ES2317016T3 - Reduccion de la interferencia en uin ensayo de desplazamiento por migracion. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de detección o identificación de un analito de interés en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito para formar de este modo un complejo del analito y el uno o más conjugados; (ii) separar el complejo de cualquier conjugado no unido en presencia de un polímero cargado usando un canal de separación en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 µm; y (iii) detectar el complejo para identificar la presencia del analito o para determinar la cantidad del analito en la muestra, donde la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del analito por unión para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de los componentes de muestra que tienen una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.

Description

Reducción de la interferencia en un ensayo de desplazamiento por migración.
Campo de la invención
Esta invención está en el campo de procedimientos y composiciones para reducir la interferencia en ensayos de cambio de migración. La presente invención proporciona polímeros cargados para bloquear constituyentes de una muestra que interfieren en un ensayo de cambio de migración y los correspondientes procedimientos de uso de estos polímeros para reducir la interferencia. Esta invención también está en el campo de procedimientos para concentrar mucho una muestra en un dispositivo microfluido. La presente invención también proporciona, por ejemplo, moléculas transportadoras cargadas y procedimientos que usan dichas moléculas para concentrar la muestra.
Antecedentes de la invención
Los ensayos de cambio de migración son procedimientos útiles para detectar y cuantificar asociaciones entre biomoléculas. Un cambio en el tiempo de retención de una molécula en un ensayo electroforético o cromatográfico, por ejemplo, puede indicar la presencia de una molécula de unión. La unión puede ser específica, tal como en el caso de interacciones anticuerpo-antígeno, o inespecífica, tal como la atracción iónica de una molécula cargada positivamente con un polímero cargado negativamente. La interferencia de interacciones inespecíficas de constituyentes de muestra en un ensayo de cambio de migración debería minimizarse para evitar la desviación de los resultados de
ensayo.
El análisis de cambio de migración en medios de separación puede adoptar muchas formas. Por ejemplo, puede observarse un cambio en el tiempo de retención de un ácido nucleico libre mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) cuando está unido a una proteína. La resina de SEC puede incluir poros lo bastante grandes para que se introduzca el ácido nucleico libre, pero demasiado pequeños para que se introduzca la pareja de ácido nucleico/proteína. La pareja de ácido nucleico/proteína fluye rápidamente en el volumen alrededor de la resina de SEC, mientras que el ácido nucleico libre fluye más lentamente a través del volumen total dentro y fuera de la resina. Existe un "cambio" en el tiempo de retención entre el ácido nucleico libre y la pareja de ácido nucleico/proteína. Además, puede interpretarse el tamaño de un pico de ácido nucleico/proteína detectado para cuantificar la cantidad de la proteína en la muestra original. La presencia de un constituyente de muestra interferente puede invalidar los resultados de un ensayo de detección de cambio o cuantitativo.
En otro ejemplo de análisis de cambio de migración, un ácido nucleico libre y una pareja de ácido nucleico/proteína pueden separarse por electroforesis capilar (CE) a través de un medio de separación de un polímero o gel de tamizado que restringe la migración de moléculas de gran tamaño, pero permite un flujo más libre de moléculas pequeñas. En la CE, se genera un flujo de tampón electroosmótico mediante una corriente eléctrica directa a través de un tubo capilar. Cuando se aplica una corriente, los iones cargados positivamente y sus moléculas de agua de solvatación asociadas migran hacia el cátodo, generando un flujo electroosmótico. Una muestra puede transportarse por este flujo a través de un medio de separación de polímero de tamizado en la luz de un tubo capilar para separar moléculas de muestra por tamaño para la detección de un cambio de migración. La pareja de ácido nucleico/proteína de mayor tamaño se enredará y se obstaculizará más su movimiento que el del ácido nucleico libre y, por lo tanto, abandonará el medio más tarde. Un detector de fluorescencia o absorbancia, por ejemplo, puede controlar la elución desde el tubo capilar para detectar picos medidos en el tiempo que pueden representarse en una gráfica para medir la diferencia de tiempo o "cambio de migración" entre la elución del ácido nucleico libre y la pareja de ácido nucleico/proteína.
Recientemente, se han realizado avances significativos en la aplicación de tecnologías basadas en microfluidos que utilizan dispositivos de canales a escala microscópica en diversos campos, por ejemplo, análisis de ADN, ARN, proteínas y metabolitos. Las ventajas de dichas tecnologías de microfluidos incluyen la reducción del volumen de reactivo, una mayor resolución, un tiempo de funcionamiento más corto y un manejo de la solución más sencillo.
Surge un problema con algunas muestras complejas, tales como muestras procedentes de un cuerpo humano, tales como sangre o lisados celulares, que pueden contener constituyentes interferentes que se unen inespecíficamente a componentes de ensayo. Por ejemplo, cuando la interacción de unión específica de interés es la unión de un factor de transcripción con una secuencia de ADN diana específica, un constituyente de muestra de unión inespecífica puede interferir con la detección de la medición del cambio de migración. El constituyente interferente puede unirse al ADN diana, dando como resultado un complejo insoluble que no migrará en el medio de separación. El constituyente interferente puede generar picos de fondo de gran interferencia o falsos positivos por unión al ADN diana. En cualquier caso, la unión inespecífica del ADN diana puede reducir la sensibilidad y/o exactitud del análisis de cambio de migración.
La unión inespecífica ha supuesto un problema en estudios de proteínas de unión a ADN. Este problema se abordó en Brehm, BBRC 63: 24-31, 1975, donde se usó una resina de intercambio aniónico (QAE-Sephadex) para adsorber proteínas séricas sanguíneas cargadas negativamente al tiempo que se retiraban por lavado proteínas cargadas positivamente que podían unirse inespecíficamente a la molécula de ADN cargada negativamente. Las proteínas adsorbidas se eluyeron de la QAE-Sephadex y después se aplicaron a ADN-celulosa.
Las proteínas que se unieron al ADN-celulosa se identificaron como proteínas de unión a ADN. Aunque está técnica podía haber retirado por lavado algunas proteínas cargadas positivamente que se hubieran unido inespecíficamente al ADN-celulosa, algunas de las proteínas retiradas por lavado eran probablemente proteínas de unión a ADN no identificadas.
En lugar de retirar todas las proteínas cargadas positivamente antes de un ensayo de unión a ADN, pueden añadirse agentes bloqueantes de polianiones a las soluciones de ensayo para minimizar la unión inespecífica. En Carthew, et al., Cell 43: 439-448, 1985, se añadió poli dldC a los tampones de procesamiento de un ensayo de cambio de migración de electroforesis en gel de unión a ADN para reducir el efecto de proteínas que se unen inespecíficamente al ADN. En dicha estrategia, el poli-dldC puede competir con el ADN diana por las moléculas de unión a ADN inespecíficas, reduciendo de este modo la interferencia de unión inespecífica al tiempo que se potencia la señal de cambio de migración de cualquier proteína unida específicamente. Teóricamente, pueden detectarse proteínas de unión a ADN específicas para el ADN diana incluso si están cargadas positivamente, puesto que pueden unirse más fuertemente al ADN diana, teniendo afinidades de unión tanto electroestática como específica. Aunque esta tecnología de bloqueo proporciona una forma de potenciar la detección de proteínas de unión a ADN, no describe procedimientos para potenciar la detección de cambios de migración que son el resultado de otros tipos de interacciones de unión específicas.
Pueden observarse cambios de migración en otras interacciones de moléculas de afinidad con analitos. Pueden observarse cambios de migración, por ejemplo, cuando un anticuerpo se une a un antígeno o cuando un polisacárido se une a una lectina. No obstante, la cromatografía o la electroforesis de estas moléculas proporciona con frecuencia picos anchos y escasamente resueltos debido a las múltiples conformaciones y a la densidad de carga inestable en estas moléculas. La diversidad de parejas de molécula de afinidad/analito posibles también puede requerir el desarrollo de un ensayo de cambio de migración especial para cada pareja. Estos problemas pueden evitarse si la molécula de afinidad está unida a un polímero transportador de alta resolución en ensayos en un conjunto de condiciones convencionales. Se describe un ejemplo de tecnología que usa un conjugado de transportador/molécula de afinidad, por ejemplo, en el documento WO 02/082083. Aunque el uso de moléculas transportadoras uniformes para moléculas de afinidad en análisis de cambio de migración puede mejorar la resolución, continúa existiendo un problema con la interferencia debida a la unión inespecífica.
Por lo tanto, continúa existiendo la necesidad de procedimientos para bloquear la interferencia en ensayos de cambio de migración, particularmente en ensayos que utilizan transportadores de moléculas de afinidad. Los ensayos de cambio de migración de muestras brutas o complejas pueden beneficiarse de composiciones, procedimientos y aparatos que pueden bloquear la interferencia debida a interacciones de unión inespecífica con las moléculas que migran. La presente invención proporciona estas y otras características que serán evidentes tras la revisión de lo siguiente.
Como se ha mencionado anteriormente, los ensayos de cambio de migración proporcionan una separación y una detección muy eficaces de la molécula de analito diana (también denominada en este documento "analito de interés"). Además, el uso de dichos ensayos de cambio de migración en combinación con dispositivos microfluidos aumenta la eficacia del ensayo. Para aumentar la sensibilidad de los ensayos de cambio de migración que usan dispositivos microfluidos, pueden emplearse diversos procedimientos para concentrar un analito de interés en una muestra antes de aplicar la muestra en una región de separación del dispositivo en el que se produce el ensayo de cambio de migración, incluyendo, por ejemplo, (i) Preconcentración de Muestra por Amplificación de Campo (FASS), un procedimiento para concentrar la muestra que utiliza la diferencia de conductividad eléctrica de un dominio de concentración y un dominio de separación (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº: 6 695 009 para "Microfluidic Methods, Devices and Systems for In Situ Material Concentration", Weiss, D. J., Saunders, K., Lunte, C. E. Electrophoresis 2001, 22, 59-65; Brito-McKibbin, P., Bebault, G. M., Chen, D. D. Y. Anal Chem. 2000, 72, 1729-1735, Ross, D., Locascio, L. E. Anal. Chem. 2002, 71, 5137-5145), (ii) Inyección de Muestra por Amplificación de Campo (FASI), un procedimiento para concentrar la muestra por inserción de un lecho de agua diminuto entre el dominio de concentración y el dominio de separación en el FASS (por ejemplo, "Field amplified sample injection in high-performance capillary electrophoresis", Chien, R. L et al. J. Chromatogr. 1991, 559, 141-148); (iii) Isotacoforesis (TTP), un procedimiento para concentrar la muestra que utiliza la diferencia de movilidad de iones en el dominio intercalado entre una solución de electrolito delantero y una solución de electrolito trasero (por ejemplo, Everaerts; F. M., Geurts, M. Mikkers, F. E. P., Verheggen, T. P. E. M J Chromatagr. 1976, 119, 129-155; Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M., Peek, J. A. F. J. Chromatogr. 1979, 168, 293-315; y Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M., Peek, J. A. F. J. Chromatogr. 1979, 168, 317-332, Hirokawa, T., Okamoto, H., Ikuta, N., y Gas, B., "Optimization of Operational Modes for Transient Isotachophoresis Preconcentration-CZE" Analytical Sciences 2001, Vol. 17 Suplemento il85), (iv) Enfoque isoeléctrico (IF), un procedimiento de concentración/separación que utiliza la diferencia de puntos isoeléctricos entre las sustancias (por ejemplo, "High performance isoelectric focusing using capillary electrophoresis instrumentation", Wehr T, et al. Am. Biotechnol. Lab. 1990, 8, 22, "Fast sand high-resolution analysis of human serum transferring by high-performance isoelectric focusing in capillaries", Kilar F. et al., Electrophoresis 1989, 10, 23-29) y (v) Extracción en Fase Sólida (SPE), un procedimiento de concentración y separación que utiliza una interacción específica entre una fase sólida (por ejemplo, una fase sólida con un adsorbente unido tal como un receptor) y un analito para adsorber el analito en la fase sólida (por ejemplo, "Microchip-based purification of DNA from Biological Simples", Breadmore M. et al. Anal. Chem. 2003, 75, 1880-1886).
El documento US 6403338 describe un sistema microfluido para análisis bioquímico tal como identificación de ADN, purificación de ácido nucleico y genotipado.
El documento US 6537433 describe un procedimiento para concentrar un analito polar en un campo eléctrico alterno causando un traslado relativo del analito polar y del campo eléctrico.
El documento CA 2443320 describe un procedimiento electroforético de separación de una sustancia que emplea un conjugado de una molécula de afinidad capaz de unirse a la sustancia unida a una molécula de ácido nucleico.
Sin embargo, cuando el analito se concentra mediante el uso de lo mencionado anteriormente Sin embargo, cuando el analito se concentra mediante el uso de los procedimientos convencionales mencionados anteriormente, los constituyentes innecesarios (por ejemplo, denominados "constituyentes de interferencia" que interfieren con la detección del analito) se concentran a menudo a la vez que el analito. Como resultado, cuando la muestra concentrada por un procedimiento convencional se usa como la muestra para la separación y la detección, la sensibilidad de detección puede ser limitada debido a los niveles de fondo e interferencia aumentados. Además, los procedimientos de concentración convencionales que utilizan electroforesis, tales como FASS; ITP e IF no pueden concentrar mucho y eficazmente un analito que tenga un peso molecular muy grande o cargas eléctricas relativamente bajas.
Es decir, en los procedimientos de concentración mencionados anteriormente, cuando se supone que el analito es esférico, la movilidad de la sustancia se muestra mediante la siguiente fórmula:
\mu_{e} = q/6..r
en la que \mu_{e} es la movilidad electroforética de un ión particular, q es la carga eléctrica del ión, es la viscosidad de una solución y es un radio del ión. Como es evidente a partir de la fórmula mencionadamente anteriormente, cuando el analito tiene un peso molecular muy grande y/o una carga eléctrica pequeña, la movilidad electroforética (\mu_{e}) del analito se reduce ya que r en la fórmula se hace grande y/o q en la fórmula se hace pequeña. Por consiguiente, cuando se usan dichos procedimientos de concentración convencionales, es difícil concentrar mucho un analito que tiene un peso molecular muy grande y/o una carga eléctrica pequeña en un tiempo corto. Además, en los procedimientos de concentración convencionales para concentrar el analito en la muestra, la optimización de las condiciones de reacción es a menudo difícil, particularmente cuando el analito coexiste en una muestra compleja con diversos constituyentes interferentes innecesarios (por ejemplo, constituyentes de interferencia) distintos del analito, que tienden a concentrarse junto con el analito. Esto es especialmente cierto en el caso de muestras de suero usadas en el campo del diagnóstico clínico, conteniendo dichas muestras una diversidad de sustancias a medir con una amplia diversidad de pesos moleculares y distribuciones de carga eléctrica. Como se ha mencionado anteriormente, el desarrollo de un procedimiento para concentrar el analito mucho y eficazmente, para detectar el analito con una alta sensibilidad y sin aumentar los niveles de fondo e interferencia, especialmente en relación con el uso de dispositivos microfluidos, sería ventajoso. La presente invención proporciona dichos procedimientos y otras características que serán evidentes tras la revisión de lo siguiente.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona procedimientos, por ejemplo, para reducir la interferencia de constituyentes de muestra con la separación de, por ejemplo, un complejo de un analito y una molécula de afinidad de cualquier molécula de afinidad libre (por ejemplo, no unida), particularmente la separación de un complejo de un analito y un conjugado de una molécula de afinidad de cualquier conjugado libre (por ejemplo, no unido), que hacen posible detectar o identificar de forma sensible y específica el analito de interés en una muestra.
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de detección o identificación de un analito de interés en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito para formar de este modo un complejo del analito y el uno o más conjugados;
(ii)
separar el complejo y cualquier conjugado no unido en presencia de un polímero cargado usando un canal de separación en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum; y
(iii)
detectar el complejo para identificar la presencia del analito o para determinar la cantidad del analito en la muestra, donde la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del analito por unión para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada;
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de componentes de muestra que tengan una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
En una realización de la invención, al menos una molécula de afinidad se marca con un marcador detectable tal como un colorante fluorescente, un colorante luminiscente, un colorante fosforescente, una proteína fluorescente, una proteína o partícula luminiscente, un trazador radiactivo, un compuesto quimioluminiscente, un mediador redox, un compuesto electrogénico, una enzima, una partícula de oro coloidal o una partícula de plata. Como alternativa, cuando la molécula de afinidad forma un conjugado con una molécula transportadora cargada, al menos una de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada que forman el conjugado se marca generalmente mediante un marcador detectable.
En algunas realizaciones del procedimiento, al menos uno de los uno o más conjugados se marca mediante un marcador detectable para formar un complejo que contiene el analito y el conjugado marcado mediante el marcador detectable; y la etapa (ii) comprende separar el complejo del conjugado marcado no unido en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
la etapa (iii) comprende:
(a)
medir la cantidad del complejo separado o detectar la presencia del complejo separado; y
(b)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (a) o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada en la etapa (a), y
en la que la molécula de afinidad en el conjugado es capaz de unirse al analito y, cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado es capaz de unirse al analito en un sitio diferente de las otras moléculas de afinidad.
En otras realizaciones del procedimiento:
\quad
la etapa (i) comprende poner en contacto la muestra que contiene el analito con una o más moléculas de afinidad y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, en la que al menos una de las moléculas de afinidad o al menos uno de los conjugados está marcado mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito y la molécula de afinidad o el conjugado;
\quad
la etapa (ii) comprende separar el complejo de la molécula de afinidad marcada no unida o del conjugado marcado no unido en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
\quad
la etapa (iii) comprende:
(a)
medir la cantidad del complejo separado y detectar la presencia del complejo separado; y
(b)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (a) o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada en la etapa (a); y
donde la molécula de afinidad y la molécula de afinidad en el conjugado son capaces de unirse al analito y cada molécula de afinidad es capaz de unirse al analito en un sitio diferente de otras moléculas de afinidad. En una realización adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) analito marcado con un marcador detectable o un análogo del analito marcado con un marcador detectable y (b) uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito o al análogo de analito, para formar de este modo un primer complejo del analito en la muestra y el conjugado y un segundo complejo del analito marcado o del análogo marcado y el conjugado;
(ii)
separar el primer y segundo complejo de cualquier analito marcado libre o análogo marcado libre que no esté implicado en la formación del segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
(iii)
medir la cantidad del segundo complejo separado;
(iv)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (iii);
en el que cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado es capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado o análogo marcado en un sitio diferente de otras moléculas de afinidad; y
la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del analito marcado o del análogo marcado por unión para formar un complejo del analito marcado o del análogo marcado, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de componentes de muestra que tengan una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) analito unido a una molécula transportadora cargada o un análogo del analito unido a una molécula transportadora cargada y (b) una o más moléculas de afinidad marcadas mediante un marcador detectable, donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito o al análogo de analito para formar de este modo un primer complejo del analito unido a la molécula transportadora cargada o del análogo unido a una molécula transportadora cargada y la molécula de afinidad marcada y un segundo complejo del analito en la muestra y la molécula de afinidad;
(ii)
separar el primer complejo de cualquier segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
(iii)
medir la cantidad del primer complejo separado o la cantidad del segundo complejo;
(iv)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (iii); y
en el que cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad es capaz de unirse al analito en la muestra y al analito o análogo de analito unido a la molécula transportadora cargada en un sitio diferente de otras moléculas de afinidad y
en el que la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del primer complejo por unión al analito o al análogo para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de componentes de muestra que tengan una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de concentración de un analito de interés en una muestra que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado; y
(ii)
concentrar el complejo mediante el uso de un canal de concentración en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala macroscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum en presencia de un polímero cargado;
\quad
en el que la molécula transportadora cargada causa un cambio en la propiedad de migración del analito por unión para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y
\quad
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de componentes de muestra que tengan una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A muestra una gráfica de cambio de migración de un ensayo sin constituyentes de muestra interferentes; la Figura 1B muestra el ensayo con constituyentes interferentes de muestra añadidos; y la Figura 1C muestra la reducción de la interferencia por adición de un polímero cargado.
La Figura 2 es un diagrama esquemático de un dispositivo microfluido para el procesamiento de un ensayo de cambio de migración como se usa en los Ejemplos.
La Figuras 3A-K son ilustraciones esquemáticas de diversos formatos de inmunoensayo que pueden usarse para detectar un analito de interés en una muestra usando los procedimientos de la presente invención.
La Figura 4 muestra una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína sin polímero cargado (por ejemplo, sulfato de heparina) en la muestra o el medio de separación (por ejemplo, gel) obtenida en el Ejemplo 1.
La Figura 5A muestra una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína con heparina al 0,05% en la muestra y heparina al 0,1% en el medio de separación; la Figura 5B es una vista despiezada de una porción de la gráfica de la Figura 5A obtenida en el Ejemplo 1.
La Figura 6A muestra una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína con heparina al 0,05% en la muestra y heparina al 1% en el medio de separación; la Figura 6B es una vista despiezada de una porción de la gráfica de la Figura 6A obtenida en el Ejemplo 1.
La Figura 7A muestra una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína con suero al 5% y con y sin Poli dl-dC al 0,01%; la Figura 7B es una vista despiezada de una porción de la gráfica de la Figura 7A obtenida en el Ejemplo 2.
La Figura 8 es un diagrama esquemático de un sistema microfluido de isotacoforesis.
La Figura 9 es un diagrama esquemático de una ITP en estado transitorio que concentra un analito en una interfaz con un electrolito delantero.
La Figura 10 es un diagrama esquemático de una separación por ITP en estado transitorio de analitos de interés y la yuxtaposición de una ITP en estado estacionario de los analitos.
La Figura 11 es un diagrama esquemático de la retirada selectiva de constituyentes de muestra durante la ITP.
La Figura 12A muestra una gráfica de cambio de migración de concentración de CA19-9 usando una muestra de anticuerpo anti-CA19-9 marcado (nº CA19-9) o una muestra de una mezcla del anticuerpo anti-CA19-9 marcado y CA19-9 obtenida en el Ejemplo 3; la Figura 12B muestra una gráfica de cambio de migración de concentración de CA19-9 usando una mezcla de anticuerpo anti-CA19-9 marcado, anticuerpo anti-CA19-9 marcado con ADN y diversas concentraciones de un CA19-9 (0, 10 ó 100 U/ml) obtenida en el Ejemplo 3.
Descripción detallada I. Ensayo de Cambio de Migración
La presente invención puede aplicarse a, por ejemplo, los denominados ensayos de cambio de migración. Se realizan ensayos de cambio de migración con el fin de separar y analizar un analito de interés y una sustancia que tiene afinidad contra el analito (por ejemplo, una molécula de afinidad), que se ponen en contacto para formar un complejo del analito y la sustancia de afinidad, después de lo cual el complejo se separa de la sustancia de afinidad que no está implicada en el complejo (por ejemplo, la sustancia de afinidad libre o no unida) en base a una diferencia de velocidad de migración entre ellas mediante el uso de un dispositivo microfluido, y el complejo separado o la sustancia de afinidad libre se analizan. Es decir, los ensayos de cambio de migración incluyen, por ejemplo, la detección de diferencias en la velocidad de migración, por ejemplo, entre una molécula de afinidad y un complejo de molécula de afinidad/analito y, en particular, entre un conjugado de molécula transportadora cargada/molécula de afinidad con y sin analito unido usando un dispositivo microfluido.
Como un ensayo de cambio de migración, pueden ejemplificarse los siguientes procedimientos: (i) un procedimiento que comprende en general poner en contacto la muestra que contiene el analito con la molécula de afinidad para formar un complejo que contiene el analito y la molécula de afinidad, separar el complejo de la molécula de afinidad libre que no está implicada en la formación del complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido, medir una cantidad del complejo separado o de la molécula de afinidad libre o detectar la presencia del complejo separado y determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada; (ii) un procedimiento que comprende en general poner en contacto la muestra que contiene el analito con un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada para formar un complejo que contiene el analito y el conjugado, separar el complejo del conjugado libre que no está implicado en la formación del complejo en un canal de separación del dispositivo microfluido, medir la cantidad del complejo separado o del conjugado libre o detectar la presencia del complejo separado, y determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia el analito en la muestra en base a la presencia detectada; (iii) un procedimiento que comprende en general poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) la molécula de afinidad y (b) el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada para formar un complejo formado entre el analito y (a) y (b), separar el complejo de la molécula de afinidad libre y/o del conjugado libre que no están implicados en la formación del complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido, medir la cantidad del complejo separado o de la molécula de afinidad libre (y/o del conjugado libre) o detectar la presencia del complejo separado, y determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada; (iv) un procedimiento que comprende en general poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) un analito marcado mediante un marcador detectable y (b) el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada para formar un complejo que contiene el analito marcado y el conjugado, separar el complejo del analito marcado libre que no está implicado en la formación del complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido, medir la cantidad del complejo separado o del analito marcado libre y determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia del analito marcado; y (v) un procedimiento que comprende en general poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) un analito marcado mediante una molécula transportadora cargada y (b) una o más moléculas de afinidad que tienen la capacidad de unirse tanto al analito como al analito unido a las moléculas transportadoras cargadas, y al menos una de las moléculas de afinidad está marcada mediante un marcador detectable, para formar un complejo del analito marcado con la molécula transportadora cargada y la molécula de afinidad marcada mediante un marcador detectable, separar el complejo de la forma libre de la molécula de afinidad marcada mediante un marcador detectable, medir la cantidad del complejo separado o de la molécula de afinidad libre marcada mediante un marcador detectable y determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia de la molécula de afinidad marcada. En los procedimientos (iv) y (v) se puede usar un análogo marcado del analito siempre que el análogo del analito tenga la capacidad de unirse al
anticuerpo.
II. Procedimientos de la Invención
La presente invención proporciona procedimientos para reducir la interferencia, por ejemplo, en los ensayos de cambio de migración descritos anteriormente. Una característica de la presente invención es que en los ensayos de cambio de migración mencionados anteriormente la separación del complejo de analito/sustancia de afinidad y la sustancia de afinidad libre que no está implicada en el complejo se realiza en presencia de un polímero cargado y se analiza el complejo separado o la sustancia de afinidad libre. En la presente invención, el término "analito" se refiere generalmente a una sustancia que se va a medir o identificar (por ejemplo, en la muestra), la expresión "sustancia de afinidad" se refiere generalmente a una molécula de afinidad y/o a un conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, y la expresión "complejo de analito/sustancia de afinidad" se refiere a un complejo de analito/molécula de afinidad, a un complejo de analito/conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada o a un complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada.
Si la muestra contiene un analito que se une específicamente a la sustancia de afinidad (por ejemplo, a la molécula de afinidad o a un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada), el complejo se mostrará de mayor tamaño tras la separación. Este cambio de tamaño aparente o "cambio de migración" indica la presencia del analito. Sin embargo, en presencia de constituyentes de muestra que se unen inespecíficamente a la sustancia de afinidad (por ejemplo, especialmente cuando la sustancia de afinidad está conjugada con una molécula transportadora), puede observarse un cambio de migración falso positivo o puede formarse un complejo insoluble que no migrará en el canal de separación. El procedimiento de la invención proporciona polímeros cargados que pueden reducir la interferencia causada por los constituyentes interferentes.
Por ejemplo, en un ensayo de cambio de migración en el que la molécula transportadora cargada es ADN, los constituyentes del suero interferirán con el ensayo. La adición de un polímero cargado, tal como sulfato de heparina, puede reducir la interferencia. La Figura 1A muestra una gráfica de electroferograma de un cambio de migración en un medio de separación entre el pico de conjugado (10) y el pico del complejo de conjugado/analito (11). Cuando se añade suero a la muestra, los constituyentes interferentes cambian el tiempo de retención, la altura y el área del pico del complejo (11), como se muestra en la Figura 1B. La adición de un polímero cargado al ensayo puede reducir los cambios por interferencia, como se muestra en la Figura 1C.
