JP4144776B2 - 分子の分離を実施するための改良された方法およびシステム - Google Patents
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Description
(関連出願との相互参照)
本出願は、1997年12月17日、出願、米国特許出願第08/992,239号の一部継続であり、これは目的のすべてのためにその全体が参考として本明細書において援用される。
【0002】
(発明の背景)
キャピラリー電気泳動は、高分子種がさらに特徴づけられ得るようにそれらを分離するための高度に有効な方法として確立されている。タンパク質および核酸分子は、キャピラリー電気泳動システムを用いて慣用的に分画および特徴づけされる分子種の2つの主な例である。これらのシステムは、通常、薄いキャピラリーの容量に対する高い表面の比の結果として有効であることが証明されている。容量に対するこの高い表面比は、より大きい熱の散逸を可能にし、次にキャピラリーへのより大きい電流の印加を可能にする。従って、システムに導入された高分子のより迅速な分離を生じる。
【0003】
目的の生物学的高分子(例えば、タンパク質および核酸)のキャピラリー電気泳動のサイズに基づいた分離において、電気泳動分離は、自由溶液中では不可能である。代わりに、このような分離は、それらの相対的なサイズに基づいてそれらの分子の電気泳動の移動度を変化させるマトリックスの存在を必要とする。
【0004】
初期のキャピラリー電気泳動システムは、固体のゲルマトリックス、例えば架橋ポリアクリルアミドを利用したが、より最近のシステムは、流動可能マトリックスのような液体ポリマー溶液を用いており、これは架橋キャピラリーシステムの欠陥、すなわち、このようなマトリックスをキャピラリーチャネルに導入することまたはキャピラリーチャネルから取り除くことを伴わずに充分な分離有効性を可能にする。
【0005】
例えば、米国特許第5,126,021号は、核酸を分離するための、低い粘度の荷電していないポリマー溶液を含むキャピラリー電気泳動チューブを備えるキャピラリー電気泳動のエレメントを報告する。
【0006】
Demorestらの米国特許第5,264,101号は、親水性のポリマー溶液の使用を報告している。これは20〜5,000kDの分子量、および全ポリマーサブユニットに対する全モノマーサブユニットのモルパーセントにより測定される0.01%と1%との間の電荷により特徴付けられ、この電荷は、ポリマーが用いられるキャピラリーの表面の電荷と逆である。このポリマーの逆の電荷は、ポリマーとキャピラリー壁との間に相互作用を生じ、キャピラリーの中で電気浸透流を減少させると報告されている。
【0007】
両方ともMadabhushiらの米国特許第5,552,028号および同第5,567,292号は、キャピラリー電気泳動システム中の荷電していない、水溶性の、シリカ吸着性ポリマーの使用が電気浸透流を減少または排除することを報告している。
【0008】
驚くべきことに、本発明者は、ポリマーがキャピラリー内部表面の電荷と同じ電荷(例えば、正または負)を用いる、キャピラリーチャネルシステムにおいてポリマー溶液が用いられ得ることを発見した。さらに驚くべきことに、このようなポリマー溶液を含むキャピラリーチャネルシステムの電気浸透流が荷電していないポリマー溶液と同じレベルかまたはより低いレベルに維持されることが発見されている。本発明は、このようなポリマーならびにこれらのポリマー利用の方法およびこのようなポリマーを用いるシステムを提供する。
【0009】
(発明の要旨)
本発明は、通常、電気泳動の手段により、分子、特に高分子種の分離に用いるための新規な方法および組成物を提供する。
【0010】
例えば、本発明のある局面において、キャピラリー電気泳動による高分子の分離の方法が提供される。この方法は、通常、基板に配置された少なくとも第1のキャピラリーチャネルを含む基板を提供する工程を含有し、ここでチャネルの表面はそれと結合した第1の表面電荷を有している。このキャピラリーチャネルは、水溶性の親水性ポリマーの産生に使用した全てのモノマーに対する荷電したモノマーのモルパーセントにより計算して約0.01%〜約2%のパーセントの電荷を含む水溶性の親水性ポリマー溶液で充填される。この荷電したモノマーサブユニットは、第1の表面電荷と同じ電荷を有する。高分子を含むサンプルは、キャピラリーチャネルの一端に導入され、そして電位勾配は、そのキャピラリーチャネルの長さにわたって印加され、これによってサンプル中の高分子がキャピラリーチャネル中で分離される。好ましい局面において、キャピラリーチャネルの表面電荷、ならびに荷電したモノマーサブユニットは、負の電荷を保有する。さらに好ましい局面において、このキャピラリーチャネルは、シリカ基板内に配置される。
【0011】
関連の局面において、本発明はまた、上記方法を実行するためのシステムおよび装置を提供する。詳細には、本発明は、キャピラリー電気泳動により高分子を分離するためのシステムを提供する。このシステムは、基板に配置された少なくとも第1の壁に囲まれたキャピラリーチャネルを有する基板を含み、このチャネルは、その内壁表面に会合した正味の表面電荷を含む。上記のように、シリカ吸着性ポリマーの溶液は、キャピラリーチャネルに配置される。このシステムはまた、このキャピラリーチャネルにわたって電位勾配を印加するためのキャピラリーチャネルに電気的に結合した電力源を備える。
【0012】
(発明の詳細な説明)
本発明は、高分子種を電気泳動的に分離する方法、ならびにこのような方法の実行に有用な組成物およびシステムを提供する。詳細には、本発明の方法は、基板内で配置された少なくとも第1のキャピラリーチャネルを有する基板を提供する工程を含む。このチャネルの表面は、それに会合する第1の表面電荷を有し、そしてキャピラリー表面と同様のまたは同じ電荷である正味の電荷(例えば、正または負)を保有するポリマー溶液を吸着する水溶性表面で充填されている。
【0013】
本明細書において用いられる用語、基板(substrate)は、代表的には、キャピラリーチャネルが配置されている固体基板をいう。代表的な基板としては、シリカのようなシリカをベースとした基板(例えば、ガラス、石英など)、シリコンなど、ポリマー性基板(例えば、プラスチック様ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(TeflonTM)、および当該分野で周知の多種の他のものが挙げられる。基板は、管状の基板(例えば、ポリマーまたは石英ガラスキャピラリーなど)を含む種々の形状または形態をとり得る。しかし、好ましい局面では、基板は、カバー構成体で覆われた場合に、キャピラリーチャネルを規定する溝が作成された平面体構造を備え、また代表的には構造においては平面状である。このような平面のキャピラリーシステムの例は、1997年4月25日出願の、同一人に譲渡された同時継続米国出願08/845,754号に記載されており、本明細書において参考として援用されている。
【0014】
キャピラリーチャネルはまた、断面が任意の種々の異なる形状であり得る。この形状には、管状チャネル、長方形のチャネル、菱形のチャネル、半球状のチャネルなど、または正確さに乏しい製造技術(例えばレーザー切断)から生じ得るような他の任意の形状でさえ含まれる。代表的には、キャピラリーチャネルの形状は、用いられた基板のタイプおよび製造の方法に依存して変動する。例えば、代表的な石英ガラスキャピラリーにおいて、このキャピラリーチャネルは管状である。一方では、平面状基板を用いるシステムにおいて、チャネルは、代表的には、基板の材料およびチャネルの製造方法に依存して、菱形、長方形または半球状のいずれかの断面形状を備える。
【0015】
