JP4922341B2 - 標的認識分子および標的認識分子を固定化する方法 - Google Patents
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Description
第27発明〜第28発明は、上記した第1〜第24発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関し、第29発明〜第30発明は、上記した第25〜第26発明にかかる標的認識分子を利用するための固定化方法に関する。
(実施例1-1)
[ペプチドセグメント]
標的認識ペプチドセグメント(標的認識用PSと略記)として、protein kinase A(PKA)基質ペプチドを用意した。このもののアミノ酸配列は〈LRRASLG〉であり、このものはセリン残基がリン酸化されている。また、下記表1および式1に基づいて算出した等電点(平均値)は7.3である。
帯電性セグメントは、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸(D)を8個連結したペプチド〈アミノ酸配列;DDDDDDDD〉とした。この帯電性セグメントの等電点(平均値)は、2.77であり、親水性である。
連結セグメントとしては、一般式化11に示すポリエチレングリコール構成単位を5個(n=5)含むBis(NHS)PEG5 〔Bis−N−Succinimidyl−(pentaethyene−glycol)ester〕(化12)を用いた。この一方端のスクシンイミド基(NHS)を上記標的認識ペプチドセグメントのN末端のアミノ酸残基のアミノ基に反応させ、他方端のスクシンイミド基を上記帯電性セグメントのN末端のアミノ酸残基のアミノ基に結合させた。
実施例1の標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列;DDDDDDDD〉のC末端に常法にしたがって基材結合用セグメントとしてシステイン〈C〉を結合させた。この実施例1−2の標的認識分子を化14に示す。
実施例1-2においては、更にシステイン残基のチオール基に、(N−[4−(p−Azidosalicylamido) butyl]−3´−(2´−pyridyldithio)propionamide)(APDP;Thermo社)を反応させ、末端に光架橋基であるアジド基を導入した。
上記APDPのジスルフィド結合と、システインのSH基とが反応(ジスルフィド交換)して、結合する。実施例1−3の標的認識分子の構造を化15に示す。
上記実施例1−3の(N−[4−(p−Azidosalicylamido) butyl]−3´−(2´−pyridyldithio)propionamide)に代えて、N−(6−Maleimidocaproyloxy)succinimide(同仁化学社)を用いて、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した。
(実施例2−1)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインを結合したもの〈配列;LRRASLGC〉を用いた。
0.1mMの標的認識ペプチドセグメントにモル比100倍の10mM Mal−PEG−Mal溶液(10%DMSO含む)を反応させた。その後、未架橋のMal−PEG−Malを取り除き、0.1mMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのシステイン残基のSH基とを、それぞれ結合反応させた。
このようにして化17で表される実施例2-1の標的認識分子を作製した。
上記実施例1−2と同様、標的認識分子の帯電性セグメント〈アミノ酸配列;RRRRRRRRRR〉のC末端に、実施例1−2と同様に基材結合用セグメントとしてシステイン〈C〉を結合させた。この実施例2−2の標的認識分子の構造を化19に示す。
上記実施例1−3と同様にして、分子末端に光架橋基(アジド基)を導入した実施例2−3にかかる標的認識分子を作製した。実施例2−3の標的認識分子を化20に示す。
上記実施例1−4と同様にして、システイン残基のチオール基にスクシンイミド基を導入した実施例2−4にかかる標的認識分子を作製した。実施例2−4の標的認識分子の構造を化21に示す。なお、Xは連結セグメント、Pはペプチドを示している。
(実施例3)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉とした。
(実施例4)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉とした。
(実施例5)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉とした。
(実施例6)
実施例5において、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリドに代え、帯電性セグメントを化4で表されるポリアリルアミン構成単位(n=14)を有するものとした。なお、帯電性セグメントに、連結セグメントと結合させるためのポリアクリル酸構成単位を導入した。これ以外は実施例5と同様にして、実施例6にかかる標的認識分子を作製した。この分子の構造を化25に示す。
(実施例7)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉とした。
(実施例8)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉とした。
(実施例9)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉とした。
(実施例10−1)
標的認識ペプチドセグメントは、上記第1実施例群と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、一般式化30に示すBis Maleimidoethane 〔Thermo社〕を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
0.1mMの標的認識ペプチドセグメントにモル比100倍の10mM Bis Maleimidoethane(10%DMSO含む)を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除き、0.1mMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例10−1と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、一般式化31に示す1,4-Di-[3´-(2-pyridyldithio) -propionamido]butane(Thermo社)を用いた。このジスルフィドの一方を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方のジスルフィドを上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例10−1と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、一般式化32に示す1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycol(Thermo社)を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
標的認識ペプチドセグメントは、上記実施例10−1と同じPKA基質ペプチド〈配列;LRRASLG〉の末端にシステインCが導入されたものとした。