El procedimiento puede llevarse a cabo, por ejemplo, de la siguiente forma o formas. Es decir, una muestra que contiene el analito se pone en contacto con al menos una molécula de afinidad para formar un complejo del analito y la molécula de afinidad, y el complejo resultante se separa de cualquier molécula de afinidad no unida en presencia de un polímero cargada mediante el uso de un canal de separación en un dispositivo microfluido, que comprende al menos un canal de separación que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum (micrómetros). Después de eso, es posible identificar la presencia del analito o determinar la cantidad del analito en la muestra por detección del complejo.
A. Polímero Cargado
El polímero cargado de la invención puede bloquear la interferencia con el ensayo de cambio de migración por interacción con constituyentes de muestra que interfieren con el ensayo. Sin vincularse a una teoría particular, se piensa que el polímero cargado, que tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada en el conjugado, reduce la interferencia en ensayos de cambio de migración debido a la unión de constituyentes de muestra interferentes cargados de forma opuesta que de otro modo se unirían a la molécula transportadora cargada en el conjugado. La unión de polímero cargado a constituyentes interferentes puede evitar, por ejemplo, cambios de migración falsos positivos debido a la unión inespecífica de constituyentes al conjugado, o ensayos fallidos debido a la formación de un complejo insoluble con los complejos de conjugado/constituyente.
Los polímeros cargados de la invención pueden ser, por ejemplo, un polímero con una carga neta (positiva o negativa) opuesta a la del constituyente de muestra. Los polímeros cargados tienen el mismo tipo (positivo o negativo) de carga neta que el conjugado correspondiente. El polímero cargado de la invención puede comprender un polímero polianiónico que puede incluir, por ejemplo, polisacáridos tales como heparina, sulfato de heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, ácido politúngstico, ácido fosfotúngstico, ácido hialurónico, dermatán sulfato y ácido polianetolsulfónico; polinucleótidos tales como ADN (por ejemplo, ADN plasmídico, ADN de timo de ternera, ADN de esperma de salmón, ADN acoplado a celulosa, ADN sintético, etc.) y ARN; polipéptidos tales como poliaminoácidos (por ejemplo, ácido poliaspártico, ácido poliglutámico, etc.) y polipéptido sintético; compuestos macromoleculares sintéticos tales como poli-dldC, sulfato de polivinilo, poliacrilato; cerámicos tales como partículas de cristal, cristal coloidal y cristal lechoso; y complejos de los mismos. El polímero cargado también puede comprender un polímero policatiónico que puede incluir, por ejemplo, polisacáridos tales como quitosana y derivados de la misma; polipéptidos tales como polilisina, polihistidina, poliarginina, protamina, histona, ornitina; compuestos macromoleculares sintéticos tales como polialilaminas, polietilenimina, polivinilamina; poliaminas tales como espermina y espermidina; lípidos catiónicos; cerámicos; y complejos de los mismos. En una realización preferida de la invención, el polímero cargado comprende polisacáridos aniónicos, preferiblemente sulfato de heparina.
En la presente invención, el polímero cargado mencionado anteriormente puede usarse en solitario o en una combinación apropiada.
Para separar el complejo de analito/sustancia de afinidad (por ejemplo, complejo de analito/molécula de afinidad, o complejo de analito/conjugado o complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado) y la sustancia de afinidad libre que no está implicada en el complejo (por ejemplo, molécula de afinidad libre o conjugado libre) en presencia del polímero de cargado, la separación se realiza en presencia del polímero cargado. Por ejemplo, el polímero cargado está presente preferiblemente en un canal de separación de un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación. En concreto, es preferible añadir el polímero cargado al medio de separación envasado en el canal de separación. La presencia del polímero cargado en el medio de separación puede reducir la transmisión de constituyentes de muestra interferentes entre procesamientos de muestra. Como alternativa, o adicionalmente, el polímero cargado puede estar presente en la solución (por ejemplo, agua, un tampón tal como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE, etc., usado en ensayos de hibridación, inmunoensayos y similares) que contiene el analito y el complejo de analito/sustancia de afinidad, y la solución obtenida que contiene el polímero cargado, el analito y el complejo de analito/sustancia de afinidad se aplica después al canal de separación. Además, el polímero cargado puede estar presente en una solución que se va a usar para aplicar una solución que contiene el analito y el complejo de analito/sustancia de afinidad al dispositivo microfluido, por ejemplo, un eluyente y un tampón de procesamiento que se va a usar en la separación (por ejemplo, agua, un tampón tal como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE, etc., usado en ensayos de hibridación, inmunoensayos y similares).
En los procedimientos mencionados anteriormente, para que el polímero cargado esté presente en la solución que contiene el analito y el complejo de analito/sustancia de afinidad, se ejemplifican los siguientes procedimientos: (i) el polímero cargada se añade a una muestra que contiene el analito o a una solución que contiene la muestra, y la solución obtenida que contiene el analito y el polímero cargado se ponen en contacto con la sustancia de afinidad; (ii) el polímero cargado se añade a una solución que contiene la sustancia de afinidad y la solución obtenida que contiene la sustancia de afinidad y el polímero cargado se ponen en contacto con la muestra que contiene el analito o con la solución que contiene la muestra; (iii) la muestra que contiene el analito o la solución que contiene la muestra y la sustancia de afinidad se añaden a una solución que contiene el polímero cargado; o (iv) la muestra que contiene el analito o la solución que contiene la muestra se pone en contacto con la sustancia de afinidad y la solución obtenida que contiene el analito y el complejo de analito/sustancia de afinidad se mezcla con una solución que contiene el polímero cargado. En los procedimientos mencionados anteriormente, el polímero cargado puede añadirse como una solución o como un polvo seco.
En la presente invención, por mezcla del polímero cargado con la muestra antes del contacto con la sustancia de afinidad (por ejemplo, la molécula de afinidad, el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada) puede obtenerse una ventaja cinética y/o precipitados de algunas sustancias interferentes. Dichos precipitados pueden retirarse por filtración o centrifugación. Tener tanto el polímero cargado como la sustancia de afinidad (por ejemplo, la molécula de afinidad, el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada) en solución puede permitir que la sustancia de afinidad se una a un analito con una gran afinidad incluso si el analito se une también inespecíficamente al polímero cargado. Por lo tanto, el polímero cargado está presente preferiblemente en al menos la etapa de separación (por ejemplo, en el medio de separación), pero puede estar presente además, y/o como alternativa, en la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito con la sustancia de afinidad (por ejemplo, la molécula de afinidad y/o el conjugado) para formar el complejo también. En una realización preferida de la invención, el polímero cargado está presente tanto en la etapa de separación (por ejemplo, en el medio de separación) entre el complejo de analito/sustancia de afinidad y la sustancia de afinidad libre como en la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito y la molécula de afinidad para formar el complejo, para aumentar la recuperación del analito que existe en la muestra. En los procedimientos mencionados anteriormente, para que el polímero cargado esté presente en la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito con la molécula de afinidad para formar el complejo, se ejemplifican los siguientes procedimientos: (i) el polímero cargado se añade a una muestra que contiene el analito o a una solución que contiene la muestra, y la solución obtenida que contiene el analito y el polímero cargado se pone en contacto con la sustancia de afinidad; (ii) el polímero cargado se añade a una solución que contiene la sustancia de afinidad y la solución obtenida que contiene la sustancia de afinidad y el polímero cargado se pone en contacto con la muestra que contiene el analito o con la solución que contiene la muestra; y (ii) la muestra que contiene el analito o la solución que contiene la muestra y la sustancia de afinidad se añaden a una solución que contiene el polímero cargado. En los procedimientos mencionados anteriormente, el polímero cargado puede añadirse como una solución o como un polvo seco.
La solución de muestra también puede ponerse en contacto con el polímero cargado en un soporte sólido para adsorber constituyentes interferentes antes de la aplicación en el medio de separación. El polímero cargado puede estar unido opcionalmente a un soporte sólido para una separación fácil del polímero cargado de la muestra. El soporte sólido puede ser, por ejemplo, cualquier matriz sólida compatible con interacciones de adsorción o química de enlaces necesarias para unir el polímero cargado particular al soporte sólido. El soporte sólido puede ser, por ejemplo, cristal, plástico, celulosa y similares. El soporte sólido puede estar, por ejemplo, en forma de perlas, gránulos, superficies porosas o superficies planas. En muchos casos, los soportes sólidos con grandes proporciones de superficie con respecto a volumen pueden proporcionar un bloqueo más eficaz de constituyentes interferentes que los de proporciones menores. La unión del polímero cargado al soporte sólido puede realizarse de una forma convencional usada habitualmente en este campo, por 
\hbox{ejemplo, como se muestra
 por Walsh MK  et al . [J. Biochem. Biophys. Methods (2001) 47
(3): 221-31].}
En el caso de que el polímero cargado esté presente en la separación entre el complejo de analito/sustancia de afinidad y la sustancia de afinidad libre, la concentración del polímero cargado en la etapa de separación (por ejemplo, en el medio de separación dentro del canal de separación) puede ser variable dependiendo de la clase del polímero cargado que se use. Generalmente, la concentración del polímero cargado puede ser cualquier concentración a la que la presencia del polímero cargado reduzca la interferencia de constituyentes de muestra con la separación de un complejo de analito/molécula de afinidad y cualquier molécula de afinidad libre, particularmente la separación de un complejo de analito/conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada y el conjugado libre en un ensayo de cambio de migración. La concentración del polímero cargado en el canal de separación (por ejemplo, dentro del medio de separación) es habitualmente de entre aproximadamente el 0,01 y el 5% (p/v), preferiblemente de aproximadamente el 0,05 al 2% (p/v), más preferiblemente de aproximadamente el 0,5 al 1,5% (p/v), por ejemplo, de aproximadamente el 1% (p/v).
En el caso de que el polímero cargado esté presente en la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito con la sustancia de afinidad para formar el complejo, la concentración del polímero cargado presente en la solución (por ejemplo, tampón) puede ser variable dependiendo de la clase de polímero cargado que se use. Generalmente, la concentración del polímero cargado puede ser cualquier concentración a la que la presencia del polímero cargado pueda reducir la interferencia sin afectar a ninguna interacción entre el analito y la sustancia de afinidad. La concentración del polímero cargado en la solución que contiene el analito y la sustancia de afinidad (por ejemplo, la molécula de afinidad, el conjugado de la molécula de afinidad/transportadora) es habitualmente de entre aproximadamente el 0,001 y el 2% (p/v), por ejemplo, de entre aproximadamente el 0,01 y el 2% (p/v), preferiblemente de entre aproximadamente el 0,001 y el 1% (p/v), por ejemplo de entre aproximadamente el 0,02 y el 1% (p/v), más preferiblemente de entre aproximadamente el 0,001 y el 0,05% (p/v), por ejemplo, de entre aproximadamente el 0,025 y el 0,5% (p/v), por ejemplo, de entre aproximadamente el 0,01% y el 0,05% (p/v).
B. Muestra
Pueden ser muestras de la presente invención cualquier material que contenga potencialmente un analito de interés. Las muestras pueden incluir, por ejemplo, un suero, un plasma, una sangre completa, un extracto tisular, un extracto celular, un extracto nuclear, un medio de cultivo, un extracto de cultivo microbiano, miembros de una biblioteca molecular, una muestra clínica, un espécimen de esputo, un líquido cefalorraquídeo, una muestra de orina, un hisopo urogenital, un hisopo de garganta, una muestra ambiental y/o similares. Cuando el analito no está libre en solución, puede liberarse en una solución por molienda, lisis, extracción, filtrado, centrifugación y otros procedimientos apropiados conocidos en la técnica. En otras palabras, las muestras a las que puede aplicarse la invención pueden ejemplificarse por las siguientes: fluidos corporales tales como un suero, un plasma, un líquido cefalorraquídeo, un líquido sinovial, un líquido linfático, etc., excreciones tales como orina, heces, etc., especímenes de origen biológico tales como expectoración, un material purulento, una exfoliación dérmica, etc., especímenes ambientales tales como alimentos, una bebida, agua corriente, agua de mar, agua de lagos y marismas, agua de río, aguas de desecho industriales, lavados para semiconductores, lavados después del lavado de instrumentos médicos, etc., y sus productos procesados reconstituidos por disolución en agua o un tampón usado habitualmente en este campo, por ejemplo, tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, etc.
C. Analitos de Interés
Los analitos pueden incluir, por ejemplo, proteínas del suero tales como cadenas peptídicas (por ejemplo, péptido C, angiotensina I, etc.), proteínas [por ejemplo, inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E (IgE), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), \beta_{2}-microglobulina, albúmina, sus productos de degradación], ferritina, etc., proteínas enzimáticas tales como amilasa, fosfatasa alcalina, \gamma-glutamil-transferasa, fosfatasa ácida, lipasa (por ejemplo, pancreática, gástrica, etc.), creatina quinasa (por ejemplo, CK-1, CK-2, mCK, etc.), ácido láctico deshidrogenasa (por ejemplo, LDH1 a LDH5, etc.), ácido glutámico-ácido oxaloacético transaminasa (por ejemplo, ASTm, ASTs, etc.), ácido glutámico-ácido pirúvico transaminasa (por ejemplo, ALTm, ALTs, etc.), colina esterasa (por ejemplo, ChE1 a ChE5, etc.), leucina aminopeptidasa (por ejemplo, C-LAP, AA, CAP, etc.), renina, proteína quinasa, tirosina quinasa, etc.; proteínas o péptidos o antígenos de glicosilo procedentes de microorganismos, por ejemplo, bacterias tales como bacilos tuberculosos, pneumococos, Corynebacterium diphteriae, Neisseria meningitidis, gonococos, estafilococos, estreptococos, bacterias intestinales, Escherichia coli, Helicobacter pylori, etc., virus tales como virus de la rubeola, virus herpes, virus de la hepatitis, virus de ATL, virus del SIDA, virus influenza, adenovirus, enterovirus, poliovirus, virus EB, HAV, HBV, HCV, VIH, HTLV, etc., hongos tales como Candida, Cryptococcus, etc., espiroquetas tales como leptospira, Treponema pallidum, etc., clamidia, micoplasma y similares; una diversidad de alergenos que causan alergias tales coma asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, etc.., por ejemplo, polvo doméstico, ácaros tales como Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, etc., polen de cedro japonés, ciprés japonés, Paspalum, ambrosía común, Phleum pratense, Anthoxanthum odoratum, centeno, etc., animales tales como gatos, perros, cangrejos, etc., alimentos tales como arroz, albumen, etc., hongos, insectos, madera, fármacos, químicos y similares; lípidos tales como lipoproteínas, etc., proteasas tales como tripsina, plasmina, serina proteasa, etc.; antígenos proteicos marcadores tumorales tales como alfa-fetoproteína (AFP), antígeno prostático específico (PSA), antígeno carcinoembrionario (CEA), PGI, PGII, \alpha^{2}-macroglobulina, etc., cadenas de azúcares (por ejemplo, CA19-9, PIVKA-II, CA125, cadenas de azúcares de antígenos de glicosilo marcadores tumorales tales como una cadena de azúcar que posee un material que contiene una cadena de azúcar especial producida por células cancerosas, por ejemplo, antígeno de glicosilo ABO, etc.); lectina (por ejemplo, concanavalina A, lectina de Lens esculenta, lectina de Phaseolus vulgaris, lectina de estramonio, lectina de germen de trigo, etc.); fosfolípidos (por ejemplo, cardiolipina, etc.); lipopolisacáridos (por ejemplo, endotoxina, etc.), sustancias químicas [por ejemplo, hormonas tales como hormonas esteroideas, gonadotropina coriónica humana (hCG), PTH, T3, T4, hormona estimulante de tiroides (TSH), insulina, hormona luteinizante (LH), FSH, prolactina, etc., hormonas ambientales tales como tributiltina, nonilfenol, 4-octil-fenol, ftalato de di-n-butilo, ftalato de diciclohexilo, benzofenona, octacloroestireno, ftalato de di-2-etilhexilo, etc.]; receptores (por ejemplo, receptores para estrógenos, THS, etc.); ligandos (por ejemplo, estrógenos, TSH, etc.); ácidos nucleicos; analitos conjugados con proteínas transportadoras; analitos conjugados con ácidos nucleicos y anticuerpos para los mismos. A este respecto, los anticuerpos usados en la presente invención como molécula de afinidad también incluyen fragmentos Fab, Fab' o F(ab')_{2} como productos de degradación producidos por la degradación con una proteinasa tal como papaína o pepsina o por degradación química. La presente invención es útil, por ejemplo, en la medición de los siguientes analitos; por ejemplo, alfa-fetoproteína, proteínas del suero, marcadores tumorales, enzimas, hormonas, HCG, TSH, FSH, LH, analitos conjugados con proteínas transportadoras, analitos conjugados con ácidos nucleicos y similares.
D. Molécula de Afinidad
La molécula de afinidad (por ejemplo, sustancia de afinidad) puede ser una cualquiera que tenga una afinidad específica por el analito de interés en la muestra y, por ejemplo, puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fab' de un anticuerpo, una región variable de anticuerpo, una lectina, avidina, un receptor, un péptido de afinidad, un aptámero y una proteína de unión a ADN. Las moléculas de afinidad pueden tener una afinidad específica por ligandos tales como, por ejemplo, partículas de virus, células bacterianas, proteínas, péptidos, hidratos de carbono, antígenos, lípidos, esteroides, compuestos químicos pequeños y similares que, por ejemplo, funcionan como enzimas, anticuerpos, hormonas, citoquinas, componentes estructurales, moléculas de señalización y ligandos para un receptor determinado, etc. y que a veces son reconocidos como marcadores tumorales, marcadores de inflamación y marcadores de enfermedad infecciosa. Estos incluyen AFP, hCG, TSH, FSH, LH, interleuquina, ligando Fas, CA19-9, CA125, PSA, HBsAg, anticuerpo anti-VIH, T4 y similares. También pueden incluir ligandos conjugados con proteínas transportadoras, ligandos conjugados con ácidos nucleicos, proteínas intracelulares, moléculas de señalización y/o similares. La molécula de afinidad usada en la invención incluye, por ejemplo, las que tienen una propiedad capaz de la unión al analito dependiendo de una interacción de proteína-proteína, una interacción de proteína-sustancia química o una interacción de sustancias químicas-sustancias químicas. En concreto, se incluyen las que se unen en base a una interacción de antígeno-anticuerpo, una interacción de cadena de azúcar-lectina, una interacción de enzima-inhibidor, una interacción de proteína-cadena peptídica, una interacción de cromosoma o cadena de nucleótidos-cadena de nucleótidos, una interacción de nucleótido-ligando o una interacción de receptor-ligando. Cuando una de las sustancias en las parejas mencionadas anteriormente es el analito, la otra es la molécula de afinidad. Por ejemplo, cuando el analito es un antígeno, la molécula de afinidad es un anticuerpo, y cuando el analito es un anticuerpo, la molécula de afinidad es un antígeno (lo mismo se aplica a las otras parejas anteriores). Los ejemplos típicos de la molécula de afinidad son los mismos que los analitos mencionados
anteriormente.
Entre ellos, es preferible usar la siguiente molécula de afinidad, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fab', una región variable de anticuerpo, una lectina mencionada anteriormente, avidina, un receptor, un péptido de afinidad, un aptámero y/o una proteína de unión a ADN. En la presente invención, la molécula de afinidad mencionada anteriormente puede usarse en solitario o en una combinación apropiada. Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad se une con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad. Y cuando la molécula de afinidad se usa en el procedimiento de ensayo competitivo mediante el uso del analito marcado mediante el marcador detectable o del análogo del analito marcado mediante el marcador detectable, la afinidad de la molécula de afinidad hacia el analito en la muestra y hacia el analito marcado es preferiblemente la misma, o la afinidad de la molécula de afinidad hacia el analito en la muestra y hacia el análogo marcado es preferiblemente la misma.
En los procedimientos de la presente invención mencionados anteriormente, la concentración de la molécula de afinidad puede ser variable dependiendo del límite de detección del analito. Generalmente, es deseable mantener la molécula de afinidad a una concentración superior que aquella a la que la molécula de afinidad puede unirse completamente con el analito a una concentración que se corresponde con el límite de detección definido en la mezcla de reacción. La concentración en la mezcla de reacción se mantiene preferiblemente a 2 veces o más del límite de detección, más preferiblemente a 5 veces o más. Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, la concentración de cada molécula de afinidad se selecciona del intervalo de concentraciones mencionado anteriormente.
Generalmente, la molécula de afinidad usada en la presente invención es una puede medirse (por ejemplo, detectarse) o marcarse mediante un marcador detectable por algún procedimiento de detección convencional. El uso de una molécula que tiene dicha propiedad hará posible medir un analito en una muestra. En el caso en el que el propio analito pueda detectarse por algún procedimiento (por ejemplo, una enzima o similar) o cuando un analito puede unirse directamente a un marcador detectable sin una molécula de afinidad, el analito en la muestra puede medirse incluso si la molécula de afinidad no posee dicha propiedad detectable descrita anteriormente. Son ejemplos de un analito que puede detectarse por sí mismo o por algún procedimiento enzimas, colorantes, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, sustancias que tienen absorción en la región ultravioleta (por ejemplo, ADN) y similares. Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, no es necesario que todas las moléculas de afinidad tengan dicha propiedad detectable.
Cuando la molécula de afinidad (o el conjugado de una molécula de afinidad/molécula transportadora) se marca con un marcador detectable, el marcador detectable puede incluir los usados convencionalmente en el campo de la presente invención, por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos enzimáticos (EIA), radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos de fluorescencia (FIA), ensayos de hibridación y similares. Dicha sustancia incluye, por ejemplo, enzimas tales como fosfatasa alcalina (ALP), \beta-galactosidasa (\beta-Gal), peroxidasa (POD), microperoxidasa, glucosa oxidasa (GOD), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), ácido málico deshidrogenasa, luciferasa, etc.; pigmentos tales como Azul Brillante de Coomassie R250, naranja de metilo, etc.; un trazador radiactivo tal como ^{99m}Tc, ^{131}I, ^{125}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{32}P, ^{35}S, etc.; colorantes fluorescentes tales como fluoresceína, rodamina, dansilo, fluorescamina, cumarina, naftilamina o sus derivados, colorantes fluorescentes de tipo cianina o colorantes fluorescentes de tipo oxazina [por ejemplo, colorantes de la serie Cy (Cy3, Cy5 y Cy5.5, etc.: Amersham Biosciences Corp.), colorantes de la serie Alexa Fluor (Alexa Fluor 647, 488, 594, etc.: Molecular Probes, Inc.), colorantes de la serie DY (DY-630, 633, 635, 640, 650, 655, 656, 780, 550, etc.: MoBiTec GmbH, Goettingen Alemania), EVOblue^{TM}30 (MoBiTec GmbH, Goettingen Alemania)]; pigmentos fluorescentes de tierras raras [una combinación de un metal de tierras raras, por ejemplo, samario (Sm), europio (Eu), terbio (Tb) o disprosio (Dy) con un compuesto quelato, por ejemplo, 4,4'-bis(1'',1'',1'',2'',2'',3'',3''-heptafluoro-4'',6''-hexadion-6''-il)cloro-sulfo-o-terfenilo (BHHCT), ácido 4,7-bis(clorosulfonil)-1,10-fenantrolin-2,9-dicarboxílico (BCPDA), ácido \beta-naftiltrifluoroacético (\beta-NTA), etc.]; pigmento fluorescente de unión a ácido nucleico; una proteína fluorescente; colorantes luminiscentes tales como luciferina, isoluminol, luminol, bis(2,4,6-trifluoro-fenil)oxalato, etc., una proteína o partícula luminiscente; sustancias absorbentes UV tales como fenol, naftol, antraceno o sus derivados, sustancias que tienen una propiedad de agente marcador de espín, ejemplificadas por compuestos que tienen un grupo oxilo tal como 4-amino-2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1-oxilo, 3-amino-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-1-oxilo, 2,6-di-t-butil-\alpha-(3,5-di-t-butil-4-oxo-2,5-ciclohexadien-1-ildideno)-p-toliloxi, un colorante fosforescente, un compuesto quimioluminiscente, un mediador redox, un compuesto electrogénico, un partícula de oro coloidal o una partícula de plata, etc.
El pigmento fluorescente mencionado anteriormente que se une a un ácido nucleico emite una intensa fluorescencia dependiendo de la unión a la cadena de ácido nucleico. Dicho pigmento fluorescente de unión a ácido nucleico incluye, por ejemplo, los denominados pigmentos intercalantes que se incorporan entre las bases de la cadena de ácido nucleico [por ejemplo, pigmentos de acridina tales como naranja de acridina, compuestos de etidio tales como bromuro de etidio, homodímero de etidio 1 (EthD-1), homodímero de etidio 2 (EthD-2), monoazida de bromuro de etidio (EMA), dihidroetidio, etc.; compuestos de yoduro tales como yoduro de propidio, yoduro de hexidio, etc.; 7-amino-actinomicina D (7-AAD), pigmentos diméricos de cianina tales como POPO-1, BOBO-1, YOYO-1, TOTO-1, JOJO-1, POPO-3, LOLO-1, BOBO-3, YOYO-3, TOTO-3, etc. (todos son nombres comerciales de Molecular Probes); pigmentos monoméricos de cianina tales como PO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, PO-BRO-3, LO-PRO-1, BU-YRO-3, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, etc. (todos son nombres comerciales de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); pigmentos SYTOX tales como SYBR Gold, SYBR Green I y SYBR Green II, SYTOX Green, SYTOX Blue, SYTOX Orange, etc., (todos son nombres comerciales de Molecular Probes)]; los que se unen a un grupo minoritario de doble hélice de ADN [por ejemplo, 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI; nombres comerciales de Molecular Probes), pentahidrato(bisbenzimida) (Hoechst 33258: nombres comerciales de Molecular Probes), triclorhidrato (Hoechst 33342; nombres comerciales de Molecular Probes), pigmento de bisbenzimida (Hoechst 34580; nombre de comerciales de Molecular Probes), etc.]; los que se unen específicamente a la secuencia de adenina-timina (AT) [por ejemplo, pigmentos de acridina, tales como 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA), bis-(6-cloro-2-metoxi-9-acridinil)espermina (homodímero de acridina), etc.; por ejemplo, hidroxiestilbamidina, etc.] y similares.
El marcaje de un analito o de una molécula de afinidad mediante un marcador detectable puede realizarse por uno cualquiera de los procedimientos habituales usados comúnmente en la técnica, tales como procedimientos de marcaje conocidos que se emplean comúnmente en EIA, RIA, FIA, ensayos de hibridación o similares, que se conocen por sí mismos [por ejemplo, Ikagaku Zikken Koza (Methods in Medical and Chemical Experiments) vol. 8, Editado por Y. Yamanura, 1ª ed., Nakayama-Shoten, 1971; A Kawao, Illustrative Fluorescent Antibodies, 1ª ed., Softscience Inc., 1983; Enzyme Immunoassay, Editado por E. Ishikawa, T. Kawai, y K. Miyai, 3ª ed., Igaku-Shoin, 1987, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nucleic Acid. Res. (1988) 16, 3671, Chu, B. C., et al., Nucleic Acid Res (1986) 14, 6115, Jabloski, et al., Chemistry of Proteins and Crosslinking, Shan S. Wong, (1991) Publicado por CRC Press, documentos EP 1088592 A2, EP 1061370 A2 y similares] y procedimientos habituales que emplean una reacción de avidina (o estreptavidina) y biotina.