種々の製造技術が、微細加工されたチャネルシステムの製造のために当該分野において周知である。例えば、このような装置が半導体産業で通常見出される基板を利用する場合、そのような産業で正式に用いられる製造方法(例えば、写真平版、湿式化学エッチング、化学蒸着、スパッタリング(sputtering)、電気鋳造など)は、容易に適用可能である。同様に、ポリマー基板でこのような装置を作製する方法もまた、容易に適用可能であり、この方法には、射出成型、エンボス加工、レ−ザー切断、LIGA技術などが挙げられる。他の有用な製造技術としては、特にマイクロスケール装置の構成要素を規定する中間体のマイクロスケール構造物を提供するために用いられる、ラミネーション技術または重層化技術が挙げられる。
【0016】
代表的には、このキャピラリーチャネルは、内部横断面寸法(例えば、約1μmと約500μmとの間の幅、深さまたは直径)を有し、そしてこのようなチャネルのほとんどは、約10μm〜約200μmの範囲の横断面寸法を有する。
【0017】
特に好ましい局面では、複数の集積マイクロスケールキャピラリーチャネルを用いる平面状の微細加工された装置が用いられる。簡略にいえば、これらの平面のマイクロスケール装置は、平面基板の表面に作製された集積チャネルネットワークを使用する。第2の基板は、第1の表面に重層され、チャネルをカバーし、そしてシールし、これによってキャピラリーチャネルを規定する。
【0018】
1つ以上の分析チャネルは、複数の異なるサンプルリザーバへ分析チャネルを接続するさらなるチャネルとともにこの装置に設けられる。これらのリザーバは、通常、第2の重層された基板において配置された装置により規定され、そして位置されるため、リザーバは、装置のチャネルの液体連絡にあることになる。特定のチャネルの位置関係の多様性は、物質輸送時間、チャネル長および使用基板に関してチャネル配置を最適化するように用いられる。このようなマイクロスケールチャネルネットワークシステムの例は、1997年10月3日出願、米国特許出願第60/060,902号に詳細に記載され、そしてその全体が参考として本明細書中に援用されている。チャネル位置の1つの特定の例は、図1に例証される。操作において、サンプル物質は、1つ以上のサンプルリザーバ116〜138に置かれる。次いで、例えば、リザーバ116に配置された第1のサンプル物質は、チャネル140および112を通してそれを動電学的に輸送することによりロードされ、分離チャネル104との交差点を横切って、チャネル184を通してリザーバ186へロード/廃棄される。次いで、サンプルは、分析チャネル104を通して緩衝液リザーバ106から動電流を指向することにより注入されてリザーバ108を廃棄し、一方、この交差点でローディングチャネル112:114にサンプルを引き戻す。最初のサンプルが分析チャネル104に分離されている間、第2のサンプル(例えば、リザーバ118に配置したサンプル)は、サンプルを動電的にチャネル142および112に輸送することにより予めロードされ、そしてチャネル182を通してロード/廃棄リザーバ184へ輸送される。最初のサンプルの分離の後、次いで、第2のサンプルは、チャネル184を通じてロード/廃棄リザーバ186へ物質を輸送することにより分析チャネル104との交差点を横切ってロードされる。
【0019】
キャピラリーチャネルの内部表面は、代表的には、これと会合した電荷を有する。例えば、シリカベースの基板(例えば、ガラスまたは石英)に配置したキャピラリーチャネルの場合、チャネルの内部表面は、代表的に、それに会合した負に荷電した化学基(例えば、シラン基)を含む。同様に、ポリマー基板はまた代表的に、シリカベースの基板の場合よりもかなり低いレベルであるが、その表面でいくらかのレベルの荷電した化学基を含む。本明細書において用いられるキャピラリーの「荷電した表面」は、代表的には、チャネルにおける液体または物質の電気浸透移動度を支持する能力により特徴付けられる。詳細には、本明細書において記載されるような荷電した表面を有するチャネルは、代表的には、緩衝液が壁と接触する(例えば、それらのチャネル内に配置された)とき、この緩衝液について、少なくとも約1×10-5cm2V-1s-1の電気浸透移動度(μEO)を支持し得る(例えば、約6〜約9のpHで、約1mM〜約100mMのホウ酸ナトリウムの緩衝液)。本発明のこの目的のために、μEOは、約7〜約9のpHで、約1mM〜約10mMのホウ酸ナトリウム緩衝液の標準緩衝液に関して定義される(例えば5mMのホウ酸ナトリウム、pH7)。より通常の局面では、液体と接触している荷電した表面は、少なくとも約2×10-5cm2V-1s-1、好ましくは少なくとも約5×10-5cm2V-1s-1、そして特定の好ましい局面では、少なくとも約1×10-6cm2V-1s-1での、上記の条件下でμEOを支持し得る。
【0020】
異なる表面はまた、種々のレベルまたはタイプの荷電した基を提示するために処理され得る。このような表面処理の例は、同時継続の同一人に譲渡された1997年4月14日出願、米国特許出願第08/843,212号に詳細に記載されており、そしてすべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用されている。本発明の特に好ましい局面において、シリカ基板に配置されたキャピラリーチャネル、例えば、平板状シリカ基板または石英ガラスキャピラリーが用いられる。
【0021】
水性のシステムにおいて、荷電したキャピラリー表面を電気泳動分離に必要な電場と組み合わせる場合、電気浸透流が生じる。多くの分離、例えばタンパク質分離のために、いくらかの電気浸透流が、キャピラリーチャネルを通して、および検出器を通過してすべてのタンパク質の正味の移動を確実にするために、現実には所望される。しかし、通常、流量のレベルを正確に制御できることが所望される。一方では、核酸のキャピラリー電気泳動分離において分離の分解度を強化するため、電気浸透流を完全に抑制することが、通常所望される。さらに、この荷電した表面は、サンプル(例えば、タンパク質など)の成分の結合に関与しており、この結合は分離の有効性を減じるために非難されている。
【0022】
本発明の方法に従って、上記のキャピラリーチャネルまたはチャネルは、水溶性シリカ吸着性ポリマーの溶液で充填される。このポリマーは代表的に、キャピラリーチャネルの内壁表面と会合する電荷と同じである約0.01%と2%との間のパーセント電荷を含む。「キャピラリーチャネルの内部表面の電荷と同じである電荷」とは、ポリマーが、キャピラリーチャネルの内部表面の荷電化学基と同じ電荷(例えば、負または正)である荷電モノマーサブユニットを含むことを意味する。従って、キャピラリーチャネルは、内部表面に負に荷電した基(例えば、シリカキャピラリーチャネルにおけるシラン基)を含む場合、このポリマーは、負に荷電したモノマーサブユニットを含む。本発明に従って、このポリマーは、好ましくは、キャピラリーチャネルの内部表面の電荷と反対の電荷を有する荷電したモノマーサブユニットは全く含まない。好ましい局面では、このポリマーは、約0.01%と約1%との間の、より好ましくは、約0.01%と約0.5%との間、そしてさらにより好ましくは、約0.05%と約0.5%との間、およびしばしば約0.05%と約0.2%との間のパーセント電荷を有する。上記のように、好ましい局面では、本発明は、シリカベースの基板、例えば、平面状基板またはキャピラリーを利用する。このように、また好ましい局面では、本発明に従って用いられたポリマーは、キャピラリーチャネルの内部表面のように負に荷電している。
【0023】
本明細書において用いられるポリマーの「パーセント電荷」とは、ポリマーの合成に用いられた全モノマーサブユニットに対する荷電したモノマーユニットのモルパーセントをいう。従って、合成反応が1mmolの荷電したサブユニットおよび99mmolの荷電していないモノマーサブユニットの混合により実行される場合、このポリマーは、本明細書で規定されるように、1%のパーセント電荷を有することになる。
【0024】
