CN101351260B - 用于微通道分离的基质和动态聚合物体系和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于微通道分离的基质聚合物和动态涂层聚合物，其组合物，以及相关方法、体系和设备。

Description

用于微通道分离的基质和动态聚合物体系和组合物

本发明要求2005年11月1日提交的申请号60/732,398的优先权，将其全部内容纳入本文作参考。 

根据国立卫生研究所和国立科学基金会授予西北大学的基金号1R01HG019770-01和DMR-0076097，美国政府享有本发明的某些权利。 

发明背景 

由于成本、时间和试剂消耗的降低，可能将测序与其它基因分析步骤整合到整体微量分析体系中，所以用于DNA测序的微流体芯片电泳代表了高通量测序计划的未来发展方向。为此，开发用于DNA测序的优良的聚合物分离基质和壁涂层至关重要。 

亲水性分离基质如直链聚丙烯酰胺(″LPA″)连同共价亲水性涂层一起用于微通道电泳，可获得大于500个碱基的阅读长度；然而，分离均需要15-18分钟以上。聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(″pDMA″)是利用杂交分离机制的疏水性分离基质，可实现的阅读长度与现有技术的聚合物相似、但分离速度较快。虽然共价涂层几乎用于所有公开的微通道DNA测序结果，但微通道模式中特别优选花费低得多也更容易实施的动态涂层。然而，用于DNA测序的所有动态涂层有些疏水性，由于DNA片段和壁涂层的相互作用导致分离效率降低。目前的工作已证明，聚(N-羟乙基丙烯酰胺)(″pHEA″)是适用于蛋白质分离和DNA测序的毛细管的亲水性动态涂层，但仅当pHEA也是分离基质时。虽然关于芯片DNA测序的大多数公开数据报道的阅读长度大于400个碱基，但芯片上的测序时间一般为18-30分钟。此外，毛细管电泳需要约60-90分钟产生相当的结果。时间和阅读长度是有关电泳分离的考虑因素。 

发明概述 

根据上述内容，本发明的一个目的是提供用于微通道分离的一种或多种聚合物组合物、体系和/或方法，从而克服现有技术的各种缺陷和缺点，包括上述缺陷和缺点。本领域技术人员应理解，本发明的一个或多个方面可满足某些目的，而一个或多个方面可满足某些其它目的。各目的可能并不等同地(所有方面)作用于本发明的每个方面。同样，可根据本发明任何一方面观察以下目的。 

本发明的一个目的可以是提供动态壁涂层聚合物，以便更好地利用与疏水性分离基质有关的优点。 

本发明的另一个目的是单独或与上述目的联合提供亲水性壁涂层聚合物，以降低电渗流和/或分析物-壁相互作用的发生率或影响。 

本发明的另一个目的是提供基质/壁涂布体系，以及相关使用方法，以便与现有技术相比在较短时间内增加序列阅读长度。 

本发明的另一个目的是提供一种或多种基质/壁涂布体系，它们能提供更长、更快的序列阅读、流动微通道电泳。 

由发明概述和以下某些实施方式的描述可以看出本发明的其它目的、特征、益处和优点，本领域技术人员不难想到各种电泳方法和技术。由上述内容以及所附实施例、数据、附图和由其而来的所有合理推论，可以看出这类目的、特征、益处和优点。 

本发明涉及可以通过微芯片电泳在施加电场下以较短的分离通道进行超快的DNA测序或基因分型的新型体系。这类体系可包括聚合物分离组分和聚合物涂布组分。在某些实施方式中，含有高分子量聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(pDMA)或其共聚物的DNA分离基质可与亲水性水溶性聚合物组分聚(N-羟乙基丙烯酰胺)(pHEA)联用，以便通过微通道电泳非常快地分离DNA测序片段。非限制性地，pHEA可被认为是动态(即物理吸附性)聚合物壁涂层组分。可将其预涂布在微通道壁上和/或用作含有聚合物分离基质组分的组合物的一部分。在某些其它实施方式中，这类体系或本发明组合物可包含这类分离和涂布组分，这类分离和涂层组分的分子量和/或含量足以提供新型DNA迁移模式，即将DNA蠕动(reptation)与瞬时缠结偶联(TEC)结合起来的新型DNA分离机制。 

更通常，本发明可部分涉及用于微通道电泳的DNA测序或基因分型组合物。这类组合物可包含含有式[-CH₂C(R)C(O)NR′R″-]_n的聚丙烯酰胺的疏水性分离基质组分，式中R可选自H或甲基，R′和R″可独立地选自C₁-约C₈直链烷基部分、C₁-约C₈烷氧基取代的直链烷基部分、C₁-约C₈支链烷基部分以及C₁-约C₈烷氧基取代的支链烷基部分、它们的共聚物，或者这类聚合物或/或共聚物的组合；还包含亲水性高于上述基质组分的含有聚(N-羟乙基丙烯酰胺)的亲水性壁涂层组分。 

在某些实施方式中，无论是均聚物、无规共聚物或嵌段共聚物，或是它们的任何组合，R可以是H，R′和R″可包括取代(如甲氧基或乙氧基、丙氧基等)或未取代的C₁-约C₄烷基部分。在某些其它实施方式中，R′和R″可以是甲基，这类组分可包括pDMA或pDMA共聚物。在上式中，n是大于1的整数，反映这类聚合物的平均摩尔质量。在某些实施方式中，如本领域所知，这类聚合物可具有中等疏水性，至少在水或水性介质中部分可溶。因此，这类组分可包含pDMA、聚(N-甲氧基乙基丙烯酰胺)或聚(N-乙氧基乙基丙烯酰胺)、它们的组合，以及它们的共聚物(其单体对应于本文所述或推知的任何一种或多种聚合物组分)(例如但不限于，N，N-二甲基丙烯酰胺和N，N-二己基丙烯酰胺的共聚物)。无论如何，R′和R″的组合仅受赋予这类聚合物组分的疏水性特征以及分子内或分子间物理相互作用和/或与其它这类部分或聚合物组分相连的能力的限制，直至至少部分地足以提供这类物质的功能作用(下文更详细地描述)。 

可以认为这类亲水性壁涂层组分的亲水性特征足以至少部分减少电渗流和/或减少有害的分析物-壁相互作用。pHEA的分子量范围可以是约600,000-约4百万克/摩尔(MDa)或约5百万克/摩尔(MDa)或更高。无论如何，根据分子量和/或终端应用，pHEA在流体介质中的含量小于该介质的0.5％(w/v)。在某些其它实施方式中，如本领域技术人员所知，pHEA在这类介质(如水性介质)中的含量约为0.1-0.4％(w/v)。无论如何，在某些实施方式中，pHEA涂层组分可以与一种或多种上述疏水性聚丙烯酰胺分离基质组分组合使用，或加入一种或多种上述疏水性聚丙烯酰胺分离基质组分中。 

