)가 수행되는 온도 조건 하에서는 상기 제3 프로브는 여기에 상기 제2 프로브가 혼성화된 후 신장됨으로써 상기 제3 프로브의 2차 구조를 풀린 상태로 유지시키는지 여부와 무관하게, 모두 2차 구조가 풀린 상태로 존재하는 바, 상기 제3 프로브에 포함된 상기 제2 형광체는 상기 제2 소광체에 의해 소광되지 않은 상태로 존재하게 된다.
따라서, 상기 단계 (d) 후, 상기 제3 프로브의 2차 구조가 회복될 수 있도록 온도를 낮추는 단계가 더 포함될 수 있으며, 상기 단계에서 상기 제3 프로브 중 상기 제2 프로브가 혼성화되어 신장되지 않은 제3 프로브의 2차 구조가 회복됨으로써 상기 제2 형광체는 다시 상기 제2 소광체에 의하 소광될 수 있다. 즉, 상기 추가적인 단계는 제2 형광체의 소광 단계이며, 이에 따라 상기 제3 프로브에 제2 프로브가 신장되지 않은 상태로 발생하는 제2 형광체의 비특이적 제2 형광 신호를 배제할 수 있다.
이 때, 상기 제3 프로브의 2차 구조가 회복될 수 있는 온도는 50 ℃ 이하이다(도 7 참조). 즉, 상기 제3 프로브의 2차 구조는 50 ℃ 이하의 온도에서 2차 구조가 회복될 수 있도록 디자인되는 것이 바람직하다. 보다 상세히 설명하면, 상기 제3 프로브는 상기 제2 형광체 및 제2 소광체를 포함하며, 상기 제2 형광체는 인접한 위치에 존재하는 상기 제2 소광체에 의해 소광된 상태로 존재하기 위한 2차 구조 형태로 존재하는데, 상기 제3 프로브는 상기 타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성)이 일어나는 온도 조건 하에서 풀린 상태로 존재할 수 있는 2차 구조 형태로 존재한다. 또한, 2차 구조가 풀린 상태로 존재하는 상기 제3 프로브는 상기 제2 프로브가 혼성화되어 신장되지 않은 상태일 경우, 50 ℃ 이하의 온도 조건에서 상기 2차 구조가 다시 회복될 수 있도록 존재한다.
상기 제3 프로브는 상기 제2 프로브가 혼성화되어 신장되지 않은 상태에서 온도가 감소함에 따라 원래의 2차 구조를 회복할 수 있으며, 56 ℃ 이하에서 제2 형광 신호의 감소가 시작되며, 바람직하게는 50 ℃ 이하, 보다 바람직하게는 48 ℃ 이하에서 완전한 소광 상태에 도달할 수 있다.
또한, 상기 제3 프로브의 2차 구조가 회복될 수 있는 시간 조건은 상기 온도 범위 내에서 5초 이상일 수 있다(도 8 참조). 상기 제2 프로브가 혼성화되어 신장되지 않은 상태의 상기 제3 프로브는 50 ℃ 이하의 온도 유지 시간에 따라 점차적으로 제2 형광 신호를 상실하게 되며, 이 때의 온도 유지 시간은 3초 이상, 바람직하게는 5초 이상인 것이 바람직하다.
상기 추가적인 제3 프로브의 소광 단계에 따라, 상기 반응 용액 내 유리(free) 제2 프로브가 존재하지 않는 경우, 상기 제3 프로브로부터 상기 제2 형광체에 의한 제2 형광 신호는 발생하지 않게 된다.
마지막으로, 상기 바이오 물질 검출용 소자로부터 발생하는 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호를 검출하기 위한 단계(단계 (e))가 개시된다. 상기 제1 형광 신호는 상기 제1 형광체로부터 발생되며, 상기 제2 형광 신호는 상기 제2 형광체로부터 발생된다. 이 때, 상기 제1 형광체 및 상기 제2 형광체 모두 각각의 소광체로부터 소광되지 않은 상태로 존재하여야 한다.
상기 단계 (e)는 상기 반응 용기(210)에 상기 소자부(220)가 결합된 상태에서 상기 형광 측정기에 의해 실시간으로 수행된다. 이 때, 상기 단계 (e)는 상기 단계 (d) 후, 상기 제3 프로브 중 상기 제2 프로브와 혼성화되지 않은 제3 프로브의 2차 구조가 회복된 후, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호를 동시에 검출하는 것이 바람직하다(도 9 참조).