本発明の水溶性ポリマーは、好ましくは表面吸着性ポリマー、そしてより好ましくはシリカ吸着性ポリマーである(例えば、その用語は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用されている米国特許第5,567,292号に規定されている)。特に好ましい表面吸着性ポリマーの例としては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメチルアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドなどのアクリルポリマーが挙げられる。これらのポリマーのそれぞれは、容易に合成され、キャピラリーの内部表面の電荷と同じ電荷を保有する荷電したモノマーサブユニット(例えば、負に荷電したサブユニット)を組込む。例えば、カルボン酸モノマーは、ポリマーに負の電荷を与えるために用いられ得る。このようなモノマーとしては、例えば、アクリル酸、ビスアクリルアミド酢酸、4,4−ビス(4−ヒドロキシフェニル)ペンタン酸、3−ブテン−1,2,3−トリカルボン酸、2−カルボキシエチルアクリラート、イタコン酸、メタクリル酸、4−ビニル安息香酸、およびその他が挙げられる。以下を含むスルホン酸またはリン酸のモノマーはまた、負の電荷を与えるために用いられ得る:例えば、2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸、2−メチル−2−プロペン−1−スルホン酸、2−プロペン−1−スルホン酸、4−スチレンスルホン酸、2−スルホエチルメタクリレート、3−スルホプロピルジメチル−3−メタクリルアミドプロピルアンモニウム内部塩、3−スルホプロピルメタクリレート、ビニルスルホン酸、ビス(2−メタクリルオキシエチル)ホスフェート、モノアクリルオキシエチルホスフェートおよびその他。正に荷電した表面を有するキャピラリーチャネルを用いるシステムの場合、正に荷電したモノマーユニットは、置換される。種々のこのようなサブユニットは、当業者に公知であり、そして例えば、2−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、3−メタクリルオキシ−2−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、およびその他のような四級アミンモノマーを含む。
【0025】
特に好ましい局面では、表面吸着性ポリマーは、ポリジメチルアクリルアミドポリマー−コ−アクリル酸である。この場合、このポリマーは、上記のように、荷電したアクリル酸モノマーを所望のパーセンテージ組込むジメチルアクリルアミドポリマーである。
【0026】
本発明の方法において用いられるポリマーの合成は、当該分野で周知である任意の数の方法で実行され得る。代表的には、合成条件およびプロトコルは、合成されるポリマーならびに組込まれる電荷の性質および量に依存して変わる。適切なポリマー合成方法の例は、例えば、Odian,Principles of Polymerization,第3版(John Wiley,new York,1991)、ならびに米国特許第5,264,101号および同第5,567,292号(これらすべては参考として本明細書において援用されている)に記載されている。
【0027】
使用のためには、このポリマーは、約0.01%と30%(w/v)との間の濃度で水溶液中に提供され得る。異なる濃度が、実行される分離の性質、キャピラリーチャネルのサイズなどに依存して用いられ得る。好ましくは、本明細書において記載された分離方法に用いられるように、このポリマー濃度は、約0.01%と約20%(w/v)との間、そしてより好ましくは約0.1%と約10%との間である。
【0028】
ポリマー溶液内のポリマーの平均分子量は、ポリマー溶液が所望される適用に依存していくらか変わり得る。例えば、より高い分解能を必要とする適用(例えば、配列決定の適用における単塩基分解)は、より高い分子量のポリマー溶液を使用し得、一方より厳密性の低い適用は、より小さい分子量のポリマー溶液を使用し得る。代表的には、本発明に従って用いられたポリマー溶液は、約1kD〜約6,000kD、好ましくは約1kDと約1000kDとの間、そしてより好ましくは約100kDと約1000kDとの間の範囲内の平均分子量を有する。
【0029】
さらに、ポリマー溶液が用いられる特定の適用に依存して、ポリマーのそれぞれのタイプの利点を利用するために、異なる分子量の組み合わせを用い得る。例えば、より高分子量のポリマーは、代表的に、より高分子についてより良い分解を提供し、一方より低分子量のポリマー溶液は、より低分子についてより良い分解を提供する。
【0030】
このように、より広範なスペクトル分離(すなわち、分離される非常に高分子および非常に低分子を有する分離)のため、用いられている分離溶液全体に、より低分子量のポリマーおよびより高分子量のポリマーの両方を組込むことはしばしば有用である。代表的には、低分子量ポリマーに対する高分子量ポリマーの比は、分離される物質に依存して変わる。しかし、一般的に、低分子量ポリマーに対する高分子量ポリマーの比は、約1:10〜約10:1、そして好ましくは約5:1〜約1:5、そしてより好ましくは約1:2〜約2:1の範囲である。代表的には、高分子量ポリマー成分は、約300kDと約1,000kDとの間、そして好ましくは約400kDと約600kDとの間の平均分子量を有する。一方で、低分子量ポリマーは、代表的には、約50kDと約300kDとの間、そして好ましくは約50kDと約200kDとの間の平均分子量を有する。分離溶液におけるポリマーの全般的なパーセンテージは、本明細書において記載された範囲内になお保持される。
【0031】
上記のパーセント電荷および分子量に加えて、本発明に従って用いられたポリマーはまた、ポリマーの粘性によって特徴付けられる。詳細には、本明細書において記載されたシステムのポリマー成分は、代表的には、約2〜約1000センチポイズ、好ましくは約5〜約200センチポイズ、そしてさらに好ましくは、約10〜約100センチポイズの範囲内で、キャピラリーチャネル内で用いられる溶液の粘性を有する。
【0032】
ポリマー成分に加えて、ポリマー溶液は、代表的には、所望の分離を達成するのに必要なものとして、pHおよび導電率を制御するための緩衝液、他のポリマーなどを含む(すなわち、ふるいわけを増強するための中性ポリマーなど)。
【0033】
操作において、水溶性の表面吸着性ポリマーの溶液がキャピラリーチャネルに導入される。この導入は、ポリマー溶液と接触してチャネルの一端に置かれることと同じく単純であり得、そしてこれはポリマーをチャネルに運ぶことを可能にする。あるいは、減圧または陽圧がポリマー溶液をキャピラリーチャネルに移動させるために用いられ得る。好ましい一体型チャネルシステムにおいて、ポリマー溶液は、代表的には、通常のキャピラリーチャネルの末端と接触して配置され(例えば、分離チャネルの末端に配置されたリザーバ)、そしてわずかな陽圧がポリマーを一体型チャネルの全体におしやるように適用される。
【0034】
分離が所望される高分子種を含むサンプルは、分離チャネルの一端に置かれ、そして電位勾配がチャネルの長さに沿って適用される。サンプル成分は、チャネルの長さに沿って、そしてそこに配置されたポリマー溶液を通じて動電的に輸送されるので、これらの成分は分解される。次いで、この分離された成分は、チャネルの長さにそった位置(代表的には、サンプルが導入された位置に遠位の分離チャネル末端の近く)で検出される。
【0035】
分離された種の検出は、代表的には、当該分野で周知のUV、電流測定のおよび/または蛍光検出システムを用いて実行される。代表的には、このような検出システムは、目的の高分子種に特有の工学的特性(例えば、二重結合構造のUV吸光度、結合した標識部分の蛍光、光散乱など)の検出により作動する。例えば、蛍光検出の場合、このような検出システムは、代表的に蛍光または種々の高分子に結合した発蛍光団標識基を用いる。例えば、核酸の場合、種々の蛍光標識化技術が用いられ得る。これらは一般的に、当該分野で周知であり、共有結合した蛍光標識基の使用を含む(例えば、その全体がすべての目的のために参考としてこれによって本明細書において援用されている米国特許第4,711,955号、同第5,171,534号、同第5,187,085号、同第5,188,934号、および同第5,366,860号に記載される)。あるいは、結合性標識基が用いられ得る。この基は、優先的に目的の高分子種と結合するか、または目的の高分子と会合した場合にのみ検出可能である(例えば、蛍光性または蛍光原性)。このような標識基の例としては、例えば、二重鎖核酸のためのインターカレート色素、ストレプトアビジン/ビオチン標識基が挙げられる。