无论如何，所得基质组分在含有本文所述种类的流体介质(如水或水性 介质，例如但不限于缓冲溶液)的组合物中的浓度(w/v)高达约5％或更高，这类浓度可取决于平均摩尔质量。在某些实施方式中，高达约3％(w/v)的基质组分是pDMA，其重均摩尔质量约为3-5MDa。在其它这类实施方式中，基质组分还可包含约1％-2％(w/v)的重均摩尔质量较低，例如但不限于约200-300kDa的pDMA。可以获得一定浓度范围的各种其它基质组分，仅由单体组分和相应部分的选择来确定和限制。 

除非另有说明，本文中所有用数字表示的属性如摩尔质量、百分数等应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非另有说明，本文的数值参数是近似值，可能取决于所需的聚合物或体系特性或者准备用相关方法实现的结果，本领域技术人员根据本发明可以改变这些百分数和摩尔质量。 

提到本发明的组合物、体系、方法和/或设备，本文所述或推出的聚合物可能适当地包含任何上述单体、由其组成或基本由其组成，不论任何这类单体在相应聚合物中所占的百分数。这类聚合物或共聚物或其单体组分组成不同、特征独特，本发明中可单独使用或联用。因此，也应理解，可以在不存在任何一种聚合物、单体组分和/或步骤(无论是否在本文中公开、提及或推出)的情况下实施或使用本文所述的本发明组合物、体系、方法和/或设备，本文中可能并未特别公开、提及或推出它们不存在。 

本发明也可能部分涉及用于RNA和DNA分离的微通道电泳体系。这类体系可包含：含pDMA的疏水性分离基质组分和含pHEA的亲水性壁涂层组分；和选自微尺寸毛细管(例如但不限于，将内径限定为约10微米-约150微米)或微通道尺寸相似的微流体电泳芯片的微通道基材。这类体系可包含上述种类的pDMA基质组分。在某些非限制性实施方式中，基质组分可包含约3％(w/v)重均摩尔质量范围约为3-5MDa的pDMA；和约1％-2％(w/v)重均摩尔质量较低(如约200-300kDa)的pDMA，。 

本发明也可部分涉及使用聚合物壁涂层和分离基质体系进行DNA或RNA电泳分离的方法。这类方法可包括提供含有pDMA组分和pHEA组分的体系，pDMA组分约占该体系的3％(w/v)-5％(w/v)；将该体系引入选自微通道电泳毛细管或微流体测序芯片的基材；和使DNA测序反应产物或RNA 组分的混合物与该体系相接触，施加一定电压作用一段时间，至少部分地足以进行电泳分离。这类方法可包括：含有上述种类的pDMA组分的体系。在某些实施方式中，可使所述pHEA组分与基材相接触，然后引入分离基质体系。在这类实施方式中，pHEA组分可用作水性溶液，接触基材一段时间，以便提供本文所述种类的壁涂层组分。无论如何，可采用这类方法分离长度长达约800个碱基的DNA序列(如单链DNA)，这类分离取决于时间和微通道长度。下文提供了这类分离/测序方法的非限制性例子。 

与上述内容相关的是，本发明也可涉及微通道电泳设备。这类设备可包括基材和其上的聚合物体系，这类基材选自微米尺寸的毛细管和微流体电泳芯片。如果不受限于微通道基片或设备构造，这类体系可包含含有pDMA组分和上述种类的pHEA组分的聚合物体系，其中pDMA组分约占该体系的3％-5％(w/v)。已证明这类聚合物体系的分离和/或壁涂布性能，也可与本领域已知的毛细管或微通道基质或壁涂层材料一起或联合使用。 

本发明也可部分涉及使用疏水性聚合物基质提高DNA分离速度的方法。这类方法可包括：提供选自微尺寸的毛细管或微流体电泳芯片微通道基材；将亲水性pHEA壁涂层组分偶联或施加于这类基材；将疏水性分离基质引入该基材，这类基质组分选自本文所述的聚丙烯酰胺、其共聚物和这类聚丙烯酰胺和/或这类共聚物的组合；和使DNA序列组分与这类基质组分的混合物相接触，施加一定电压作用一段时间，至少部分地足以对这类混合物进行电泳分离，其中基质组分的分子量和浓度至少部分足以使混合物内DNA组分发生瞬时缠结偶联或蠕动。在某些实施方式中，分离可以是瞬时缠结偶联和蠕动的组合。在某些这类实施方式中，在约50％的迁移时间中，DNA组分可通过瞬时缠结偶联迁移，在约50％的迁移时间中，通过蠕动迁移。无论如何，可利用落射荧光视频显微镜检测荧光染色的DNA分子，从而监测这类迁移的动力学概况。在某些实施方式中，与采用现有技术的LPA基质进行分离相比，这类方法提供的分离速度快3倍以上。 

非限制性地，在某些实施方式中，这类方法的基质组分可选自pDMA和/或其共聚物。关于前者，这类基质组分可包含约3％(w/v)重均摩尔质量约为3-5MDa的pDMA和约1％(w/v)-约2％(w/v)重均摩尔质量较低如约 200-300kDa的pDMA。无论如何，在这类实施方式中，迁移的特征可以是通过基质的DNA电泳迁移率与DNA分子大小的双对数曲线图的直线区域，其中分子大小可表示为碱基和/或碱基对。例如但不限于，DNA分子大小范围可以是约200个碱基-约800个碱基，这种双对数曲线图线性区域的斜率约为-4.40至-0.60。 

附图简要说明 

图1.通过GPC-MALLS鉴定pDMA。几个非限制性实施例中使用的pDMA的摩尔质量分布。该分布是三次实验的平均值。 

图2.在适合测序的浓度下pDMA基质的粘度显著提高。然而，这一粘度仍然比现有技术的LPA基质低得多，更易加载到微通道中。 

图3.与现有技术LPA基质相比，pDMA基质的ssDNA分离。3％和4％pDMA中的所有37个峰相互分离。观察到5％pDMA和LPA基质中分辨率丧失。DNA片段迁移时间取决于浓度。 

图4A-B.A)图2中分离得到的峰的选择性(μ_i-μ_i-1/μ_avg)。这两种基质显示了相似的峰分离。B)通过250个碱基，LongRead^TM基质的峰比pDMA基质宽得多(这种条带加宽是此基质测序性能降低的主要原因)。 

图5.pDMA基质中ssDNA梯的迁移率数据。条件与图1相同。用虚线标记出该曲线为线性时的DNA大小。对3％、4％和5％基质而言，线性区域的斜率分别是-0.54、-0.59和-0.50。 

图6.由DNA成像视频捕获的数字图像。以所示时间间隔开的一系列画面显示了通过本发明代表性网络移动的两种DNA分子。上面一种分子在给定时间内蠕动通过整个观察框。下面一种分子先是蠕动，然后以类似瞬时缠结偶联的基质钩住和牵拉聚合物网络通过观察框。 