여기서, 상기 제1 형광 신호의 검출은 제2 형광 신호의 검출과 동시에 수행되는 것이 바람직하나, 검출 효율 증대를 위해 별도의 시기에 서로 독립적으로 각각의 형광 신호에 대한 검출이 수행될 수 있다. 즉, 상기 단계 (c)의 실시간 PCR에 의해 상기 복합체로부터 분해되어 방출되는 상기 제1 형광체가 발생시키는 상기 제1 형광 신호를 1차적으로 검출한 뒤, 상기 단계 (d)와 상기 제3 프로브의 추가적인 소광 단계를 거쳐 상기 제3 프로브에 상기 제2 프로브가 혼성화되어 신장된 상태로 존재할 경우, 상기 제3 프로브에 포함된 상기 제2 형광체로부터 발생되는 상기 제2 형광 신호를 2차적으로 검출할 수 있다(도 10 참조).
상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재할 경우, 반응의 반복 사이클의 수가 증가할수록 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 세기가 증가하게 된다. 또한, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 반응 용기(210)에 상기 소자부(220)가 결합된 상태에서 상기 형광 측정기에 의해 동시에 검출될 수 있다. 이 때, 상기 제1 형광체 및 제2 형광체는 서로 다른 파장대에서 검출되는 형광 신호를 발생시키는 것이 바람직하다.
또한, 다른 실시예에 있어서, 정량 및 정성 분석 감도를 증가시키기 위해, 상기 제1 형광체 및 상기 제2 형광체 중 적어도 하나는 서로 다른 파장대에서 검출되는 형광 신호를 발생시키는 복수의 형광 물질을 포함하도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 상기 형광 신호는 상기 바이오 물질 검출용 소자(200)의 상부를 통해 카메라로 이미지 획득하여 얻게 되는데, 상술한 바와 같이 다양한 프로브의 디자인을 통해 다중 분석이 가능하며, 유전자 증폭에 비례하게 형광 신호가 변화함으로써 정량 및 정성 분석이 가능하다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 캡의 상부 방향으로 수행되는 직선형(trans type) 형광 신호 검출 방법을 통해 검출될 수 있으며(도 11 참조), 다른 실시예에 있어서, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 바이오칩의 표면에 대하여 일정한 경사를 가지는 방향으로 수행되는 경사형(oblique type) 형광 신호 검출 방법을 통해 검출될 수 있으며(도 12 참조), 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 바이오칩의 측면 방향에서 이색성 물질(dichroic material)을 이용하여 수행되는 측면형(epi type) 형광 신호 검출 방법을 통해 검출될 수 있다(도 13 참조).
본 발명의 일 실시예에 따른 방법은 반응 온도, 반응 시간 및 반복 사이클 횟수를 자동적으로 제어할 수 있는 온도순환장치(thermal cycler) 내에서 수행될 수 있다. 이 때, 상기 반응 온도, 반응 시간 및 반복 사이클 횟수는 상기 반응 용기(210)에 상기 소자부(220)가 결합된 상태에서 상기 온도순환장치에 의해 자동적으로 제어될 수 있다. 또한, 상기 온도순환장치는 형광 측정기를 더 포함함으로써 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석이 하나의 장치 내에서 수행될 수 있도록 한다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
200 : 바이오 물질 검출용 소자
210 : 반응 용기
220 : 소자부
221 : 캡
222 : 로드
223 : 바이오칩
224 : 반응 용액

Claims (46)

  1. (a) 상부에 개구부가 형성된 반응 용기; 및 상기 개구부를 통해 상기 반응 용기에 탈부착 가능한 소자부;를 포함하며, 여기서 상기 소자부는, 상기 반응 용기의 개구부에 결합되는 캡; 및 상기 캡의 하부로 연장되어 형성된 로드;를 포함하며, 상기 로드에는 표면에 제3 프로브가 고정된 바이오칩이 구비되어 있는, 바이오 물질 검출용 소자를 준비하는 단계;
    (b) 상기 반응 용기 내로 제1 프로브-제2 프로브 복합체, 정방향(forward) 프라이머, 역방향(reverse) 프라이머, dNTP (deoxynucleotide triphosphate), 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소, 타겟 유전자를 포함하는 샘플 및 완충 용액을 포함하는 반응 용액을 첨가하는 단계로서,
    여기서 상기 제1 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제1 형광체와 상기 제1 형광체를 소광시킬 수 있는 제1 소광체를 포함하며, 상기 제2 프로브는 상기 샘플 내 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않되, 상기 제3 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 상기 샘플 내 타겟 유전자를 증폭하기 위해 상기 타겟 유전자의 핵산서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머이며;
    (c) 상기 샘플 내 타겟 유전자의 변성 반응, 상기 샘플 내 타겟 유전자와 상기 복합체, 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머의 혼성화 반응 및 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 상기 프라이머의 신장 반응을 포함하는 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계로서,
    상기 혼성화 반응을 통해 상기 타겟 유전자와 상기 복합체 중 상기 제1 프로브 사이에서만 혼성화 반응이 수행되며, 상기 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의한 신장 반응을 수행하는 동안, 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브 및 상기 제1 형광체가 분해되어 방출되며;
    (d) 상기 방출된 제2 프로브와 상기 바이오칩에 고정된 상기 제3 프로브가 혼성화한 후 상기 중합효소에 의해 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장되는 단계로서,