【0036】
述べたように、本発明の好ましい局面は、蛍光検出システムを利用する。代表的には、このようなシステムは、分離された高分子種が分離チャネルを通過して輸送された場合にこの分離チャネルで光エネルギーを指向し得る光供給源を使用する。この光供給源は、代表的に適切な波長の光を生産して標識基を活性化する。次いで、標識基由来の蛍光発光は、適切な光学(例えば、キャピラリーチャネルに近接して配置された対物レンズ)により収集され、そして収集された光は、フォトダイオードまたは光電子増倍管のような分光測定検出器で方向付けられる。この検出器は、代表的には引き続く保管と分析のために検出器からデータを受け取り、そしてそのデータを記録するコンピューターに繋がれる。
【0037】
このポリマー組成物は、電気泳動の技術を用いた高分子種の分離において広範に適用可能である。このような高分子種としては、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物などが挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい局面では、本明細書で記載されたポリマー組成物は、サンプル中の核酸の電気泳動分離および/または同定に用いられる。このような核酸は、例えば、遺伝子型決定のためには染色体DNAのフラグメントまたは1部分、例えば遺伝子発現分析のためにはmRNAのフラグメントまたは1部分、または増幅工程の確認のための重合反応産物を含み得る。さらに、このようなポリマー組成物は、ヌクレオチド配列の決定のために、核酸フラグメントまたは合成産物のネスト状のセット(nested set)(例えば、SangerまたはMaxamおよびGilbertの配列決定操作で調製される)の分離において特に有用である。これらの配列決定操作において、フラグメントのネスト状セットは、代表的には、単一のヌクレオチドで次のフラグメントと長さの異なる(例えば、単塩基伸長)目的の核酸配列のフラグメントを多数含む。次いで、これらのネスト状セットにおけるフラグメントは、サイズにより分離され(例えば、キャピラリー電気泳動の操作において)、そしてその末端ヌクレオチドにより特徴付けられる。次いで、ネスト状フラグメントのすべての分析は、目的配列のヌクレオチド配列を提供する。好ましい配列決定操作の例は、例えば、すでに参考として援用された米国特許第5,171,534号に記載さている(これは、Sangerの配列決定操作において、4つの異なる標識ジデオキシヌクレオチドを用いる)。それぞれの標識ジデオキシヌクレオチドは、異なる蛍光発光または吸収極大を有する。目標テンプレート依存性の重合の間、4つのジデオキシヌクレオチドのそれぞれのランダムな組込みは、すべての可能な伸長産物を含んだフラグメントのネスト状のセットを生じ、ここでそれぞれの伸長産物は、その末端ジデオキシヌクレオチドにより異なって標識される。異なる標識は、単回の検出操作における末端ヌクレオチドの特徴づけ、および引き続いて、標的核酸の全体的な配列の決定を可能にする。
【0038】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに例示される。
【0039】
(実施例)
(I.ポリマー合成)
以下のプロトコールに従ってポリマー溶液を調製した:
(A.)ポリジメチルアクリルアミドの2−メチル−1−プロパノール重合。
【0040】
25mlの枝つきフラスコに6mlの2−メチル−1−プロパノールおよび3mlのN,N−ジメチルアクリルアミドを添加した。このフラスコに、穴を通してフラスコの底まで供給されるアルゴンガスラインを有する一穴ゴム栓をはめ込んだ。このフラスコの枝は開放したままにした。アルゴンの定常流を、フラスコ中の溶液を通じて10分間、バブリングした。10分間のバブリング時間の後、このフラスコに3ミリグラムを超える2,2’アゾビスイソブチロニトリルを添加した。このフラスコを60℃の水浴中に入れ、アルゴンガスのバブリングを継続した。1時間後、このフラスコを周囲の温度に冷却した。ここでフラスコ中の溶液は粘性の液体になり、これは重合化が起こったことを示す。ポリマーの精製は、これを一連の沈殿および溶解に供することにより達成した。このポリマーを、ヘキサンの100ml中で析出させた。このヘキサンを注ぎ出し、そしてこのポリマー沈殿物を約50mlの塩化メチレンに溶解した。次いで、この溶液を再度、ヘキサンで析出させ、そして塩化メチレンに再溶解した。最後のヘキサン沈殿の後、精製したポリマーを48時間、真空乾燥した。次いで、これをPolymer#1とラベルしたガラスバイアルに貯蔵した。
【0041】
(B.)ポリジメチルアクリルアミド/アクリル酸の2−メチル−1−プロパノール重合(99.9/0.1)
25ml枝付きフラスコに、6mlの2−メチル−1−プロパノール、3mlのN,N−ジメチルアクリルアミドおよび0.0054mlのアクリル酸を添加した。このフラスコに、フラスコの底まで、穴を通して供給されるアルゴンガスラインを有する一穴ゴム栓をはめ込んだ。このフラスコの枝は開放したままにした。アルゴンの定常流を、フラスコ中の溶液を通じて10分間、バブリングした。10分間のバブリング時間の後、このフラスコに3ミリグラムを超える2,2’アゾビスイソブチロニトリルを添加した。このフラスコを60℃の水浴中に入れ、アルゴンガスのバブリングを継続した。1時間後、このフラスコを周囲の温度に冷却した。ここで、フラスコ中の溶液は粘性液体になり、これは重合が起こったことを示す。ポリマーの精製は、これを一連の沈殿および溶解に供することにより達成した。このポリマーを、100mlのヘキサン中に析出させた。このヘキサンを注ぎ出し、そしてこのポリマー沈殿物を約50mlの塩化メチレンに溶解した。次いで、この溶液を再度、ヘキサンで析出し、そして塩化メチレンに再溶解した。最後のヘキサン沈殿の後、精製したポリマーを48時間、真空乾燥した。次いで、これをPolymer#2とラベルしたガラスバイアルに貯蔵した。
【0042】
(C.)中程度の分子量のポリジメチルアクリルアミド/アクリル酸の水性重合(99.9/0.1)。
【0043】
25mlの枝つきフラスコに、4.0mlのメタノール、5.0mLの脱イオン水、1.0mLのN,N−ジメチルアクリルアミドおよび0.0018mlのアクリル酸を添加した。このフラスコに、穴を通してフラスコの底まで供給されるアルゴンガスラインを有する一穴ゴム栓をはめ込んだ。このフラスコの枝は開放したままにした。アルゴンの定常流を、フラスコ中の溶液を通じて10分間、バブリングした。過硫酸アンモニウムの10パーセント溶液を脱イオン水で作製した。10分間のバブリング時間の後、200μlを超える過硫酸アンモニウム溶液をこのフラスコに添加した。このフラスコを50℃の水浴中に入れ、アルゴンガスのバブリングを継続した。45分後、このフラスコを周囲の温度に冷却した。ここで、フラスコ中の溶液は粘性の液体になり、これは重合が起こったことを示す。この溶液を10kDの透析チューブ(Spectrum Technologies,part number 132680)に移した。このロードしたチューブを1000mlの脱イオン水中に置き、24時間攪拌した。この水を、新鮮な脱イオン水と交換し、そしてさらに24時間攪拌した。この第2の24時間が終了した後、透析バッグを水から取り出し、内容物をプラスチックトレイに注ぎ出した。このポリマー溶液を含むトレイを、60℃のオーブンに4時間置き、乾燥させた。次いで、このトレイをオーブンから取り出し、薄い透明なポリジメチルアクリルアミド/アクリル酸(99.9/0.1)のフィルムをトレイからはがし、保管のためにガラスバイアルに置き、そしてPolymer#3とラベルした。