某些实施方式的详述。 

可能影响DNA电泳分离的缠结聚合物的溶液特性。 

为了进一步理解本发明的某些实施方式，考虑了以下内容：开发用于测序的最优聚合物基质是微通道系统商业化的最大限制之一。只可能在聚合物链重 叠并形成缠结网络的半稀释聚合物溶液中进行DNA测序。重叠浓度(overlapconcentration)c^*定义为总体溶液浓度，它与螺管(coil)内的聚合物浓度精确匹配。方程1根据这一定义提供了c^*的估计值： 

$c^{*}\≈\frac{{3M}_w}{4\mathrm{\π}{N}_A{R}_g^3}---\left(1\right)$

当M_w是重均摩尔质量时，N_A是阿伏加德罗常数，R_g是聚合物回转半径。可由方程(1)，通过某些技术如光散射技术测定M_w和R_g来计算重叠浓度。或者，可通过测定一系列聚合物浓度的零剪切粘度并以双对数为轴用粘度与聚合物浓度作图来确定重叠浓度。该曲线变为非线性的浓度是重叠浓度，该网络缠结的程度可表示为c/c^*之比。 

随着DNA通过缠结聚合物网络移动，限定该网络的重要参数是聚合物筛选长度ξ。在聚合物溶液中，筛选长度取决于聚合物R_g和浓度 

$\mathrm{\ξ}=0.5R_g{\left(\frac{c}{c^{*}}\right)}^{\frac{-3}{4}}---\left(2\right)$

在凝胶电泳中，平均孔隙尺寸对确定分离机制和尝试将关于凝胶分离机制的理论联系到缠结网络时至关重要。已提出使用筛选长度作为这些溶液的“孔隙尺寸”，可通过将″空泡(blob)″大小ξ_b定义为缠结点之间的平均链长度而进行略微改变。这种调节仅将新的前因子引入该定义，定义为 

${\mathrm{\ξ}}_b=2.86\mathrm{\ξ}=1.43R_g{\left(\frac{c}{c^{*}}\right)}^{\frac{-3}{4}}---\left(3\right)$

因此，通常可根据此空泡大小确定该聚合物网络，所述空泡大小取决于聚合物浓度和螺管尺寸。 

缠结聚合物溶液中的DNA分离机制。 

上述聚合物网络参数可用于描述DNA通过缠结网络迁移的不同机制。分离机制取决于DNA分子的R_g相对于网络中空泡大小。小于网络孔隙尺寸的DNA尺寸可以迁移通过该溶液，其机制类似于Ogston所述通过致密纤维阵列移动的球的机制。这通常称为Ogston筛分，相对于自由溶液迁移率的DNA迁移率在数学上可表示为 

$\frac{\mathrm{\μ}}{{\mathrm{\μ}}_0}=\exp (-K_{r}c)---\left(4\right)$

其中K_r是阻滞系数，它与DNA螺管半径的平方成正比，c是凝胶或聚合 物浓度。通过将分析物迁移率的自然对数对凝胶的聚合物浓度作图的弗格森(Ferguson)曲线分析此机制。然后由曲线斜率得到阻滞系数的值。 

当DNA分子的螺管大小接近和超过该网络的孔隙尺寸时，预计DNA迁移率的Ogston模型会失败。对大于孔隙尺寸的DNA的观察产生DNA迁移率的有偏蠕动模型。通过考虑DNA分子长度发生的波动重新评价此模型，称为有波动的有偏蠕动。这些模型预计，DNA迁移率迂回通过该网络的方式类似于溶液的缠结聚合物熔体蠕动理论。该机制中的重要参数是有下式给出的降低的电场： 

$\mathrm{\ϵ}=\frac{{\mathrm{\η}}_s{\mathrm{\ξ}}_b{\mathrm{\μ}}_{0}E}{k_{b}T}---\left(5\right)$

其中η_s是溶剂粘度，E是电场强度，k_b是波耳兹曼常数，T是绝对温度。这些模型通常推倒出(例如)低电场，或ε＜＜1。得到的BRF模型的迁移率形式为 

${\left(\frac{\mathrm{\μ}}{{\mathrm{\μ}}_0}\right)}_{\mathrm{BRF}}={[{\left(3N\right)}^{-2}+{\left(\frac{2\mathrm{\ϵ}}{5+2\mathrm{\α\ϵ}}\right)}^2]}^{\frac{1}{2}}---\left(6\right)$

其中N是以碱基数表示的DNA大小，α是调节因子。在此模型中，小于首项的DNA尺寸占主导地位且DNA迁移率是大小依赖性的情况下，存在临界DNA尺寸。 

N＜N_crit时， $\left(\frac{\mathrm{\μ}}{{\mathrm{\μ}}_0}\right)=\frac{1}{3N}---\left(7\right)$

这种DNA蠕动方案被称为非定向蠕动，大多数DNA分离(包括测序)都是以这种方案进行的。对临界尺寸以上的DNA，第二项占主导地位，基于尺寸的分离消失。这种蠕动方案称为定向蠕动。DNA的临界尺寸取决于孔隙尺寸和电场强度。 

N_crit～ε^-2(8) 

预计临界尺寸与网格大小无关，但现有技术显示，非定向至定向蠕动的转变取决于网格大小。这种结果表明，较小的孔隙尺寸倾向于定向蠕动较小的DNA尺寸。因此，电场强度以及缠结网络的空泡大小是确定电泳分离DNA的上限尺寸的重要参数。 

虽然Ogston筛分和有偏蠕动的机制可应用于缠结溶液，但Barron等发现 了在低于重叠浓度的聚合物溶液中普遍存在的不同分离机制。在羟乙基纤维素(HEC)超稀溶液中，可以分离dsDNA大分子(＞1kbp)，缠结聚合物溶液的理论不足以解释该结果。因此，为该分离提出称为瞬时缠结偶联的新机制。在这种机制中，DNA在迁移过程中碰到聚合物链，二者的偶联增加了对DNA分子的牵拉阻力。碰到聚合物链的概率是DNA大小依赖性的，因此可以进行分离。 

聚合物物理特性对测序性能有影响。通常，较长的DNA测序阅读长度需要亲水性高分子量聚合物。同时，较低粘度和涂布玻璃表面的能力为操作该体系提供了技术上和成本上的优势。合成条件靶向摩尔质量超过1×10⁶ g/mol的pDMA和pHEA。这通常是进行较长DNA测序阅读，同时也满足稳定动态涂布需要的阈值。图1显示了通过GPC-MALLS测定，本研究中使用的pDMA的摩尔质量分布。表1小结了室温下测定的pDMA和pHEA聚合物特性。pDMA溶液的零剪切粘度见图2。许多LPA基质的粘度在100,000cP²⁸数量级，将测序所用浓度范围的pDMA基质加载到微通道中容易得多。 