    여기서 상기 제3 프로브는 제2 형광 신호를 발생시킬 수 있는 제2 형광체와 상기 제2 형광체를 소광시킬 수 있는 제2 소광체를 포함하며, 상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 신장됨에 따라 상기 제2 형광체로부터 상기 제2 소광체가 이격되어 발광이 일어나며; 및
    (e) 상기 제1 형광체에 의한 제1 형광 신호 및 상기 제2 형광체에 의한 제2 형광 신호를 검출하는 단계;
    를 포함하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 로드에 구비된 바이오칩이 반응 용액에 잠기도록 상기 반응 용액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 바이오칩은 상기 로드의 외주면 및 하부로부터 선택된 적어도 하나의 영역에 구비될 수 있으며,
    여기서 상기 바이오칩이 구비되는 적어도 하나의 영역은 상기 반응 용액에 잠긴 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제3 프로브는 이의 5' 말단 또는 3' 말단 고분자 물질에 의해 상기 바이오칩에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 반응 용액 중 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소는 반응당 0.1 단위(unit) ~ 1 단위(unit)의 범위 내에서 선택되는 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 반응 용액 중 제1 프로브-제2 프로브 복합체는 반응당 0.5 pmole ~ 10 pmole의 범위 내에서 선택되는 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 반응 용액 중 상기 정방향(forward) 프라이머 및 상기 역방향(reverse) 프라이머는 대칭 또는 비대칭 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 상기 반응 용액 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않을 경우, 상기 반응 용액 내 분해되어 방출된 제2 프로브는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않을 경우, 상기 제1 형광체는 상기 제1 소광체에 의해 소광되어 있으며, 상기 제2 형광체는 상기 제2 소광체에 의해 소광되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않을 경우, 상기 제1 형광체에 의한 제1 형광 신호 및 상기 제2 형광체에 의한 제2 형광 신호가 발생하지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재할 경우,
    상기 타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성이 일어난 후, 상기 제1 프로브-제2 프로브 복합체 중 제1 프로브와 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머는 상기 타겟 유전자 중 상보적인 위치에 혼성화되며,
    상기 제2 프로브는 상기 제1 프로브에는 결합되어 있되, 상기 타겟 유전자에는 혼성화되지 않은 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성은 92 ℃ ~ 98 ℃의 온도 범위 내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 신장 반응은 상기 프라이머의 신장 온도 하에서 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의해 수행되며,
    상기 프라이머의 신장 반응이 수행되는 동안, 상기 타겟 유전자 중 상보적인 위치에 혼성화되어 있는 상기 복합체로부터 상기 제2 프로브 및 상기 제1 형광체가 상기 중합효소에 의해 분해되어 방출되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 중합효소에 의한 상기 프라이머의 신장은 50 ℃ ~ 70 ℃의 온도 범위 내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 중합효소는 50 ℃ ~ 65 ℃의 온도 범위 내에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 복합체로부터 분해된 상기 제1 형광체는 상기 제1 소광체에 의해 소광되지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하지 않거나, 상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재하되, 상기 타겟 유전자 중 상보적인 위치에 상기 복합체가 혼성화되어 있지 않은 경우,
    상기 복합체는 상기 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 가지는 중합효소에 의해 분해되지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 제3 프로브에 포함된 상기 제2 형광체와 상기 제2 소광체는 서로 인접한 위치에 배치됨으로써, 상기 제2 소광체에 의해 상기 제2 형광체가 소광될 수 있는 2차 구조의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성이 일어나는 온도 하에서, 상기 제3 프로브는 2차 구조가 풀린 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 타겟 유전자의 이중가닥 형태의 주형 DNA의 변성이 일어나는 온도 하에서, 상기 제2 형광체는 상기 제2 소광체에 의해 소광되지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)로부터 방출된 상기 제2 프로브가 상기 제3 프로브에 혼성화되기 전,
    상기 제3 프로브는 2차 구조가 풀린 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 단계 (c)로부터 방출된 상기 제2 프로브가 2차 구조가 풀린 상태로 존재하는 상기 제3 프로브에 혼성화된 후,