連結セグメントとしては、上記実施例10−3と同じ1,11-Bis-maleimido -triethyleneglycol(Thermo社)を用いた。この一方端のマレイミド基を上記標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基に反応させ、他方端のマレイミド基を上記帯電性セグメントのSH基に結合させた。
0.1mMの標的認識ペプチドセグメントにモル比100倍の10mM Bis Maleimido ethane(10%DMSO含む)を反応させた。その後、未架橋のBis Maleimidoethaneを取り除き、0.1mMの帯電性セグメントを反応させ、連結セグメントの一方端のマレイミド基と標的認識ペプチドセグメントのシステイン残基のSH基とを、連結セグメントの他方端のマレイミド基と帯電性セグメントのSH基とを、それぞれ結合反応させた。下記化33に示す10mM N-[g-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester溶液を混合し、帯電性セグメントのSH基と反応させ、末端にスクシンイミド基を有する基材結合セグメントを導入した。
上記各実施例では、標的認識ペプチドセグメントとしてprotein kinase A基質ペプチドを用いたが、本発明の主要要素である標的認識ペプチドセグメントは、上記物質に限られない。本発明にかかる標的認識ペプチドセグメントは、標的物質を特異的に認識するペプチドであればよい。標的物質を特異的に認識するペプチドであるか否かは、検出目的とする標的物質との関係において判定する。具体的には、ファージディスプレイ法(Pharge Display - Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 Barbas. C. et al.)や、スポット合成法(The SPOT-synthesis technique. Synthesis peptide arrays on membrane supports-principles and applications. J. Immunol. Methods 267 2002 13-26 R. Frank)などの公知の方法を用いて、検出目的とする標的物質を認識できるペプチド配列を決定し、この配列のペプチドを標的認識ペプチドセグメントとして選定する。
2 連結セグメント
3 帯電性セグメント
3’ 帯電性セグメントの繰り返し単位
4 基材
5 基材結合セグメント
10 分析チップ
11 注液口
12 マイクロ流路
13 排出口
14・15 電極(何れか一方が固定化部位)
16 検出器
17 電源
Claims (36)
- 標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、
静電気的作用を利用して基材に可逆的に固定させるセグメントであって同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る3個以上の帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結するための連結セグメントと、
を備え、
前記連結セグメントはアミノ酸残基を含まないセグメントであり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、pH7以上の水溶液中でマイナスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 標的物質を特異的に識別する認識部位としての標的認識ペプチドセグメントと、
静電気的作用を利用して基材に可逆的に固定させるセグメントであって同一の溶液中で同一極性の電荷に帯電し得る3個以上の帯電性官能基を備えた帯電性セグメントと、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントのそれぞれに化学結合して両者を連結するための連結セグメントと、
を備え、
前記連結セグメントはアミノ酸残基を含まないセグメントであり、
前記帯電性セグメントの帯電性官能基が、pH7未満の水溶液中でプラスに帯電する官能基である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1または2に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、同一の溶液中で異なる極性に帯電する官能基を有しない、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし3のいづれかに記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントはポリエチレングリコールからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし3のいづれかに記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントは炭化水素鎖からなる、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1または3から5のいづれかに記載の標的認識分子において、
記標的認識ペプチドセグメントの等電点が6以下である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項2ないし5のいづれかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が8以上である
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項3に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントはシステイン残基を含み、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし7の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントの一方端がシステイン残基であり、当該システイン残基の硫黄元素に前記連結セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし7の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントのN末端またはC末端の何れか一方に前記連結セグメントが化学結合され、当該結合部位と異なる連結セグメント部位に前記帯電性セグメントが化学結合されている、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし10の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントが、3個以上のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項11に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アルギニン、リシンからなる群から1つ以上選択された塩基性アミノ酸残基を3個以上含み、かつ、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基を含まない、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項11に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントとしてのペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から1つ以上選択された酸性アミノ酸残基を3個以上含み、かつ、アルギニン残基及びリシン残基を含まない、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項11ないし13の何れか1項に記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントを構成するアミノ酸残基の数が、前記標的認識ペプチドセグメントを構成するアミノ酸残基の数よりも多い、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし24の何れかに記載の標的認識分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントは、3個以上19個以下のアミノ酸残基を有するペプチドからなる、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし25の何れかに記載の標的認識分子において、