表1-合成的用于基质和涂层的pDMA和pHEA的聚合物特性 

聚合物	Mw(MDa)	Rg(nm)	PDI
				pDMA	3.4	124	1.6
pHEA	4.0	135	3.2

ssDNA分离 

虽然在毛细管电泳设备中，pDMA被认为是有效的测序基质，但并未检测这种聚合物在微通道体系中测序的性能。用浓度为3-5％的pDMA在微通道电泳体系中分离ssDNA片段(以市售LPA基质为对照)。样品是含有37种DNA片段大小的25碱基梯。这些分离的电泳图见图3。虽然3％和4％pDMA基质能够分离所有37个峰，但5％pDMA和LPA基质不能完全分辨最大的DNA片段。因此，除了粘度较低以外，pDMA溶液分离最长达900个碱基的25碱基梯的性能优于4％LPA基质。此体系的有效分离距离为7.5cm，比市售CAE设备低得多。由于微通道体系采用能够进行更有效分离的交叉注射设计，所以大大降低了需要的通道长度，从而使分离更快。 

在pDMA基质中，DNA迁移时间明显依赖于聚合物浓度，这些pDMA基质中的迁移时间通常短于LPA基质。由于大多数微通道测序研究也采用 了较长通道以及不同的电场强度和温度以便优化其单个体系，所以难以直接比较迁移时间。然而，在相同电泳条件下，许多微通道研究所选基质4％LPA的迁移时间比本文所用的pDMA基质长。 

DNA测序结果 

除与LPA相比分离速度提高外，pDMA可用作自身涂布基质因而不再需要共价涂布通道壁，这种共价涂布过程昂贵且耗时。在高通量环境下，动态吸附的聚合物壁涂层比共价涂布更具吸引力，因为其成本降低且实施更简单。然而，pDMA涂层有些疏水性，可能与分析物相互作用。pHEA的亲水特性使其成为出色的壁涂层，因为它可降低电渗流和分析物-壁相互作用。 

各种浓度的pDMA和市售Pop-5^TM和Beckman LongRead^TM基质的测序结果，以及利用不同动态涂层的结果见表2。聚合物涂层的化学特性会显著影响阅读长度。在4％pDMA基质中，采用pDMA作为动态涂层时阅读长度可以是420个碱基。pHEA用作动态涂层时，可使阅读长度延长130个碱基。这种阅读长度的增加归因于可能使分离期间条带加宽的壁-分析物相互作用的降低。 

表2-玻璃微芯片的DNA测序结果 

测序基质	涂层聚合物	平均阅读长度a(n＝3)	长阅读长度a	时间b(s)
					3％pDMA	pHEA	349	377	225
4％pDMA	pHEA	512	550	340
					5％pDMA	pHEA	489	530	388
Pop-5TM	pHEA	384	430	355
					LongRead TM LPA	pHEA	＜300	318	N/Ac
4％pDMA	pDMA	372	420	290
					Pop-5TM	Pop-5TM	＜50	N/Ac	N/Ac

^*所有实验均在50℃和235V/cm(～3μA电流)下进行 

^a准确度98.5％ 

^b达到平均阅读长度的时间 

^c无法测定 

另一令人感兴趣的结果是，不同于在ABI CAE设备中的商业应用，Pop-5^TM聚合物不可用作自身涂布基质。这可解释为用于制备本研究微流体芯片的玻璃与毛细管所用的熔融石英玻璃的化学性质基础差异。存在盐和 其它杂质能提高玻璃芯片的结合特性，但这会改变Pop-5^TM聚合物的涂布能力。然而，如果Pop-5^TM基质加到芯片上之前应用pHEA，能将阅读长度由非常低的水平(＜50个碱基)增加到约380个碱基。比较pDMA基质与Pop^TM 基质的结果表明，开发用于毛细管体系的聚合物基质不一定是微通道体系的最佳基质。通过pDMA基质与贝克曼(Beckman)LongRead^TM基质(毛细管体系优化的LPA基质)中获得的更好的测序阅读长度进一步确认了这一结果。 

pDMA测序基质优化配方与pHEA动态涂布的组合在较短时间产生的阅读长度大于市售基质。4％pDMA基质能以98.5％准确度平均递送512个碱基，包括550个碱基的长阅读。通过比较不同pDMA浓度揭示出，在ssDNA分离中3％pDMA基质能使500个碱基片段的迁移时间提高25％；然而，平均只准确调用349个碱基进行测序。因此，对较长的阅读长度而言，需要这种特定pDMA摩尔质量的浓度超过3％。然而，4％配方代表了最优浓度，因为阅读长度在浓度为5％时降低。 

在图3所示的分离中，3％pDMA基质能以高分辨率快速分离DNA大片段，但无法获得与较高pDMA浓度相当的测序阅读长度。由于较高聚合物浓度是分离短DNA片段的重要参数，较低浓度有利于分离较大的片段，通过混合平均摩尔质量较高和平均摩尔质量较低的聚合物来配制聚合物基质。表3显示了两种pDMA聚合物“混合物”的结果(准确度98.5％)。平均摩尔质量较高的pDMA(3.4MDa)的应用浓度为3％(w/v)，而平均摩尔质量较低的pDMA(240kDa)的应用浓度为1％和2％(w/v)，以使这两种基质的总pDMA浓度为4％和5％(w/v)。虽然具有单一平均摩尔质量的基质运行得也非常好，但混合摩尔质量的基质运行得更好。4％混合基质的平均阅读长度最长为560个碱基(6分钟阅读长度为587个碱基)，而5％混合基质的最长单个阅读长度为601个碱基，仅需要6.5分钟即可实现此阅读长度。(最长测序实验的四色测序电泳图未显示。) 

可以进一步分析pDMA基质和LongRead^TM LPA基质的分离，以确定这种市售基质的性能较差的原因。从ssDNA分离中，图4A-B中用这两种分离的选择性和峰宽对各种DNA片段大小作图。这种选择性是基质分离作 用的量度，定义为用平均迁移率标准化的相邻峰之间的迁移率差异。峰宽衡量了该体系中所有条带加宽来源的组合作用。在图4A中，4％pDMA聚合物和LongRead^TM基质的选择性明显相似，这无法解释测序性能的差异。然而，图4B显示了在大于约250个碱基的DNA尺寸下，LPA基质的峰宽显著增加。相信这种条带加宽作用是这一体系性能较差的主要原因，pDMA基质中高得多的峰效率(较小的宽度)使得这些聚合物的测序阅读长度增加。而且，LongRead^TM LPA体系的较宽峰可能需要较长的分离通道来实现相似的阅读长度(也需要较长时间)。 

表3-采用pHEA涂层的混合摩尔质量pDMA基质的测序比较^a

^a运行条件与表2相同 

^b高摩尔质量pDMA是3.4MDa；低摩尔质量pDMA是240kDa 

^c准确度为98.5％时的阅读长度 

研究pDMA基质中的DNA分离机制 

相信通过缠结聚合物溶液的DNA分离通过上述两种机制进行。虽然DNA小片段倾向于通过该聚合物网络筛分(Ogston筛分)，但DNA蠕动是较大片段的分离机制。蠕动提供了较高分辨率的分离，应该是高性能测序所需的机制。这可以解释为何需要较高浓度来测序较小的DNA，因为较高浓度下较小的网格大小能将蠕动机制起始点转变为较小的DNA。相似的推理可解释为何较长的阅读需要较低浓度。随着机制转变为定向蠕动，基质丧失了所有分辨力。由于这种转变取决于网格大小(参见Eq 8)，所以在较高聚合物浓度下DNA倾向于定向在较小尺寸上。 

