JP6174367B2 - トロンビン含有試薬及び測定方法 - Google Patents
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Description
[1]アニオン性ポリアミノ酸を含有することを特徴とする、トロンビン含有試薬。
[2]前記アニオン性ポリアミノ酸が、高分子量のアニオン性ポリアミノ酸である、[1]のトロンビン含有試薬。
[3]前記アニオン性ポリアミノ酸が、少なくとも2つのアニオン性モノアミノ酸を含む、[1]又は[2]のトロンビン含有試薬。
[4]前記アニオン性ポリアミノ酸が、少なくとも1つ以上のアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む、[1]〜[3]のいずれかのトロンビン含有試薬。
[5]前記アニオン性ポリアミノ酸が、測定時の反応液中の最終濃度として0.01(W/V)%〜10(W/V)%で含有される、[1]〜[4]のいずれかのトロンビン含有試薬。
[6]非イオン性界面活性剤を含有する、[1]〜[5]のいずれかのトロンビン含有試薬。
[7]トロンビン含有試薬が、フィブリノゲン測定試薬、トロンビン時間測定試薬、アンチトロンビン測定試薬、直接トロンビン阻害剤濃度測定試薬の中から選択される、[1]〜[6]のいずれかのトロンビン含有試薬。
[8]トロンビンを含有し、且つ、トロンビン活性を介する血中成分測定試薬を用いる測定方法において、トロンビン活性を介する測定反応系にアニオン性ポリアミノ酸を共存させることを特徴とする、前記測定方法。
[9]トロンビン含有試薬を用いる血中成分測定において、前記トロンビン含有試薬がアニオン性ポリアミノ酸を含有することを特徴とする、キャリーオーバーの抑制方法。
アニオン性ポリアミノ酸は、高分子量のアニオン性ポリアミノ酸が好ましい。アニオン性ポリアミノ酸の分子量の上限は、400万以下が好適で、さらに、300万以下がより好適であり、さらに200万以下が特に好適である。また、下限については、2000以上、好ましくは5万以上、更に好ましくは10万以上が好適である。
該試薬に含有されるアニオン性ポリアミノ酸の濃度は、測定時の反応液中の最終濃度として0.01(W/V)%〜10(W/V)%が好適であり、さらに0.05(W/V)%〜5(W/V)%がより好適であり、さらに、0.1(W/V)%〜3(W/V)%が特に好適である。
例えば、2試薬系の場合、アニオン性ポリアミノ酸は、検体希釈液に含有しても良いし、トロンビンを含有する測定試薬に含有しても良いし、その両方に含有しても良い。また、トロンビン含有試薬を分注した直後に、続いてトロンビン非含有試薬を分注する場合には、少なくともトロンビンを含有する測定試薬に含有することが好ましい。従って、アニオン性ポリアミノ酸は、少なくともトロンビンを含有する測定試薬に共存できると汎用性が高く好ましい。
例えば、トロンビン含有試薬は溶液状態において、通常緩衝液が使用される。その種類は、pH4〜9の範囲に緩衝能をもつ緩衝剤を適宜選択して用いる。例えば、HEPES、MOPS、BIS−TRIS、TRIS、MOPSO、ADA、MES等から1種もしくは2種以上が選択され用いられる。またトロンビン含有試薬には適当な防腐剤や、アミノ酸や糖等の一般的な安定化剤を添加してもよい。また、フィブリン生成に効果的な塩化ナトリウムやカルシウム化合物等や、高分子多糖類や合成高分子類を含ませることもできる。さらにアルブミン、ゼラチン、グロブリン等のタンパク質を含有させることもできる。これらタンパク質は1種もしくは2種以上を組み合わせて選択して用いることができる。
また、前記非イオン性界面活性剤は、前記アニオン性ポリアミノ酸と同様にトロンビン含有試薬に添加することができる。
フィブリノゲン測定試薬の調製は以下の操作によって実施した。
30mmol/L BisTrisからなるpH6.5の緩衝液に、トロンビンを100IU/mLとなるように溶解したものを基本組成(試薬1)とし、それにポリグルタミン酸(分子量150万前後)(ヤクルト薬品工業社製)を0.5(W/V)%になるように添加したもの(試薬2)、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル(商品名:Triton X−100)を0.5(W/V)%となるように添加したもの(試薬3)、さらにポリグルタミン酸(分子量150万前後)とTriton X−100を各0.5(W/V)%になるように添加したもの(試薬4)を調製し、フィブリノゲン測定用試薬とした。
