JP5615306B2 - 標的認識分子および標的認識分子を固定化する方法 - Google Patents
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Description
トが、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する3個以上の帯電性官能基を備えることを特徴とする。
的認識ペプチドセグメントの等電点が、6以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、pH7以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基であることを特徴とする。
て、前記帯電性セグメントが、同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電する3個以上の帯電性官能基を備え、かつ異なる極性に帯電する官能基を有しないものであることを特徴とする。
分子において、前記帯電性セグメントが、nが3以上150の化1で表されるポリアクリル酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
子において、前記帯電性セグメントは、nが3以上150の化4で表されるポリアリルアミン塩酸塩構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
子において、前記帯電性セグメントが、nが1以上150以下の化9で表されるコンドロイチン硫酸構成単位を有するセグメントであることを特徴とする。
第27発明〜第28発明は、上記した第1〜第24発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関し、第29発明〜第30発明は、上記した第25〜第26発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関する。
(実施例1-1)
[ペプチドセグメント]
標的認識ペプチドセグメント(標的認識用PSと略記)として、protein ki
nase A(PKA)基質ペプチドを用意した。このもののアミノ酸配列は〈LRRA
SLG〉であり、このものはセリン残基がリン酸化されている。また、下記表1および式1に基づいて算出した等電点(平均値)は7.3である。
帯電性セグメントは、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸(D)を8個連結したペプチド〈アミノ酸配列;DDDDDDDD〉とした。この帯電性セグメントの等電点(平均値)は、2.77であり、親水性である。
連結セグメントとしては、一般式化11に示すポリエチレングリコール構成単位を5個(n=5)含むBis(NHS)PEG5 〔Bis-N−Succinimidyl−(pentaethyene-glycol) ester〕(化12)を用いた。この一方端のスクシンイミド基(NHS)を上記標的認識ペプチドセグメントのN末端のアミノ酸残基のアミノ基に反応させ、他方端のスクシンイミド基を上記帯電性セグメントのN末端のアミノ酸残基のアミノ基に結合させた。
実施例1の標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列;DDDDDDDD〉のC末端に常法にしたがって基材結合用セグメントとしてシステイン〈C〉を結合させた。この実施例1−2の標的認識分子を化14に示す。
実施例1-2においては、更にシステイン残基のチオール基に、(N−[4−(p−Azidosalicylamido) butyl]−3´−(2´−pyridyldit
hio)propionamide)(APDP;Thermo社)を反応させ、末端に光架橋基であるアジド基を導入した。
上記APDPのジスルフィド結合と、システインのSH基とが反応(ジスルフィド交換)して、結合する。実施例1−3の標的認識分子の構造を化15に示す。
上記実施例1−3の(N−[4−(p−Azidosalicylamido) butyl]−3´−(2´−pyridyldithio)propionamide)に代えて、N−(6−Maleimidocaproyloxy)succinimide(同
仁化学社)を用いて、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した。
端を持つSAM膜を形成する。
(実施例2−1)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉の末端にシステインを結合したもの〈配列;LRRASLGC〉を用いた。
0.1mMの標的認識ペプチドセグメントにモル比100倍の10mM Mal−PEG−Mal溶液(10%DMSO含む)を反応させた。その後、未架橋のMal−PEG−Malを取り除き、0.1mMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端の
マレイミド基と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのシステイン残基のSH基とを、それぞれ結合反応させた。
このようにして化17で表される実施例2-1の標的認識分子を作製した。
上記実施例1−2と同様、標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列;RRRRRRRRRR〉のC末端に、実施例1−2と同様に基材結合用セグメントとしてシステイン〈C〉を結合させた。この実施例2−2の標的認識分子の構造を化19に示す。
上記実施例1−3と同様にして、分子末端に光架橋基(アジド基)を導入した実施例2−3にかかる標的認識分子を作製した。実施例2−3の標的認識分子を化20に示す。
上記実施例1−4と同様にして、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した実施例2−4にかかる標的認識分子を作製した。実施例2−4の標的認識分子の構造を化21に示す。なお、Xは連結セグメント、Pはペプチドを示している。
(実施例3)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉とした。
を有するものとした。
テル結合させ、スクシンイミド基と標的認識ペプチドセグメントのアミノ基とを結合させた。
(実施例4)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉とした。
(実施例5)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉とした。
(実施例6)
実施例5において、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリドに代え、帯電性セグメントを化4で表されるポリアリルアミン構成単位(n=14)を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。これ以外は実施例5と同様にして、実施例6にかかる標的認識分子を作製した。この分子の構造を化25に示す。
(実施例7)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉とした。
(実施例8)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉とした。
は10%以上であればよい。
セグメントのアミノ基とを結合させた。
(実施例9)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉とした。
セグメントのアミノ基とを結合させた。
(実施例10−1)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;
LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、一般式化30に示すBis Maleimidoethane 〔Thermo社〕を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
0.1mMの標的認識ペプチドセグメントにモル比100倍の10mM Bis Maleimidoethane(10%DMSO含む)を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除き、0.1mMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基と
標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例10−1と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、一般式化31に示す1,4-Di-[3´-(2-pyridyldithio) -propionamido]butane(Thermo社)を用いた。このジスルフィドの一方を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方のジスルフィドを上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例10−1と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、一般式化32に示す1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycol(Thermo社)を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例10−1と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、上記実施例10−3と同じ1,11-Bis-maleimido -triethyleneglycol(Thermo社)を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグ
メントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
0.1mMの標的認識ペプチドセグメントにモル比100倍の10mM Bis Maleimido ethane(10%DMSO含む)を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除
き、0.1mMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基
と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。下記化33に示す10mM N-[g-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester溶液を混合し、帯電性セグメント
のSH基と反応させ、末端にスクシンイミド基を有する基材結合セグメントを導入した。
上記各実施例では、標的認識ペプチドセグメントとしてprotein kinase A基質ペプチドを用いたが、本発明の主要要素である標的認識ペプチドセグメントは、上記物質に限られない。本発明にかかる標的認識ペプチドセグメントは、標的物質を特異的に認識するペプチドであればよい。標的物質を特異的に認識するペプチドであるか否かは、検出目的とする標的物質との関係において判定する。具体的には、ファージディスプレイ法(Pharge Display - Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 Barbas. C. et al.)や、スポット合成法(The SPOT-synthesis technique. Synthesis peptide arrays on membrane supports-principles and applications. J. Immunol. Methods 267 2002 13-26 R. Frank)などの公知の方法を用いて、検出目的とする標的物