【0044】
(D.)高分子量のポリジメチルアクリルアミド/アクリル酸の水性重合(99.9/0.1)
25mlの枝付きフラスコに、8.0mlの脱イオン水、2.0mlのN,N−ジメタクリルアミドおよび0.0018mlのアクリル酸を添加した。このフラスコに、穴を通してフラスコの底まで供給されるへアルゴンガスラインを有する一穴ゴム栓をはめ込んだ。このフラスコの枝は開放したままにした。アルゴンの定常流を、フラスコ中の溶液を通じて10分間、バブリングした。過硫酸アンモニウムの10パーセント溶液を脱イオン水で作製した。10分間のバブリング時間の後、200μlを超える過硫酸アンモニウムをこのフラスコに添加した。このフラスコを50℃の水浴中に入れ、アルゴンガスのバブリングを継続した。45分後、このフラスコを周囲の温度に冷却した。ここで、フラスコ中の溶液は、軟性のゲル様物質となり、これは重合が起こったことを示す。このポリマーを30mlの脱イオン水で希釈し、次いで、この溶液の10mlを10kDの透析チューブ(Spectrum Technologies,part number 132680)に移した。このロードしたチューブを1000mlの脱イオン水中に置き、24時間攪拌した。この水を、新鮮な脱イオン水と交換し、そしてさらに24時間攪拌した。この第2の24時間が終了した後、透析バッグを水から取り出し、内容物をプラスチックトレイに注ぎ出した。このポリマー溶液を含むトレイを、60℃のオーブンに4時間置き、乾燥させた。次いで、このトレイをオーブンから取り出し、次いで薄い透明なポリジメチルアクリルアミド/アクリル酸のフィルム(99.9/0.1)をトレイからはがし、保管のためにガラスバイアルに入れ、そしてPolymer#4とラベルした。
【0045】
(E.)ポリマーの粘性測定
上記のように調製された種々のポリマーの粘性を、Ubberholde粘度計(Technical Glass Products,Dover NJ)次いでASTM D445試験法を用いて20℃で測定した。それぞれのポリマーを、以下の実施例での電気泳動分離のために用いられる濃度(重量/容量)まで水と混合した。粘度を以下、表1に提供する:
【0046】
【表1】
(II)電気泳動分離
上記のように合成されたポリマーを用いて、それらの効力を実証するために、以下のように、マイクロスケール組込みチャネル装置の標準核酸サンプルの分離を実行した。
【0047】
(A.)コントロールPolymer#1での100bpのラダーの分離
中性のコントロールポリマー(Polymer#1)の6.5%溶液を、10%(w/v)の濃度で水中にこのポリマーを溶解することにより調製した。次いで、分離で用いるためのポリマー溶液を0.65mlのポリマー溶液、0.2mlのGenetic Analysis Buffer(Perkin−Elmer,Norwalk CT)、および0.15mlの蒸留水の混合により作製した。インターカレートする色素(Syto 61,Molecular Probes,Inc.)を1:2500の比でポリマー溶液に添加した。サンプル緩衝液を8mlの蒸留水および4μlのSyto 61TMに、2mlのGenetic Analysis Bufferを添加することにより調製した。
【0048】
実験的な分離を、100bpのラダー(Promega)で実行した。これには100bpごとの増分で、100〜1000bpの長さの範囲の核酸フラグメントを含み、また1500bpフラグメントを含む。このサンプルを、Syto61TMを含むサンプル緩衝液に保存ラダー溶液を1:10に希釈することにより調製した。
【0049】
サンプルの分離を複数サンプルマイクロスケールキャピラリー電気泳動装置で実行した。ここでは、複数のサンプルは共通の分離キャピラリーチャネルに沿って連続的に分離される。この装置は平面状ガラスチップ構造を用い、ここでこのチャネルは、第1の平面状ガラス基板に溝として刻まれ、そして第2のガラス基板は、第1の基板に重ねられて合わせられ、このチャネルを規定する。この組込まれたチャネル装置は、図1に示されるチャネルの形状を有し、これは同じ分離チャネルに沿って12までのサンプルの連続分析を可能にする。
【0050】
この装置のチャネルを、ポリマーを1つの共通リザーバに導入し、そしてこのポリマー溶液を内部連結したチャネルすべてに運ばせることによってPolymer#1で充填した。装置中の9つのサンプルウェルを、ラダーDNAを含むサンプル緩衝液で充填し、一方3つのウェルをプレーンなサンプル緩衝液(DNAなし)で充填した。この分離を電流制御のもとで作動する電気的コントローラーを用いて装置内で泳動した。分離種を、分離チャネルに沿って1点に方向付けられる赤色レーザーダイオードを用いて蛍光発光させ、そして蛍光を、対物レンズにより収集し、そして検出のために光電子増倍管に送信した。シグナルを保持時間の関数としてPCに記録した。中性のポリマー溶液を用いて得られた分離データ(例えば、荷電していないポリジメチルアクリルアミドポリマー溶液)を、保持時間(秒)の関数としての蛍光強度のプロットとして(任意の単位で)図2に示す。詳細には、図2は、3つの反復実験の分離(サンプルB1、B3およびB4)およびDNAが導入されていないコントロール泳動(サンプルB2)における100bpラダーの分離を例証する。9つの反復実験の分離および3つのコントロール泳動の全てを実行した。そしてそれぞれの分離からのデータは図2に示すデータと実質的に同一であった。
【0051】
(B.Polymer#2での100bpラダーの分離)
負に荷電したポリマー(Polymer#2)の溶液を、上記、実施例IIAの、Polymer#1と同じ方法で調製した。このポリマー溶液を再度用い、同一の電気的コントロールのもとで、同一の複数サンプル装置で、同様に調製し核酸の分離を実施した。
【0052】
図3は同一の分離でPolymer#2を用いて獲得されたデータ(サンプルB1、B3およびB4)およびコントロール(サンプルB2)を例証する。再び、10の反復実験の分離および2つのコントロールの泳動の全てを実行した。そしてそれぞれの場合におけるデータは示されたデータと実質的に同一であった。
【0053】
(C.Polymer#3での100bpラダーの分離)
Polymer#3の2.0%溶液を、20mlガラスバイアルに、0.20gのPolymer3、2.0gのGenetic Analysis Bufferおよび7.80gの水を添加することにより調製した。次いで、この混合物を1時間攪拌し、0.2ミクロンフィルターに通した。インターカレート色素(Syto 61、Molecular Probes、Eugene OR)を、1:2500の比で溶液に添加した。サンプル緩衝液を8mlの脱イオン水および4μlのSyto 61に2mlのGene Scan bufferを添加することにより調製した。100bpのラダーの分離を再度、上記と同一の条件下および同一のシステム使用で実行した。代表的な分離を図4に示す。図4に見られるように、ラダーの11のフラグメントすべてを90秒より短い時間で分離した。
【0054】
(D.Polymer#4での100bpラダーの分離)
Polymer4の1.8%溶液を、20mlガラスバイアルに、0.18gのPolymer 4、2.0gのGenetic Analysis Bufferおよび7.82gの水を添加することにより調製した。次いで、この混合物を1時間攪拌し、0.2ミクロンフィルターに通した。インターカレート色素(Syto 61、Molecular Probes、Eugene OR)を、1:2500の比で溶液に添加した。サンプル緩衝液を8mlの脱イオン水および4μlのSyto 61に2mlのGene Scan bufferを添加することにより調製した。再度、Polymer#4を用いた代表的な分離を図5に示す。ここで、11のフラグメントすべてを再度、90秒より短い時間ではっきりと分離した。
【0055】
