JP5840273B2 - 血液凝固時間延長剤 - Google Patents

Description

本発明は、フィブリノゲン測定試薬に代表される血液凝固能測定試薬、すなわち血液凝固活性化剤含有試薬及び／又は血液凝固能測定用検体希釈液に用いられる血液凝固時間延長剤、並びにこれを用いた血液凝固能測定試薬に関する。

血液凝固の機序は、一般的に２つの系に大別される。１つは、血液凝固第ＸＩＩ因子の異物との接触活性化に始まり、多段の反応を経て最終的にトロンビンを生成する内因系、もう１つは、血液凝固第ＶＩＩ因子と組織トロンボプラスチンによる血液凝固第Ｘ因子の活性化に始まり、同じくトロンビンを生成する外因系である（図１）。いずれの系も最終的には、生成したトロンビンの働きでフィブリノゲンがフィブリンに転化することにより凝固が起こる。こうした血液凝固機序について、異常の有無、又は異常の原因を明らかにするため、血液凝固活性化剤を用いたいくつかの血液凝固能検査が有り、臨床検査の現場で広く用いられている。

血液凝固活性化剤及びそれを使用した血液凝固能検査には次のようなものがある。
１）トロンビンを使用した血液凝固能検査
フィブリノゲン測定、ＡＴＩＩＩ測定、トロンビン時間測定
２）組織トロンボプラスチンを使用した血液凝固能検査
プロトロンビン時間測定、プロトロンビン時間を用いたＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ因子の活性測定、複合因子測定（トロンボテスト・ヘパプラスチンテスト等）
３）リン脂質を使用した血液凝固能検査
部分トロンボプラスチン時間測定、活性化部分トロンボプラスチン時間測定、活性化部分トロンボプラスチン時間測定を用いたＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲンの活性測定、蛇毒時間測定、蛇毒時間測定を用いたＸ因子の定量、希釈蛇毒時間測定を用いたループスアンチコアグラント（ＬＡ）測定、プロテインＣ活性測定、トロンボプラスチン生成試験
上記１）〜３）のいずれの検査においても、患者検体に血液凝固活性化剤等を含む試薬を混合することによる凝固の惹起から最終的にフィブリノゲンがフィブリンに転化し析出するまでの時間を測定する。

血液凝固能検査における凝固の検出方法は、力学的検出法と光学的検出法に大別できる。力学的検出法とは反応液中に投入した磁性物等を、磁力等によりモニターし、凝固によって粘性が高くなり磁性物の動きが鈍くなるのを検出する方法である。光学的検出法とは凝固によって反応液が白く濁るのを透過光あるいは散乱光の変化量として検出する方法であり、比較的簡便であることから最も広範に利用されている。これらは、現在では一般的に自動化装置により検出されている。散乱光検出法で得られる散乱光の強度変化曲線の一例を図２に示す。図中、Ａ点は血液凝固活性化剤を含む試薬を混合することにより凝固が惹起された点を示し、その後多段の反応を経てフィブリン析出が開始することにより、Ｂ点以降、散乱光強度の変化が現れる。次々にフィブリノゲンが消費され、反応液中でほぼ枯渇すると散乱光強度の変化は無くなり、Ｃ点のごとく曲線は平坦になり、凝固は終了する。このような散乱光の強度変化曲線を元に、公知の算出パラメータにより凝固時間が算出される（特許文献１）。ここで、散乱光の強度変化量の極大値をΔＨとすると、ΔＨが大きい方が、凝固検出が鋭敏となり、より正確な検出が可能となることは自明である。それ故使用される血液凝固能測定試薬は光学的変化量が大きく表示されるような特性を持つものが望ましい。しかし、Ａ点からＣ点までの変化があまりに短時間に起こる場合、精度良く凝固時間を測定することができない。そこで通常、凝固時間を延長させる物質を添加して、凝固時間が所望の長さになるよう調節する。血液凝固時間延長剤として、特許文献２では塩化ナトリウムを初めとするアルカリ金属又はアルカリ土類金属のハロゲン化物塩が、特許文献３ではプロピオン酸ナトリウムが例示されている。しかしこのような従来の血液凝固時間延長剤は、同時に添加量依存的にΔＨを減少させる負の効果が大きいことが問題となっていた。