在对数比例尺上将DNA迁移率对片段大小作图，可以在数据的线性部分观察到非定向蠕动分离，如图5所示的图1ssDNA梯的分离。图5所示数据与前述毛细管体系中pDMA基质的数据相似。具体说，Ogston型筛分到非定向蠕动，以及非定向蠕动到定向蠕动之间存在平滑转变。 

在长DNA测序阅读中，图5曲线的线性区域延伸至较大DNA尺寸可 能很重要。相对于5％pDMA，4％pDMA基质中较大DNA尺寸的迁移率保持在线性区域内，因此向定向蠕动的转变转移至较小的DNA尺寸。因此，4％pDMA给出的阅读长度应该大于5％基质，本研究的结果证明，即使对低于此限的DNA大小而言，4％基质也能提供较佳的测序结果。然而应注意，迁移率曲线不能说明可降低测序所需单碱基分辨的条带加宽作用，因此测序阅读长度小于仅由ssDNA梯的迁移率曲线预计的值。 

缠结网络破裂 

与两个较高浓度相比，3％pDMA基质的迁移率曲线的线性区域延伸更长，而该基质的阅读长度通常短得多。一个原因是需要较高的聚合物浓度以更好地分离小尺寸DNA(如上所述)。影响较大DNA尺寸的分离性能的另一因素是该聚合物网络的缠结强度。通常，在给定分子量的情况下，缠结网络强度随着聚合物浓度的增加而增加并能更好地缠结链，因此在网格大小需要大到足以测序较大DNA时，摩尔质量较高的聚合物更有效。缠结强度也受单条链的螺管尺寸的影响。pDMA链的螺管尺寸通常小于更亲水的聚合物如LPA。 

需要强烈缠结的网络来分离蠕动通过的DNA，因此迁移DNA造成该聚合物网络的破坏倾向于降低分离效果和阅读长度。在弱缠结的网络中，破坏的频率更高，尤其是通过较大DNA时。然而，随着网络被破坏DNA分子与聚合物链的缠结现象仍然趋向尺寸依赖性。此机制涉及瞬时缠结偶联(TEC)，这种偶联是本领域熟知和已确立的现象，由Barron等发现，可用于分离稀聚合物溶液中的dsDNA。(参见例如，Barron，A.E.，Soane，D.S.和Blanch，H.W.(1993)J.Chrom.A652：3-16；Barron，A.E.，Blanch，H.W.和Soane，D.S.(1994)Electrophoresis 15：597-615；和Barron，A.E.，Sunada，W.M.和Blanch，H.W.(1996)Biotech.Bioeng.52：259-270，各自全文纳入本文作参考)。虽然未定向蠕动是这些基质分离DNA的主要机制，但网络破坏和DNA-聚合物缠结也可能对分离有贡献。因为预计这种网络破坏(有挂钩)比蠕动快，所以这种机制可以解释与LPA测序基质相比，在较弱缠结的pDMA溶液中分离速度较高。 

通过视频显微镜研究pDMA基质中的dsDNA，进一步提示了这种DNA分离的混合机制。图6显示了25℃下两种DNA分子在3.0％pDMA基质中随时间的变化，其中一种分子通过蠕动迁移而另一种分子破坏网络并在通过溶液时牵拉聚合物链。较小的DNA分子蠕动通过该溶液，然后钩到网络上并牵拉网络，而较大的DNA分子在整个视屏框期间继续蠕动。这证明，这两种机制可同时存在于同一基质中。 

如下所示，一种用于毛细管和微芯片的新型聚合物基质/聚合物壁涂布体系，其包含疏水性聚合物和亲水性聚合物的混合物，其中疏水性聚合物例如聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)用作DNA分离基质，亲水性聚合物例如聚(N-羟乙基丙烯酰胺)则用作亲水性动态壁涂层，所述物质能通过毛细管，特别是微芯片电泳超快分离DNA序列。疏水性测序聚合物与动态亲水性聚合物壁涂层的混合物未曾用于微流体电泳装置。可在7分钟内以高准确率碱基调用对500-600个碱基进行测序，特别是通过在有效分离距离仅为7.5cm的微通道电泳模式和其它条件如(优化)施加的电场强度(如235V/cm)和温度(如50℃)下组合两种这类聚合物进行测序。将M_w优选约3-4MDa的PDMA用1xTTE+7M脲缓冲液溶解至浓度为3-5％w/v提供了测序基质，而将pHEA动态涂层预先施加到微流体芯片中。此外，将约1-2％低摩尔质量pDMA(～200-300kDa)加入3％(w/v)高摩尔质量pDMA(3-4MDa)溶液(总聚合物浓度4％(w/v))中产生的测序阅读长度长得多，电泳6.5分钟阅读至多600个碱基。特别地，如果不受限于任何一种理论或操作方式，这类条件能够通过瞬时缠结偶联和蠕动之间某种状态的混合DNA分离机制对DNA进行超快测序，这是一种未曾证明的DNA测序机制。可通过观察DNA迁移率与片段大小的双对数曲线图推倒出这种机制，用单分子落射荧光显微成像实验验证了这种机制。在DNA迁移率对DNA大小的双对数曲线中，在超快测序条件下线性区域的斜率为-0.40至-0.60。 

根据聚合物特性如分子量、组成和溶液浓度进一步优化这类分离介质以及优化壁涂层聚合物，能够在较短时间阅读更长的序列。获得的结果代表迄今为止对这一阅读长度最快的测序时间，因此使微通道测序技术发展向前迈进。 

本发明的实施例

下面的非限制性实施例和数据阐释了与本发明的组合物、系统、方法和/或设备有关的各个方面和特征，包括将疏水性分离基质聚合物组分和亲水性壁涂层聚合物组分用于微通道电泳。与现有技术相比，本发明的组合物、方法、系统和/或设备提供的结果和数据是令人惊讶、出人意料和与现有技术相反的。虽然用几种聚合物组分、组合物和设备阐释了本发明的应用，但本领域技术人员应理解，用多种其它聚合物组分、组合物和/或设备可获得类似的结果，这些都在本发明范围之内。 