上記の実施例から見られ得るように、負に荷電したポリマー溶液(Polymer#2、#3および#4)は、繰り返しの泳動において、核酸フラグメントの非常に高い解像の分離を提供する。これらの分離は同等であり、ある場合には、中性のポリマー溶液(Polymer#1)を用いてより良い分離が得られる。
【0056】
(E.中性および負に荷電したポリマー溶液中の電気浸透流の比較)
電気浸透流のレベルをまた、中性および荷電したポリマー溶液(それぞれ、Polymer#1および#2)について決定した。ローダミンB(電気浸透流の中性蛍光インディケーター)を、100bpラダーのかわりに、1μMの濃度でサンプル緩衝液に添加したことを除いて、上記と同じプロトコールをこの測定に用いた。350mV/cmの電場をローダミンBを含むサンプルウェルにアプライし、そしてこの進行を蛍光検出顕微鏡で視覚的にモニターした。中性の荷電していないポリマー溶液については、8.0×10-6cm2V-1s-1の電気浸透流が測定され、負に荷電したポリマー溶液については、4.2×10-6cm2V-1s-1の電気浸透流速が測定された。従って、電気浸透流により適切な減少を提供することに加えて、驚くべきことに、負に荷電したポリマーは、実行された実験において中性に荷電したポリマーにわたる電気泳動流のより大きい低下を生じた。いずれの事象においても、両方の値は、コートされていないシリカキャピラリーにわたり電気浸透流の約20倍の減少を示した。
【0057】
(F.平面状ポリマー基板での高分子分離)
(1.プラスチックの平面状キャピラリー構造の製造)
平面状キャピラリーチャネル構造のレイアウトを図6に示す。最初の製造工程は、チャネルプレートを作製するためにエキシマレーザーでキャピラリーを、鋳型ポリメチルメタクリレートの0.2×3.7×2.2cmの切片にレーザー切断することである。レーザー切断されたチャネルを、12.5ミクロンの深さ、および85ミクロンの幅で測定した。チャネルプレートと同じ外部寸法を有するトッププレート(ただしこれはチャネルプレート上にチャネルが終結する場所で整列されたプレートを通じて穴をあけられた0.25cmの孔を有する)もまた製造した。2つのプレートを一緒にサンドイッチし、次いで10キログラムの重量を適用し、さらに2時間、92℃までこのアセンブリを熱することにより結合した。次いでこの重量を除き、この部分を周囲温度まで冷却した。
【0058】
(2.プラスチックの平面状キャピラリーでのPolymer#3による電気浸透流の抑制)
最初に、構築物溶液の電気浸透流をコントロールとして緩衝液を用いて測定した。Genetic Analysis Buffer(Perkin−Elmer)を測定に用いた。これを1mlの10×緩衝液濃縮物と9mlの脱イオン水を混合することにより調製した。中性の色素であるBodipy−Fluorescein(Molecular Probe)を緩衝液のアリコートに添加し、電気浸透流のマーカーとして用いた。このプラスチックキャピラリー構造物を最初に、緩衝液溶液で充填した。次いで、ウェルの1つを中性の色素を含む緩衝液溶液で充填した。この構築物を実施例Eに記載された顕微鏡システムで作動し、そして色素の移動を視覚的に追跡した。電気浸透流は2.26×10-4cm2/sec−Vと測定された。
【0059】
次いで、電気浸透流をGenetic Analysis Buffer中のPolymer#3の2.0%溶液で測定した。この溶液をSyto 61を添加しなかったこと以外は上記のように調製した。先に記載したポリマー基板をポリマー溶液で充填した。1つのウェルをBodipy Fluorescin 緩衝液溶液で充填した。電場を印加し、色素の移動の速度を視覚的に測定した。次いで、この電場を逆にし、色素の移動の速度を視覚的に測定した。この逆転した電場では、色素は反対方向に同じ速度で移動した。この電気浸透流は、2.54×10-6cm2/sec−V、つまり緩衝液コントロールにおいて20倍低い因子であると計算された。
【0060】
(3.分離基質としてPolymer#3を用いるポリマー装置におけるDNA分離)
緩衝液およびDNAサンプルのすべてを、上記のように調製した。用いたこのマイクロスケールチャネル装置を上記F1に記載した。この装置を、3mW赤色固体レーザー(Coherent)を装備した蛍光検出顕微鏡システムで泳動した。印加された電場は、注入から検出ポイントまで1.8cmの分離長で210v/cmである。この分離は、図7に例証しており、これからラダー中の11のフラグメントが識別可能なことを確認し得る。
【0061】
(III.混合ポリマーの分離)
ポリジメチルアクリルアミド/コアクリル酸ポリマーの2つの異なる溶液をPolyscience,Inc.から入手した。それぞれのポリマー溶液は、負の電荷(0.1%)に調製された同じレベルを有した。この第一のポリマー溶液は約100kDの平均分子量を有する低分子量ポリマーであった。第二のポリマー溶液は、約500kDの平均分子量を有するより高分子量のポリマー溶液であった。
【0062】
第一の分離を高分子量ポリマーのみを用いて、50塩基対と100塩基対との間のフラグメントのDNA標準ラダーで実行した。分離の条件は、実質的に前記載と同様である。図8Aは、総ポリマー0.8%でこの高分子量ポリマー溶液のみを用いた種々のフラグメントの分離のクロマトグラムを示す。見られ得るように、たとえピークが良好に分離されても、最も小さいフラグメント(最も左)が緊密に一緒に集められている、すなわちあまり分離されない。これらの結果はまた、1%および1.2%の総ポリマーでも見られた。
【0063】
第二の実験において、同じDNA標準ラダーを低分子量および高分子量ポリマーの混合物を用いて分離した。詳細には、高分子量ポリマー(0.8%)と低分子量ポリマー(0.5%)の混合物を調製した(総ポリマー濃度1.3%)。DNAラダーの分離についてのクロマトグラムを図8Bに示す。このクロマトグラムから理解され得るように、混合されたポリマー溶液は、より低い分子量の種(例えば、50および100塩基対フラグメント)のよりよい分離を提供する。分離におけるマイナーな損失が、高分子量フラグメントに見られたが、この損失は最小限であった。
【0064】
本発明を、明瞭さおよび理解の目的のためにある程度詳細に記載したが、形態および詳細における種々の変化が本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得るということは、本開示を読めば当業者には、明白となる。本出願に引用されたすべての刊行物および特許資料は、それぞれの個々の刊行物または特許資料が個々に示されるように、同じ範囲へのすべての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、本発明に従った、12までの異なるサンプル材料のためのサンプル成分の電気泳動分離における使用のためのシリカマイクロスケール電気泳動装置を概略的に例証する。
【図2A】 図2Aは、最初に中性のポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型チャネル電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図2B】 図2Bは、最初に中性のポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型チャネル電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図2C】 図2Cは、最初に中性のポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型チャネル電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図2D】 図2Dは、最初に中性のポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型チャネル電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図3A】 図3Aは、最初にポリマー溶液に関する負の電荷を有するポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図3B】 図3Bは、最初にポリマー溶液に関する負の電荷を有するポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図3C】 図3Cは、最初にポリマー溶液に関する負の電荷を有するポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図3D】 図3Dは、最初にポリマー溶液に関する負の電荷を有するポリマー溶液で充填されたシリカマイクロスケール組み込み型電気泳動装置中のDNA標準サンプルのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図4】 図4は、図3のようにクロマトグラフィー分離を例証する。ただし、図3に示すクロマトグラムの作成において用いられたポリマー溶液より大きい平均分子量および粘性を有する荷電ポリマーを用いている。