質を認識できるペプチド配列を決定し、この配列のペプチドを標的認識ペプチドセグメントとして選定する。
程度の中性のキャリア液に溶解した場合、標的認識ペプチドセグメント部分の電荷は無視しうる程度の大きさとなる。すなわち、上記各実施例にかかる標的認識分子においては、帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスまたはマイナスの何れに帯電するものであっても、標的認識ペプチドセグメント部分の電荷に殆ど影響されないことから、標的認識ペプチドセグメントの平均等電点との関連性において帯電性セグメントの電荷の種類を規定する必要がない。
が十分に高まるので、プラス電荷を与えた固定化部位(電極)に効率よく集合させ可逆的に固定化させることができる。
リア水溶液に溶解すると、帯電性セグメントのプラス電荷密度が十分に高まる。よって、この要件を充足させることにより、マイナス電荷を与えた固定化部位(電極)に効率よく集合させ可逆的に固定化させることができることになる。
2 連結セグメント
3 帯電性セグメント
3’ 帯電性セグメントの繰り返し単位
4 基材
5 基材結合セグメント
10 分析チップ
11 注液口
12 マイクロ流路
13 排出口
14・15 電極(何れか一方が固定化部位)
16 検出器
17 電源
Claims (28)
- 標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、
静電気的作用を利用して基材に可逆的に固定させるセグメントであって同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る3個以上の帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、
アミノ酸残基を含むセグメントであって前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメントと、
を有し、
前記帯電性セグメントは、アミノ酸残基を有さないセグメントである標的認識分子。 - 請求項1に記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントは、アミノ酸残基からなるセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、6以下であり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、pH7以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が、8以上であり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、pH7以下の水溶液中でプラスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし3の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化1で表されるポリアクリル酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1ないし3の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化2で表されるポリスチレンスルホン酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1、2又は4に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、化3で表されるポリエチレンイミン構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1、2又は4に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化4で表されるポリアリルアミン塩酸塩構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1、2又は4に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化5で表されるポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1、2又は4に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化6で表されるポリビニルピリジン構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1ないし3の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化7で表されるポリビニル硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1ないし3の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが1以上150以下の化8で表されるデキストラン硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1ないし3の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが1以上150以下の化9で表されるコンドロイチン硫酸構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1ないし3の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、nが3以上150以下の化10で表されるヌクレオチド構成単位を有するセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。
- 請求項1ないし14の何れかに記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、同一の溶液中で異なる極性に帯電する官能基を有しない、
を有する標的認識分子。 - 請求項1ないし15の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントは、3個以上19個以下のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1〜16の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントは、システイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1〜16の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの一方端がシステイン残基であり、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1〜18の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントのN末端またはC末端の何れか一方に前記連結セグメントが化学結合され、当該結合部位と異なる連結セグメント部位に前記帯電性セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、
静電気的作用を利用して基材に引きつけられるセグメントであって同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る3個以上の帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、
アミノ酸残基を含むセグメントであって前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結する連結セグメントと、
前記帯電性セグメントに結合された、基材と不可逆的に化学結合させるための基材結合用官能基と、を有し、
前記帯電性セグメントは、アミノ酸残基を有さないセグメントである、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項20に記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントは、一方端の結合可能部位で前記標的認識ペプチドセグメントと化学結合し、前記一方端の結合可能部位から最も離れた他方端側の結合可能部位で前記帯電性セグメントと化学結合し、
前記帯電性セグメントの、前記連結セグメントと化学結合した部位から最も離れた結合可能部位に、前記基材結合用官能基が結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項20または21に記載の標的認識分子において、
前記基材結合用官能基が、チオール基、アジド基、またはスクシンイミド基である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項3、5、6、11〜14の何れか1項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が6以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項4、7〜10の何れか1項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が8以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項20ないし22の何れかに記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が6以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用官能基と電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項20ないし22の何れかに記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が8以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電する官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用官能基と電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - 電極を備えた基板と、前記電極に固定化された標的認識分子と、を有する標的認識分子固定化電極基板であって、
前記標的認識分子が、上記請求項1ないし22の何れか1項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする標的認識分子固定化電極基板。 - 電極と、前記電極に固定化された標的認識分子と、標的認識分子が捕捉した標的分子を検出する検出器と、を有する特定分子検出装置であって、
前記標的認識分子が、上記請求項1ないし22の何れか1項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする特定分子検出装置。
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