試薬5は、ポリグルタミン酸(分子量20万〜40万)(日本ポリグル社)とTriton X−100を各0.5(W/V)%となるように添加した。
試薬6は、ポリビニルアルコール(分子量約1000)(WAKO)とTriton X−100を各0.5(W/V)%となるように添加した。
測定は、全臨床検査システムSTACIA(三菱化学メディエンス)を用いて、波長405nmにおける濁度変化からフィブリノゲン量を算出した。
実施例2−1:ポリグルタミン酸含有の効果
実施例1において調製した各フィブリノゲン測定試薬を用いて、血漿中のフィブリノゲン濃度を測定した時の同時再現性を検討した。フィブリノゲン濃度は238mg/dLのSHP(ヒト標準血漿)(SYSMEX)を生理食塩水で1/2希釈した検体をそれぞれ多重度=20で測定し、変動係数を比較した。その結果を表1に示す。
試薬1(比較例)・・・未添加
試薬2(実施例)・・・ポリグルタミン酸(分子量150万前後)
試薬3(比較例)・・・Triton X−100
試薬4(実施例)・・・ポリグルタミン酸(分子量150万前後)
+TritonX−100
試薬5(実施例)・・・ポリグルタミン酸(分子量20万〜40万)
+TritonX−100
試薬6(比較例)・・・ポリビニルアルコール(分子量約1000)
+TritonX−100
なお測定は、サンプル検体10μLを緩衝液90μLで希釈し、さらに各フィブリノゲン試薬50μLを添加したものを使用した。
以上より、ポリグルタミン酸を添加することでCV値が改善でき、ポリグルタミン酸と非イオン界面活性剤を添加することにより更に高いCV値を容易に達成できることは、非常に有用性が高い。
実施例1で調製した試薬1(比較例)、試薬2(実施例)、試薬3(比較例)及び試薬4(実施例)を使用し、前記の全臨床検査システムSTACIAで測定した。試薬分注ノズルは共通である。
試薬1〜4をそれぞれ測定直後に、続いてAPTT試薬(IL社製)の測定を行った。比較として、トロンビン非含有の試薬(トロンビンを含まないこと以外は試薬1と同じ)での測定直後に、APTT試薬の測定を行った(リファレンス)。
リファレンスではAPTTの凝固時間の変化は起こらず、前測定試薬の影響は認められなかったが、試薬1の場合はAPTTの凝固時間の短縮が観察され、前測定試薬に含まれるトロンビンのキャリーオーバーが原因であると考えられた。そこで、試薬1〜4を使用し、ポリグルタミン酸の添加により、トロンビン含有試薬中のトロンビンのキャリーオーバーの抑制効果を比較した。その結果を表2に示す。
Claims (8)
- 高分子量のアニオン性ポリアミノ酸及び非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする、トロンビン含有試薬。
- 前記の高分子量のアニオン性ポリアミノ酸が、分子量2000〜400万の高分子量のアニオン性ポリアミノ酸である、請求項1に記載のトロンビン含有試薬。
- 前記アニオン性ポリアミノ酸が、少なくとも2つのアニオン性モノアミノ酸を含む、請求項1又は2のいずれか一項に記載のトロンビン含有試薬。
- 前記アニオン性ポリアミノ酸が、少なくとも1つ以上のアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のトロンビン含有試薬。
- 前記アニオン性ポリアミノ酸が、測定時の反応液中の最終濃度として0.01(W/V)%〜10(W/V)%で含有される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のトロンビン含有試薬。
- トロンビン含有試薬が、フィブリノゲン測定試薬、トロンビン時間測定試薬、アンチトロンビン測定試薬、直接トロンビン阻害剤濃度測定試薬の中から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載のトロンビン含有試薬。
- トロンビンを含有し、且つ、トロンビン活性を介する血中成分測定試薬を用いる測定方法において、トロンビン活性を介する測定反応系に高分子量のアニオン性ポリアミノ酸及び非イオン性界面活性剤を共存させることを特徴とする、前記測定方法。
- トロンビン含有試薬を用いる血中成分測定において、前記トロンビン含有試薬が高分子量のアニオン性ポリアミノ酸及び非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする、キャリーオーバーの抑制方法。
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