【図5】 図5は、図4のようにクロマトグラフィー分離を例証する。ただし、図4に示すクロマトグラムの作成において用いられたポリマーよりさらに大きい平均分子量および粘性を有するポリマー溶液を用いている。
【図6】 図6は、本発明に従って高分子の分離を実行するために用いた平面ポリマー基板/マイクロスケールのチャネル装置のためのチャネルの相対的位置を例証する。
【図7】 図7は、本発明のポリマーを用いるポリメチルメタクリレート微小流量装置における100bpラダーのクロマトグラフィー分離を例証する。
【図8】 図8Aおよび図8Bは、単に大きい分子量でのふるいわけポリマー(図8A)または高分子量および低分子量の混合物ふるいわけポリマー(図8B)で実行した分離を比較したクロマトグラムを示す
Claims (52)
- キャピラリー電気泳動により高分子を分離する方法であって、以下の工程を包含する、方法:
その中に配置した少なくとも第1のキャピラリーチャネルを備える基板を提供する工程であって、ここで該チャネルの表面は、それと会合した第1の表面電荷を有する工程;
該キャピラリーチャネルを、水溶性の親水性ポリマー溶液の産生に使用した全てのモノマーに対する荷電したモノマーサブユニットのモルパーセントにより計算して0.01%〜2%のパーセント電荷を有する該水溶性の親水性ポリマー溶液で充填する工程であって、ここで、該荷電したモノマーサブユニットは、第1の表面電荷と同じ電荷を有するモノマーサブユニットからなる、工程;
該キャピラリーチャネルの一端に高分子を含むサンプルを導入する、工程、および;
キャピラリーチャネルの長さを横切って電位の勾配を印加する工程であって、ここで該サンプル中の該高分子が該キャピラリーチャネル内で分離される工程。 - 前記提供する工程で提供された前記基板が、負の第1の表面電荷を含み、かつ前記の充填工程における前記荷電したモノマーサブユニットは、負に荷電したモノマーサブユニットからなる、請求項1に記載の方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで前記負に荷電したモノマーサブユニットは、アクリル酸、ビスアクリルアミド酢酸、4,4−ビス(4−ヒドロキシフェニル)ペンタン酸、3−ブテン−1,2,3−トリカルボン酸、2−カルボキシエチルアクリラート、イタコン酸、メタクリル酸、4−ビニル安息香酸、スルホン酸、2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸、2−メチル−2−プロペン−1−スルホン酸、2−プロペン−1−スルホン酸、4−スチレンスルホン酸、2−スルホエチルメタクリレート、3−スルホプロピルジメチル−3−メタクリルアミドプロピルアンモニウム内部塩、3−スルホプロピルメタクリレート、ビニルスルホン酸、ビス(2−メタクリルオキシエチル)ホスフェート、およびモノアクリルオキシエチルホスフェートから選択される、方法。
- 前記の提供工程で提供された基板がシリカベースの基板である、請求項1に記載の方法。
- 前記の提供工程で提供された基板が固体ポリマー性基板を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記の固体ポリマー性基板がポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレンの群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記の提供工程で提供された基板がシリカ基板を含み、そして前記充填工程におけるポリマーがポリジメチルアクリルアミド−コ−アクリル酸を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記サンプルが複数の異なる核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記異なる核酸が標的核酸配列の複数の異なるフラグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記異なる核酸が標的核酸配列のフラグメントのネスト状セットを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記フラグメントのネスト状セットにおけるそれぞれのフラグメントがフラグメントの末端での単一のヌクレオチドの付加または脱落により、該ネスト状セット中の少なくとも1つの他のフラグメントと異なっている、請求項10に記載の方法。
- 前記提供工程において提供されたキャピラリーチャネルが前記基板内に配置された少なくとも第2のキャピラリーチャネルを横切りそして液体連絡している、請求項1に記載の方法。
- 前記提供工程において提供されたキャピラリーチャネルが基板内に配置された少なくとも第2および第3のキャピラリーチャネルを横切りそして液体的連絡している、請求項1に記載の方法。
- 請求項13に記載の方法であって、ここで前記印加工程は、同時に、前記サンプルを前記第2のチャネルから前記第1のチャネルへ移動するため、および該第1のチャネルで該サンプル中の高分子を分離するために、該第1のキャピラリチャネルおよび第2のキャピラリーチャネルのそれぞれを横切る電位勾配を印加する工程を包含する、方法。
- 前記印加工程が同時に、前記第1、第2および第3のキャピラリーチャネルのそれぞれを横切る電位勾配を印加する工程を包含する、請求項13に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液におけるポリマーが0.01%と1%との間の正味の電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液におけるポリマーが0.01%と0.5%との間の正味の電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液におけるポリマーが0.05%と0.2%との間の正味の電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液が0.01%と20%(w/v)との間のポリマー濃度を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液が0.1%と10%(w/v)との間のポリマー濃度を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液が2センチポイズと1000センチポイズとの間の粘性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液が5センチポイズから200センチポイズの範囲内の粘性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマー溶液が10センチポイズから100センチポイズの範囲内の粘性を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーが1kDから5,000kDの分子量を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリジメチルアクリルアミドポリマーであり、そして前記荷電したモノマーがアクリル酸である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記ポリマーは、低分子量ポリマーおよび高分子量ポリマーの混合物を含み、該低分子量ポリマーは、50kDと300kDとの間の分子量を有し、そして該高分子量ポリマーは、300kDと1,000kDとの間の平均分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記ポリマーは、低分子量ポリマーおよび高分子量ポリマーの混合物を含み、該低分子量ポリマーは、50kDと200kDとの間の分子量を有し、そして該高分子量ポリマーは、400kDと600kDとの間の平均分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記低分子量ポリマーおよび高分子量ポリマーの混合物が1:10と10:1との間の低分子量ポリマーと高分子量ポリマーの割合を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記低分子量ポリマーおよび高分子量ポリマーの混合物が1:5と5:1との間の低分子量ポリマーと高分子量ポリマーの割合を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記低分子量ポリマーおよび高分子量ポリマーの混合物が1:2と2:1との間の低分子量ポリマーと高分子量ポリマーの割合を含む、請求項26に記載の方法。
- キャピラリー電気泳動により高分子を分離するための、以下を含むシステム:
その中に配置された少なくとも第1の壁に囲まれたキャピラリーチャネルを有する基板 であって、ここで該チャネルは、該チャネルの内部表面に会合した正味の表面電荷を有する基板;
該キャピラリーチャネルに配置されたシリカ吸着性ポリマーの溶液であって、以下を含む該ポリマーの溶液:
1kDと5,000kDとの間の分子量;
水溶性の親水性ポリマーである該シリカ吸着性ポリマーの溶液の産生に使用した全てのモノマーに対する荷電したモノマーサブユニットのモルパーセントにより計算して0.01%〜2%のパーセント電荷として表される正味の電荷であって、該正味の電荷は該正味の表面電荷と同じである電荷;および
該キャピラリーチャネルを横切って電位勾配を印加するために該第1のキャピラリーチャネルと電気的に連結した電力供給源。 - 前記キャピラリーチャネルの内部表面に会合した前記正味の表面電荷が負である、請求項31に記載のシステム。
- 前記基板がシリカ基板である、請求項32に記載のシステム。
- 前記基板がシリカキャピラリーチューブおよびエッチングされた平面状シリカ基板から選択される、請求項35に記載のシステム。
- 前記基板が固体ポリマー性基板を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記固体のポリマー性基板がポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレンの群から選択される、請求項35に記載のシステム。
- 前記基板が、該基板に配置された少なくとも第2の壁に囲まれたキャピラリーチャネルをさらに含み、該第2の壁に囲まれたキャピラリーチャネルが、前記第1の壁に囲まれたキャピラリーチャネルを横切っており、そして液体連絡されている、請求項31に記載のシステム。
- 前記電力供給源が前記第1および第2のキャピラリーチャネルのそれぞれと電気的に結合し、該電力供給が、同時に該第1および第2のキャピラリーチャネルのそれぞれの長さを横切って電位勾配を印加する、請求項37に記載のシステム。
- 前記ポリマーが0.01%と1%との間の正味の電荷を有する、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマーが0.01%と0.5%との間の正味の電荷を有する、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマーが0.05%と0.2%との間の正味の電荷を有する、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマー溶液が0.01%〜20%(w/v)の範囲内のポリマー濃度を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマー溶液が0.1%〜10%(w/v)の範囲内のポリマー濃度を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマー溶液が2センチポイズと1000センチポイズとの間の粘性を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマー溶液が5センチポイズ〜200センチポイズの範囲内の粘性を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマー溶液が10センチポイズ〜100センチポイズの範囲内の粘性を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマーがアクリルポリマーであり、そして前記荷電したモノマーサブユニットがアクリル酸、ビスアクリルアミド酢酸、4,4−ビス(4−ヒドロキシフェニル)ペンタン酸、3−ブテン−1,2,3−トリカルボン酸、2−カルボキシエチルアクリラート、イタコン酸、メタクリル酸、4−ビニル安息香酸、スルホン酸、2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸、2−メチル−2−プロペン−1 −スルホン酸、2−プロペン−1−スルホン酸、4−スチレンスルホン酸、2−スルホエチルメタクリレート、3−スルホプロピルジメチル−3−メタクリルアミドプロピルアンモニウム内部塩、3−スルホプロピルメタクリレート、ビニルスルホン酸、ビス(2−メタクリルオキシエチル)ホスフェート、およびモノアクリルオキシエチルホスフェートから選択される、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマーが、ポリジメチルアクリルアミド−コ−アクリル酸を含む、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマーが正味の負の電荷を有する、請求項31に記載のシステム。
- 前記ポリマーが、アクリル酸の存在下でジメチルアクリルアミドモノマーを重合体化するプロセスにより作製され、該アクリル酸は全モノマー濃度の0.01%と2%との間の濃度で存在する、請求項31に記載のシステム。
- 前記第1の正味の表面電荷が、前記壁に囲まれたキャピラリーチャネルに配置され、7〜9のpHで、1mM〜10mMのホウ酸ナトリウム緩衝液を含む緩衝液の電気浸透移動度を支持し得、該電気浸透移動度が少なくとも約1×10 -5 cm 2 V -1 s -1 である、請求項31に記載のシステム。
- キャピラリー電気泳動により高分子を分離するための、以下を包含する壁に囲まれたキャピラリー:
固体基板に配置されたキャピラリーチャネルであって、ここで該キャピラリーチャネルの内部表面は、それと会合する第1の正味の表面電荷を有する、キャピラリーチャネル;および
該キャピラリーチャネルに配置されたシリカ吸着性ポリマー溶液であって、以下を含む該ポリマー溶液:
1kDと5,000kDとの間の分子量;
水溶性の親水性ポリマーである該シリカ吸着性ポリマーの溶液の産生に使用した全てのモノマーに対する荷電したモノマーサブユニットのモルパーセントにより計算して0.01%〜2%のパーセント電荷で表される正味の電荷であって、該正味の電荷は第1の正味の表面電荷と同じである。
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