これら従来法の問題点を解決する目的で、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、高分子多糖などの高分子物質を添加した試薬を用いる方法が提案されている（特許文献４及び５）。

特開平８−１５２６３号公報 特許２９９４５５７号公報 特許３３３０６８５号公報 特許３０７４６１１号公報 特開平５−６０７６３号公報

しかしながら、試薬に高分子物質を添加する方法は、試薬自体の粘性を高めてしまい、ピペットや試薬プローブによる試薬分取精度が低下するという問題、未凝固と凝固時の濁度差が十分に得られず、十分な光学的変化の増強が得られないという問題があった。
従って本発明の課題は、血液凝固時間を所望の時間に延長し、かつ光学的変化を増強させるような組成の試薬を提供することにある。このことによって、血液凝固能検査の正確性向上に寄与することができる。

そこで本発明者は、種々の化合物を用いて光学的変化を増強させる血液凝固時間延長剤を探索してきたところ、特定の構造を有するグアニジン化合物又はその塩が、血液凝固時間の延長作用に加えて、凝固時の光学的変化を増強させる作用を有し、これを血液凝固能測定試薬の添加剤として用いれば、血液凝固能が正確かつ高感度で測定できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次式（１）

（式中、Ｒ¹は水素原子、アミノ基又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表されるグアニジン化合物又はその酸付加塩を有効成分とする血液凝固時間延長剤を提供するものである。

また、本発明は、上記の血液凝固時間延長剤を含有することを特徴とする血液凝固活性化剤含有試薬又は血液凝固能測定用検体希釈液を提供するものである。

さらに、本発明は、上記の血液凝固時間延長剤を含有し、血液凝固活性化剤がトロンビンであることを特徴とするフィブリノゲン測定用血液凝固活性化剤含有試薬又はフィブリノゲン測定用検体希釈液を提供するものである。

また一態様において、本発明は、血液凝固時間を延長させるための、次式（１）

（式中、Ｒ¹は水素原子、アミノ基又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表されるグアニジン化合物又はその酸付加塩の使用を提供するものである。
一実施形態において、上記グアニジン化合物又はその酸付加塩は、血液凝固活性化剤とともに使用される。別の実施形態において、上記グアニジン化合物又はその酸付加塩は、血液凝固能測定用検体希釈液とともに使用される。

また一態様において、本発明は、血漿検体に、次式（１）

（式中、Ｒ¹は水素原子、アミノ基又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表されるグアニジン化合物又はその酸付加塩を添加することを含む、血液凝固時間を延長する方法を提供するものである。
一実施形態において、上記グアニジン化合物又はその酸付加塩は、血液凝固能測定用検体希釈液とともに添加される。別の実施形態において、上記グアニジン化合物又はその酸付加塩は、血液凝固活性化剤とともに添加される。

また一態様において、本発明は、血漿検体と、血液凝固活性化剤と、上記グアニジン化合物又はその酸付加塩とを含有する反応液を調製する工程；及び、反応液の凝固時間を測定する工程を含む、血液凝固能測定方法を提供するものである。
また一態様において、本発明は、当該血漿検体を用いた凝固時間の測定値と、当該血漿検体の代わりに希釈標準液を用いて同様に凝固時間を測定して得られた測定値とを比較することによる、血漿検体中のフィブリノゲン濃度を求める方法を提供するものである。

本発明の血液凝固時間延長剤を用いれば、光学的変化が増強されるため、フィブリノゲン測定、ＰＴ、ＡＰＴＴ等の血液凝固能が、正確に測定できる。

臨床検査における血液凝固の機序を模式的に示す。 血液凝固能測定の際、散乱光検出法で得られる散乱光強度変化曲線の一例を示す。 各化合物の添加量と凝固時間の関係を示す。 各化合物の添加によって凝固時間を調整したときの、凝固時間と散乱光強度変化量極大値の関係を示す。 従来法試薬と本発明試薬による散乱光強度変化曲線を示す。