E. Puesta en Contacto de la Muestra con una Molécula de Afinidad
Para poner en contacto la muestra que contiene el analito con la molécula de afinidad, se realiza la etapa de contacto para formar un complejo del analito y la molécula de afinidad. No existen limitaciones en términos de cómo puede producirse dicho complejo. Por ejemplo, una muestra que contiene un analito y una molécula de afinidad pueden disolverse, dispersarse o suspenderse, respectivamente, por ejemplo, en agua o tampones tales como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE y similares para dar materiales líquidos, y estos materiales líquidos pueden mezclarse y ponerse en contacto entre sí. Como alternativa, la muestra y la molécula de afinidad pueden disolverse, dispersarse o suspenderse a la vez. En el caso en el que la muestra que contiene un analito sea un líquido, una molécula de afinidad puede mezclarse directamente con la muestra. Si la muestra que contiene un analito es un líquido, como se ha descrito anteriormente, puede no disolverse, dispersarse o suspenderse, por ejemplo, en agua o en los tampones. En el procedimiento mencionado anteriormente, se seleccionó una concentración del tampón a partir del intervalo usado habitualmente en el campo de la presente invención.
En el procedimiento de la presente invención, es difícil definir en general el pH y la temperatura para poner en contacto la muestra con la molécula de afinidad, en otras palabras, para formar un complejo del analito y la molécula de afinidad, puesto que dependen de las propiedades del analito o de la molécula de afinidad. Sin embargo, en la medida en que no alteren la formación del complejo, la condición puede seleccionarse de acuerdo con una forma convencional usada habitualmente en el campo de la presente invención, por ejemplo, EIA, RIA, FIA o ensayos de hibridación conocidos. Es decir, el contacto (por ejemplo, la formación) puede realizarse habitualmente a un pH de entre aproximadamente 2 y 10, preferiblemente a un pH de entre 5 y 9 y habitualmente a una temperatura de entre 0 y 90ºC, preferiblemente de entre 5 y 40ºC. La reacción puede realizarse durante un periodo de unos pocos segundos a varias horas dependiendo de las propiedades respectivas del analito y la molécula de afinidad, puesto que el tiempo de reacción necesario para la formación del complejo varía dependiendo de sus propiedades.
La puesta en contacto de la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados también puede realizarse de diversas formas. Es decir, (i) se hace que contacten la muestra y el conjugado para formar un complejo del analito y el conjugado independientemente sin usar un dispositivo microfluido y, después, se aplica una solución que contiene el complejo obtenido en el dispositivo microfluido para concentrar el complejo o (ii) la muestra y el conjugado se aplican en el dispositivo microfluido y el contacto de la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados y la concentración del complejo obtenido se realizan consecutivamente en el dispositivo microfluido.
Es preferible realizar la etapa de contacto y la etapa de concentración consecutivamente y de forma continua, y es más preferible que se realicen mediante el procedimiento que comprende poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula vehículo cargada, para formar un complejo del analito y el conjugado en un canal conectado de forma fluida con el canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum (micrómetros), y concentrar el complejo mediante el uso de una técnica de concentración en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum (micrómetros). En los procedimientos mencionados anteriormente, el canal conectado de forma fluida con el canal de concentración puede tener las mismas características (materiales, formas, etc.) que el canal de separación descrito anteriormente.
F. Conjugado
Para mejorar o aumentar la eficacia de separación del complejo de analito/molécula de afinidad y la molécula de afinidad libre y analizar el analito con una precisión suficiente, se usa una molécula de afinidad unida a una molécula transportadora cargada, es decir, un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada, en los procedimientos de la presente invención de acuerdo con las reivindicaciones 1-52. Es decir, una muestra que contiene el analito se pone en contacto con un conjugado de molécula de afinidad/molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado, y el complejo resultante se separa de cualquier conjugado no unido en presencia de un polímero cargado mediante el uso de un canal de separación en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación. Después de eso, es posible identificar la presencia del analito o determinar una cantidad del analito en la muestra por detección del complejo.
Cuando se usa un conjugado de una molécula de afinidad (por ejemplo, un anticuerpo) y una molécula transportadora cargada en el formato de ensayo, la molécula transportadora cargada (por ejemplo, un polímero cargado tal como ADN o ARN) de la presente invención puede transportar la molécula de afinidad y cualquier analito unido, al tiempo que proporciona una alta resolución y una señal detectable en un ensayo de clasificación por tamaños. La molécula transportadora cargada en el conjugado proporciona, por ejemplo, una alta resolución y sensibilidad mientras que la molécula de afinidad proporciona, por ejemplo, especificidad a los ensayos de cambio de migración de la invención. La molécula transportadora cargada puede tener una proporción de carga con respecto a masa elevada y un mínimo de formas conformacionales para alta resolución en medios de separación. El uso de una molécula transportadora cargada puede tener muchas ventajas en un ensayo de cambio de migración.
En un procedimiento de ensayo no competitivo, las moléculas transportadoras cargadas de la presente invención incluyen una molécula que, por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada, causa un cambio en la propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito.
En un procedimiento de ensayo competitivo, las moléculas transportadoras cargadas de la presente invención se usan mediante la unión al analito o a un análogo del analito, si es necesario, a través de la molécula de afinidad. Es decir, un analito o un análogo del analito unido a una molécula transportadora cargada también puede usarse para mejorar la separación de un complejo del analito y la molécula de afinidad.
La separación mejorada mediante el uso de las moléculas transportadoras cargadas es beneficiosa en el caso de la separación, por ejemplo, del analito, el análogo, la molécula de afinidad, la molécula transportadora cargada, el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada, un complejo del analito (o del análogo) y la molécula de afinidad, el analito marcado, el análogo marcado, la molécula de afinidad marcada, el conjugado marcado, un complejo del analito marcado (o el análogo marcado) y la molécula de afinidad y/o un complejo del analito (o el análogo) y la molécula de afinidad marcada. En otras palabras, las moléculas transportadoras cargadas de la presente invención tienen una propiedad capaz de causar un cambio en la propiedad de separación del analito (o del análogo) y la molécula de afinidad (o un complejo de la misma) por unión al analito (o al análogo) para formar un complejo del analito (o del análogo), la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada, y de separar el complejo del analito (o del análogo), la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada del analito mencionado anteriormente (o del análogo) (por ejemplo, uno que no contenga tanto el analito o el análogo como la molécula transportadora cargada) que no está implicado en la formación del complejo del analito (o del análogo), la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
La molécula transportadora cargada puede tener una carga positiva neta o una carga negativa neta y es preferible una molécula transportadora cargada que tenga una carga negativa neta. Se usa una molécula transportadora cargada que tiene el mismo tipo (positivo o negativo) de carga neta que el polímero cargado correspondiente.
Las moléculas transportadoras cargadas de la presente invención que tienen el carácter mencionado anteriormente se seleccionan de, por ejemplo, óxidos metálicos inorgánicos tales como sílice y alúmina; metales tales como oro, titanio, hierro y níquel; óxidos metálicos inorgánicos y similares, que tienen grupos funcionales introducidos por procesos de acoplamiento de silano y similares; seres vivos tales como diversos microorganismos y células eucariotas; polisacáridos tales como agarosa, celulosa, dextrano insoluble; compuestos macromoleculares sintéticos tales como látex de poliestireno, copolímero de estireno-butadieno, copolímero de estireno-metacrilato, copolímero de acroleína-dimetacrilato de etilenglicol, látex de estireno-estirenosulfonato, poliacrilamida, metacrilato de poliglicidilo, partículas recubiertas con poliacroleína, poliacrilonitrilo reticulado, copolímero de acrílico o éster acrílico, acrilonitrilo-butadieno, cloruro de vinilo-éster acrílico y acetato de polivinilo-acrilato; moléculas biológicas tales como eritrocitos, azúcares, cadenas de nucleótidos (por ejemplo, ADN, ARN), polipéptidos o derivados de los mismos (por ejemplo, polipéptidos sulfonados), proteínas y lípidos y similares. Una molécula transportadora cargada que tiene una carga negativa neta es preferiblemente una cadena de nucleótidos (por ejemplo, ADN, ARN) o un polipéptido sulfonado, más preferiblemente ADN o ARN. Una molécula transportadora cargada que tiene una carga positiva neta es preferiblemente un polímero catiónico. En la presente invención, es más preferible una molécula aniónica que comprende una cadena de nucleótidos (por ejemplo, ADN, ARN) o un polipéptido sulfonado. El ADN es particularmente adecuado debido a la estabilidad de la molécula y a la síntesis abundante y a la experiencia de química de enlaces en la técnica.
La cadena de nucleótidos usada en la presente invención tiene restos nucleotídicos como unidades básicas que comprenden bases de purina o bases de pirimidina, pentosa como porción de azúcar y fosfatos. Los nucleótidos respectivos se enlazan en los carbonos 3' y 5' de la porción de azúcar a través de los fosfatos para formar una cadena polinucleotídica, por ejemplo, ARN, en el que la porción de azúcar es ribosa, y/o ADN, en el que la porción de azúcar es desoxirribosa. La cadena de nucleótidos puede ser monocatenaria, bicatenaria o más. La cadena de nucleótidos usada en la invención puede prepararse de una forma convencional por sí misma, por ejemplo, síntesis química, un procedimiento para extracción y purificación de las células obtenidas de microorganismos, insectos, animales, plantas, etc., un procedimiento que usa las células mencionadas anteriormente en las que se ha introducido un gen vector adecuado tal como plásmido, fago, cósmido, etc., procedimiento en el que las células se incuban y el vector multiplicado se extrae y se purifica, y un procedimiento que utiliza una técnica de multiplicación de genes tal como PCR (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.). La cadena de nucleótidos resultante se destruye por descomposición química o con una enzima de escisión de ácido nucleico, tal como enzimas de restricción, y después se purifica opcionalmente para formar una cadena de nucleótidos de la longitud deseada. En la presente invención, la molécula transportadora cargada mencionada anteriormente puede usarse en solitario o en una combinación apropiada.
Puede usarse cualquier clase de nucleótidos modificados que se sepa que aumentan la estabilidad del nucleótido, por ejemplo, hacia diversas actividades nucleasa, para generar la molécula transportadora cargada. Por ejemplo, puede usarse un análogo de fosforotioato de nucleótido, un nucleótido que contiene un grupo metileno en lugar de oxígeno en el anillo de ribosa, o un nucleótido que tiene un reemplazo del sustituyente 2'-desoxiazúcar con una modificación 2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2-O-alcoxilo y 2'-O-alilo. Dichas modificaciones se enumeran, por ejemplo, en Nucleic Acids Res., 1997, 25, 4429-4443, Susan M Freier, et al.
Las moléculas transportadoras cargadas pueden variar en tamaño, por ejemplo, habitualmente de aproximadamente 0,6 kDa a 70000 kDa, preferiblemente de aproximadamente 3 kDa a 7000 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 6 kDa a aproximadamente 400 kDa. El tamaño de la molécula transportadora puede optimizarse dependiendo, por ejemplo, del tipo de medio de separación, de los límites de resolución del medio de separación, del tamaño del analito, del tamaño de la molécula de afinidad, etc., para proporcionar una sensibilidad y una resolución útiles. Especialmente en el caso de usar la cadena de nucleótidos como la molécula transportadora cargada, la longitud de la cadena de nucleótidos puede ser habitualmente de entre aproximadamente 1 pb a 100000 pb, preferiblemente de entre 5 pb y 10000 pb, más preferiblemente de entre 10 pb y 1000 pb, más preferiblemente de entre 10 pb y 500 pb, en la medida en que el propósito de la invención pueda lograrse. La cadena de nucleótidos usada en la invención puede modificarse apropiadamente con una adecuada dentro del alcance de lograr el propósito de la invención.
En la presente invención, la unión de la molécula transportadora cargada a la molécula de afinidad puede llevarse a cabo de la misma forma que el marcaje del analito o de la molécula de afinidad mediante el marcador detectable, como se ha mencionado anteriormente. Por ejemplo, la unión de la molécula transportadora cargada a la molécula de afinidad puede llevarse a cabo utilizando los grupos funcionales respectivos de la molécula de afinidad y de la molécula transportadora cargada directamente o a través de un engarce [por ejemplo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfo-succinimidilo (Sulfo-SMPB), 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfo-succinimidilo (Sulfo-SMCC), N-(\varepsilon-maleimido-caproiloxi)succinimida (EMCS), éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), etc.]. La unión puede realizarse de una forma convencional usada habitualmente en este campo, por ejemplo, procedimientos de marcaje conocidos por sí mismos utilizados en EIA, RIA, FIA o ensayos de hibridación conocidos [por ejemplo, Ikagaku Jikken Koza (Experimental Manual in Medical Chemistry), vol. 8, Editado por Yuichi Yamamura, Primera edición, Nakayama Shoten, 1971; Zusetu (IlIustrative Description) Fluorescent Antibodies, Akira Kawao, Primera edición, Soft Science, 1983; Enzyme Immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 3ª Edición, Igaku-Shoin, 1987; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc. documentos EP 1088592 A2, EP 1061370 A2 y similares, o en un procedimiento convencional que utiliza la reacción de avidina (o estreptavidina) con biotina.
Después de la introducción preliminar de un grupo funcional reactivo en la molécula transportadora cargada, la molécula de afinidad puede unirse a la molécula transportadora cargada que contiene el grupo funcional reactivo en el procedimiento de unión mencionado anteriormente. Especialmente en el caso de usar una cadena de nucleótidos como la molécula transportadora cargada, la introducción de un grupo funcional reactivo en la cadena de nucleótidos puede realizarse de acuerdo con un procedimiento conocido por sí mismo incluyendo, por ejemplo, un procedimiento para introducir un grupo funcional reactivo usando un compuesto que tiene un grupo funcional reactivo en el grupo 5'-trifosfato localizado en el extremo terminal del ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto que tiene un grupo amino tal como N-tri-fluoro-acetilaminoalquilamina, un compuesto que tiene un grupo tiol tal como cistamina, un compuesto que tiene biotina tal como N-biotinilaminoalquilamina, un compuesto que tiene un grupo maleimido tal como maleimidoalquilamina, etc.) en la formación de un enlace fosfoamidita en presencia de un agente de condensación, por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida (EDC), clorhidrato (WSC), etc. [Nucleic Acid Res. (1988) 16, 3671, Chu, B. C., et al.]; un procedimiento para introducir un grupo funcional reactivo usando un compuesto que tiene un grupo funcional reactivo en el grupo hidroxilo 3' localizado en el extremo terminal del ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto que tiene un grupo amino tal como ácido N-trifluoroacetilaminoalquilcarboxílico, un compuesto que tiene biotina tal como ácido N-biotinilaminoalquil-carboxílico, un compuesto que tiene un grupo maleimido tal como ácido maleimidoalquilcarboxílico, etc.) en la formación de un enlace éster en presencia de un agente de condensación, por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), clorhidrato (WSC), etc., o la reacción directa con sus ésteres activos [Nucleic Acid Res. (1986) 14, 6115, Jabloski, et al.]; un procedimiento para la introducción de un engarce reactivo con amino en un fragmento escindido por una enzima de restricción en el extremo terminal del que sobresale una base que contiene amino (adenina, citosina) como una cadena sencilla (extremo adhesivo, extremo cohesivo) [Chemistry of Proteins and Crosslinking Shan S. Wong, (1991) Publicado por CRC Press]; un procedimiento para la incorporación de un monómero nucleotídico que tiene un grupo funcional reactivo en un fragmento escindido por una enzima de restricción que forma un extremo sobresaliente de cadena sencilla con una enzima generadora de extremos romos (ADN polimerasa T4, enzima generadora de extremos romos en ADN, etc.) (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.); un procedimiento para utilizar hibridación, en el que se introduce un grupo funcional reactivo en el extremo 5' de un oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria para la porción de cadena sencilla de un fragmento escindido por una enzima de restricción que forma un extremo sobresaliente de cadena sencilla, para hibridar en el extremo sobresaliente de cadena sencilla del fragmento escindido por una enzima de restricción (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.); un procedimiento que utiliza PCR, en el que se usa un cebador de PCR en el que se ha introducido un grupo funcional reactivo en el extremo 5' en una PCR para dar como producto de PCR una cadena de nucleótidos en la que se ha introducido un grupo funcional reactivo en el extremo 5' (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.). Por lo tanto, puede introducirse un grupo funcional reactivo en el extremo terminal de ácidos nucleicos. Cuando se usa un ácido nucleico monocatenario, la cadena de nucleótidos en la que se ha introducido un grupo funcional reactivo también puede prepararse de acuerdo con un procedimiento para hibridar en el ácido nucleico monocatenario un oligonucleótido que tenga una secuencia complementaria al extremo 5' de la cadena de nucleótidos y al grupo funcional reactivo introducido en el extremo 5' (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.). El grupo funcional reactivo que se ha mencionado anteriormente incluye, por ejemplo, un grupo hidroxi, grupo alquilo halogenado, grupo isotiocianato, grupo avidina, grupo biotina, grupo carboxilo, grupo cetona, grupo maleimido, grupo éster activo, grupo haluro de ácido sulfónico, grupo haluro de ácido carboxílico, grupo amino, grupo ácido sulfónico, grupo piilidildio, grupo aldehído y similares.
Cuando el número de la cadena de nucleótidos que se va a unir con la molécula de afinidad es irregular, el número de la cadena de nucleótidos que existe en el complejo formado se vuelve irregular para hacer que la separación del complejo sea inespecífica. Por lo tanto, es preferible unificar el número de la cadena de nucleótidos a unir con la molécula de afinidad. Por la misma razón, es apropiado que el número de la molécula de afinidad que se une a una molécula de la cadena de nucleótidos sea de una molécula.
En el procedimiento de unión mencionado anteriormente, cuando la cadena de nucleótidos tiene un grupo funcional en ambos extremos con el que puede unirse una molécula de afinidad, la cadena de nucleótidos puede escindirse enzimáticamente o químicamente de forma preliminar, de tal modo que se introduce el grupo funcional reactivo en un extremo y, después, se permite que se una con la molécula de afinidad. Como alternativa, se permite que la cadena de nucleótidos se una a la molécula de afinidad para producir un intermedio con el que se une la molécula de afinidad en ambos extremos, y la cadena de nucleótidos que se une al intermedio se escinde enzimáticamente o químicamente para dar un producto en el que la molécula de afinidad está unida a un extremo del ácido nucleico.
Puede usarse química de enlaces para unir la molécula de afinidad con la molécula transportadora cargada para formar un conjugado en la invención. La química de enlaces puede basarse en reacciones con grupos amino, tioles, grupos carboxilo, grupos imidazol, grupo succinimida y similares. Por ejemplo, un transportador de ADN que incluye nucleótidos modificados para tener un grupo amina puede mezclarse en solución con la molécula de afinidad y un engarce NHS de dos extremos, entrecruzando de este modo el ADN con la molécula de afinidad. Otras técnicas para unir o asociar o hacer interaccionar una molécula de afinidad con una molécula transportadora se describen en detalle en el documento WO 02/082083.
El conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada que se va a usar en la presente invención es preferiblemente un conjugado de al menos una molécula de afinidad seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fab', una región variable de anticuerpo, una lectina, avidina, un receptor, un péptido de afinidad, un aptámero y una proteína de unión a ADN, y al menos una molécula transportadora cargada seleccionada del grupo que consiste en una cadena de nucleótidos (por ejemplo, ADN, ARN), polímeros catiónicos y un polipéptido sulfonado. Es más preferible un conjugado de al menos una molécula de afinidad seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fab', una región variable de anticuerpo y un péptido de afinidad y al menos una molécula transportadora cargada seleccionada del grupo que consiste en una cadena de nucleótidos (por ejemplo, ADN, ARN) y un polipéptido sulfonado y, adicionalmente, es más preferible un conjugado de al menos una molécula de afinidad seleccionada de un anticuerpo, un fragmento Fab o Fab' y una cadena de nucleótidos, particularmente ADN, como una molécula transportadora cargada.
En la presente invención, el conjugado mencionado anteriormente puede usarse en solitario o en una combinación apropiada. Cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado se une con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad.
En los procedimientos mencionados anteriormente, es difícil definir en general la concentración del conjugado porque es variable dependiendo del límite de detección del analito. Sin embargo, es deseable mantener el conjugado a una concentración superior que aquella a la que el conjugado puede unirse completamente con el analito a una concentración que se corresponde con el límite de detección definido en la mezcla de reacción. La concentración en la mezcla de reacción se mantiene preferiblemente a 2 veces o más del límite de detección, más preferiblemente a 5 veces o más. Cuando se usan dos o más conjugados, la concentración de cada conjugado se selecciona del intervalo de concentración mencionado anteriormente.
Dicho conjugado es en general uno que puede medirse (por ejemplo, detectarse) o marcarse mediante un marcador detectable por algún procedimiento. Es decir, al menos uno de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada en el conjugado es generalmente uno que puede medirse o marcarse mediante un marcador detectable por algún procedimiento. El uso de un conjugado que tiene dicha propiedad hará fácil medir un analito en una muestra. En el caso en el que pueda detectarse el propio analito por algún procedimiento (por ejemplo, una enzima o similar) o cuando un analito pueda unirse directamente a un marcador detectable sin un conjugado, el analito en la muestra puede medirse incluso si el conjugado no posee dicha propiedad detectable descrita anteriormente. Cuando se usan dos o más conjugados, no es necesario que todos los conjugados tengan dicha propiedad.
El marcador detectable es como se ha descrito anteriormente, y el marcaje del conjugado, por ejemplo, la molécula de afinidad y/o la molécula transportadora cargada, mediante el marcador detectable puede llevarse a cabo de la misma forma que el marcaje del analito o de la molécula de afinidad mediante el marcador detectable o la unión de la molécula transportadora cargada con la molécula de afinidad, como se ha mencionado anteriormente.
Especialmente en el caso de que el conjugado tenga la cadena de nucleótidos como la molécula transportadora cargada, el marcador puede unirse a la cadena de nucleótidos directamente o a través de un engarce [por ejemplo, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, EMCS, NHS, etc.] o un ácido nucleico (que sea diferente de la cadena de nucleótidos que se va a marcar, unida a la molécula de afinidad; en lo sucesivo abreviado como "cadena de nucleótidos engarcea"), péptido, proteína, azúcar y similar (en lo sucesivo abreviado como "sustancia engarcea"). Cuando la cadena de nucleótidos se une al marcador a través de una sustancia engarcea, la unión de la cadena de nucleótidos con la sustancia engarcea o la unión de la sustancia engarcea con el marcador puede realizarse de la misma forma que en la unión de la cadena de nucleótidos con la molécula de afinidad o en el marcaje del conjugado con el marcador.
Como alternativa, puede usarse química de enlaces para unir covalentemente marcadores detectables con el polímero. Por ejemplo, puede sintetizarse ADN como una molécula transportadora cargada usando nucleótidos modificados que incluyen engarces, tales como una cadena alifática con un grupo terminal éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). Un marcador detectable, tal como una amina de tipo fluoresceína, puede unirse covalentemente con el polímero después de un ataque nucleófilo por la NHS en el grupo amina marcador. Opcionalmente, el nucleótido modificado puede incluir un grupo reactivo engarce, tal como una amina, que puede ser atacado por un grupo engarce unido al marcador. Otras técnicas para el marcaje o la unión o asociación o interacción de un conjugado con un marcador detectable se describen en detalle en el documento WO 02/082083.
Al llevar a cabo el marcaje de la cadena de nucleótidos con el marcador a través de una sustancia engarcea, una sustancia engarcea marcada previamente con el marcador puede unirse a la cadena de nucleótidos o, como alternativa, la sustancia engarcea puede unirse a la cadena de nucleótidos, seguido de la unión con el marcador, o se permite que la cadena de nucleótidos, la sustancia engarcea y el marcador se unan todos a la vez. Además, en la presente invención, el marcaje de la cadena de nucleótidos con el marcador puede realizarse antes o al mismo tiempo que o después de la formación del complejo del analito/conjugado (cadena de nucleótidos)/marcador de acuerdo con el marcador que se use. No existen limitaciones para esta modificación. Particularmente, se prefiere unir la cadena de nucleótidos con la sustancia engarcea marcada previamente con el marcador.
Por ejemplo, la biotina se une a una cadena de nucleótidos y después a avidina (o estreptavidina) previamente marcada con un marcador. Por lo tanto, la cadena de nucleótidos puede marcarse fácilmente bajo el control de la cantidad del marcador. En otro caso, por ejemplo, la biotina se une primero a una cadena de nucleótidos y después a una sustancia engarcea (por ejemplo, cadena de nucleótidos engarcea, etc.) marcada con un marcador unido previamente a biotina a través de avidina (o estreptavidina). Por lo tanto, la cadena de nucleótidos puede marcarse fácilmente bajo el control de la cantidad del marcador. Además, puesto que una molécula de avidina (o estreptavidina) puede hacer que se unan 4 moléculas de biotina, es posible hacer que se unan 3 moléculas del engarce marcado para aumentar la sensibilidad de la medición.
El uso de un pigmento fluorescente que se une a un ácido nucleico como marcador puede llevarse a cabo de la forma siguiente. De acuerdo con una forma convencional (por ejemplo, un procedimiento que se describe en el Handbook of Fluorescent Probe and Research Chemicals, 7ª edición, Capítulo 8; Molecular Probes, Inc.), se pone en contacto un marcador con una cadena de nucleótidos [incluyendo la cadena de nucleótidos en un conjugado de molécula transportadora cargada (una cadena de nucleótido)/molécula de afinidad o en un complejo de un analito y un conjugado de molécula transportadora cargada/molécula de afinidad] en una solución de tampón usada habitualmente en el campo de los ensayos de hibridación o inmunoensayos, por ejemplo, agua o tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE, etc., a una temperatura adecuada durante un periodo de tiempo adecuado. En el procedimiento mencionado anteriormente, el contacto de la cadena de nucleótidos con el marcador puede llevarse a cabo por disolución o dispersión o suspensión de la cadena de nucleótidos, una muestra que contiene el analito, el conjugado de molécula transportadora cargada (la cadena de nucleótidos)/molécula de afinidad, el marcador, el complejo del conjugado de molécula transportadora cargada (la cadena de nucleótidos)/molécula de afinidad y el marcador, etc., directamente en agua o un tampón como se ha mencionado anteriormente, o por disolución o dispersión o suspensión de los componentes respectivos en agua o un tampón como se ha mencionado anteriormente para dar productos líquidos, seguido de mezcla de los mismos para ponerlos en contacto entre sí.
En la presente invención, la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito con el conjugado de la molécula transportadora cargada y la molécula de afinidad puede llevarse a cabo de la misma forma que el contacto de la muestra que contiene el analito con la molécula de afinidad que se ha mencionado anteriormente. Las condiciones de reacción (por ejemplo, pH, temperatura, tiempo de reacción, etc.) son las mismas que para la condición mencionada anteriormente de contacto de la muestra y la molécula de afinidad.
G. Uso de Molécula de Afinidad y Conjugado
Para mejorar o aumentar la eficacia de separación del complejo de analito/molécula de afinidad y la molécula de afinidad libre adicionalmente y proporcionar una resolución mayor de detección del analito, puede usarse tanto una molécula de afinidad como una molécula de afinidad unida a una molécula transportadora cargada, por ejemplo, un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada, en el procedimiento mencionado anteriormente. Es decir, se pone en contacto una muestra que contiene el analito con una molécula de afinidad y un conjugado de molécula de afinidad/molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y el conjugado, y el complejo resultante se separa de cualquier molécula de afinidad y/o conjugado no unido en presencia de un polímero cargado mediante el uso de un canal de separación en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación. Después de eso, es posible identificar la presencia del analito o determinar la cantidad del analito en la muestra por detección del complejo.