实施例1 

PDMA合成 

由购自美国宾夕法尼亚州费斯特维的单体-聚合物和达哈实验室公司(Monomer-Polymer and Dajac Labs，Feasterville，PA，USA)的纯度为99+％的单体N，N-二甲基丙烯酰胺合成高分子量pDMA分离基质聚合物。在水浴设定为47℃的情况下，N₂流动30分钟使DI水中4wt％单体溶液脱气，然后用V-50(二盐酸2，2′-氮双(2-脒基丙烷)，美国弗吉尼亚州里士满的外克化学品公司(Wako Chemicals，Richmond，VA USA))启动。16小时后，将粘性聚合物溶液转移到100,000MW截止值透析膜上，通过频繁换水透析10天。透析后，冻干样品，以回收摩尔质量超过1MDa的固体pDMA聚合物。本发明的各种其它基质聚合物和共聚物可由市场购得，或者可通过如上所述的类似方式或采用已知的合成技术或其修改形式由相应单体制备得到，本领域技术人员通过了解本发明能够知道这些方式、技术或其修改形式。 

另外，将5mL异丙醇加入上述反应混合物能降低pMDA的摩尔质量，使其适合混合到混合的摩尔质量基质中。通过将5mL异丙醇加入单体溶液中，聚合和纯化产生的聚合物产品的摩尔质量约为200-300kDa。 

实施例2 

pHEA合成 

为了合成壁涂层聚合物pHEA，N-羟乙基丙烯酰胺单体是购自刊布莱 克斯公司(Cambrex)的45％溶液(商品名Duramide^TM)。将一些单体溶液稀释到100mL体积，以使单体的终浓度为0.5wt％。将水浴设定为25℃，在N₂下使单体溶液脱气30分钟。脱气后，通过加入100μL 10wt％过硫酸铵溶液(阿来思科公司(Amresco Inc)，美国俄亥俄州索伦(Solon，OH USA))和10μL TEMED(阿来思科公司)启动该反应。使该反应进行16小时，然后将聚合物溶液转移到100,000MW截止值透析膜上，通过频繁换水透析10天。透析后，冻干该溶液，以回收摩尔质量超过1MDa的固体聚合物。 

实施例3 

聚合物分子量表征 

通过串联的凝胶渗透色谱-多角激光散射(GPC-MALLS)测定分子量分布。先用连续连接的Shodex OH-Pak柱SB-806HQ、SB-804HQ和SB-802.5HQ在GPC(沃特公司(Waters Corp)，美国马萨诸塞州米尔福德(Milford，MA USA))上分馏稀聚合物溶液。分馏后，使GPC流出液直接流入DAWNDSP激光光度计中，然后流入Optilab DSP干涉法折射计(这两种设备均购自瓦特技术公司(Wyatt Technologies)，美国加州圣芭芭拉(Santa Barbara，CA USA))。在鉴定过程中，将100μL稀(1mg/mL)溶液(含有由0.1M NaCl、50mM Na₂HPO₄和200ppm NaN₃组成的流动相)注射到该设备中，流速为0.300mL/min。用瓦特技术公司的ASTRA软件处理GPC-MALLS数据。合成的聚合物均用摩尔质量、旋转半径和多分散指数表征。 

实施例4 

施涂pHEA涂层 

根据Albarghouthi等所述的方案，先用1M HCl溶液填充微通道，静置15分钟。去除1M HCl溶液后，用去离子水洗涤该通道，然后用pHEA涂层溶液充满该通道，静置15分钟。pHEA涂层溶液是用去离子水配制的聚合物的0.1％w/v水溶液。涂布导致通道的电渗流小于1×10^-5cm²/Vs。 

实施例5 

微通道/微芯片电泳 

在微通道电泳系统上分析ssM13mp18测序片段和ssDNA ET-900梯(均来自安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)，美国新泽西州皮斯卡 塔韦(Piscataway，NJ USA))，该系统是为我们在美国加利福尼亚州芒廷维尤的阿克拉拉生物科学公司(ACLARA Biosciences，Mountain View，CAUSA)的实验室定制的。该系统能通过激光诱发的荧光(LIF)进行灵敏的多色检测。该系统由两个子系统组成：为微流体装置提供电压的电气系统和在荧光分子通过通道中的激光聚焦点时检测荧光分子的光学子系统。可以用LabView软件中的一个程序同时控制这两个子系统。 

实施例6 

该电气系统由能够独立地控制四个电极的高压电源供电。各电极可设定为0-4.5kV，或者可与电路断开(″浮动″)。该软件让使用者能够在设定时间内将所有四个电极的电压设定为所需电压设定点，可按顺序采用多重电压和时间步骤来完成复杂芯片功能或不同的分离方案。光学子系统由共聚焦落射荧光系统组成，其中荧光团由JDS Uniphase Series 2214-30s1单行488-nm氩离子激光器(美国加州圣荷塞(San Jose，CA USA))激发。用反射镜将激光束导向TE200倒置落射荧光显微镜。然后使该光束通过带通滤光片，用二向色镜反射回来，通过尼康(Nikon)10x/0.45显微镜物镜聚焦到微流体通道中心，产生直径约为10μm的激光点。通过同一物镜收集发射的荧光，使其通过二向色镜，然后通过第二个宽带通滤光片(科罗马技术公司(Chroma Technology)，美国佛蒙特州布莱特尔博罗(Brattleboro，VT USA))。使滤过的光通过透射光栅并将其聚焦到冷却至-15℃的高量子效率532×64像素电荷耦合器件(CCD)(滨松公司(Hamamatsu Corp.)，美国新泽西州卜利积沃特(Brigewater，NJ USA))，从而测定滤过光的光谱。对CCD相机的数据进行像素分段(binning)，以定量测定一定范围波长的发射光的强度，用溶剂的拉曼散射线进行校正。可以10-50Hz的频率收集数据。用LabView中的程序收集CCD输出值CCD、进行分段、低通过滤，并储存。 

实施例7 

用购自麦克罗尼微流体公司(Micronit Microfluidics BV)(Enschede，荷兰)的7.5-cm有效分离距离的单通道玻璃微芯片进行实验。用pDMA或pHEA涂布通道的具体方法是：先用1M HCl冲洗15分钟，接着用0.1％(w/v)聚合物溶液填充该通道15分钟。在用TTE缓冲液(50mM Tris，50mM TAPS 和2mM EDTA)配制的含有7M脲、Pop-5^TM基质(应用生物系统公司(AppliedBiosystems，Inc)，美国加州福斯特城(Foster City，CA USA))和贝克曼(Beckman)LongRead^TM LPA基质(安玛西亚公司)的pDMA(M_w＝3.4MDa)和LPA(M_w＝2.5MDa)基质中分离ssDNA和测序，其浓度范围是3-5％(w/v)。在各轮实验中，施加235V/cm电场60秒，然后注射样品。同时，用1％或2％低摩尔质量pDMA(约200-300kDA)和3％到4％高摩尔质量pDMA配制混合摩尔质量pDMA基质。采用偏移量为100μm的偏移T注射器，以100V/cm注射样品40秒。以235V/cm进行分离，将38V/cm反偏压施加于样品和样品废液孔。在该轮实验期间芯片维持在50℃。用NNIM碱基调用软件(Basecaller)(NNIM，LLC，美国犹他州盐湖城(Salt Lake County，UT USA))和测序软件(Sequencher)v4.0.5(遗传密码公司(Gene Codes Corp.)，美国密歇根州安阿伯(Ann Arbor，MI USA))完成碱基调用(basecalling)。这类pDMA基质在6-7分钟的测序阅读长度约为500-600个碱基，而市售基质的测序长度不超过约400个碱基。 