    상기 제3 프로브 상에서 상기 제2 프로브가 상기 중합효소에 의해 신장됨으로써 상기 제3 프로브의 2차 구조가 풀린 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제3 프로브의 2차 구조가 풀린 상태에서 상기 제2 형광체는 상기 제2 소광체에 의해 소광되지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (d) 후, 상기 제3 프로브의 2차 구조가 회복될 수 있도록 온도를 낮추는 단계를 더 포함하며,
    상기 단계에서 상기 제3 프로브 중 상기 제2 프로브와 혼성화되지 않은 제3 프로브의 2차 구조가 회복됨으로써 상기 제2 형광체가 상기 제2 소광체에 의해 소광되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 제3 프로브의 2차 구조가 회복될 수 온도는 50 ℃ 이하인 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 단계 (d) 후, 상기 제3 프로브는 50 ℃ 이하의 온도에서 5초 이상의 안정화를 통해 2차 구조가 회복되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c) 내지 단계 (e)는 동일한 바이오 물질 검출용 소자 내에서 복수회의 반복 사이클로서 순차적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  29. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c) 내지 단계 (e)는 동일한 바이오 물질 검출용 소자 내에서 복수회의 반복 사이클로서 독립적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    첫 번째 사이클에서의 단계 (c) 에 의해 상기 복합체로부터 분해되어 방출된 제2 프로브는 두 번째 사이클에서의 단계 (c)의 혼성화 반응 온도 하에서
    상기 바이오칩에 고정된 상기 제3 프로브에 혼성화되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  31. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (e)는 형광 측정기에 의해 실시간으로 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 단계 (e)는 상기 반응 용기에 상기 소자부가 결합된 상태에서 상기 형광 측정기에 의해 실시간으로 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  33. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 샘플 내 상기 제1 프로브와 상보적인 서열을 가지는 타겟 유전자가 존재할 경우,
    상기 반복 사이클의 수가 증가할수록 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 세기가 증가하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 단계 (d) 후, 상기 제3 프로브 중 상기 제2 프로브와 혼성화되지 않은 제3 프로브의 2차 구조가 회복된 후, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광체 및 제2 형광체는 서로 다른 파장대에서 검출되는 형광 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광체 및 상기 제2 형광체 중 적어도 하나는 서로 다른 파장대에서 검출되는 형광 신호를 발생시키는 복수의 형광 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  38. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 캡의 상부 방향으로 수행되는 직선형(trans type) 형광 신호 검출 방법을 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  39. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 바이오칩의 표면에 대하여 일정한 경사를 가지는 방향으로 수행되는 경사형(oblique type) 형광 신호 검출 방법을 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  40. 제1항에 있어서,
    상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호는 상기 바이오칩의 측면 방향에서 이색성 물질(dichroic material)을 이용하여 수행되는 측면형(epi type) 형광 신호 검출 방법을 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  41. 제1항에 있어서,
    상기 캡은 광투과율이 50% 이상인 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 캡은 유리, 쿼츠, 흄드 실리카, 아크릴, 폴리카보네이트, 사이클로올레핀 공중합체(COC) 및 사이클로올레핀 중합체(COP) 중에서 선택되는 적어도 하나의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  43. 제1항에 있어서,
    상기 로드는 9.0 x 10-6/m·K 이하의 열팽창계수를 가지는 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  44. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 반응 온도, 반응 시간 및 반복 사이클 횟수를 자동적으로 제어할 수 있는 온도순환장치(thermal cycler) 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 반응 온도, 반응 시간 및 반복 사이클 횟수는 상기 반응 용기에 상기 소자부가 결합된 상태에서 상기 온도순환장치에 의해 자동적으로 제어될 수 있는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 온도순환장치는 형광 측정기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법.
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