En la presente invención, pueden usarse dos o más moléculas de afinidad y dos o más conjugados. En este caso, cada molécula de afinidad (incluyendo la molécula de afinidad en cada conjugado) se une con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad.
En el caso de usar tanto la molécula de afinidad como el conjugado, al menos uno de la molécula de afinidad y el conjugado es en general uno que puede medirse (por ejemplo, detectarse) o marcarse mediante un marcador detectable por algún procedimiento convencional. El uso de una molécula de afinidad o de un conjugado que tiene dicha propiedad hará fácil medir un analito en una muestra. En el caso en el que el propio analito pueda detectarse por algún procedimiento (por ejemplo, una enzima o similar), o cuando el analito pueda unirse directamente a un marcador detectable sin una molécula de afinidad o un conjugado, el analito en la muestra puede medirse incluso si la molécula de afinidad y el conjugado no poseen dicha propiedad detectable descrita anteriormente. Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad o dos o más conjugados, no es necesario que todas las moléculas de afinidad o todos los conjugados tengan dicha propiedad. En el procedimiento mencionado anteriormente, un marcador detectable, un marcaje de una molécula de afinidad o de un conjugado mediante el marcador detectable, etc. son como se han descrito anteriormente. No existen limitaciones en cuanto a cómo poner en contacto la muestra que contiene el analito con la molécula de afinidad y el conjugado para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y el conjugado. Por ejemplo, una muestra que contiene un analito, una molécula de afinidad y un conjugado pueden disolverse, dispersarse o suspenderse, respectivamente, por ejemplo, en agua o tampones tales como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE y similares para dar materiales líquidos, y estos materiales líquidos pueden mezclarse y ponerse en contacto entre sí. Como alternativa, la muestra, la molécula de afinidad y el conjugado pueden disolverse, dispersarse o suspenderse juntos a la vez. En el caso en el que la muestra que contiene un analito sea líquida, una molécula de afinidad y/o un conjugado pueden mezclarse directamente con la muestra. Si la muestra que contiene un analito es líquida, como se ha descrito anteriormente, puede no disolverse, dispersarse o suspenderse, por ejemplo, en agua o en los tampones.
En el procedimiento mencionado anteriormente, se selecciona una concentración del tampón del intervalo usado habitualmente en este campo. La concentración de la molécula de afinidad y del conjugado en la etapa de contacto de la muestra con la molécula de afinidad y el conjugado es como se ha mencionado anteriormente. Las condiciones de reacción (por ejemplo, pH, temperatura, tiempo de reacción, etc.) son las mismas que en la condición de contacto de la muestra y la molécula de afinidad mencionada anteriormente.
H. Procedimiento de Separación
El complejo resultante del analito y la sustancia de afinidad (por ejemplo, el complejo de analito/molécula de afinidad, el complejo analito/conjugado o el complejo analito/molécula de afinidad/conjugado) se separa de la sustancia de afinidad libre no implicada en la formación del complejo (por ejemplo, la molécula de afinidad y/o el conjugado). Puede aplicarse un procedimiento de separación en el que el complejo y la sustancia de afinidad libre pueden separarse en base a la diferencia en la velocidad de migración de los mismos. En esta separación, por ejemplo, puede usarse un procedimiento convencional usado en este campo, el denominado procedimiento de separación B/F. Son ejemplos típicos una separación eléctrica que utiliza electricidad tal como electroforesis (por ejemplo, enfoque isoeléctrico, electroforesis en SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en acrilamida), dielectroforesis, etc., análisis en columna (por ejemplo, análisis en columna de filtración en gel, análisis en columna de intercambio iónico, análisis en columna de afinidad), análisis espectrométrico de masas, adsorción, cromatografía electrocinética micelar (MEKC) y similares. En particular, puede usarse preferiblemente una separación eléctrica incluyendo electroforesis o dielectroforesis, tal como enfoque isoeléctrico, electroforesis en SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en acrilamida, etc. Más particularmente, es preferible usar electroforesis capilar o dielectroforesis, ya que pueden realizarse en una condición de refrigeración eficaz y a alto voltaje con una eficacia de separación elevada.
Además, particularmente cuando se usan dispositivos y sistemas microfluidos para realizar la separación, con frecuencia se da el caso de que el analito de interés puede estar presente en la muestra a una concentración muy baja y en volúmenes muy pequeños. Con frecuencia, la cantidad de analito puede caer hasta casi o por debajo del umbral de detección para el sistema analítico microfluido. Por consiguiente, puede ser preferible en ciertas situaciones usar una o más operaciones de concentración de muestra o preconcentración por acumulación de muestra en línea (tal como se ha descrito anteriormente y se describe a continuación) en dispositivos microfluidos para aumentar la sensibilidad de detección para el analito de interés. Un ejemplo particularmente útil de una técnica de concentración de muestra en línea que puede usarse en la práctica de los procedimientos de la presente invención es la isotacoforesis (ITP), tal como se describe en Everaerts, F. M., Geurts, M., Mikkers, F. E. P., Verheggen, T. P. E. M J Chromatogr. 1976, 119, 129-155; Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M., Peek, J. A. F. J. Chromatogr. 1979, 168, 293-315; y Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M., Peek, J. A. F. J. Chromatogr. 1979, 168, 317-332. En la ITP, las muestras se insertan habitualmente entre los electrolitos delantero y trasero con una movilidad electroforética suficientemente superior e inferior, respectivamente. No obstante, los electrolitos delantero y trasero también pueden disponerse en otras combinaciones también, antes o después del lecho de muestra. Véase, por ejemplo, Hirokawa, T, Okamoto, H., Ikuta, N. y Gas, B., "Optimization of Operational Modes for Transient Isotachophoresis Preconcentration-CZE", Analytical Sciences 2001, Vol. 17 Suplemento i185. En última instancia se alcanza una configuración en estado estacionario de acuerdo con principios de límites móviles bien conocidos, y todas las zonas de muestra migran a la misma velocidad. La concentración de muestra en cada zona de migración se ajusta por sí misma con respecto a la concentración de los electrolitos delanteros. En la presente invención, se usó la ITP como un procedimiento de concentración de muestra en el Ejemplo 2 descrito a continuación para realizar un ensayo de AFP en el que se usó Poli (dl-dC) para eliminar la interferencia del suero. Existen muchas otras técnicas de concentración de muestra diferentes usadas en la electroforesis capilar distintas de la ITP que pueden usarse en la práctica de los procedimientos de la presente invención, tales como preconcentración de muestra de campo amplificado (FASS) y extracción en fase sólida (SPE). Por ejemplo, se describe una PASS en una microplaca microfluida usando presión de orificios múltiples y control de flujo electrocinético simultáneo en el documento US 6 695 009. Además, pueden usarse una diversidad de otros procedimientos de concentración de muestra desarrollados recientemente en la práctica de los procedimientos de la presente invención, tales como el uso de cambios de pH en los electrolitos delantero/trasero para crear regiones de preconcentración de muestra (véase, por ejemplo, Weiss, D. J., Saunders, K., Lunte, C. B. Electrophoresis 2001, 22, 59-65; Britz-McKibbin, P., Bebault, G. M., Chen, D. D. Y. Anal Chem. 2000, 72, 1729-1735) y/o mediante equilibrado de la velocidad electroforética de los analitos frente al flujo global de solución en presencia de un gradiente de temperatura (véase, por ejemplo, Ross, D., Locascio, L. E. Anal Chem. 2002, 71, 5137-5145). En la presente invención, pueden utilizarse todos los tampones, cargas, una diversidad de reactivos tales como soluciones de procesamiento, etc., usados convencionalmente en los procedimientos de separación que se han mencionado anteriormente. La concentración de estos materiales puede seleccionarse opcionalmente de acuerdo con los procedimientos de separación conocidos. La condición para la separación (por ejemplo, pH, temperatura, voltaje aplicado, tiempo y similares) puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con procedimientos conocidos.
I. Dispositivo Microfluido
En la presente invención, puede realizarse una separación del complejo del analito y la sustancia de afinidad (por ejemplo, el complejo de analito/molécula de afinidad, el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado) de la sustancia de afinidad libre no implicada en la formación del complejo (por ejemplo, la molécula de afinidad y/o el conjugado) mediante el uso de un sistema microfluido que incluye generalmente un dispositivo microfluido y un detector, basado en los procedimientos de separación mencionados anteriormente. Los procedimientos de la presente invención están bien adaptados a la aplicación en dispositivos microfluidos. Pueden introducirse muestras en dispositivos microfluidos para ensayos de cambios de migración rápidos y precisos usando volúmenes mínimos de reactivos y muestras. Pueden introducirse mezclas de muestras con una sustancia de afinidad (por ejemplo, molécula de afinidad y/o conjugado) en tampones bajos en sal, mientras que los tampones en el medio de separación tienen un contenido en sal superior para proporcionar un efecto de "preconcentración" de los componentes de la mezcla de ensayo que se acumulan en el frente del bolo de muestra para una mayor sensibilidad y una mejor resolución. Las muestras pueden explorarse en un formato de exploración de alto rendimiento, por ejemplo, por aspiración de muestras de microplacas de bibliotecas de muestras o placas multipocillo (por ejemplo, de 96, 384 convencionales u otras placas multipocillo de mayor tamaño) a dispositivos microfluidos (por ejemplo, microplacas) para una exploración, adquisición de datos e interpretación de datos rápida. El dispositivo microfluido puede tener, por ejemplo, uno o más canales de separación que contienen el medio de separación y fluyen hacia una región del canal de detección o a un canal de detección separado donde el efluente se controla mediante un detector. Los dispositivos microfluidos de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, un detector para detectar los componentes separados en la muestra. Dichos detectores pueden incluir, por ejemplo, sistemas de exploración de geles, detectores de fluorescencia, o detectores de polarización de fluorescencia.
El dispositivo microfluido a usar en la presente invención tiene típicamente una estructura de cuerpo que incluye y/o contiene al menos un componente fluido, por ejemplo, un canal, cámara, pocillo o similar, que tiene al menos una dimensión de sección transversal que es de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 \mum, teniendo con frecuencia estos canales y/o cámaras al menos una dimensión de sección transversal de entre aproximadamente 0,1 \mum y 200 \mum, en algunos casos de entre aproximadamente 0,1 \mum y 100 \mum y, con frecuencia, de entre aproximadamente 0,1 \mum y 20 \mum. Dichas dimensiones de sección transversal incluyen, por ejemplo, anchura, profundidad, altura, diámetro o similares. Típicamente, las estructuras que tienen estas dimensiones se describen también como que son a "escala microscópica". Los dispositivos microfluidos de acuerdo con la presente invención incluyen típicamente al menos uno y, preferiblemente, más de un canal y/o cámara dispuestos dentro de una sola estructura de cuerpo. Dichos canales o cámaras pueden ser distintos y estar separados o, como alternativa, pueden estar en conexión fluida. Dichas conexiones fluidas pueden proporcionarse por canales, intersecciones de canales, válvulas y similares. Pueden existir intersecciones de canales en varios formatos, incluyendo intersecciones en cruz, intersecciones en "T" o cualquier número de otras estructuras por las que dos canales están en comunicación fluida.
La estructura de cuerpo de los dispositivos microfluidos descritos en este documento comprende típicamente una agregación de dos o más componentes separados que, cuando se combinan o se unen entre sí apropiadamente, forman el dispositivo microfluido de la presente invención, por ejemplo, que contiene los canales y/o cámaras descritos en este documento. Típicamente, los dispositivos microfluidos descritos en este documento se fabrican como un agregado de capas de sustrato. En particular, dichos dispositivos preferidos comprenden una porción superior, una porción inferior y una porción interior, en los que la porción interior define sustancialmente los canales y cámaras del dispositivo. Puede emplearse una diversidad de materiales de sustrato como la porción inferior. Típicamente, debido a que los dispositivos se microfabrican, se seleccionarán los materiales de sustrato en base a su compatibilidad con técnicas de microfabricación conocidas, por ejemplo, fotolitografía, grabado químico húmedo, ablación láser, técnicas de abrasión por aire, moldeo por inyección, estampado y otras técnicas. Los materiales de sustrato también se seleccionan generalmente por su compatibilidad con el intervalo completo de condiciones a las que pueden exponerse los dispositivos microfluidos, incluyendo extremos de pH, temperatura, concentración salina y aplicación de campos eléctricos. Por consiguiente, en algunos aspectos preferidos, el material de sustrato puede incluir materiales asociados normalmente con la industria de semiconductores, en la que se emplean con regularidad dichas técnicas de microfabricación incluyendo, por ejemplo, sustratos basados en sílice, tales como cristal, cuarzo, silicio o polisilicio, así como otros materiales de sustrato tales como arseniuro de galio y similares. En el caso de materiales semiconductores, a menudo será deseable proporcionar un recubrimiento o capa aislante, por ejemplo, óxido de silicio, sobre el material de sustrato y, particularmente, en las aplicaciones en las que se vayan a aplicar campos eléctricos al dispositivo o a su contenido.
En aspectos preferidos adicionales, los materiales de sustrato comprenderán materiales poliméricos, por ejemplo, plásticos tales como polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato, politetrafluoroetileno (TEFLON^{TM}), polivinilcloruro (PVC), polidimetilsiloxano (PDMS), polisulfona, poliestireno, polimetilpenteno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilidina, ABS (copolímero de acrilonitrilo-butadieno-estireno) y similares. Dichos sustratos poliméricos se fabrican fácilmente usando técnicas de microfabricación disponibles como se han descrito anteriormente, o a partir de matrices microfabricadas usando técnicas de moldeo bien conocidas, tales como moldeo por inyección, estampado o troquelado o similares. Se prefieren dichos materiales de sustrato poliméricos por su facilidad de fabricación, bajo coste y disponibilidad, así como por ser inertes en general a la mayoría de condiciones de reacción extremas. De nuevo, estos materiales poliméricos pueden incluir superficies tratadas, por ejemplo, superficies derivatizadas o recubiertas, para potenciar su utilidad en el sistema microfluido, por ejemplo, proporcionar una dirección de fluido mejorada, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.885.470.
El sistema microfluido de la presente invención incluye preferiblemente un detector. Un detector que controle la elución desde el canal de separación puede detectar la elución del complejo de sustancia de afinidad/analito (por ejemplo, complejo de molécula de afinidad/analito, complejo de conjugado/analito o complejo de molécula de afinidad/conjugado/analito) antes de que la sustancia de afinidad libre (por ejemplo, molécula de afinidad libre y/o conjugado libre) alcance el detector. Dispositivos microfluidos tales como el Agilent DNA 500 LabChip® pueden proporcionar un análisis rápido de múltiples muestras con una sensibilidad y resolución elevadas.
Un detector puede situarse para detectar la sustancia de afinidad libre y/o el complejo de sustancia de afinidad/analito a medida que se eluyen del medio de separación en el canal de separación. La sustancia de afinidad (por ejemplo, conjugado) puede detectarse sin modificaciones o pueden asociarse marcadores detectables con la sustancia de afinidad (por ejemplo, conjugado) para aumentar la sensibilidad de detección. La sustancia de afinidad (por ejemplo, conjugado) puede incluir ciertas moléculas transportadoras cargadas, tales como polímeros, que sean detectables, por ejemplo, por sus características de absorbancia de luz distintivas. Por ejemplo, el ADN como una molécula transportadora cargada puede tener una fuerte absorbancia a aproximadamente 260 nm para la detección mediante un espectrofotómetro a medida que se eluye del medio de separación.
Pueden situarse detectores, por ejemplo, en el extremo efluente de un canal de separación para controlar la elución de picos detectables. Opcionalmente, un detector puede explorar a través de un medio de separación, tal como un gel de poliacrilamida, para detectar las posiciones relativas del complejo separado y la sustancia de afinidad libre (por ejemplo, molécula de afinidad libre y/o conjugado libre). El detector puede ser cualquier tipo apropiado para el marcador detectable, tal como un detector de absorbancia, detector de fluorescencia, detector de polarización de fluorescencia, espectrofotómetro, sistema de detección de fosfoimágenes, voltímetro, contador de centello, refractómetro y/o similares. Dichos detectores pueden proporcionar una señal de salida digital o analógica que puede interpretarse para identificar y/o cuantificar un analito.
La interpretación de la salida del detector con respecto al tiempo puede usarse, por ejemplo, para determinar la presencia de un analito y/o para cuantificar la cantidad del analito presente en la muestra. Pueden interpretarse parámetros de los picos tales como tiempo de retención, velocidad de migración, altura del pico, localización del pico y proporciones de los picos para identificar la presencia del analito y/o cuantificar la cantidad del analito en una muestra. Pueden emplearse técnicas analíticas convencionales, tales como el uso de muestras de referencia, muestras patrón y análisis de regresión para interpretar los resultados de los análisis.
El sistema y dispositivo microfluido (por ejemplo, microplaca microfluida) de la presente invención, tal como el Agilent Bioanalyzer 2100 usando el DNA 500 LabChip, puede proporcionar separaciones rápidas de alta resolución usando cargas de muestra pequeñas. Como se muestra en la Figura 2, el dispositivo microfluido (20) puede tener, por ejemplo, pocillos de muestra y/o pocillos de reactivo (21) conectados a través de microcanales de flujo controlado. El dispositivo de la presente invención puede comprender, por ejemplo, una microplaca microfluida con pocillos para el polímero bloqueante y la sustancia de afinidad (por ejemplo, molécula de afinidad y/o conjugado) y un tubo capilar aspirador (22) para dividir en alícuotas muestras de la placa multipocillo (23). La microplaca puede incluir, por ejemplo, microcanales fusionados para mezclar componentes de ensayo, canales de incubación (24) para dar tiempo a las reacciones y canales de separación (25) rellenos con medio de separación. Los sistemas de control de flujo pueden dirigir el contacto de un polímero cargado de un pocillo y la muestra del aspirador a través de microcanales fusionados, seguido de la mezcla con la sustancia de afinidad (por ejemplo, molécula de afinidad y/o conjugado) del pocillo de sustancia de afinidad. Después de un periodo adecuado de flujo en un canal de incubación, la muestra procesada puede aplicarse en un medio de separación de, por ejemplo, poli-N,N-dimetilacrilamida (pDMA) en tampón, en el que la sustancia de afinidad libre (por ejemplo, molécula de afinidad libre y/o conjugado libre) se separa del complejo de sustancia de afinidad/analito (por ejemplo, complejo de molécula de afinidad/analito, complejo de conjugado/analito o complejo de molécula de afinidad/analito/conjugado). La sustancia de afinidad libre puede abandonar el canal de separación en primer lugar, para que se detecte antes de cualquier complejo de sustancia de afinidad/analito. El detector (26), tal como un detector de fluorescencia, controla los tampones que abandonan el canal de separación para detectar la sustancia de afinidad marcada fluorescente con una gran sensibilidad y envía una señal de salida a un circuito lógico. La información de la separación puede interpretarse para identificar la presencia del analito (por ejemplo, complejo de sustancia de afinidad/analito) y/o la cantidad de analito.
Se usan opcionalmente una diversidad de procedimientos de transporte de material de acuerdo con dichos dispositivos microfluidos. Por ejemplo, en un aspecto preferido, el movimiento de material a través de los canales de un dispositivo está causado por la aplicación de diferenciales de presión a través de los canales por los que se desea el flujo de material. Esto puede conseguirse por aplicación de una presión positiva en un extremo de un canal o de una presión negativa en el otro extremo. En redes de canales complejos, pueden controlarse caudales controlados en todos los diversos canales interconectados mediante la inclusión de válvulas y similares dentro de la estructura del dispositivo, por ejemplo, para abrir y cerrar el flujo por un canal dado. Como alternativa, pueden ajustarse las resistencias de canales para establecer la velocidad, el ritmo y/o volumen de movimiento de material por diferentes canales, incluso bajo un solo diferencial de presión aplicado, por ejemplo, vacío aplicado en un solo orificio de canal. Se ilustran ejemplos de dichas redes de canales en, por ejemplo, los documentos WO 00/45 712, US 6 511 853 y
WO 00/58 719.
Como alternativa, para aplicaciones microfluidas de la presente invención, pueden usarse sistemas de transporte electrocinético controlado. Este tipo de transporte electrocinético se describe en detalle en la Patente de Estados Unidos Nº 5.858.195. Dichos sistemas de transporte y dirección de material electrocinéticos incluyen los sistemas que dependen de la movilidad electroforética de especies cargadas dentro del campo eléctrico aplicado a la estructura. Más particularmente se hace referencia a dichos sistemas como sistemas de transporte de material electroforéticos. Otros sistemas de dirección y transporte de material electrocinéticos dependen del flujo electroosmótico de fluido y material dentro de una estructura de canal o cámara que es el resultado de la aplicación de un campo eléctrico a través de dichas estructuras. En resumen, cuando se sitúa un fluido en un canal que tiene una superficie que lleva grupos funcionales cargados, por ejemplo, grupos hidroxilo en canales de cristal o microcapilares de cristal grabados, esos grupos pueden ionizarse. En el caso de grupos funcionales hidroxilo, esta ionización, por ejemplo, a pH neutro, da como resultado la liberación de protones desde la superficie y hacia el fluido, creando una concentración de protones cerca de la interfaz fluido/superficie o una cubierta cargada positivamente rodeando el fluido global en el canal. La aplicación de un gradiente de voltaje a lo largo del canal, provocará que la cubierta de protones se mueva en la dirección de la disminución del voltaje, es decir, hacia el electrodo negativo.
La expresión "transporte y dirección de material electrocinético controlado", como se usa en este documento, se refiere a sistemas electrocinéticos como se han descrito anteriormente, que emplean un control activo de los voltajes aplicados en múltiples, es decir, más de dos, electrodos. En otras palabras, dichos sistemas electrocinéticos controlados regulan al mismo tiempo gradientes de voltaje aplicados a través de al menos dos canales entrecruzados. En particular, los dispositivos y sistemas microfluidos preferidos descritos en este documento incluyen una estructura de cuerpo que incluye al menos dos canales o conductos fluidos entrecruzados, por ejemplo, cámaras cerradas interconectadas cuyos canales incluyen al menos tres extremos terminales no entrecruzados. La intersección de dos canales se refiere a un punto en el que dos o más canales están en comunicación fluida entre sí e incluye intersecciones en "T", intersecciones en cruz, intersecciones en "rueda de vagón" de múltiples canales o cualquier otra geometría de canal en la que dos o más canales estén en dicha comunicación fluida. Un extremo terminal no entrecruzado de un canal es un punto en el que termina un canal sin que sea resultado de la intersección de ese canal con otro canal, por ejemplo, una intersección en "T". En aspectos preferidos, los dispositivos incluirán al menos tres canales entrecruzados que tienen al menos cuatro extremos terminales no entrecruzados. En una estructura de canal en cruz básica, en la que un canal horizontal individual intersecciona y se cruza con un canal vertical individual, el transporte de material electrocinético controlado funciona dirigiendo de forma controlada el flujo de material a través de la intersección, proporcionando flujos restringidos desde los otros canales en la intersección. Por ejemplo, suponiendo que se desease transportar un primer material a través del canal horizontal, por ejemplo, de izquierda a derecha, a través de la intersección con el canal vertical. El simple flujo de material electrocinético de este material a través de la intersección podría lograrse por aplicación de un gradiente de voltaje a lo largo del canal horizontal, es decir, aplicando un primer voltaje en el extremo terminal izquierdo de este canal y un segundo voltaje inferior en el extremo terminal derecho de este canal, o dejando el extremo terminal derecho en flotación (sin aplicación de voltaje). Sin embargo, este tipo de flujo de material a través de la intersección daría como resultado una cantidad sustancial de difusión en la intersección, como resultado tanto de las propiedades difusivas naturales del material que se transporta en el medio usado, así como de los efectos convectivos en la intersección.
En el transporte de material electrocinético controlado, el material que se transporta a través de la intersección se restringe por el flujo a un nivel reducido desde los canales laterales, por ejemplo, los canales superior e inferior. Esto se consigue por aplicación de un ligero gradiente de voltaje a lo largo de la trayectoria de flujo de material, por ejemplo, desde el extremo terminal superior o inferior del canal vertical, hacia el extremo terminal derecho. El resultado es una "constricción" del flujo de material en la intersección que evita la difusión del material hacia el canal vertical. Después, el volumen de material constreñido en la intersección puede inyectarse en el canal vertical por aplicación de un gradiente de voltaje a lo largo del canal vertical, es decir, desde el extremo terminal superior hasta el extremo terminal inferior. Para evitar cualquier exudación de material del canal horizontal durante esta inyección, se dirige de nuevo un nivel reducido de flujo hacia los canales laterales, dando como resultado una "retirada" del material de la intersección.
Además de los esquemas de inyección constreñida, el transporte de material electrocinético controlado se utiliza fácilmente para crear válvulas virtuales que no incluyen partes mecánicas o móviles. En concreto, con respecto a la intersección en cruz descrita anteriormente, el flujo de material desde un segmento a otro del canal, por ejemplo, del brazo izquierdo al brazo derecho del canal horizontal, puede regularse, interrumpirse y reiniciarse eficazmente por un flujo controlado del canal vertical, por ejemplo, del brazo inferior al brazo superior del canal vertical. En concreto, en el modo "desconectado" el material se transporta desde el brazo izquierdo a través de la intersección y hacia el brazo superior por aplicación de un gradiente de voltaje a través de los extremos terminales izquierdo y superior. Un flujo restringido se dirige desde el brazo inferior hasta el brazo superior por aplicación de un gradiente de voltaje similar a lo largo de esta trayectoria (del extremo terminal inferior al extremo terminal superior). Después, se dispensan cantidades medidas de material desde el brazo izquierdo hacia el brazo derecho del canal horizontal cambiando el gradiente de voltaje aplicado de la izquierda a la parte superior a de izquierda a derecha. La cantidad de tiempo y el gradiente de voltaje aplicado establecen la cantidad de material que se dispensará de esta forma. Aunque se han descrito con fines ilustrativos con respecto a una intersección en cruz de cuatro vías, estos sistemas de transporte de material electrocinético controlado pueden adaptarse fácilmente para redes de canales interconectados más complejas, por ejemplo, matrices de canales paralelos interconectados.
Cuando la migración de la sustancia de afinidad (por ejemplo, molécula de afinidad y/o conjugado) a través del medio de separación se dirige por un potencial de voltaje, tal como en la electroforesis, pueden aplicarse grandes cargas en tampones bajos en sal para proporcionar una sensibilidad mejorada al tiempo que se conserva una resolución adecuada. Si la muestra contiene sólo una concentración reducida de analito o si la mezcla se diluye mucho en la manipulación, puede ser deseable cargar una muestra de gran tamaño en el medio de separación para una mejor sensibilidad en el análisis de cambio de migración. No obstante, una muestra de gran tamaño puede introducirse en el medio de separación como un amplio bolo que se eluye como picos anchos escasamente resueltos. Este problema puede reducirse por aplicación de la muestra en un tampón bajo en sal mientras que la electroforesis se procesa en un tampón de procesamiento de mayor contenido en sal. La muestra baja en sal es relativamente deficiente en transportadores cargados para la corriente electroforética, de tal modo que los componentes de muestra cargados se mueven rápidamente para acumularse en el frente del bolo de muestra. Los componentes de muestra cargados se acumulan en una banda afilada en el frente del bolo de muestra cuando alcanzan el tampón de procesamiento de mayor contenido en sal con los transportadores de carga abundantes. De este modo, puede aplicarse una muestra diluida de gran volumen en un medio de separación electroforética para la detección de picos más intensos sin una pérdida de resolución sustancial.