实施例8 

流变学 

用Anton Paar Physica MCR 300(美国弗吉尼亚州阿什兰(Ashland，VA，USA))测定零剪切粘度，用连接于数字控制的再循环水浴(胡拉波美国公司(Julabo USA Inc.)，美国宾夕法尼亚州阿伦敦(Allentown，PA，USA))的珀耳帖控制器保温。用锥-板(CP50-1型)固定装置和双隙库爱特(Couette)(DG26.7型)固定装置在25-50℃温度范围内进行受控剪切应力和剪切率扫描。用这一设备产生零剪切粘度与聚合物浓度的曲线(参见图2)。 

实施例9 

视频显微术 

用YOYO-1(分子探针公司(Molecular Probes)，美国俄勒冈州尤金(Eugene，OR USA))荧光标记DNA。所有蛋白质和糖试剂均购自费希尔科技公司(Fisher Scientific)(美国宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh，PA USA))，48kbp ds-λDNA购自英杰公司(Invitrogen)(美国加州圣地亚哥)，β巯基乙醇(BME)购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich， St.Louis，MO USA)。该标记法每5-10个dsDNA碱基对产生约1个标记。为了观察荧光标记的DNA，将染色溶液与过氧化氢酶母液、葡萄糖氧化酶母液、BME、20％葡萄糖缓冲液和聚合物溶液(预先混合24消失以溶解)混合。温和混合过夜后，准备对该聚合物/DNA溶液拍照。 

实施例10 

用于对DNA拍照的杂交芯片由Sylgard 184聚(二甲基硅氧烷)(费希尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡)微通道和1.5-厚的盖玻片(费希尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡)组成。以10∶1的重量比混合预聚物和固化剂，从而形成PDMS通道。将脱气混合物倾倒在Scotch Magic Tape^TM细条上，在真空室中固化过夜。将固化PDMS切成0.5cm长的方块，以适合盖玻片，所得通道的深度约为50-60微米。 

实施例11 

用密歇根大学莫里斯实验室(Morris lab，University of Michigan)建立的自制系统观察DNA迁移(Albarghouthi，M.N.，Stein，T.M.和Barron，A.E.(2003)Electrophoresis 24：1166-1175；de Carmejane，O.，Yamaguchi，Y.，Todorov，T.I.和Morris，M.D.(2001)Electrophoresis 22：2433-2441)。该成像系统由装有尼康CFI 100x/N.A.1.4油浸显微镜物镜的尼康TE200(尼康仪器公司(Nikon Instruments Inc.)，美国纽约州梅尔维尔(Melville，NY，USA))倒置落射荧光显微镜组成。用100瓦汞灯光源(通过依次排列的吸热滤器和蓝光激发滤器立方体聚焦(460nm-500nm))(科罗马技术公司，美国佛蒙特州布莱特尔博罗)获得DNA荧光。用0.5英寸CCD，TM-6710-CL相机(JAI Pulnix，美国加州桑尼维尔(Sunnyvale，CA USA))通过510nm宽带滤光片(科罗马技术公司，美国佛蒙特州布莱特尔博罗)和VS4-1845第3代图象增强器(视频示波器国际公司(Videoscope International)，美国弗吉尼亚州杜勒斯(Dulles，VA USA))收集DNA发出的荧光。该高速相机的帧率可调节至120帧/秒，全部空间分辨率为648×484像素。以30帧/秒捕获所有视频，利用XCAP-STD(EPIX公司(EPIX INC)，美国伊利诺斯州野牛林(BuffaloGrove，IL USA))软件通过PIXCI控制板(EPIX公司，美国伊利诺斯州野牛林)直接储存至计算机。用购自麦克罗尼公司的高电压电源施加电泳电压。 可用此技术拍摄通过聚合物基质迁移的单个DNA分子的照片。 

实施例12 

采用动态pHEA聚合物预先涂布的微通道，将4％(w/v)聚(N-甲氧基乙基丙烯酰胺)(pNMEA)聚合物溶液加载到该通道中作为测序基质。当温度设定为50℃，7.5cm长的分离通道上电场为235V/cm时，约6.5分钟实现的DNA测序阅读长度为540个碱基(准确度98.5％)。用NNIM碱基调用软件和测序软件4.0.5版进行碱基调用。(测序电泳图未显示) 

实施例13 

除了在微芯片上测序DNA外，也将本发明聚合物体系(如pDMA基质和pHEA动态涂层)用于ABI 3100市售设备的22-cm毛细管。以50℃的温度和250V/cm的电场进行所有测序实验。原始测序数据显示，相对于市售POP^TM-6基质，4％混合摩尔质量pDMA(1％低摩尔质量和3％高摩尔质量)能够快速测序。这类pDMA基质中的分离速度比POP^TM基质快3倍，这证明在毛细管设备中也可进行更快的测序。测序结果见表4，该结果比较了pHEA涂布的毛细管中4％混合摩尔质量pDMA和POP^TM-6。混合摩尔质量pDMA的分离速度快得多。这种基质能在约22分钟内测序650个碱基。用NNIM碱基调用程序和测序程序第4.0.5版完成碱基调用(4％混合摩尔质量的测序电泳图未显示)。 

表4-测序基质的比较 

^*3％高摩尔质量(2.7MDa)+1％低摩尔质量(280kDa) 

*** 

如前述实施例所示，能够用具有pHEA动态涂层的pDMA基质在6.5分钟内对至多600个碱基进行DNA测序。为此工作合成的pDMA的性能远远优于市售基质，相对于更具疏水性的涂层选择pHEA对延长阅读长度至关重要。单链DNA片段在本研究中使用的pDMA基质中的迁移率高于用于前述微通道研究的普通LPA基质。pDMA基质在短短的7.5cm分离距离上测序阅读长度超过600个碱基的事实也对高速有贡献。 

流变学数据和视频显微镜研究提示，弱缠结的pDMA网络的测序速度可能高于缠结较强的网络，因为迁移的DNA分子可能更频繁地破坏该网络。虽然网络破坏通常导致分离能力降低，但DNA可钩住并牵拉松散的聚合物链，这类似于DNA迁移率仍然是大小依赖性的TEC机制。虽然视频显微术提示了这种混合分离机制，但目前没有现成的DNA分离理论考虑了这些机制。 

可优化此系统，相对DNA尺寸分析迁移率时提示，可能进行较长的阅读。在11.5cm和15.9cm通道长度上进行测序。假定是扩散-限制体系，碱基调用软件可准确调用碱基的最小分辨率与通道长度的平方根成比例，而迁移时间应线性增加。因此，采用11.5cm通道时，可用此体系在～9分钟内阅读至多630个碱基，而15.9cm通道将在～12分钟内阅读800个碱基。对于4％pDMA基质在850个碱基附近开始转变为定向蠕动的现象破坏了这些结果，这种转变将改变迁移率对长度的依赖性，可以预计到阅读长度变短。然而，pDMA基质与pHEA动态涂层在较短时间内提供长测序阅读的能力代表了微芯片测序系统的显著进步，必将使下一代测序技术的发展向前推进。 