前記帯電性セグメントは、基材と不可逆的に化学結合させるための基材結合用官能基を備える、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項25に記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントは、一方端の結合可能部位で標的認識ペプチドセグメントと化学結合し、前記一方端の結合可能部位から最も離れた他方端側の結合可能部位で前記帯電性セグメントと化学結合し、
前記帯電性セグメントは、前記連結セグメントと化学結合した部位から最も離れた結合可能部位に不可逆的に化学結合させるための基材結合用官能基を備える、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項26または27に記載の標的認識分子において、
前記基材結合用官能基は、チオール基、アジド基、またはスクシンイミド基である、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし28の何れかに記載の標的分子において、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記帯電性セグメントがシステイン残基をそれぞれ有し、
前記連結セグメントが、ジスルフィド基およびマレイミド基のうちから選択されるチオール基と反応可能な2つの官能基を有し、
前記標的認識ペプチドセグメントと前記連結セグメントとが、前記システイン残基と前記ジスルフィドとの反応により生じるジスルフィド結合により、または前記システイン残基の硫黄元素が前記マレイミド基に付加することにより、化学結合しており、
前記帯電性セグメントと前記連結セグメントとが、前記システイン残基と前記ジスルフィドとの反応により生じるジスルフィド結合により、または前記システイン残基の硫黄元素が前記マレイミド基に付加することにより、化学結合している、
ことを特徴とする標的認識分子。 - 請求項1ないし28の何れかに記載の標的認識分子において、
前記連結セグメントが、
(i)ポリエチレングリコール構成単位からなるセグメント部分、
(ii)Bis Maleimidoethaneと2つのチオール基とが反応することにより生じるセグメント部分であって、Bis Maleimidoethaneの2つのマレイミド基がそれぞれチオール基と反応することにより生じるセグメント部分、
(iii)1,4-Di-[3’-(2-pyridyldithio)-propionamido]butaneと2つのチオール基とが反応することにより生じるセグメント部分であって、1,4-Di-[3’-(2-pyridyldithio)-propionamido]butaneの2つのジスルフィドがそれぞれチオール基と反応することにより生じるセグメント部分、または
(iv)1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycolとチオール基とが反応することにより生じるセグメント部分であって、1,11-Bis-maleimido-triethyleneglycolの2つのマレイミド基がそれぞれチオール基と反応することにより生じるセグメント部分を含む、
ことを特徴とする標的認識分子。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項1または3〜6、8〜10、15から6、21〜24の何れか1項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が6以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電し得る官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項2〜5または7〜10、17〜20の何れか1項に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が8以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電し得る官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に標的認識分子を電気的に捕集し保持させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項26、27、または28に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が6以下であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がマイナスに帯電し得る官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以上に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にプラス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用官能基と電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - マイクロ流路内に電極が形成された分析用チップに、上記請求項26、27、または28に記載の標的認識分子を固定化する方法であって、
前記標的認識ペプチドセグメントの等電点が8以上であり、前記帯電性セグメントの帯電性官能基がプラスに帯電し得る官能基である標的認識分子を溶液に溶解し、溶液pHをpH7以下に調整した標的認識分子含有溶液を作製する工程と、
前記マイクロ流路内の電極にマイナス電荷を印加した状態で、前記マイクロ流路内に前記標的認識分子含有溶液を流し、電極表面に電気的に標的認識分子を捕集させ、標的認識分子の基材結合用官能基と電極とを化学結合させる工程と、
を備える標的認識分子を固定化する方法。 - 電極を備えた基板と、前記電極に固定化された標的認識分子と、を有する標的認識分子固定化電極基板であって、
前記標的認識分子が、上記請求項1ないし請求項30の何れか1項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする標的認識分子固定化電極基板。 - 電極と、前記電極に固定化された標的認識分子と、標的認識分子が捕捉した標的分子を検出する検出器と、を有する特定分子検出装置であって、
前記標的認識分子が、上記請求項1ないし請求項30の何れか1項に記載された標的認識分子である、
ことを特徴とする特定分子検出装置。
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