El detector del sistema puede incluir cualquier dispositivo apropiado para la señal de interés. Cuando la sustancia de afinidad tiene un espectro de absorbancia de luz útil, el detector puede ser un espectrofotómetro. Cuando la sustancia de afinidad tiene un marcador detectable asociado, el detector puede ser un tipo adecuado para el marcador. Por ejemplo, un fluorómetro para un marcador fluorescente, un contador de centelleo para un marcador radiactivo, un tubo fotodiódico para un marcador quimioluminiscente y similares. Si la separación se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), el detector puede incluir, por ejemplo, un sistema de exploración que detecte el grado de migración de bandas de sustancia de afinidad libre y/o de complejo de sustancia de afinidad/analito a lo largo del gel. Si la separación se lleva a cabo por cromatografía o electroforesis capilar, el detector puede ser, por ejemplo, un detector apropiado concentrado en la corriente efluente del medio de separación para detectar la sustancia de afinidad y/o el complejo de sustancia de afinidad/analito a medida que se eluyen a lo largo del tiempo. Dichos detectores pueden proporcionar señales de salida analógicas o digitales que pueden interpretarse mediante un circuito lógico de la invención.
Los circuitos lógicos del dispositivo pueden recibir, por ejemplo, señales cuantitativas de los detectores que varían en función de la cantidad de sustancia de afinidad detectada, por ejemplo, en una localización del gel o en un efluente cromatográfico a lo largo del tiempo. El circuito lógico puede ser tan simple como un sistema de registro de gráficas que represente la amplitud de señal sobre un papel gráfico móvil, o puede ser un sistema informático o de software digital sofisticado. Un software comúnmente disponible, tal como Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer - Biosizing [DNA 7500], puede proporcionar, por ejemplo, identificaciones de picos, alturas de picos, integraciones del área de picos, resta del fondo, análisis de regresión, para identificar y cuantificar analitos.
J. Medios de Separación
En la presente invención, es preferible usar un medio de separación tal como un polímero que tiene un efecto de tamizado molecular en un canal de separación del dispositivo microfluido mencionado anteriormente y realizar la separación por el medio de separación. No existen limitaciones particulares para el medio de separación (por ejemplo, carga) envasado en el canal de separación en la medida en que se haya usado de forma convencional en el campo de la presente invención.
En concreto, la separación de la sustancia de afinidad libre y el complejo de analito/sustancia de afinidad se realiza preferiblemente mediante electroforesis capilar en gel, por ejemplo, en un medio de separación dispuesto en un canal de separación de un dispositivo microfluido. En la electroforesis capilar en gel, el medio de separación es, por ejemplo, una matriz restringida de polímeros lineales o reticulados que pueden dificultar el flujo de moléculas de gran tamaño al tiempo que permiten el flujo libre de moléculas más pequeñas.
Dichos medios de separación pueden incluir, por ejemplo, poliéteres tales como óxido de polietileno (PEO), polietilenglicol (PEG), óxido de polipropileno, etc.; polialquileniminas tales como polietilenimina, etc.; polímeros de tipo ácido poliacrílico tales como ácido poliacrílico, éster de poliacrilato, poliacrilato de metilo, etc.; polímeros de tipo poliamida, tales como poliacrilamida, polimetacrilamida, poli-n,n-dimetilacrilamida (pDMA), etc.; polímeros de tipo ácido polimetacrílico tales como ácido polimetacrílico, éster de polimetacrilato, polimetacrilato de metilo, etc.; polímeros de tipo polivinilo tales como acetato de polivinilo, polivinilpirrolidona (PVP), poliviniloxazolidona, etc.; polímeros de hidroxilo hidrosolubles tales como pululano, yersinano, xantano, dextrano, goma guar, gel de agarosa, etc.; celulosa hidrosoluble tal como metilcelulosa, hidroxietilcelulosa (HEC), hidroxipropilcelulosa, etc.; copolímeros hidrosolubles tales como copolímero de sacarosa y epiclorohidrina [por ejemplo, Ficoll (un nombre comercial, Pharmacia)]; y sus derivados, y copolímeros que contienen múltiples clases de unidades monoméricas constituyendo sus polímeros. Los medios de separación pueden usarse solos o en combinación de dos o más miembros. Entre ellos, son preferibles un gel de poliacrilamida, polietilenglicol (PEG), óxido de polietileno (PEO), un copolímero de sacarosa y epiclorohidrina (Ficoll), polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC), poli-N,N-dimetilacrilamida (pDMA) y gel de agarosa. Es más preferible la poli-N,N-dimetilacrilamida (pDMA).
Dichos medios pueden cargarse en canales de separación de un dispositivo microfluido para proporcionar, por ejemplo, separaciones rápidas de alto rendimiento. En la presente invención, no es necesario usar los medios de separación mencionados anteriormente, pero la separación también puede realizarse usando solamente agua o un tampón.
El peso molecular de los medios de separación mencionados anteriormente es habitualmente de entre aproximadamente 500 Da y 6.000 kDa, preferiblemente de 1 a 1.000 kDa, más preferiblemente de 100 a 1.000 kDa. La concentración del medio de separación usado como se ha mencionado anteriormente se selecciona opcionalmente dentro del intervalo empleado habitualmente en el campo de la presente invención, es decir, habitualmente entre aproximadamente el 0,01 y el 40% (p/v), preferiblemente del 0,01 al 20% (p/v), más preferiblemente del 0,1 al 10% (p/v). Habitualmente, en el interior del canal de separación del dispositivo microfluido, el medio de separación mencionado anteriormente se envasa junto con un tampón.
No existen limitaciones particulares sobre el tipo de tampón que puede usarse en la práctica de los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, el tampón a usar puede incluir muchos de los usados en el campo de los ensayos de hibridación, inmunoensayos y similares, tales como, por ejemplo, tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE, etc. Estos tampones pueden usarse habitualmente en una concentración de entre aproximadamente 0,1 mM y 10 M, preferiblemente de 1 mM a 5 M, más preferiblemente de 5 mM a 1 M. El pH del tampón puede estar en cualquier intervalo en el que la separación de sustancia no se vea afectada desfavorablemente, y es habitualmente de entre aproximadamente 2 y 3, preferiblemente de 4 a 11, más preferiblemente de 5 a 9. Dichos parámetros pueden optimizarse para conseguir una preconcentración por amplificación de campo si se desea. Cuando el medio de separación mencionado anteriormente se añade a un tampón, la viscosidad del tampón es habitualmente de entre aproximadamente 2 y 1.000 milipascales segundo (centipoises), preferiblemente de 5 a 200 milipascales segundo (centipoises), más preferiblemente de 10 a 100 milipascales segundo (centipoises).
La separación también puede ser, por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaños (SEC). La resina de SEC puede tener poros lo bastante grandes como para admitir la sustancia de afinidad (por ejemplo, molécula de afinidad y/o conjugado), pero no lo bastante grandes para admitir el complejo de sustancia de afinidad/analito (por ejemplo, complejo de molécula de afinidad/analito, complejo de conjugado/analito o complejo de molécula de afinidad/analito/conjugado). Cuando la mezcla se bombea a través de una columna de resina de SEC, el complejo de sustancia de afinidad/analito fluye solamente en el volumen fuera de la resina, mientras que la sustancia de afinidad libre fluye más lentamente a través del volumen exterior más el volumen de resina interior.
K. Detección
El complejo de analito/sustancia de afinidad (por ejemplo, el complejo de analito/molécula de afinidad, el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado) o la sustancia de afinidad libre (por ejemplo, molécula de afinidad libre y/o conjugado libre) que no está implicada en la formación del complejo separado por el procedimiento de separación mencionado anteriormente puede medirse o detectarse mediante un procedimiento que se corresponda con las propiedades de la propiedad detectable de las moléculas implicadas (por ejemplo, el marcador detectable asociado con las mismas). Por lo tanto, puede determinarse la cantidad del analito en una muestra o puede identificarse la presencia del analito en la muestra. Es decir, el complejo de analito/molécula de afinidad se separa de la molécula de afinidad libre que no está implicada en la formación del complejo, el complejo de analito/conjugado se separa del conjugado libre que no está implicado en la formación del complejo o el complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado se separa de la molécula de afinidad libre y/o del conjugado que no están implicados en la formación del complejo, de acuerdo con la separación mencionada anteriormente. El complejo resultante, o la molécula de afinidad libre y/o el conjugado libre pueden medirse o detectarse mediante un procedimiento que se corresponda con las propiedades de los mismos (es decir, el marcador detectable). Por lo tanto, puede determinarse la cantidad del analito en una muestra o puede identificarse la presencia del analito en la muestra con gran sensibilidad y en un periodo de tiempo reducido.
Se muestran en las Figuras 3A a 3F varias realizaciones específicas de la presente invención. Pueden usarse una diversidad de técnicas de ensayo inmunoquímicas conocidas en la técnica en la práctica de la presente invención para detectar un analito de interés en la muestra, tales como ensayos de anticuerpos de tipo sándwich e inmunoensayos ligados a enzimas (véase, por ejemplo, Bolton et al., Handbook of Experimental Immunology, Weir, D. M., Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986, vol. 1, Capítulo 26, para una discusión general sobre inmunoensayos) y otros formatos de ensayo similares conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente y se muestra por ejemplo en la Figura 3A, el formato de ensayo puede usarse para separar un complejo (30), que comprende un analito (32) y un conjugado (31) correspondiente, que comprende una molécula de afinidad (34) tal como un anticuerpo o antígeno unido (por ejemplo, conjugado) a una molécula transportadora cargada marcada (36), por ejemplo, un molécula de ADN marcada fluorescentemente que tiene una o más etiquetas fluorescentes unidas a la misma, de cualquier conjugado de anticuerpo/molécula transportadora cargada libre (no unido) (31) (para mayor comodidad y claridad, la etapa de separación se representa mediante el símbolo "/" en las figuras). Como alternativa, puede realizarse un formato de inmunoensayo de tipo sándwich como se muestra en las Figuras 3B-F, en el que se utiliza un complejo de resto de unión etiquetado (por ejemplo, marcado)/analito, tal como un complejo de anticuerpo marcado fluorescentemente/analito, para unirse de forma detectable a otro resto de unión (por ejemplo, un anticuerpo marcado o no marcado o un conjugado de ADN-anticuerpo).
Un primer ejemplo de un inmunoensayo de tipo sándwich se ilustra esquemáticamente en la Figura 3B, que ilustra la unión del complejo de antígeno/anticuerpo marcado (31) a otra molécula de afinidad, por ejemplo, el anticuerpo (39). La muestra que contiene el analito de interés (32) se preincuba preferiblemente con el conjugado marcado (31) para formar el complejo de resto de unión/analito. La Figura 3C muestra un formato de inmunoensayo de tipo sándwich en el que el segundo anticuerpo (39) incluye un marcador fluorescente y el conjugado de ADN-anticuerpo (31) no está marcado. Las Figuras 3D-F muestran un formato de inmunoensayo de tipo sándwich en el que se usan dos (o más) conjugados de ADN-anticuerpo (31, 31') (Figura 3D) y en el que también se usa una tercera molécula de afinidad marcada o no marcada (39) (Figuras 3E-F). Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad como se muestra en las Figuras 3B-F, por ejemplo, cada molécula de afinidad se une típicamente al analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad.
En las Figuras 3A a 3F mencionadas anteriormente, uno, dos o más de dos de cada uno de los conjugados (31) y (31'), el conjugado marcado (31), la molécula de afinidad (39) y la molécula de afinidad marcada (39) pueden usarse en la práctica de los procedimientos de la presente invención de acuerdo con las reivindicaciones 1-52. Son ejemplos específicos no limitantes de ensayos que emplean el formato de ensayo de tipo sándwich los siguientes:
(a)
Se describe un procedimiento para determinar o identificar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con una o más moléculas de afinidad, estando al menos una de las mismas marcada mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito y la molécula de afinidad marcada mediante el marcador detectable; (ii) separar el complejo de cualquier molécula de afinidad libre marcada mediante el marcador detectable que no esté implicado en la formación del complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado; (iii) medir la cantidad del complejo separado o detectar la presencia del complejo separado; y (iv) determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada; en el que la molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse al analito y en el que cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad:
(b)
Se describe un procedimiento para determinar o identificar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde al menos uno de los uno o más conjugados está marcado mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito y el conjugado marcado mediante el marcador detectable; (ii) separar el complejo del conjugado marcado mediante el marcador detectable que no está implicado en el complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado; (iii) medir la cantidad del complejo separado o detectar la presencia del complejo separado; y (iv) determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada; en el que la molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse al analito y, cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada. En otras palabras, la molécula transportadora cargada causa un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito y permite que un complejo que contiene el analito y el conjugado marcado mediante el marcador detectable se separe del conjugado marcado mediante el marcador detectable que no está implicado en el complejo, por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar el complejo que contiene el analito y el conjugado marcado mediante el marcador detectable.
(c)
Se describe un procedimiento para determinar o identificar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con una o más moléculas de afinidad y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde al menos una de las moléculas de afinidad o al menos uno de los conjugados está marcado mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito, la molécula de afinidad y el conjugado; (ii) separar el complejo de cualquier molécula de afinidad libre marcada mediante el marcador detectable o del conjugado marcado mediante el marcador detectable que no está implicado en la formación del complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado; (iii) medir la cantidad del complejo separado o detectar la presencia del complejo separado; y (iv) determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada; en el que la molécula de afinidad y la molécula de afinidad en el conjugado tienen una propiedad capaz de unirse al analito y cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad, y la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada. En otras palabras, la molécula transportadora cargada causa un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito y permite que un complejo que contiene el analito, la molécula de afinidad y el conjugado se separe de la molécula de afinidad libre marcada mediante el marcador detectable o del conjugado libre marcado mediante el marcador detectable que no están implicados en el complejo, por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar el complejo que contiene el analito, la molécula de afinidad y el conjugado.
Como alternativa, el analito en una muestra puede medirse mediante los denominados ensayos competitivos, en los que se emplea analito marcado o analito unido con la molécula transportadora cargada (o el análogo marcado del analito o el análogo del analito unido a la molécula transportadora cargada) para reacciones competitivas entre el analito marcado o el analito unido con la molécula transportadora cargada (o el análogo marcado del analito o el análogo del analito unido a la molécula transportadora cargada) y el analito en la muestra.
En ensayos competitivos, la molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado (o al análogo marcado). Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito marcado de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo marcado de cualquier otra molécula de afinidad. Además, cuando el analito existe tanto en una forma unida con una proteína u otra sustancia de unión (por ejemplo, la forma unida) como en una forma no unida con una proteína u otra sustancia de unión (por ejemplo, la forma no unida) en una muestra, en la que la forma unida y la forma no unida están en equilibrio, puede usarse el ensayo competitivo que usa el análogo del analito para analizar la forma no unida del analito.
Otras realizaciones de la presente invención que usan el formato de ensayo competitivo se muestran típicamente en las Figuras 3G a 3K. En las realizaciones que se muestran por ejemplo en las Figuras 3G-J, puede usarse un ensayo competitivo en el que un analito marcado o un análogo marcado del analito (por ejemplo, analito 32') compite con un analito de interés (32) en la muestra por la unión a una o más moléculas de afinidad no marcadas, tales como un anticuerpo o un conjugado de ADN-anticuerpo (por ejemplo, el conjugado o conjugados de ADN-anticuerpo 31 y/o 31'). Pueden usarse múltiples moléculas de afinidad cuando sea deseable o necesario proporcionar una mayor resolución de la señal detectable en el ensayo de clasificación por tamaños, como se muestra por ejemplo en las Figuras 3H y 3I. En otra realización que se muestra por ejemplo en la Figura 3K, puede usarse un ensayo competitivo en el que un analito o un análogo de analito (por ejemplo, analito 32') unido con una molécula transportadora cargada (por ejemplo, cadena de nucleótidos) compite con un analito de interés (32) en la muestra por la unión a una o más moléculas de afinidad marcadas tales como un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo marcado 39). En las Figuras 3G a 3K mencionadas anteriormente, puede usarse uno, dos o más de dos de los conjugados (31) y (31'), la molécula de afinidad (39) y la molécula de afinidad marcada (39) en la práctica de los procedimientos de la presente invención.
En el procedimiento de la presente invención mencionado anteriormente, cuando la forma no unida del analito se determina mediante el uso del análogo del analito, es preferible que el análogo del analito no reaccione sustancialmente con proteínas u otras sustancias de unión que se unen con el analito para formar la forma unida. La molécula de afinidad marcada en la Figura 3K se une con al menos el analito de la forma no unida y el análogo. Es preferible que la molécula de afinidad marcada se una con el analito de la forma no unida y el análogo pero no se una con el analito de la forma unida.
Son ejemplos específicos de ensayos realizados mediante el uso del formato de ensayo competitivo los siguientes:
(a)
Se describe un procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con el analito (o el análogo) marcado mediante un marcador detectable y una o más moléculas de afinidad para formar un primer complejo del analito en la muestra y la molécula de afinidad y un segundo complejo del analito marcado (o del análogo marcado) y la molécula de afinidad; (ii) separar el segundo complejo de cualquier analito marcado libre (o análogo marcado libre) que no esté implicado en la formación del segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado; (iii) medir la cantidad del segundo complejo separado o la cantidad del analito marcado libre separado (o del análogo marcado libre separado); y (iv) determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida; en el que la molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado o una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al análogo marcado, y en el que cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito marcado de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo marcado de cualquier otra molécula de afinidad. La afinidad de la molécula de afinidad hacia el analito en la muestra y el analito marcado es preferiblemente la misma, o la afinidad de la molécula de afinidad hacia el analito en la muestra y el análogo marcado es preferiblemente la misma. En el procedimiento mencionado anteriormente, cuando la forma no unida del analito se analiza mediante el uso del análogo del analito, es necesario que el análogo del analito no sea sustancialmente reactivo con proteínas u otras sustancias de unión que se unen con el analito para formar la forma unida.
(b)
Se describe un procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con el analito (o el análogo) marcado mediante un marcador detectable y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un primer complejo del analito en la muestra y el conjugado y un segundo complejo del analito marcado (o del análogo marcado) y el conjugado; (ii) separar el segundo complejo de cualquier analito marcado libre (o análogo marcado libre) que no esté implicado en la formación del segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado; (iii) medir la cantidad del segundo complejo separado o la cantidad del analito marcado libre (o del análogo marcado libre separado); y (iv) determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida; en el que la molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado o al analito en la muestra y al análogo marcado, y cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito marcado de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo marcado de cualquier otra molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito marcado (o del análogo marcado) por unión al analito marcado (o al análogo marcado) a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito marcado (o del análogo marcado), la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada. En otras palabras, la molécula transportadora cargada causa un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito marcado (o del análogo marcado) y permite que un segundo complejo del analito marcado (o del análogo marcado) y el conjugado se separe del analito marcado libre (o análogo marcado libre) que no está implicado en el complejo, por unión con el analito marcado (o el análogo marcado) a través de la molécula de afinidad para formar el segundo complejo del analito marcado (o del análogo marcado) y el conjugado. La afinidad de la molécula de afinidad hacia el analito en la muestra y el analito marcado es preferiblemente la misma, o la afinidad de la molécula de afinidad hacia el analito en la muestra y el análogo marcado es preferiblemente la misma. En el procedimiento de la presente invención mencionado anteriormente de acuerdo con la reivindicación 27, cuando se analiza la forma no unida del analito mediante el uso del análogo del analito, es necesario que el análogo del analito no sea sustancialmente reactivo con proteínas u otras sustancias de unión que se unen con el analito para formar la forma unida.
(c)
Se describe un procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con el analito unido a una molécula transportadora cargada (o el análogo unido a una molécula transportadora cargada), una o más moléculas de afinidad marcadas mediante un marcador detectable para formar un primer complejo del analito unido a la molécula transportadora cargada (o del análogo unido a una molécula transportadora cargada) y la molécula de afinidad marcada y un segundo complejo del analito en la muestra y la molécula de afinidad marcada; (ii) separar el primer complejo de cualquier segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado; (iii) medir la cantidad del primer complejo separado o la cantidad del segundo complejo; y (iv) determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida; en el que la molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito unido a la molécula transportadora cargada o al analito en la muestra y al análogo unido a la molécula transportadora cargada, y en el que cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito unido a la molécula transportadora cargada en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito unido a la molécula transportadora cargada de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo unido a la molécula transportadora cargada en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo unido a la molécula transportadora cargada de cualquier otra molécula de afinidad, y la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del primer complejo por unión al analito (o al análogo) para formar un complejo del analito (o del análogo), la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada. En otras palabras, la molécula transportadora cargada causa un cambio en una propiedad de separación (por ejemplo, migración) del analito marcado (o del análogo marcado) y permite que un complejo del analito (o del análogo) que no está unido a la molécula transportadora cargada y la molécula de afinidad marcada se separe del segundo complejo del analito y la molécula de afinidad marcada, por unión al analito marcado (o al análogo marcado) para formar el primer complejo del analito unido a la molécula transportadora cargada (o del análogo unido a una molécula transportadora cargada) y la molécula de afinidad marcada. En el procedimiento de la presente invención mencionado anteriormente de acuerdo con la reivindicación 28, la unión de la molécula transportadora cargada al analito o al análogo del analito puede llevarse a cabo de la misma forma que la unión de la molécula transportadora cargada a la molécula de afinidad que se ha mencionado anteriormente. En el procedimiento de la presente invención mencionado anteriormente de acuerdo con la reivindicación 28, cuando la forma no unida del analito se analiza mediante el uso del análogo del analito, es necesario que el análogo del analito no sea sustancialmente reactivo con proteínas u otras sustancias de unión que se unen con el analito para formar la forma unida. La molécula de afinidad marcada se une con al menos el analito de la forma no unida y el análogo. Es preferible que la molécula de afinidad marcada se una con el analito de la forma no unida y el análogo pero no se una con el analito de la forma unida. Cuando la molécula de afinidad marcada se une con el analito de la forma unida, el analito de la forma no unida y el análogo, en la etapa de medición (iii) mencionada anteriormente se mide la cantidad del primer complejo separado o la cantidad total del segundo complejo, la molécula de afinidad marcada libre y un complejo del analito de la forma unida y la molécula de afinidad marcada.
El análogo mencionado anteriormente del analito que se va a usar en la presente invención tiene una propiedad capaz de unirse con la molécula de afinidad de una forma similar a como se une el analito con la molécula de afinidad. Es decir, el análogo tiene un grupo o grupos funcionales (por ejemplo, un sitio o sitios de unión) en su estructura que son funcionalmente los mismos que el grupo o grupos funcionales del analito que interaccionan con la molécula de afinidad y el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada. La introducción de un marcador detectable y/o una molécula transportadora cargada en la molécula de análogo no altera la función de dicho grupo o grupos en la estructura del análogo en términos de la interacción con la molécula de afinidad. El análogo en la presente invención incluye uno que está modificado, cambiado, desnaturalizado o tiene eliminada una parte de la estructura del analito. Dichos análogos incluyen, por ejemplo, una proteína de recombinación que introduce una variación en una parte de una proteína del analito, péptidos que modifican o cambian una parte de la secuencia de péptidos del analito, ácidos nucleicos que modifican o cambian una parte de la secuencia de ácidos nucleicos del analito y similares.
En el caso mencionado anteriormente para analizar la forma no unida del analito, el analito de interés es uno que existe tanto en una forma unida con una proteína u otra sustancia de unión (por ejemplo, la forma unida) como en una forma no unida con una proteína u otra sustancia de unión (por ejemplo, la forma no unida) en una muestra y en la que la forma unida y la forma no unida están en equilibrio. Dichos analitos incluyen, por ejemplo, T4, cortisol, progesterona, estradiol, testosterona, PSA, proteína C, elastasa, catepsina G, trombina, C_{1}-esterasa, plasmina, activador del plasminógeno de tipo tisular y similar. No existen limitaciones particulares para la proteína u otras sustancias de unión en la forma unida en la medida en que tengan una afinidad por el analito y una propiedad capaz de unirse con el analito. Estas proteínas u otras sustancias de unión incluyen, por ejemplo, globulina, prealbúmina o albúmina en el caso de T4 como el analito de interés, globulina o albúmina en el caso de cortisol, progesterona, estradiol o testosterona, \alpha_{1}-antiquimiotripsina o \alpha_{2}-macroglobulina en el caso de PSA, inhibidor de proteína C en el caso de proteína C, inhibidor de \alpha_{1}-tripsina en el caso de elastasa, \alpha_{1}-antiquimiotripsina en el caso de catepsina G, antitrombina III en el caso de trombina, inhibidor de C_{1} en el caso de C_{1}-esterasa, inhibidor de \alpha_{2}-plasmina en el caso de plasmina, inhibidor del activador del plasminógeno 1 en el caso de activador del plasminógeno de tipo tisular y similares.
En los procedimientos mencionados anteriormente, en la determinación de la cantidad del analito en una muestra en base a la cantidad medida del marcador detectable del complejo separado o del marcador detectable que no está implicado en la formación del complejo, por ejemplo, se usa otra muestra que contiene el analito a una concentración conocida en la misma medición que se ha mencionado anteriormente para preparar una curva de calibración que muestre una relación entre la cantidad del analito obtenido de este modo y la del marcador detectable del complejo separado o del marcador detectable que no está implicado en la formación del complejo. A esta curva de trabajo se ajusta el valor medido del marcador detectable obtenido por medición de una muestra que contiene el analito para determinar la cantidad del analito deseado.
Además, es posible calcular la cantidad relativa del analito contenido en una muestra por adición de una sustancia detectable como patrón interno a una concentración conocida a una muestra, seguida de la comparación de la cantidad de la sustancia añadida como patrón interno con la del marcador detectable del complejo separado o del marcador detectable que no está implicado en la formación del complejo. De esta forma, se hace posible corregir el error entre el uso de múltiples dispositivos.
En el procedimiento de la presente invención, la medición del marcador detectable del complejo separado o del marcador detectable que no está implicado en la formación del complejo puede conseguirse de acuerdo con una forma convencional que responde al tipo de marcador detectable usado. Por ejemplo, cuando la propiedad del marcador depende de una actividad enzimática, la medición puede realizarse en una forma convencional de EIA o hibridación como se describe en, por ejemplo, "Enzyme Immunoassay" Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Volumen Suplementario 31, Editado por Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tuji y Eiji Ishikawa, páginas 51-63, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Publicado el 10 de septiembre de 1987. Cuando el analito es un material radiactivo, puede detectarse de acuerdo con una forma convencional de RIA o hibridación usando un detector adecuado tal como un contador GM de inmersión, contador de centelleo líquido, contador de centelleo de pocillos, etc., que responde a la clase e intensidad de la radiación emitida por el material radiactivo [véase: Ikagaku Jikken Koza (Experimental Manual in Medical Chemistry), vol. 8, Editado por Yuichi Yamamura, Primera edición, Nakayama Shoten, 1971; Seikagaku Jikkenn Koza (Experimental Manual in Biochemistry), 2, Experimental Procedure for Tracer, Último volumen, Akihiro Takemura, Tasuku Honjo, páginas 501-525, Tokyo Kagaku Dojin, Publicado el 25 de febrero de 1977]. Cuando la propiedad del marcador depende de la fluorescencia, la medición puede realizarse en una forma convencional de FIA o hibridación usando un detector tal como un fluorofotómetro o un microscopio láser confocal como se describe en Zusetu (Illustrative Description) Fluorescent Antibodies, Akira Kawao, Primera edición, Soft Science, 1983; Seikagaku Jikkenn Koza (Experimental Manual in Biochemistry), 2, Chemistry of Nucleic Acid III, Mineo Saneyoshi, páginas 299-318, Tokyo Kagaku Dojin, Publicado el 15 de diciembre de 1977. Cuando la propiedad del marcador depende de la luminiscencia, la medición puede realizarse de una forma convencional usando un detector tal como un contador de fotones de acuerdo con un procedimiento como se describe en, por ejemplo, "Enzyme Immunoassay" Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Volumen Suplementario 31, Editado por Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tuji y Eiji Ishikawa, páginas 252-263, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Publicado el 10 de septiembre de 1987. Además, cuando la propiedad es de absorbancia en una región ultravioleta, la detección puede realizarse de una forma convencional usando un detector tal como un espectrofotómetro. Cuando la propiedad es de coloración, la detección puede realizarse de una forma convencional usando un detector tal como un espectrofotómetro o microscopio. Además, cuando el analito tiene una propiedad de espín, la detección puede realizarse de una forma convencional usando un detector tal como un aparato de resonancia del espín electrónico, de acuerdo con un procedimiento como se describe en, por ejemplo, en "Enzyme Immunoassay". Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Volumen Suplementario 31, Editado por Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tuji y Eiji Ishikawa, páginas 264-271, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Publicado el 10 de septiembre de 1987. La detección también puede ser por polarización de fluorescencia.