本发明的体系/组合物可延伸至测序中心或可采用线性聚合物基质和动态聚合物涂层的其它测序应用。也可能对需要电泳分离DNA的许多基因分型和法医应用感兴趣，因为可以(例如)用图1A所示的基质和涂层组合分离大范围的DNA尺寸。 

Claims (35)

1.一种用于微通道电泳的DNA测序或基因分型组合物，其包含疏水性分离基质组分和亲水性壁涂层组分，所述疏水性分离基质组分含有式

的聚丙烯酰胺，式中R选自H和甲基，R′和R″独立地选自C1-C8直链烷基部分、C1-C8烷氧基取代的直链烷基部分、C1-C8支链烷基部分和C1-C8烷氧基取代的支链烷基部分，或者它们的共聚物，所述聚丙烯酰胺至少部分可溶于水；所述亲水性壁涂层组分含有聚(N-羟乙基丙烯酰胺)。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述基质组分选自聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)共聚物。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述基质组分包含水性介质配制的3w/v％-5w/v％聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述基质组分含有3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述基质组分含有1w/v％-2w/v％重均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

6.一种测序组合物，其包含疏水性分离基质组分和壁涂层组分，所述疏水性分离基质组分含有聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)组分，所述壁涂层组分含有亲水性聚(N-羟乙基丙烯酰胺)组分。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述基质组分包含水性介质配制的3w/v％-5w/v％聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述基质组分包含3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和1w/v％-2w/v％平均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

9.一种用于DNA和RNA分离的微通道电泳系统，所述系统包含疏水性分离基质组分和亲水性壁涂层组分以及微通道基材，所述疏水性分离基质组分含有聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)，所述亲水性壁涂层组分含有聚(N-羟乙基丙烯酰胺)；所述微通道基材选自微尺寸毛细管和微流体电泳芯片，所述毛细管限定的内部尺寸为10微米-150微米，所述微流体电泳芯片的微通道尺寸为10微米-150微米。

10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述基质组分包含3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和1w/v％-2w/v％重均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

11.如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述聚(N-羟乙基丙烯酰胺)与所述基材相接触。

12.一种使用聚合物壁涂层和分离基质体系进行电泳DNA和RNA分离的方法，所述方法包括：

提供含有聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)分离基质组分和聚(N-羟乙基丙烯酰胺)壁涂层组分的体系，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)组分占所述体系的3w/v％-5w/v％；

将所述体系引入选自微通道电泳毛细管和微流体电泳芯片的基材；和

在施加电压下使选自DNA测序反应产物组分和RNA组分的混合物与所述体系接触足以至少部分地电泳分离所述混合物的时间。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述基质组分包含3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和1w/v％-2w/v％重均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，使所述聚(N-羟乙基丙烯酰胺)组分与所述基材相接触。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚(N-羟乙基丙烯酰胺)组分是用水性介质配制的。

16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述体系包含DNA测序缓冲液，所述混合物包含DNA分子。

17.如权利要求16所述的方法，分离单链DNA，其中所述DNA序列组分之一含有至多800个碱基，所述分离与时间和微通道长度有关联。

18.一种微通道电泳设备，其包括选自微尺寸毛细管和微流体电泳芯片的基材；以及基材上的聚合物体系，所述体系含有聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)分离基质组分和聚(N-羟乙基丙烯酰胺)壁涂层组分，所述聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)分离基质组分占所述体系的3w/v％-5w/v％。

19.如权利要求18所述的设备，其特征在于，所述基质组分含有3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和1w/v％-2w/v％重均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N-一二甲基丙烯酰胺)。

20.如权利要求18所述的设备，其特征在于，将所述聚(N-羟乙基丙烯酰胺)组分施加于所述基材。

21.一种使用聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)基质提高DNA分离速度的方法，所述方法包括：

提供选自微尺寸毛细管和微流体电泳芯片的微通道基材；

使亲水性聚(N-羟乙基丙烯酰胺)壁涂层组分偶联于所述基材；

将疏水性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)基质组分引入所述基材，所述基质组分至少部分可溶于水；和

在施加电压下使DNA序列组分的混合物与所述基质组分接触足以至少部分地电泳分离所述混合物的时间，所述聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的分子量和浓度至少部分地足以使所述混合物中的DNA组分发生瞬时缠结偶联和蠕动中至少一种。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述分离是所述瞬时缠结偶联和蠕动的组合。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述DNA组分在50％的所述迁移时间中通过瞬时缠结偶联迁移，在50％的所述迁移时间中通过蠕动迁移。

24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，通过落射荧光视频显微术观察荧光染色的DNA分子来监测DNA迁移动力学。

25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述基质含有3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和1w/v％-2w/v％重均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述迁移的特征是通过所述基质的DNA电泳迁移率与DNA分子大小的双对数曲线的线性区域，所述分子大小以碱基和碱基对之一表示。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述DNA分子大小为200个碱基到800个碱基，所述曲线的线性区域的斜率为-0.40至-0.60。

28.一种利用疏水性聚合物基质提高DNA分离速度的方法，所述方法包括：

提供选自微尺寸毛细管和微流体电泳芯片的微通道基材；

使亲水性聚(N-羟乙基丙烯酰胺)壁涂层组分偶联于所述基材；

将疏水性分离基质组分引入所述基材，所述基质组分选自权利要求1所述的聚丙烯酰胺、其共聚物、所述聚丙烯酰胺的组合、所述共聚物的组合以及任意所述聚丙烯酰胺与任意所述共聚物的组合，所述基质组分至少部分可溶于水；和

在施加电压下使DNA序列组分的混合物与所述基质组分接触足以至少部分电泳分离所述混合物的时间，所述聚丙烯酰胺的分子量和浓度足以至少部分地使所述混合物中的DNA组分发生瞬时缠结偶联和蠕动中至少一种。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述分离是所述瞬时缠结偶联和蠕动的组合。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述DNA组分在50％的所述迁移时间中通过瞬时缠结偶联迁移，在50％的所述迁移时间中通过蠕动迁移。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，通过落射荧光视频显微术观察荧光染色的DNA分子来监测DNA迁移动力学。

32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述基质组分选自聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)及其共聚物。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述基质包含3w/v％重均摩尔质量为3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和1w/v％-2w/v％重均摩尔质量为200-300kDa的聚(N，N二甲基丙烯酰胺)。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述迁移的特征是通过所述基质的DNA电泳迁移率与DNA分子大小的双对数曲线的线性区域，所述分子大小以碱基和碱基对之一表示。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述DNA分子大小范围是200个碱基到800个碱基，所述曲线的线性区域的斜率为-0.40至-0.60。

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