El procedimiento para la determinación o identificación en la presente invención puede realizarse de acuerdo con los procedimientos conocidos por sí mismos mencionados anteriormente usando reactivos apropiadamente seleccionados de una forma convencional por sí misma excepto por la etapa adicional de realizar la separación en presencia del polímero cargado, donde el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de los componentes de muestra que tienen una carga opuesta a la molécula transportadora cargada, preferiblemente realizando tanto la separación como el contacto de la muestra (el analito) y la sustancia de afinidad para formar un complejo.
La presencia de analito en la muestra puede identificarse, por ejemplo, por detección de un cambio de migración de la molécula de afinidad marcada, un cambio de migración del conjugado marcado de la molécula de afinidad, un cambio de migración del analito marcado o de su análogo marcado y/o su complejo con la correspondiente molécula de afinidad, o un cambio de migración del analito marcado o de su análogo marcado y/o su complejo con su correspondiente conjugado de la molécula de afinidad, o su combinación. También puede usarse un cambio de migración del complejo del analito conjugado con una molécula transportadora cargada y la correspondiente molécula de afinidad, o un cambio de migración del complejo del análogo del analito conjugado con una molécula transportadora cargada y la correspondiente molécula de afinidad marcada para identificar la presencia del analito. El análisis de muestras de control negativas, sin analito, puede procesarse en el ensayo para determinar el tiempo de elución del pico de dicha molécula marcada y/o su complejo o su velocidad de migración a través del medio de separación. Puede realizarse el procesamiento de muestras de control positivas, que contienen una cantidad detectable de analito de referencia, en el ensayo para determinar el tiempo de elución del pico de la molécula marcada y/o su complejo o su velocidad de migración a través del medio de separación. Cuando se procesan muestras desconocidas en el mismo ensayo, puede identificarse la presencia del analito por detección de un pico con el mismo tiempo de retención o velocidad de migración que el pico de molécula marcada y/o su complejo. Para asegurar que el pico identificado no es sólo una interferencia de fondo en el ensayo, pueden usarse técnicas de validación de procedimientos convencionales para determinar un valor umbral de altura de pico o área de pico que proporcione una confianza estadística de que se haya detectado una señal real sobre el fondo.
Pueden añadirse marcadores internos a cada muestra para proporcionar un marco de referencia para la identificación de picos o para ajustar los tiempos de elución por la variabilidad interensayo, permitiendo comparaciones precisas entre procesamientos de ensayo. Por ejemplo, pueden añadirse marcadores detectables de alto peso molecular y de bajo peso molecular a muestras para agrupar los picos de conjugado en un marco de referencia. Si los tiempos de elución varían de un procesamiento a otro, todavía pueden identificarse picos de conjugado por sus posiciones relativas entre los marcadores internos, como saben los especialistas en la técnica.
La cantidad de analito presente en una muestra puede determinarse por comparación de la altura del pico o del área del pico del complejo de conjugado/analito identificado con una curva patrón. La curva patrón puede ser, por ejemplo, una ecuación que represente los valores de altura o área de picos para una o más muestras patrón que tienen cantidades conocidas de analito. Pueden introducirse en la fórmula valores de altura o área de picos de una muestra desconocida para determinar la cantidad de analito en la muestra. Los valores de altura o área de picos pueden ajustarse por resta del fondo de un control negativo para aumentar la exactitud de la determinación.
El analito puede cuantificarse relacionando las proporciones de altura de picos o proporciones de área de picos para picos de conjugado libre y de complejo con una fórmula o gráfica de valores. La fórmula o gráfica de concentraciones frente a las concentraciones de analito puede calcularse u obtenerse empíricamente para el ensayo, como se sabe en la técnica. La adición de marcadores internos puede mejorar los datos de cuantificación por comparación con resultados obtenidos de diferentes procesamientos de ensayos con una cantidad conocida del analito.
Al llevar a cabo el procedimiento de la invención, cuando se usa una cadena de nucleótidos y existe una posibilidad de existencia de una nucleasa o nucleasas tales como ADNasa, ARNasa, etc., es apropiado añadir un inhibidor de nucleasas tal como bis(2-aminoetiléter)tetraacetato de etilenglicol (EGTA), tetraacetato de etilendiamina (EDTA), heparina y similares a una solución que contiene una cadena de nucleótidos.
En resumen, cuando la cadena de nucleótidos se pone en contacto con otra sustancia (por ejemplo, muestra, molécula de afinidad o conjugado) o cuando el complejo de analito/sustancia de afinidad se separa de la sustancia de afinidad libre no implicada en la formación del complejo, es apropiado añadir un inhibidor como se ha mencionado anteriormente a una solución que contiene la cadena de nucleótidos o a una solución que se pone en contacto con la cadena de nucleótidos para llevar a cabo el contacto en presencia del inhibidor.
Los reactivos y otros materiales usados para realizar la presente invención pueden formularse en una composición o kit para separar un conjugado libre de una molécula transportadora cargada y una molécula de afinidad, y un complejo de un analito en la muestra y el conjugado, de tal modo que el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención puede llevarse a cabo sucesivamente. En concreto, la composición o kit para separar un conjugado libre de una molécula transportadora cargada y una molécula de afinidad, y un complejo de un analito en la muestra y el conjugado de la presente invención comprende un medio de separación y un polímero cargado. En una realización preferida de la composición o kit mencionado anteriormente, el conjugado se marca mediante un marcador detectable. Más preferiblemente, la molécula transportadora cargada en el conjugado se marca mediante el marcador detectable. La composición o kit mencionado anteriormente puede comprender además la molécula de afinidad. En este caso, al menos uno de la molécula de afinidad y el conjugado (por ejemplo, la molécula de afinidad y/o la molécula transportadora cargada en el conjugado) se marca preferiblemente mediante el marcador detectable. La realización preferida de ejemplos de los respectivos componentes es como se han mencionado anteriormente. La composición o kit mencionada anteriormente puede usarse en combinación con un dispositivo microfluido que puede comercializarse como parte del kit.
III. Procedimiento de Concentración
En la presente invención, se realizan procedimientos de concentración con el fin de concentrar un analito de interés en la muestra mediante el uso de un dispositivo microfluido y aplicar un analito concentrado de una concentración elevada al ensayo de cambio de migración. Pueden usarse una diversidad de procedimientos de concentración en el dispositivo microfluido para concentrar un analito en la muestra, tales como las denominadas técnicas de concentración de muestra en línea. Las operaciones de concentración de muestra o preconcentración por acumulación de muestra en línea pueden clasificarse en dos tipos: (i) técnicas de concentración electroforéticas, que utilizan una diferencia en la movilidad electroforética de constituyentes de muestra en un capilar (por ejemplo, FASS, FASI, ITP, IF, etc.) y (ii) técnicas de concentración por adsorción química, que utilizan adsorbentes (por ejemplo, SPE, etc.) (R. L. Chien, Electrophoresis, 24, 486-497, 2003).
Por ejemplo, pueden usarse los siguientes procedimientos de concentración: (i) FASS (Preconcentración de Muestra por Amplificación de Campo) que utiliza la diferencia de conductividad eléctrica de un dominio de concentración y un dominio de separación (por ejemplo, documento US 6 695 009, Weiss, D. J., Saunders, K., Lunte, C. E. Electrophoresis 2001, 22, 59-65; Britz-McKibbin, P., Bebault, G. M., Chen, D. D. Y. Anal Chem. 2000, 72, 1729-1735, Ross, D., Locascio, L. E. Anal Chem. 2002, 71, 5137-5145), (ii) FASI (Inyección de Muestra por Amplificación de Campo), por la que se inserta un lecho de agua diminuto entre el dominio de concentración y el dominio de separación en el FASS (por ejemplo, "Field amplified sample injection in high-performance capillary electrophoresis", Chien, R. L et al. J. Chromatogr. 1991, 559, 141-148), (iii) ITP (Isotacoforesis), que utiliza las diferencias de movilidad de iones en el dominio intercalado entre una solución delantera y una solución trasera (por ejemplo, Everaerts, F. M., Geurts, M., Mikkers, F. E. P., Verheggen, T. P. E. M J Chromatagr. 1976, 119, 129-155; Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M., Peek, J. A. F. J. Chromatogr. 1979, 168, 293-315; y Mikkers, F. E. P., Everaerts, F. M., Peek, J. A. F. J. Chromatogr. 1979, 168, 317-332, Hirokawa, T, Okamoto, H., Ikuta, N. y Gas, B., "Optimization of Operacional Modes for Transient Isotachophoresis Preconcentration-CZE," Analytical Sciences 2001, Vol. 17 Suplemento il85, (iv) IF (Enfoque isoeléctrico), que utiliza la diferencia del punto isoeléctrico entre las sustancias (por ejemplo, "High performance isoelectric focusing using capillary electrophoresis instrumentation", Wehr T, et al. Am. Biotechnol. Lab. 1990, 8, 22, "Fast sand high resolution analysis of human serum transferring by high performance isoelectric focusing in capillaries", Kilar F. et al., Electrophoresis 1989, 10, 23-29), (v) SPE (Extracción en Fase Sólida) que utiliza una interacción específica entre una fase sólida (por ejemplo, una fase sólida con adsorbente unido tal como un receptor) y un analito para adsorber el analito en la fase sólida (por ejemplo, "Microchip-based purification of DNA from Biological Samples", Breadmore M. et al. Anal. Chem. 2003, 75, 1880-1886).
IV. Procedimientos de Concentración de la Invención
La presente invención proporciona procedimientos que comprenden concentrar el analito que no se ha concentrado eficazmente mediante los procedimientos de concentración conocidos descritos anteriormente con una concentración elevada y detectar el analito con gran sensibilidad por reducción de la interferencia en la operación objetivo (por ejemplo, en la etapa de separación y de detección) por cualquier constituyente innecesario distinto del analito en la muestra que se concentra simultáneamente con el analito (por ejemplo, "constituyentes de interferencia" que interfieren en la detección del analito). Además, la presente invención también proporciona procedimientos para optimizar las condiciones de reacción para concentrar fácilmente la sustancia objetivo para la medición sensible del analito.
Una característica de la presente invención es que, en los procedimientos de concentración mencionados anteriormente, se concentra un complejo del analito y el conjugado o un complejo del analito, el conjugado y la molécula de afinidad formado por contacto (por ejemplo, reacción) del analito en la muestra con una molécula de afinidad unida a una molécula transportadora cargada (por ejemplo, un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada). Es decir, el procedimiento de concentración de la presente invención se lleva a cabo para resolver los problemas que se mencionan a continuación: a) Cuando el analito en la muestra tiene un tamaño molecular muy grande y/o una carga eléctrica pequeña, la movilidad electroforética del analito se vuelve lenta (por ejemplo, se reduce). Como resultado, es difícil concentrar mucho dicho analito en poco tiempo, por ejemplo, se hace difícil concentrar dicha sustancia eficazmente. b) Cuando constituyentes innecesarios (por ejemplo, constituyentes de interferencia) en la muestra distintos del analito migran hacia la misma región que la sustancia objetivo, los constituyentes innecesarios se concentran simultáneamente con el analito. Como resultado, cuando la muestra concentrada que incluye el analito se usa como la muestra para la separación y la detección, los niveles de fondo y de interferencia se elevan y como resultado se produce una reducción de la sensibilidad del ensayo (por ejemplo, la sensibilidad del ensayo se reduce). c) Cuando el analito coexiste con constituyentes de interferencia en la muestra como en el caso de una muestra de suero clínica, es muy difícil optimizar las condiciones de reacción de tal modo que el analito se concentre al tiempo que los constituyentes de interferencia innecesarios no se concentren simultáneamente con el analito o se concentren en una región diferente de la del analito (por ejemplo, en este caso, la etapa de optimización de la concentración es muy importante para una detección sensible. Sin embargo, encontrar dicha condición óptima requiere mucho tiempo y es laborioso).
Los procedimientos de la presente invención usan por lo tanto una molécula transportadora cargada (por ejemplo, un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada) que puede concentrar eficazmente un analito que tiene un peso molecular muy grande y/o una carga relativamente pequeña a una concentración elevada y que puede concentrar el analito en una región de migración en la que la concentración de los constituyentes innecesarios (por ejemplo, constituyentes de interferencia) sea menor o de aproximadamente cero, o en una región de migración en la que no existan constituyentes de interferencia innecesarios (por ejemplo, una región de migración en la que la concentración de constituyentes de interferencia sea menor o mediante el control de la movilidad de migración del analito por selección de una molécula transportadora cargada adecuada y optimización de las condiciones de reacción para concentrar el analito).
Por ejemplo, cuando el analito está presente en suero, los constituyentes de interferencia (por ejemplo, proteínas que coexisten en la muestra, etc.) migran y se concentran en la misma región que el analito. El complejo formado por reacción del analito y el conjugado de molécula de afinidad/molécula transportadora cargada, en el que la molécula transportadora cargada, tal como ADN, es de una longitud adecuada (por ejemplo, de 50 a 3000 pb), migra y se concentra en una región diferente de los constituyentes de interferencia en el suero (por ejemplo, una región en la que la concentración de los constituyentes de interferencia es menor o de aproximadamente cero).
En la presente invención, la expresión "constituyentes innecesarios" (por ejemplo, "constituyentes de indeferencia") se refiere en general a sustancias distintas del analito que coexisten en la muestra o en una solución que contiene el analito y que migran y se concentran en la misma región que el analito, y que interfieren en la separación o en la detección del analito cuando se realiza la electroforesis mediante procedimientos de electroforesis convencionales.
Los constituyentes innecesarios (por ejemplo, constituyentes de interferencia) incluyen, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, hemoglobina, metales, pigmentos biológicos de azúcares, lípidos, electrolitos y similares. La expresión "constituyentes innecesarios" también se refiere en general a materiales usados en la reacción de marcaje de la molécula de afinidad o del analito (o su análogo) y que permanecen en las preparaciones de material marcado incluso después de etapas de purificación. En general también se refiere a moléculas de afinidad marcadas que no reaccionan con el analito y que permanecen como una forma no unida, o analitos marcados que no reaccionan con la molécula de afinidad y que permanecen como una forma no unida en la mezcla de reacción. El procedimiento de la presente invención puede llevarse a cabo, por ejemplo, de la siguiente forma o formas. Es decir, una muestra que contiene el analito se pone en contacto con un conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, y el complejo resultante migra a la región de concentración de constituyentes de interferencia reducida o cero (por ejemplo, una región con escasos constituyentes de interferencia) y se concentra mediante el uso de un canal de concentración (por ejemplo, preconcentración por acumulación) en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum. Después de eso, por aplicación de este complejo al ensayo de cambio de migración, es posible identificar la presencia del analito o determinar la cantidad del analito en la muestra por detección del complejo con una gran sensibilidad.
A. Conjugado
Mediante la selección de una molécula transportadora cargada adecuada en el conjugado de la invención, es posible controlar la propiedad de migración (por ejemplo, movilidad) del analito. El conjugado puede marcarse mediante un marcador detectable como se ha descrito anteriormente. El marcador detectable, los ejemplos preferibles del mismo, el procedimiento de marcaje usado, etc., son los mismos que se han descrito anteriormente. En los procedimientos mencionados anteriormente, para concentrar el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/conjugado/molécula de afinidad, se usa un canal de concentración (por ejemplo, de preconcentración por acumulación) en un dispositivo microfluido. Para concentrar dichas moléculas y sus complejos en un canal microfluido por medio de los procedimientos de concentración ejemplificados anteriormente, dichas moléculas que se van a concentrar se diluyen preferiblemente en un tampón adecuado con un pH y una fuerza iónica adecuados. Por ejemplo, cuando se selecciona un procedimiento de concentración de FASS, dichas moléculas que se van a concentrar se diluyen en tampón de baja conductividad y, después, se ponen en contacto y se someten a la etapa de concentración. Por ejemplo, una muestra de suero que incluye un analito de interés y un conjugado de una molécula de afinidad que reconoce el analito específicamente y la molécula cargada se diluyen 10 veces mediante tampón HEPES 7,5 mM (pH 7,5) que incluye NaCl 7,5 mM.
B. Muestra y Analito
La muestra y el analito son los mismos que se han descrito anteriormente. Especialmente, el procedimiento de concentración de la presente invención es útil para un analito que migra y se concentra en la misma región que los constituyentes de interferencia y para un analito que genera un complejo junto con una molécula afinidad y/o su conjugado y que migra y se concentra en la misma región que los constituyentes de interferencia usando procedimientos convencionales. Para concentrar dicho analito y su complejo en un canal microfluido eficazmente por medio de los procedimientos de concentración ejemplificados anteriormente, dicho analito que se va a concentrar se diluye preferiblemente en un tampón adecuado con un pH y una fuerza iónica adecuados. Por ejemplo, cuando se selecciona un procedimiento de concentración de FASS, el analito que se va concentrar se diluye en un tampón de baja conductividad y, después, se pone en contacto y se somete a la etapa de concentración. Por ejemplo, un suero que incluye un analito de interés se diluye 10 veces con tampón HEPES 7,5 mM (pH 7,5), que incluye NaCl 7,5 mM.
C. Puesta en Contacto de la Muestra con un Conjugado
La etapa de contacto se realiza por contacto de la muestra que contiene el analito con el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada. No existen limitaciones en términos de cómo puede formarse dicho complejo. Por ejemplo, una muestra que contiene un analito y un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada pueden disolverse, dispersarse o suspenderse, respectivamente, por ejemplo, en agua o tampones tales como tampón Tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE y similares para dar materiales líquidos, y estos materiales líquidos pueden mezclarse y ponerse en contacto entre sí. Como alternativa, la muestra y el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada pueden disolverse, dispersarse o suspenderse juntos a la vez. En el caso en el que una muestra que contiene un analito sea un líquido, un conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada puede mezclarse directamente con la muestra. Si la muestra que contiene un analito es un líquido, como se ha descrito anteriormente, puede no disolverse, dispersarse o suspenderse, por ejemplo, en agua o en los tampones. En el procedimiento mencionado anteriormente, se selecciona una concentración del tampón del intervalo usado habitualmente en el campo de la presente invención. El pH del tampón también se selecciona del intervalo usado habitualmente en el campo de la presente invención. Por ejemplo, cuando se concentra una mezcla de una muestra y un conjugado de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada mediante un procedimiento de FASS, la etapa de contacto se lleva a cabo preferiblemente en un tampón de conductividad menor. Además, cuando el procedimiento de concentración se realiza mediante un procedimiento de FASS, es preferible usar un tampón que tenga una conductividad eléctrica baja, tal como una concentración menor de tampón Hepes, Taps y Tris con una concentración salina inferior, y similar.
Generalmente es difícil optimizar el pH y la temperatura para el contacto de la muestra con la molécula de afinidad, en otras palabras, para formar un complejo del analito y la molécula de afinidad, ya que dependen de las propiedades del analito y la molécula de afinidad, y las condiciones de reacción también afectan a la eficacia de concentración. Sin embargo, en el procedimiento de la presente invención, en la medida en que no alteren la formación del complejo, las condiciones de reacción pueden seleccionarse de acuerdo con una forma convencional usada habitualmente en el campo de la presente invención, por ejemplo, EIA, RIA, FIA o ensayos de hibridación conocidos. Es decir, la etapa de contacto puede realizarse habitualmente a un pH de entre aproximadamente 2 y 10, preferiblemente a un pH de entre 5 y 9, y habitualmente a una temperatura de entre 0 y 90ºC, preferiblemente de entre 5 y 40ºC. La reacción puede realizarse durante un periodo de unos pocos segundos a varias horas dependiendo de las propiedades respectivas del analito y del conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada, ya que el tiempo de reacción necesario para la formación del complejo varía dependiendo de sus propiedades.
D. Molécula de Afinidad
En la presente invención, pueden usarse una o más moléculas de afinidad adicionales (por ejemplo, como una molécula afinidad que no se ha unido a la molécula transportadora cargada). Uno de los propósitos para usar una o más moléculas de afinidad adicionales es facilitar la separación y la detección del analito. Las características de la molécula o moléculas de afinidad adicionales, los ejemplos de dichas moléculas, la concentración a usar, etc. son las mismas que se han descrito anteriormente. La molécula o moléculas de afinidad adicionales pueden marcarse mediante un marcador detectable como se ha descrito anteriormente. El marcador detectable, los ejemplos preferibles del mismo, el procedimiento de marcaje usado, etc. son los mismos que se han descrito anteriormente.
E. Uso de Conjugado y Molécula de Afinidad
Cuando se usa un conjugado y una molécula de afinidad, la muestra que contiene el analito se pone en contacto con una molécula de afinidad y un conjugado de molécula de afinidad/molécula transportadora cargada para formar un complejo de analito, la molécula de afinidad y el conjugado, y el complejo resultante se concentra mediante el uso de un canal de concentración (por ejemplo, de preconcentración por acumulación) en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración (por ejemplo, de preconcentración por acumulación).
En la presente invención pueden usarse dos o más moléculas de afinidad y dos o más conjugados. En dicho caso, cada molécula de afinidad (incluyendo la molécula de afinidad en cada conjugado) se une con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad. En el caso de usar tanto la molécula de afinidad como el conjugado, al menos uno de la molécula de afinidad y el conjugado es en general uno que pueda medirse (por ejemplo, detectarse) o marcarse mediante un marcador detectable por algún procedimiento convencional. El uso de una molécula de afinidad o un conjugado que tenga que dicha propiedad hará más fácil medir un analito en una muestra. En el caso en el que el propio analito pueda detectarse por algún procedimiento (por ejemplo, una enzima o similar) o cuando un analito pueda unirse directamente a un marcador detectable sin una molécula de afinidad o un conjugado, el analito en la muestra puede medirse incluso si la molécula de afinidad y el conjugado no poseen dicha propiedad detectable descrita anteriormente. Cuando se usan dos o más moléculas de afinidad o dos o más conjugados, no es necesario que todas las moléculas de afinidad o todos los conjugados tengan dicha propiedad detectable. En el procedimiento mencionado anteriormente, el marcador detectable, el procedimiento usado para marcar una molécula de afinidad o un conjugado mediante el marcador detectable, etc. son como se han descrito anteriormente.
Para poner en contacto la muestra que contiene el analito con la molécula de afinidad y el conjugado para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y el conjugado, no existen limitaciones en lo que se refiere a cómo puede producirse dicho complejo. Por ejemplo, una muestra que contiene un analito, una molécula de afinidad y un conjugado pueden disolverse, dispersarse o suspenderse, respectivamente, por ejemplo, en agua o tampones tales como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE y similares para dar materiales líquidos, y estos materiales líquidos pueden mezclarse y ponerse en contacto entre sí. Como alternativa, la muestra, la molécula de afinidad y el conjugado pueden disolverse, dispersarse o suspenderse juntos a la vez. En el caso en el que una muestra que contiene un analito sea un líquido, una molécula de afinidad y/o un conjugado pueden mezclarse directamente con la muestra. Si la muestra que contiene un analito es un líquido, como se ha descrito anteriormente, puede no disolverse, dispersarse o suspenderse, por ejemplo, en agua o en los tampones.
En el procedimiento mencionado anteriormente, se selecciona una concentración del tampón del intervalo usado habitualmente en este campo. La concentración de la molécula de afinidad y el conjugado en la etapa de contacto de la muestra con la molécula de afinidad y el conjugado es como se ha mencionado anteriormente. Las condiciones de reacción (por ejemplo, pH, temperatura, tiempo de reacción, etc.) son las mismas que la condición mencionada anteriormente del contacto de la muestra y la molécula de afinidad.
F. Polímero Cargado
En el procedimiento de concentración de la presente invención de acuerdo con las reivindicaciones 29-51, también puede usarse el polímero cargado descrito anteriormente. Debido a que un polímero cargado que puede unirse a constituyentes interferentes puede evitar, por ejemplo, cambios de migración falsos positivos debidos a la unión inespecífica de constituyentes con el conjugado o el conjugado y la molécula de afinidad, o ensayos fallidos debidos a la formación de un complejo insoluble con el conjugado o el conjugado y los complejos de molécula de afinidad/constituyente, se usa un polímero cargado en el procedimiento de concentración de la presente invención. El polímero cargado, sus características, ejemplos del mismo, la concentración a usar, etc. son los mismos que se han descrito anteriormente. Cuando se usa el polímero cargado, el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/conjugado/molécula de afinidad puede concentrarse en presencia del polímero cargado.
Por ejemplo, el polímero cargado está preferiblemente presente en un canal de concentración (por ejemplo, de preconcentración por acumulación) de un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración. En concreto, es preferible añadir el polímero cargado al medio de concentración (por ejemplo, preconcentración por acumulación) envasado en el canal de concentración. La presencia del polímero cargado en el medio de concentración puede reducir la transmisión de constituyentes de muestra interferentes entre procesamientos de muestra. Como alternativa, o adicionalmente, el polímero cargado puede estar presente en la solución (por ejemplo, agua, un tampón tal como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE, etc., usado en ensayos de hibridación, inmunoensayos y similares) que contiene el analito y el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/conjugado/molécula afinidad y, después, la solución obtenida que contiene el polímero cargado, el analito y el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/conjugado/molécula de afinidad se aplica en el canal de concentración. Además, el polímero cargado puede estar presente en una solución que se vaya a usar para aplicar una solución que contiene el analito y el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/conjugado/molécula de afinidad en el dispositivo microfluido, por ejemplo, un eluyente y un tampón de procesamiento que se va a usar en la concentración (por ejemplo, agua, un tampón tal como tampón tris, tampón fosfato, tampón Veronal, tampón borato, tampón de Good, tampón SSC, tampón TBE, tampón TAE, etc., usado en ensayos de hibridación, inmunoensayos y similares). En los procedimientos mencionados anteriormente, el procedimiento para preparar el polímero cargado presente en la solución que contiene el analito y el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/conjugado/molécula de afinidad es el mismo que se ha descrito anteriormente.
Además, en el procedimiento de concentración de la presente invención, por razones que se han descrito anteriormente, el polímero cargado está presente preferiblemente en al menos la etapa de concentración (por ejemplo, en el medio de concentración), pero puede estar presente adicionalmente y/o como alternativa en la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito con el conjugado o el conjugado y la molécula de afinidad para formar el complejo. En una realización preferida de la invención, el polímero cargado está presente tanto en la etapa de concentración (por ejemplo, en el medio de concentración) del complejo de analito/conjugado o del complejo analito/conjugado/molécula de afinidad como en la etapa de contacto de la muestra que contiene el analito y el conjugado o el conjugado y la molécula de afinidad para formar el complejo para aumentar la recuperación del analito existente en la muestra.
En los procedimientos mencionados anteriormente, el procedimiento para preparar el polímero cargado presente en la etapa de contacto de la muestra y el conjugado o en la etapa de contacto de la muestra, el conjugado y la molécula de afinidad es el mismo que se ha descrito anteriormente. La concentración del polímero cargado que se va a usar, etc., es la misma que se ha descrito anteriormente.
G. Procedimiento de Concentración
El complejo resultante del analito (o el análogo) y el conjugado, el complejo del analito (o del análogo), el conjugado y la molécula de afinidad o el complejo del analito (o del análogo), la molécula transportadora cargada y la molécula de afinidad se concentra. Son ejemplos típicos operaciones de concentración de muestra o preconcentración por acumulación de muestra en línea tales como una concentración electroforética que utiliza una diferencia en la movilidad electroforética en un capilar (por ejemplo, FASS, FASI, ITP, IF, etc.), una concentración por adsorción química que utiliza un adsorbente (por ejemplo, SPE, etc.) y similares. En particular, puede usarse preferiblemente una concentración electroforética. (R. L. Chien, Electrophoresis, 24, 486-497, 2003).
Entre los procedimientos de concentración electroforética, son preferibles los procedimientos (por ejemplo, ITP, FASS, FASI, etc.) basados en la denominada concentración electrocinética. Dichos procedimientos se basan, por ejemplo, en los siguientes principios. Mediante la selección y el uso de un tampón adecuado de tal modo que la movilidad electroforética del analito que se va a concentrar en la zona de tampón para la migración en el canal de concentración se vuelva más lenta que en la zona de solución antes de aplicarse en el canal de concentración que contiene el analito, cuando el analito se mueve hacia el límite entre la zona de solución que contiene el analito y la zona de tampón para la migración en el canal de concentración, la velocidad de migración del analito se ralentiza en el límite y el analito se concentra (por ejemplo, R. L. Chien, Electrophoresis, 24, 486-497, 2003, R. L. Chien, D. S. Burgi, Anal. Chem., 64, 489A, 1992, D. S. Burgi, R. L. Chien, Anal. Chem., 63, 2042, 1991, R. L. Chien, D. S. Burgi, J. Chromatogr., 559, 141, 1991). Para realizar el procedimiento de concentración de la presente invención mediante el uso del procedimiento mencionado anteriormente, la concentración del complejo resultante del analito (o del análogo) y el conjugado, del complejo del analito (o del análogo), el conjugado y la molécula de afinidad o del complejo del analito (o del análogo), la molécula transportadora cargada y la molécula de afinidad se realiza mediante el uso de un tampón para la migración en el canal de concentración en el que el tampón tiene una propiedad por la que la movilidad electroforética del complejo [por ejemplo: complejo de analito (o análogo)/conjugado, complejo de analito (o análogo)/conjugado/molécula de afinidad o complejo de analito (o análogo)/molécula transportadora cargada/molécula de afinidad] en el tampón para la migración en el canal de concentración es más lenta que en una solución que contiene el complejo que se aplica en la etapa de concentración. Como resultado, cuando el complejo se mueve hacia el límite entre la solución que contiene el complejo y el tampón para la migración en el canal de concentración, la velocidad de migración del complejo se ralentiza en el límite y el complejo se concentra. Más particularmente, entre ellos es preferible usar FASS, ITP, por ejemplo, basados en el siguiente principio. La ITP es un procedimiento basado en el principio de que por colocación del analito entre dos iones, un ión delantero de una movilidad electroforética más rápida que el analito y un ión trasero de una movilidad electroforética más lenta que el analito, el analito se concentra. Y la FASS es un procedimiento basado en el principio de que la movilidad electroforética del analito se reduce cuando la sustancia en el dominio de concentración alcanza el limite de un dominio de separación y un dominio de concentración y, entonces, la sustancia se concentra, en el que el dominio de separación tiene una conductividad mayor que el dominio de concentración (por ejemplo, documento US 6 695 009, Weiss, D. J., Saunders, K., Lunte, C. E. Electrophoresis 2001, 22, 59-65; Britz-McKibbin, P., Bebault, G. M., Chen, D. D. Y. Anal. Chem. 2000, 72, 1729-1735, Ross, D., Locascio, L. E. Anal Chem. 2002, 71, 5137-5145). Entre los procedimientos de concentración mencionados anteriormente, es preferible usar el procedimiento de concentración en el que el complejo se concentra en base a la carga de la molécula transportadora cargada en el conjugado unido con el analito.
En la presente invención pueden utilizarse todos los tampones, cargas, una diversidad de reactivos tales como soluciones de procesamiento, etc., usados convencionalmente en los procedimientos de concentración que se han mencionado anteriormente. La concentración de estos materiales puede seleccionarse, opcionalmente, de acuerdo con procedimientos de concentración conocidos. La condición para la concentración (por ejemplo, pH, temperatura, voltaje aplicado, tiempo y similares) puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con procedimientos conocidos.
Los analitos de interés pueden acumularse (por ejemplo, concentrarse) en un volumen menor que el de la muestra de analito original por isotacoforesis (ITP) en un dispositivo microfluido. Por ejemplo, un bolo de muestra puede cargarse entre dos sistemas tampón diferentes en un canal y exponerse a una corriente eléctrica para generar un estado estacionario de zonas de soluto que migran por orden de movilidad decreciente. En el estado estacionario, las zonas pueden adoptar la misma concentración y migrar a lo largo del canal a la misma velocidad que el electrolito delantero. Como alternativa, un bolo de muestra puede cargarse adyacente a un electrolito y preconcentrarse en una condición dinámica (por ejemplo, transitoria) en la interfaz para inyección, por ejemplo, sin haber alcanzado un equilibrio de estado estacionario entre el electrolitos de la ITP. La preconcentración puede realizarse, por ejemplo, en un canal de concentración (por ejemplo, de preconcentración por acumulación) de un dispositivo microfluido en el que una muestra se carga entre regiones del canal de un electrolito trasero y un electrolito delantero.
Como se muestra en la Figura 8A, la muestra de analito (80) puede cargarse en el segmento del canal de carga (81) mediante una presión diferencial entre un pocillo al vacío (82) y un pocillo de muestra (83). Cuando se aplica un campo eléctrico a través del segmento del canal de acumulación (por ejemplo, concentración) (84), la corriente la llevan los electrolitos delanteros de movilidad elevada (por ejemplo, proporción de carga con respecto a masa elevada) (85), los analitos de movilidad intermedia (86) y el electrolito trasero de movilidad reducida (87), como se muestra en la Figura 8B. A medida que se desarrolla la ITP, puede establecerse un estado estacionario en el que el volumen del analito (86) se reduce hasta el punto en el que la concentración del analito cargado (86) es equivalente a la concentración del electrolito delantero (85). En el estado estacionario, la solución de analito preconcentrado migra a lo largo del segmento del canal de preconcentración (84) a la misma velocidad que los electrolitos delantero (85) y trasero (87), como se muestra en la Figura 8C, llevando los electrolitos y los analitos cargados la misma cantidad de corriente eléctrica por unidad de volumen en el segmento del canal de preconcentración. Factores tales como la densidad de carga y la velocidad de migración diferencial en estado transitorio de los analitos y electrolitos tienden a concentrar los analitos y electrolitos en zonas durante la ITP. Los segmentos del canal de preconcentración de la invención pueden ser de cualquier tamaño, incluyendo canales a escala microscópica que tienen una dimensión, tal como anchura o profundidad, que varía de aproximadamente 500 \mum a aproximadamente 0,1 \mum, o de aproximadamente 100 \mum a aproximadamente 1 \mum, o de aproximadamente 10 \mum.
La preconcentración por acumulación también puede realizarse en un estado transitorio. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 9A, moléculas de analito inicialmente diluidas y dispersas (90) pueden acumularse, por ejemplo, en la interfaz del electrolito delantero (91), como se muestra en la Figura 9B. Esta concentración de analito en una interfaz puede producirse antes del establecimiento de concentraciones de transporte de analito y electrolito uniformes en estado estacionario. Opcionalmente, un analito puede acumularse en un estado transitorio, por ejemplo, durante la aplicación inicial de un campo eléctrico en la ITP, en la interfaz del electrolito trasero (92). En otras realizaciones de ITP en estado transitorio, los analitos pueden concentrarse en zonas distintas de la interfaz de los electrolitos de la ITP. Pueden acumularse múltiples analitos de interés en un estado estacionario o estado transitorio, por ejemplo, en la interfaz de uno o ambos electrolitos. Por ejemplo, como se muestra en las Figuras 10A a 10C, puede cargarse una solución de muestra (100) con un primer analito de interés (101) y un segundo analito de interés (102) entre la solución de electrolito trasero (103) y la solución de electrolito delantero (104). En el caso de que el primer analito tenga una movilidad más lenta que el segundo analito, pero una movilidad más rápida que el electrolito trasero, el primer analito puede acumularse en la interfaz con el electrolito trasero en presencia de un campo eléctrico. Mientras tanto, en el estado transitorio, como se muestra en la Figura 10B, el segundo analito, con una movilidad algo mayor que la del primer analito, puede acumularse en el otro extremo del bolo de muestra a lo largo de la interfaz con el electrolito delantero de movilidad más rápida. Dicha situación puede proporcionar la oportunidad de la aplicación separada secuencial o en paralelo del primer y segundo analito en uno o más segmentos del canal de separación, como puede apreciarse por los especialistas en la técnica. Una vez que se ha establecido un estado estacionario durante la ITP, como se muestra en la Figura 10C, el primer y el segundo analito cargado pueden comprimirse en bandas estrechas adyacentes, por ejemplo, por aplicación conjunta para la resolución en un segmento del canal de separación.
En procedimientos de la invención, las movilidades de los electrolitos traseros y electrolitos delanteros puede ajustarse para proporcionar una preconcentración selectiva de un analito de interés al tiempo que se separan los constituyentes de muestra que no son de interés del analito. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 11A, puede cargarse una solución de muestra (110) que contiene el analito de interés (111), un constituyente de muestra de movilidad lenta que no es de interés (112) y un constituyente de muestra de movilidad rápida que no es de interés (113) entre el electrolito trasero (114) y el electrolito delantero (115). Cuando se aplica un campo eléctrico al canal, los constituyentes de muestra que no son de interés de movilidad lenta (112) pueden quedar por detrás de los electrolitos traseros, mientras que los constituyentes de muestra que no son de interés de movilidad rápida (113) pueden precipitarse por delante de los electrolitos delanteros, como se muestra en la Figura 11B. Una ITP continuada hasta un estado estacionario puede, por ejemplo, separar adicionalmente constituyentes de muestra que no son de interés del analito, como se muestra en la Figura 11C. La retirada de constituyentes de muestra que no son de interés de los analitos de interés puede proporcionar un material para inyección mejorado para la separación en un segmento del canal de separación. Después de que las muestras se hayan tratado previamente mediante ITP para retirar los constituyentes de muestra que no son de interés, el análisis de los analitos de interés aplicados en un segmento del canal de separación puede tener, por ejemplo, una interferencia de fondo reducida, una mayor resolución debido a volúmenes de inyección menores, una cuantificación más exacta debido a mejores medidas basales y un menor número de picos solapantes, etc.
Los electrolitos traseros y electrolitos delanteros pueden confeccionarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, mediante el ajuste de las movilidades de los electrolitos para proporcionar una retención y una acumulación (por ejemplo, concentración) muy especificas de analitos de interés, al tiempo que se retiran los constituyentes de muestra que no son de interés. En una realización, el pH de los electrolitos se selecciona para agrupar el pK de un analito de interés de tal modo que los constituyentes de muestra que no son de interés que tienen pK fuera del agrupamiento se retirarán en la ITP. El pK de los analitos de interés puede determinarse, por ejemplo, empíricamente o en base a la estructura molecular conocida de los analitos. En otras realizaciones, el analito de interés puede, por ejemplo, agruparse estrechamente entre las composiciones de electrolito trasero y delantero seleccionados que se sabe que tienen movilidades más lenta y más rápida que el analito. Pueden usarse muchos iones y tampones en electrolitos para agrupar analitos, tales como, por ejemplo, cloruro, TAPS, MOPS y HEPES. Opcionalmente, la movilidad de los electrolitos y/o analitos puede modularse por ajuste de las características de viscosidad o de exclusión por tamaños de la solución de muestra, la solución de electrolito trasero y/o la solución de electrolito delantero. En otra opción para ajustar la movilidad de las soluciones de ITP, la movilidad de las soluciones de analito y/o soluciones de electrolito pueden moderarse, particularmente durante las migraciones de ITP en estado transitorio, por ajuste de la concentración, la fuerza iónica o la conductividad de las soluciones. La temperatura de las soluciones puede seleccionarse en otras opciones más para ajustar la movilidad de analitos, electrolitos o soluciones de ITP.
Pueden usarse una diversidad de técnicas de ensayo inmunoquímicas conocidas en la técnica en la práctica de la presente invención para concentrar para la detección un analito de interés en la muestra, tales como ensayos de anticuerpos de tipo sándwich e inmunoensayos ligados a enzimas (véase, por ejemplo, Bolton et al., Handbook of Experimental Immunology, Weir, D. M., Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986, vol. 1, Capítulo 26, para una discusión general sobre inmunoensayos) y otros formatos de ensayo similares conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, en el formato de ensayo descrito anteriormente y que se muestra en las Figuras 3A a 3K, la presente invención puede usarse para concentrar un complejo que comprende un analito o un análogo del analito y un conjugado.
Son ejemplos específicos del formato de ensayo de tipo sándwich que se muestra en las Figuras 3A a 3F mencionadas anteriormente los siguientes:
(a)
Se describe un procedimiento para concentrar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde al menos uno del uno o más conjugados está marcado mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito y el conjugado marcado mediante el marcador detectable; (ii) concentrar el complejo en un canal de concentración de un dispositivo microfluido; en el que la molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse al analito y, cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad, y la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de migración del analito por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
(b)
Se describe un procedimiento para concentrar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con una o más moléculas de afinidad y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde al menos uno de la molécula de afinidad o al menos uno del conjugado está marcado mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito, la molécula de afinidad y el conjugado; (ii) concentrar el complejo en un canal de concentración de un microfluido; en el que la molécula de afinidad y la molécula de afinidad en el conjugado tienen una propiedad capaz de unirse al analito y cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en un sitio diferente sobre el analito de cualquier otra molécula de afinidad, y la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de migración del analito por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
Son ejemplos específicos del formato de ensayo competitivo que se muestra en las Figuras 3G a 3K mencionadas anteriormente los siguientes:
(a)
Se describe un procedimiento para concentrar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con el analito (o el análogo) marcado mediante un marcador detectable y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un primer complejo del analito y el conjugado y un segundo complejo del analito marcado (o del análogo marcado) y el conjugado; (ii) concentrar el segundo complejo; en el que la molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado o al analito en la muestra y al análogo marcado y, cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito marcado de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo marcado de cualquier otra molécula de afinidad, y en el que la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de migración del analito marcado o del análogo marcado por unión al analito marcado o al análogo marcado a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito marcado o del análogo marcado, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
(b)
Se describe un procedimiento para concentrar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con el analito (o el análogo) marcado mediante un marcador detectable, una o más moléculas de afinidad y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un primer complejo del analito, la molécula de afinidad y el conjugado y un segundo complejo del analito marcado (o del análogo marcado), la molécula de afinidad y el conjugado; (ii) concentrar el segundo complejo; en el que la molécula de afinidad y la molécula de afinidad en el conjugado tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado o al analito en la muestra y al análogo marcado y cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito marcado en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito marcado de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo marcado en un sitio diferente sobre cada analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo marcado de cualquier otra molécula de afinidad, y en el que la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de migración del analito marcado o del análogo marcado por unión al analito marcado o al análogo marcado a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito marcado o del análogo marcado, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
(c)
Se describe un procedimiento para concentrar un analito en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con el analito unido a una molécula transportadora cargada (o el análogo unido a una molécula transportadora cargada), una o más moléculas de afinidad marcadas mediante un marcador detectable para formar un primer complejo del analito unido a la molécula transportadora cargada (o del análogo unido a una molécula transportadora cargada) y la molécula de afinidad marcada y un segundo complejo del analito y la molécula de afinidad marcada; (ii) concentrar el primer complejo; en el que la molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse al analito en la muestra y al analito unido a la molécula transportadora cargada o al analito en la muestra y al análogo unido a la molécula transportadora cargada, y en el que cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el analito unido a la molécula transportadora cargada en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el analito unido a la molécula transportadora cargada de cualquier otra molécula de afinidad, o cada molécula de afinidad tiene una propiedad capaz de unirse con el analito en la muestra y el análogo unido a la molécula transportadora cargada en un sitio diferente sobre el analito en la muestra y en un sitio diferente sobre el análogo unido a la molécula transportadora cargada de cualquier otra molécula de afinidad, y en el que la molécula transportadora cargada tiene una propiedad capaz de causar un cambio en una propiedad de migración del primer complejo por unión al analito o al análogo para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
H. Dispositivo Microfluido
En la presente invención, puede realizarse una concentración de complejo de analito/conjugado o complejo de analito/conjugado/molécula de afinidad mediante el uso de un sistema microfluido que incluye generalmente un dispositivo microfluido basado en los procedimientos de concentración mencionados anteriormente. El dispositivo microfluido a usar en el procedimiento de concentración de la presente invención tiene al menos uno o más canales de concentración (por ejemplo, preconcentración por TIP) que pueden contener un medio de concentración. Es preferible usar un dispositivo microfluido en el procedimiento de concentración de la presente invención que tenga al menos uno o más canales de concentración que pueden contener un medio de concentración y un canal en conexión fluida con el canal de concentración. El canal de concentración y el canal en conexión fluida con el canal de concentración tienen las mismas características que las del canal de separación descrito anteriormente. Cuando se realiza la separación y la medición del analito consecutivamente después de llevar a cabo el procedimiento de concentración de la presente invención, es preferible usar el dispositivo microfluido que incluye adicionalmente uno o más canales de separación, un canal de carga de muestra, un canal de mezcla de muestra, un detector, etc. como se ha descrito
anteriormente.
I. Medios de Concentración
El medio de concentración puede ser el mismo que el medio de separación descrito anteriormente. El medio de concentración se selecciona convenientemente de acuerdo con el procedimiento de concentración que se use. La concentración del medio de concentración que se vaya a usar se selecciona convenientemente del intervalo mencionado anteriormente de acuerdo con el procedimiento de concentración que se use. No es necesario usar dicho medio de concentración dependiendo del procedimiento de concentración que se use.
J. Separación y Detección
El analito concentrado resultante en la muestra (por ejemplo, el complejo que comprende el analito o el análogo del analito y el conjugado) se aplica en el ensayo de cambio de migración descrito anteriormente. Mediante la aplicación del analito concentrado por el procedimiento de concentración de la presente invención en el ensayo de cambio de migración es posible medir (por ejemplo, identificar o detectar) el analito con una gran sensibilidad. El analito concentrado mediante el procedimiento de concentración de la presente invención puede usarse con cualquier ensayo de cambio de migración descrito anteriormente. Es decir, el complejo concentrado resultante que comprende el analito y el conjugado de la molécula transportadora cargada y la sustancia de afinidad (por ejemplo, el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado) se separa de la sustancia de afinidad libre no implicada en la formación del complejo (por ejemplo, la molécula de afinidad y/o el conjugado) en base a la diferencia en la velocidad de migración entre el complejo y la sustancia de afinidad libre. Y después, al complejo de analito/sustancia de afinidad (o el complejo de analito/conjugado o el complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado) o la sustancia de afinidad libre (por ejemplo, molécula de afinidad libre y/o conjugado libre), que no está implicada en la formación del complejo separado por el procedimiento de separación mencionado anteriormente, pueden medirse o detectarse mediante un procedimiento que se corresponda con las propiedades de la propiedad detectable de las moléculas implicadas (por ejemplo, el marcado detectable asociado con las mismas). Por lo tanto, puede determinarse la cantidad del analito en una muestra o puede identificarse la presencia del analito en la muestra. Es decir, el complejo de analito/conjugado se separa del conjugado libre que no está implicado en la formación del complejo, o el complejo de analito/molécula de afinidad/conjugado se separa de la molécula de afinidad libre y/o conjugado que no está implicado en la formación del complejo de acuerdo con la separación mencionada anteriormente. El complejo resultante, o la molécula de afinidad libre y/o el conjugado libre pueden medirse o detectarse mediante un procedimiento que se corresponda con las propiedades de los mismos (por ejemplo, el marcador detectable). El procedimiento de separación, los medios de separación, la detección, etc. son los mismos que se han descrito anteriormente.
Si el analito concentrado mediante el procedimiento de concentración de la presente invención se aplica en el procedimiento de separación y detección de la presente invención descrito anteriormente, puede conseguirse una medición del analito altamente sensible y exacta. Cuando el analito concentrado mediante el procedimiento de concentración de la presente invención se aplica en el ensayo de cambio de migración, el principio del ensayo de cambio de migración que se va a aplicar puede ser el mismo que el principio del procedimiento de concentración para concentrar el analito o puede diferir del principio del procedimiento de concentración para concentrar el analito. Para separar y medir el analito con una gran precisión, es preferible que el principio del ensayo de cambio de migración difiera del principio del procedimiento de concentración para concentrar el analito. Por ejemplo, cuando se usa ITP para concentrar el analito, el ensayo de cambio de migración para separar y medir se selecciona convenientemente de procedimientos distintos de la ITP tales como FASS, FASI, IF y similares.
Un ejemplo específico no limitante del procedimiento mencionado anteriormente es el siguiente: se describe un procedimiento de detección o identificación de un analito de interés en una muestra que comprende: (i) poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado; (ii) concentrar el complejo mediante el uso de un canal de concentración en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum; (iii) separar el complejo y cualquier conjugado no unido en presencia de un polímero cargado mediante el uso de un canal de separación en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum; y (iv) detectar el complejo para identificar la presencia del analito o para determinar la cantidad del analito en la muestra; en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de los componentes de muestra que tienen una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada y reduce la interferencia con la detección; y en el que la molécula transportadora cargada causa un cambio en una propiedad de migración del analito por unión al analito a través de la molécula de afinidad para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada.
Los siguientes Ejemplos no limitantes ilustran los diversos usos y procedimientos de la presente invención para reducir la interferencia en ensayos de cambio de migración.
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Ejemplo
Ejemplo 1
El siguiente Ejemplo no limitante ilustran el uso de sulfato de heparina como el polímero cargado para bloquear la interferencia del suero en un inmunoensayo de alfa-fetoproteína.
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Reactivos
Gel: pDMA al 2,5%/glicerol al 3%/Tween20 al 0,05%/BSA al 0,5%/HEPES 150 mM/NaCl/LCA 2,5 mg/ml (pH: 7,5).
Tampón para muestras de suero (en lo sucesivo abreviado como tampón de muestra): HEPES 7,5 mM/Tween20 al 0,025%/BSA al 0,1% + anticuerpo monoclonal anti-APP WA-2 IgG 20 nM (pH: 7,5). El anticuerpo monoclonal se preparó en nuestras instalaciones. H. Katoh et al., Anal. Chem. (1998) 70, 2110-2114).
Tampón para anticuerpo (en lo sucesivo abreviado como tampón de anticuerpo): HEPES 7,5 mM/NaCl/Tween-20 al 0,025%/BSA al 0,01% (pH: 7,5).
Conjugado de anticuerpo anti-AFP marcado/ADN: conjugado de 3 nM de anticuerpo monoclonal anti-APP marcado con 4Alexa Fluor 647 WA-1-ADN de 140 pb; el colorante Alexa Fluor 647 se adquirió en Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon) y la molécula transportadora cargada de ADN se preparó mediante reacción de PCR. El anticuerpo monoclonal anti-AFP WA-1 reconoce un epítopo diferente de AFP que WA-2. El conjugado se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 02/082083. El anticuerpo monoclonal se preparó en nuestras instalaciones (H. Katoh et al, Anal. Chem. (1998) 70, 2110-2114). El ADN de 140 pb se preparó de la forma siguiente: se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el empleo de una secuencia sintetizada de 5'-GGTTAGCAACTTAC
TACCGGATTTTG-3' como cebador directo, una secuencia sintetizada de 5'-CCTAGCAAACTCGGAAGATTTTTT
CAGA-3' como cebador inverso y ADN lambda (de New England Bio Labs, Inc., Beverly, MA) como molde. La temperatura de hibridación era de 60 grados C. Después de la amplificación, el fragmento de ADN amplificado se purificó y se confirmó que tenía una longitud de 140 pb usando un kit de ADN Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA).
Polímero cargado: Sulfato de heparina (Sigma-Aldrich)
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Ensayos de Cambio de Migración
Se diluyó una muestra de suero 1:10 con el tampón de muestras que no contenía sulfato de heparina (Figura 4) y con sulfato de heparina al 0,05% (Figuras 5A-B y 6A-B, respectivamente) y se mezcló sobre una microplaca (usando una microplaca microfluida 20 similar a la que se muestra en la Figura 2) con conjugado de anticuerpo anti-AFP marcado-ADN. El complejo de conjugado se formó durante una incubación de 1 min sobre la microplaca (por ejemplo, en un canal de incubación 24 de la microplaca 20 de la Figura 2). Después de la incubación (por ejemplo, en el canal de incubación 24 de la microplaca microfluida 20 de la Figura 2), la mezcla resultante se preconcentró electroforéticamente y se inyectó en el canal de separación (por ejemplo, canal de separación 25 de la microplaca 20 de la Figura 2) relleno con polímero de pDMA que no contiene sulfato de heparina (Figura 4), con sulfato de heparina al 0,1% (Figura 5) y sulfato de heparina al 1% (Figura 6), respectivamente. Se aplicó voltaje al canal de separación (25) de la microplaca (20) de la Figura 2 para separar el conjugado libre y el complejo con movilidades diferentes. El sulfato de heparina en el tampón de muestra y en el gel actuaba evitando la unión inespecífica de componentes del suero a la porción de ADN del conjugado y también actuaba bloqueando la interferencia del suero en el gel durante la separación. Por ejemplo, la Figura 4 muestra una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína en un medio de separación entre el pico de conjugado (40) (por ejemplo, conjugado de ADN-anticuerpo-colorante Alexa) (por ejemplo, sin suero) y (40') (por ejemplo, con suero al 10%) y el pico de complejo de conjugado/AFP (42) (sin suero) y (42') (con suero al 10%) sin polímero cargado (por ejemplo, sulfato de heparina) en la muestra o el medio de separación (por ejemplo, gel).
Cuando se añadía suero a la muestra, los constituyentes interferentes modifican el tiempo de retención, la altura y el área del pico del complejo (40) y (42), como se muestra mediante los números de referencia (40') y (42') en la Figura 4. La adición de polímero cargado (por ejemplo, sulfato de heparina) al ensayo puede reducir los cambios por interferencia, como se muestra en las Figuras 5A-5B y 6A-6B. Las Figuras 5A-B muestran una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína con sulfato de heparina al 0,05% en la muestra y sulfato de heparina al 0,1% en el medio de separación, mostrando el efecto del sulfato de heparina en la reducción de la interferencia con la detección por unión a los constituyentes de muestra que se unen inespecíficamente al polímero de ADN (por ejemplo, mostrando una recuperación de aproximadamente el 60% de AFP a partir de la muestra de suero). Las Figuras 6A-B muestran una gráfica de cambio de migración de un ensayo de alfa-fetoproteína con sulfato de heparina al 0,05% en la muestra y sulfato de heparina al 1% en el medio de separación, mostrando una recuperación de aproximadamente el 100% de AFP a partir de la muestra de suero, como se muestra por los picos de conjugado (40) y (40') y los picos de complejo de AFP/conjugado (42) y (42') aproximadamente solapantes, respectivamente. Por lo tanto, la adición de sulfato de heparina como polímero cargado al medio de separación y al tampón de muestra tiene un efecto profundo en la reducción de la interferencia con la detección del analito por unión a los constituyentes de muestra que se unen inespecíficamente a la molécula transportadora.
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Ejemplo 2
El siguiente Ejemplo no limitante ilustra el uso de ITP en un ensayo de AFP con suero y un ejemplo de un electroforegrama que muestra los resultados con suero al 5% con y sin Poli dl-dC al 0,01%. En este Ejemplo, se usó poli(dl-dC) en lugar de sulfato de heparina como polímero cargado para eliminar la interferencia del suero. La concentración de poli(dl-dC) era de aproximadamente el 0,01% (p/v).
\quad
Tampón delantero: Tris 15 mum/NaCl 50 mM/pDMA al 0,9%/Tween-20 al 0,05%/BSA al 0,01%
\quad
Tampón trasero: Tris 15 mM/HEPES 25 mM/pDMA al 0,9%/Tween-20 al 0,05%/BSA al 0,01%
Muestra en un tampón delantero con suero al 10% y anticuerpo monoclonal anti-AFP WA-2 IgG 100 nM, poli(dldC) 100 \mug/ml. El anticuerpo monoclonal se preparó en nuestras instalaciones (H. Katoh et al., Anal. Chem. (1998) 70, 2110-2114).
Se realizó una reacción de unión fuera de la microplaca por mezcla de una muestra con solución de Ab 1:1.
Conjugado de anticuerpo anti-AFP marcado/ADN: conjugado de 500 pM de anticuerpo monoclonal anti-AFP WA-1 con 2Alexa Fluor 647-ADN de 140 pb; el colorante Alexa Fluor 647 se adquirió en Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon), y la molécula transportadora cargada de ADN se preparó mediante reacción de PCR. El anticuerpo monoclonal anti-AFP WA-1 reconoce un epítopo diferente de AFP que WA-2. El conjugado se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 02/082083. El anticuerpo monoclonal se preparó en nuestras instalaciones (H. Katoh et al, Anal. Chem. (1998) 70, 2110-2114). El ADN de 140 pb se preparó de la forma siguiente: se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el empleo de una secuencia sintetizada de 5'-GGTTAGCAACTTACTACCG
GATTTTG-3' como cebador directo, una secuencia sintetizada de 5'-CCTAGCAAACTCGGAAGATTTTTTCAGA-3' como cebador inverso y ADN lambda (de New England Bio Labs, Inc., Beverly, MA) como molde. La temperatura de hibridación era de 60 grados C. Después de la amplificación, el fragmento de ADN amplificado se purificó y se confirmó que tenía una longitud de 140 pb usando un kit de ADN Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA).
Polímero Cargado: Poli (dl-dC) (Sigma-Aldrich).
Las Figuras 7A-B muestran gráficas de cambio de migración de la fluorescencia relativa (eje Y) frente al tiempo (eje X) de un ensayo de alfa-fetoproteína realizado en un medio de separación en un canal de separación de un dispositivo microfluido similar al usado en el Ejemplo 1 anterior entre el pico de conjugado (50) (por ejemplo, conjugado de ADN-anticuerpo-colorante Alexa) (con suero al 5% y sin Poli dl-dC) y (50') (con suero al 5% y Poli dl-dC a aproximadamente el 0,01%) y el pico de complejo de conjugado/AFP (52) (con suero al 5% y sin Poli dl-dC) y (52') (con suero al 5% y Poli dl-dC a aproximadamente el 0,01%). Como se muestra en las Figuras 7A-B, la adición de polímero cargado (por ejemplo, Poli dl-dC) al ensayo puede reducir la interferencia con la detección por unión a los constituyentes de muestra que se unen inespecíficamente al polímero de ADN (por ejemplo, mostrando una recuperación de aproximadamente el 60% de AFP a partir de la muestra de suero). El uso de la técnica de ITP puede aumentar la sensibilidad del ensayo (por ejemplo, como se muestra por la altura relativa de picos en las figuras) en aproximadamente 100 veces o más sobre un ensayo de electroforesis capilar convencional que no emplea una técnica de concentración o preconcentración por acumulación de muestra.
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Ejemplo 3
El siguiente Ejemplo no limitante ilustra el uso de ADN como la molécula transportadora cargada para concentrar una muestra de CA19-9.
\quad
Tampón delantero: Tris 15 mM/NaCl 50 mM/pDMA al 0,2%/Tween-20 al 0,05%/BSA al 0,01%
\quad
Tampón trasero: Tris 15 mM/HEPES 25 mM/pDMA al 0,2%/Tween-20 al 0,05%/BSA al 0,01%.
Anticuerpo anti-CA19-9 marcado: el anticuerpo monoclonal anti-CA19-9 (IgG) (Biodesign international) se marcó con Alexa por mezcla del anticuerpo y Alexa647 succinimida (Molecular probes, Inc., Eugene, Oregon, Estados Unidos) en tampón bicarbonato de sodio 0,2 M (pH 8,3) durante 2 horas y, después, el colorante Alexa no unido se retiró de la mezcla por aplicación de la mezcla de reacción a filtración en gel y cromatografía de intercambio iónico-DEAE.
Conjugado de anticuerpo anti-CA19-9/ADN: se preparó un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CA19-9 (IgG) (Biodesign international) y ADN de 250 pb de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 02/082083. El ADN de 250 pb se preparó de la forma siguiente: se llevó a cabo una reacción de PCR mediante el empleo de una secuencia sintetizada de secuencia 5'-ATCTATGACTGTACGCCACTGTCCCTAG- 3' como cebador directo que tenía un grupo NH_{2} en el extremo 5', una secuencia sintetizada de 5'-CCTAGCAAACTCGGAA
GATTTTTTCAGA-3' como cebador inverso y ADN lambda (de New England Bio Labs, Inc., Beverly, MA) como molde. La temperatura de hibridación era de 60 grados C. Después de la amplificación, el fragmento de ADN amplificado se purificó y se confirmó que tenía una longitud de 250 pb usando un kit de ADN Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA).
Muestra: se usó como muestra el anticuerpo anti-CA19-9 marcado (nº CA19-9), la mezcla que contiene el complejo del anticuerpo anti-CA19-9 marcado y el CA19-9 y la mezcla que contiene el complejo del conjugado de anticuerpo anti-CA19-9/ADN, el CA19-9 y el anticuerpo anti-CA19-9 marcado, que se obtuvieron mediante el procedimiento que se describe a continuación.
Anticuerpo anti-CA19-9 marcado (nº CA19-9): 2 nM de anti-CA19-9 marcado con Alexa purificado.
La mezcla que contenía el complejo del anticuerpo anti-CA19-9 marcado y el CA19-9: se mezclaron 2 nM de anti-CA19-9 marcado con Alexa purificado con 100 U/ml de CA19-9 (Biodesign international) y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min para generar el complejo antígeno-anticuerpo. La mezcla que contenía el complejo del conjugado de anticuerpo anti-CA19-9/ADN, el antígeno CA19-9 y el anticuerpo anti-CA19-9 marcado: se mezcló el conjugado de anticuerpo anti-CA19-9/ADN preparado con diversas concentraciones (0, 10 ó 100 U/ml) de CA19-9 y 2 nM de anticuerpo anti-CA19-9 marcado con Alexa y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min.
Procedimiento de Concentración: Después, la muestra se aplicó en un canal de carga que está en conexión fluida con un canal de concentración que estaba aguas abajo del canal de carga y estaba relleno con tampón delantero y un canal de tampón trasero que estaba aguas arriba del canal de concentración y relleno con tampón trasero. Después, el canal de carga se cargaba con la muestra, se aplicaba un campo eléctrico y se realizaba la concentración de acuerdo con los principios de la ITP. Las Figuras 12A-B muestran gráficas de cambio de migración de la fluorescencia relativa (eje Y) frente al tiempo (eje X) de una concentración de CA19-9 realizada en un canal de concentración de un dispositivo microfluido.
La Figura 12A muestra los resultados de experimentos con el anticuerpo anti-CA19-9 marcado (nº CA19-9) (pico de anticuerpo marcado (121): por ejemplo, anticuerpo anti-CA19-9 marcado) y con una mezcla del anticuerpo anti-CA19-9 marcado y CA19-9 (pico de complejo de anticuerpo marcado/antígeno (121'): por ejemplo, complejo del anticuerpo anti-CA19-9 marcado y el antígeno CA19-9).
\newpage
La Figura 12B muestra los resultados de una mezcla del anticuerpo anti-CA19-9 marcado, el anticuerpo anti-CA19-9 marcado con ADN y CA19-9 (pico de conjugado/antígeno/anticuerpo marcado (122): por ejemplo, conjugado de anticuerpo anti-CA19-9 y ADN/antígeno CA19-9/anticuerpo anti-CA19-9 marcado obtenido mediante el uso de 0 U/ml de CA19-9); pico de conjugado/antígeno/anticuerpo marcado (122'): por ejemplo, conjugado de anticuerpo anti-CA19-9 y ADN/antígeno CA19-9/anticuerpo anti-CA19-9 marcado obtenido mediante el uso de 10 U/ml de CA19-9; y pico de conjugado/antígeno/anticuerpo marcado (122''): por ejemplo, conjugado de anticuerpo anti-CA19-9 y ADN/antígeno CA19-9/anticuerpo anti-CA19-9 marcado obtenido mediante el uso de 100 U/ml de CA19-9).
Como se muestra en la Figura 12A, el complejo del analito (por ejemplo, CA19-9) y la molécula de afinidad (por ejemplo, el anticuerpo anti-CA19-9 marcado) migraba un poco más rápido que la molécula de afinidad libre (no unida) pero no estaba concentrado. Por otro lado, como se muestra en la Figura 12B, el complejo del analito (por ejemplo, antígeno CA19-9), la molécula de afinidad (por ejemplo, anticuerpo anti-CA19-9 marcado con Alexa) y el conjugado de la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada (por ejemplo, el conjugado de anticuerpo anti-CA19-9/ADN) se concentró muy eficazmente, dando como resultado un pico muy marcado del complejo. Además, el pico estaba bien correlacionado con las concentraciones de antígeno CA19-9. Es decir, el uso de la molécula transportadora cargada (por ejemplo, ADN) en la etapa de concentración puede concentrar el analito en una concentración muy elevada.
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en este documento son con fines ilustrativos solamente y que se sugerirán diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos para personas especialistas en la técnica, y deben incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción
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Claims (52)

1. Procedimiento de detección o identificación de un analito de interés en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito para formar de este modo un complejo del analito y el uno o más conjugados;
(ii)
separar el complejo de cualquier conjugado no unido en presencia de un polímero cargado usando un canal de separación en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de separación que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum; y
(iii)
detectar el complejo para identificar la presencia del analito o para determinar la cantidad del analito en la muestra, donde la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del analito por unión para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de los componentes de muestra que tienen una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polímero cargado es un polímero polianiónico o un polímero policatiónico.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que:
(a)
el polímero cargado es un polímero polianiónico seleccionado del grupo que consiste en polisacáridos, polinucleótidos, polipéptidos, compuestos macromoleculares sintéticos, cerámicos y un complejo de los mismos; o
(b)
el polímero cargado es un polímero polianiónico seleccionado del grupo que consiste en poli-dldC, sulfato de heparina, sulfato de dextrano, ácido politúngstico, ácido polianetolsulfónico, sulfato de polivinilo, poliacrilato, sulfato de condroitina, ADN plasmídico, ADN de timo de ternera, ADN de esperma de salmón, ADN acoplado a celulosa, partículas de cristal, cristal coloidal y cristal lechoso; o
(c)
el polímero cargado es un polímero policatiónico seleccionado del grupo que consiste en polialilaminas, polilisina, polihistidina, quitosana, protamina, polietilenimina y poliarginina.
4. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polímero cargado comprende una carga neta negativa o una carga neta positiva.
5. Procedimiento de la reivindicación 4, en el que el polímero cargado tiene una carga neta negativa y comprende sulfato de heparina.
6. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(a)
la molécula de afinidad es una que se une al analito mediante interacción proteína-proteína, interacción proteína-compuesto químico o interacción compuesto químico-compuesto químico; o
(b)
la molécula de afinidad es una que se une al analito mediante interacción antígeno-anticuerpo, interacción cadena de azúcar-lectina, interacción enzima-inhibidor, interacción proteína-cadena peptídica, interacción cromosoma o cadena de nucleótidos-cadena de nucleótidos, interacción nucleótido-ligando o una interacción receptor-ligando; o
(c)
la molécula de afinidad se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo Fab', F(ab') o Fab, una región variable de anticuerpo, una lectina, una avidina, un receptor, un péptido de afinidad, un aptámero y una proteína de unión a ADN.
7. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula transportadora cargada es una molécula aniónica o una molécula catiónica.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el que la molécula transportadora cargada es una molécula aniónica que comprende una cadena de nucleótidos o un polipéptido sulfonado.
9. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula transportadora cargada comprende ADN, ARN, un polímero catiónico o un polipéptido sulfonado.
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10. Procedimiento de la reivindicación 9, en el que la molécula transportadora cargada comprende ADN que comprende una o más secuencias sintéticas.
11. Procedimiento de la reivindicación 10, en el que la una o más secuencias sintéticas comprenden uno o más análogos de nucleótidos que comprenden un grupo engarce o un grupo reactivo engarce.
12. Procedimiento de la reivindicación 11, en el que el grupo engarce o grupo reactivo engarce comprende un grupo amino, un tiol, un grupo carboxilo, un grupo imidazol o un grupo succinimida.
13. Procedimiento de la reivindicación 12, que comprende además unir covalentemente un marcador detectable con el grupo engarce o grupo reactivo engarce.
14. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos un conjugado está marcado con un marcador detectable.
15. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
(a)
la molécula transportadora cargada en el conjugado está marcada mediante un marcador detectable; o
(b)
la molécula de afinidad en el conjugado está marcada mediante un marcador detectable.
16. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el marcador detectable es un colorante fluorescente, un colorante luminiscente, un colorante fosforescente, una proteína fluorescente, una proteína o partícula luminiscente, un trazador radiactivo, un compuesto quimioluminiscente, un mediador redox, un compuesto electrogénico, una enzima, una partícula de oro coloidal o una partícula de plata.
17. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que separar comprende la separación electroforética del conjugado o el complejo a través de un medio de separación en el canal de separación.
18. Procedimiento de la reivindicación 17, en el que:
(a)
el medio de separación comprende una resina de exclusión por tamaños, una poliacrilamida, gel, polietilenglicol (PEG), óxido de polietileno (PEO), un copolímero se sacarosa y epiclorohidrina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC), poli-N,N-dimetilacrilamida (pDMA) o un gel de agarosa; o
(b)
el medio de separación comprende además el polímero cargado.
19. Procedimiento de la reivindicación 18(b), en el que:
(a)
el polímero cargado está presente en el medio de separación a una concentración de entre aproximadamente el 0,01 y el 5%; o
(b)
el polímero cargado está presente en el medio de separación a una concentración de entre aproximadamente el 0,05 y el 2%.
20. Procedimiento de la reivindicación 17, que comprende además introducir un polímero cargado en un tampón que comprende la muestra y, preferiblemente, en el que el polímero cargado está presente en el tampón de muestra a una concentración de entre aproximadamente el 0,001 y el 2%.
21. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el canal de separación tiene al menos una dimensión de sección transversal a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 200 \mum.
22. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
\quad
al menos uno de los uno o más conjugados está marcado mediante un marcador detectable para formar un complejo que contiene el analito y el conjugado marcado mediante el marcador detectable;
\quad
la etapa (ii) comprende separar el complejo del conjugado marcado no unido en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
\quad
la etapa (iii) comprende:
(a)
medir la cantidad del complejo separado o detectar la presencia del complejo separado; y
(b)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (a) o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada en la etapa (a), y
en el que la molécula de afinidad en el conjugado es capaz de unirse al analito y, cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado es capaz de unirse al analito en un sitio diferente del de las otras moléculas de afinidad.
\global\parskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
\quad
la etapa (i) comprende poner en contacto la muestra que contiene el analito con una o más moléculas de afinidad y uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada, donde al menos una de las moléculas de afinidad o al menos uno de los conjugados está marcado mediante un marcador detectable, para formar un complejo que contiene el analito y la molécula de afinidad o el conjugado;
\quad
la etapa (ii) comprende separar el complejo de la molécula de afinidad marcada no unida o del conjugado marcado no unido en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
\quad
la etapa (iii) comprende:
(a)
medir la cantidad del complejo separado y detectar la presencia del complejo separado; y
(b)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (a) o identificar la presencia del analito en la muestra en base a la presencia detectada en la etapa (a); y
en el que la molécula de afinidad y la molécula de afinidad en el conjugado son capaces de unirse al analito, y cada molécula de afinidad es capaz de unirse al analito en un sitio diferente del de otras moléculas de afinidad.
24. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende un suero, un plasma, una sangre completa, un extracto tisular, un extracto celular, un extracto nuclear, un medio de cultivo, un extracto de cultivo microbiano, miembros de una biblioteca molecular, una muestra clínica, un espécimen de esputo, un espécimen de heces, un líquido cerebroespinal, una muestra de orina, un hisopo urogenital, un hisopo de garganta o una muestra ambiental.
25. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el analito comprende AFP, hCG, TSH, FSH, LH, interleuquina, ligando Fas, CA19-9, CA125, PSA, HBsAg, anticuerpo anti-VIH o T4.
26. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende antes de la etapa de separación (ii) la etapa adicional de concentrar el complejo mediante el uso de un canal de concentración en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum.
27. Procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) analito marcado con un marcador detectable o un análogo del analito marcado con un marcador detectable y (b) uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito o análogo de analito para formar de este modo un primer complejo del analito en la muestra y el conjugado y un segundo complejo del analito marcado o el análogo marcado y el conjugado;
(ii)
separar el primer y segundo complejo de cualquier analito marcado libre o análogo marcado libre que no está implicado en la formación del segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
(iii)
medir la cantidad del segundo complejo separado; y
(iv)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (iii);
en el que cuando se usan dos o más conjugados, cada molécula de afinidad en el conjugado es capaz de unirse al analito en la muestra y al analito marcado o al análogo marcado en un sitio diferente del de otras moléculas de afinidad; y
la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del analito marcado o del análogo marcado por unión para formar un complejo del analito marcado o del análogo marcado, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada;
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de los componentes de la muestra que tienen una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
28. Procedimiento para determinar un analito en una muestra que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con (a) un analito unido a una molécula transportadora cargada o un análogo del analito unido a una molécula transportadora cargada y (b) una o más moléculas de afinidad marcadas mediante un marcador detectable, donde la molécula de afinidad es capaz de unirse al analito o al análogo del analito para formar de este modo un primer complejo del analito unido a la molécula transportadora cargada o del análogo unido a una molécula transportadora cargada y a la molécula de afinidad marcada y un segundo complejo del analito en la muestra y la molécula de afinidad marcada;
(ii)
separar el primer complejo de cualquier segundo complejo en un canal de separación de un dispositivo microfluido en presencia de un polímero cargado;
(iii)
medir la cantidad del primer complejo separado o la cantidad del segundo complejo;
(iv)
determinar la cantidad del analito en la muestra en base a la cantidad medida en la etapa (iii); y
en el que cuando se usan dos o más moléculas de afinidad, cada molécula de afinidad es capaz de unirse al analito en la muestra y al analito o al análogo de analito unido a la molécula transportadora cargada en un sitio diferente del de otras moléculas de afinidad y
en el que la molécula transportadora cargada es capaz de causar un cambio en el tiempo de migración del primer complejo por unión al analito o al análogo para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere con la unión de los componentes de la muestra que tienen una carga opuesta a la de la molécula transportadora cargada.
29. Procedimiento de concentración de un analito de interés en una muestra que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra que contiene el analito con uno o más de conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado; y
(ii)
concentrar el complejo mediante el uso de un canal de concentración en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum en presencia de un polímero cargado,
en el que la molécula transportadora cargada causa un cambio en una propiedad de migración del analito por unión para formar un complejo del analito, la molécula de afinidad y la molécula transportadora cargada; y
en el que el polímero cargado tiene la misma carga que la molécula transportadora cargada, de tal modo que el polímero cargado interfiere en la unión de los componentes de la muestra que tienen una carga opuesta a la molécula transportadora cargada.
30. Procedimiento de la reivindicación 29, en el que el contacto de la muestra que contiene el analito con uno o más conjugados de una molécula de afinidad y una molécula transportadora cargada para formar un complejo del analito y el conjugado se realiza en un microcanal fluídico conectado al canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum.
31. Procedimiento de la reivindicación 29, en el que:
(a)
la concentración del complejo se realiza mediante la utilización de la diferencia en la movilidad electroforética entre el complejo y los constituyentes de interferencia en base a la carga de la molécula transportadora cargada; o
(b)
la concentración del complejo se realiza mediante la utilización de la diferencia en una propiedad de adsorción entre el complejo y los constituyentes de interferencia en base a la carga de la molécula transportadora cargada; o
(c)
la concentración del complejo se realiza de acuerdo con un procedimiento de concentración seleccionado del grupo que consiste en concentración de muestra por amplificación de campo (FASS), inyección de muestra por amplificación de campo (FASI), isotacoforesis (ITP), enfoque isoeléctrico (IF) y extracción en fase sólida (SPE); o
(d)
la concentración del complejo se realiza de acuerdo con un procedimiento de concentración seleccionado del grupo que consiste en concentración de muestra por amplificación de campo (FASS) e isotacoforesis (ITP).
32. Procedimiento de la reivindicación 29, en el que:
(a)
la molécula transportadora cargada es una molécula aniónica o una molécula catiónica; o
(b)
la molécula transportadora cargada es una molécula aniónica que comprende una cadena de nucleótidos o un polipéptido sulfonado; o
(c)
la molécula transportadora cargada comprende ADN, ARN, un polímero catiónico o un polipéptido sulfonado;
(d)
la molécula transportadora cargada comprende ADN que comprende una o más secuencias sintéticas.
33. Procedimiento de la reivindicación 32(d), en el que la una o más secuencias sintéticas comprenden uno o más análogos de nucleótidos que comprenden un grupo engarce o un grupo reactivo engarce.
34. Procedimiento de la reivindicación 33, en el que el grupo engarce o grupo reactivo engarce comprende un grupo amino, un tiol, un grupo carboxilo, un grupo imidazol o un grupo succinimida.
35. Procedimiento de la reivindicación 34, que comprende además unir covalentemente un marcador detectable con el grupo engarce o el grupo reactivo engarce.
36. Procedimiento de la reivindicación 32(d) en el que la una o más secuencias sintéticas consisten en una seleccionada de un análogo de fosforotioato de nucleótido, un nucleótido que contiene un grupo metileno en lugar de oxígeno en el anillo de ribosa o un nucleótido que tiene una sustitución del sustituyente 2'-desoxiazúcar por una modificación 2-fluoro, 2'-O-metilo, 2-O-alcoxilo y 2'-O-alilo.
37. Procedimiento de la reivindicación 29, en el que la etapa de contacto comprende además poner en contacto la muestra con una o más moléculas de afinidad para formar un complejo del analito, el conjugado y la molécula de afinidad.
38. Procedimiento de la reivindicación 29 o de la reivindicación 37, en el que:
(a)
la molécula de afinidad es una que se une al analito mediante una interacción proteína-proteína, una interacción proteína-compuesto químico o una interacción química; o
(b)
la molécula de afinidad es una que se une al analito mediante una interacción antígeno-anticuerpo, una interacción cadena de azúcar-lectina, una interacción enzima-inhibidor, una interacción proteína-cadena peptídica, una interacción cromosoma o cadena de nucleótidos-cadena de nucleótidos, una interacción nucleótido-ligando o una interacción receptor-ligando; o
(c)
la molécula de afinidad se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo Fab', F(ab')_{2} o Fab, una región variable de anticuerpo, una lectina avidina, un receptor, un péptido de afinidad, un aptámero y una proteína de unión a ADN.
39. Procedimiento de la reivindicación 37, en el que al menos un conjugado o al menos una molécula de afinidad que no forma un conjugado está marcada con un marcador detectable.
40. Procedimiento de la reivindicación 29, en el que:
(a)
la molécula transportadora cargada en el conjugado está marcada mediante un marcador detectable; o
(b)
la molécula de afinidad en el conjugado está marcada mediante un marcador detectable.
41. Procedimiento de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, en el que el marcador detectable es un colorante fluorescente, un colorante luminiscente, un colorante fosforescente, una proteína fluorescente, una proteína o partícula luminiscente, un trazador radiactivo, un compuesto quimioluminiscente, un mediador redox, un compuesto electrogénico, una enzima, una partícula de oro coloidal o una partícula de plata.
42. Procedimiento de la reivindicación 29 o de la reivindicación 37, en el que la etapa de contacto y/o la etapa de concentración se realiza en presencia de un polímero cargado.
43. Procedimiento de la reivindicación 42, en el que el polímero cargado es un polímero polianiónico o un polímero policatiónico.
44. Procedimiento de reivindicación 43, en el que:
(a)
el polímero cargado es un polímero polianiónico seleccionado del grupo que consiste en polisacáridos, polinucleótidos, polipéptidos, compuestos macromoleculares sintéticos, cerámicos y complejos de los mismos; o
\newpage
(b)
el polímero cargado es un polianión seleccionado del grupo que consiste en poli-dldC, sulfato de heparina, sulfato de dextrano, ácido politúngstico, ácido polianetolsulfónico, sulfato de polivinilo, poliacrilato, sulfato de condroitina, ADN plasmídico, ADN de timo de ternera, ADN de esperma de salmón, ADN acoplado a celulosa, partículas de cristal, cristal coloidal y cristal lechoso; o
(c)
el polímero cargado es un policatión seleccionado del grupo que consiste en polialilamina, polilisina, polihistidina, quitosán, protamina, polietilenimina y poliarginina.
45. Procedimiento de la reivindicación 42, en el que el polímero cargado comprende una carga negativa neta o el polímero cargado comprende una carga positiva neta.
46. Procedimiento de la reivindicación 45, en el que el polímero cargado comprende sulfato de heparina.
47. Procedimiento de la reivindicación 29 o de la reivindicación 37, en el que la etapa de concentración comprende la concentración electroforética del conjugado o del complejo a través de un medio de concentración en el canal de concentración, en el que el medio de concentración comprende (a) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en una resina de exclusión por tamaños, un gel de poliacrilamida, polietilenglicol (PEG), óxido de polietileno (PEO), un copolímero de sacarosa y epiclorohidrina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC), poli-N,N-dimetilacrilamida (pDMA) o un gel de agarosa; o (b) el compuesto (a) y un polímero cargado.
48. Procedimiento de la reivindicación 42, en el que:
(a)
el polímero cargado está presente en el medio de concentración a una concentración de entre aproximadamente el 0,01 y el 5%; o
(b)
el polímero cargado está presente en el medio de concentración a una concentración de entre aproximadamente el 0,05 y el 2%.
49. Procedimiento de la reivindicación 47, que comprende además introducir un polímero cargado en un tampón que comprende la muestra.
50. Procedimiento de la reivindicación 49, en el que el polímero cargado comprende sulfato de heparina que está presente en el tampón de muestra a una concentración de entre aproximadamente el 0,001 y el 2%.
51. Procedimiento de la reivindicación 29, en el que el canal de concentración tiene al menos una dimensión de sección transversal a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 200 \mum.
52. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende antes de la etapa de separación (ii) la etapa adicional de concentrar el complejo mediante el uso de un canal de concentración en un dispositivo microfluido que comprende al menos un canal de concentración que tiene al menos una dimensión a escala microscópica de entre aproximadamente 0,1 y 500 \mum.
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