本発明の血液凝固時間延長剤は、前記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分とするものである。式（１）中、Ｒ¹は、水素原子、アミノ基又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。ここで、アルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、特に炭素数２〜５のアルキル基が好ましい。当該アルキル基に置換し得る基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミノ基が挙げられ、カルボキシル基とアミノ基の両者、又はアルコキシカルボニル基とアミノ基の両者が置換している場合が好ましい。

式（１）で表される化合物の具体例としては、グアニジン、アミノグアニジン、アルギニン、アルギニンアルキルエステルが挙げられ、このうち、光学的変化増強作用が大きく、正確な測定ができる点でアミノグアニジンが特に好ましい。また式（１）の化合物の酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩等が挙げられる。

本発明の血液凝固時間延長剤は、血液凝固時間を延長させるだけでなく、血液凝固能測定における反応液の濁度変化を増強させる作用を有する。このことは、血液凝固の最終産物であるフィブリン網の形成状態がより強固となることを示している。従って、本発明の血液凝固時間延長剤は、濁度変化を直接検出する光学的検出法、フィブリン網の形成状態を磁性物等でモニターする力学的検出法等に使用でき、光学的検出法に使用するのが好ましい。ここで、光学的検出法には散乱光量検出法と透過光量検出法があるが、散乱光量検出法に使用するのが好ましい。

本発明の血液凝固時間延長剤を適用することができる血液凝固能検査は、患者検体に血液凝固活性化剤等を含む試薬を混合することによる凝固の惹起から最終的にフィブリノゲンがフィブリンに転化し析出するまでの時間を測定するものであればよい。例としては、フィブリノゲン測定、ＡＴＩＩＩ測定、トロンビン時間測定、プロトロンビン時間測定、プロトロンビン時間を用いたＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ因子の活性測定、複合因子測定（トロンボテスト・ヘパプラスチンテスト等）、部分トロンボプラスチン時間測定、活性化部分トロンボプラスチン時間測定、活性化部分トロンボプラスチン時間測定を用いたＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲンの活性測定、蛇毒時間測定、蛇毒時間測定を用いたＸ因子の定量、希釈蛇毒時間測定を用いたループスアンチコアグラント（ＬＡ）測定、プロテインＣ活性測定、トロンボプラスチン生成試験、その他凝固異常検出等が挙げられる。

上記血液凝固能検査の測定は、検体に、血液凝固活性化剤含有試薬（例えば、フィブリノゲン測定においてはトロンビン含有試薬）を添加し、フィブリンが析出するまでの時間を測定するものである。検体は、必要に応じて検体希釈液で適宜希釈される。本発明の血液凝固時間延長剤は、測定系に含まれていればよく、血液凝固活性化剤含有試薬に含有させてもよいし、検体希釈液に含有させてもよい。すなわち、本発明の血液凝固時間延長剤は、例えばフィブリノゲン測定においては、トロンビン含有試薬に含有させてもよいし、検体希釈液に含有させてもよい。
上記血液凝固活性化剤含有試薬は、上記血液凝固能検査に使用されるものであればよい。例えば、トロンビン含有試薬、組織トロンボプラスチン含有試薬、リン脂質含有試薬等が挙げられる。また、上記検体希釈液は、上記血液凝固能検査に使用されるものであればよい。例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳなどのグッド緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、バルビタール緩衝液、生理食塩液、水等を挙げることができる。

本発明の血液凝固時間延長剤は、血液凝固検査において精度良く測定可能な凝固時間が得られるように反応液中に含有させることが好ましい。例えば、フィブリノゲン測定の場合、正常血漿（濃度約３００ｍｇ／ｄＬ）を測定したとき、５〜５０秒、好ましくは７〜２０秒、さらに好ましくは９〜１５秒の凝固時間が得られるように反応液中に含有させることが好ましい。血液凝固時間延長剤としてアミノグアニジンを用いる場合は、フィブリノゲン測定の反応液中の濃度、すなわち検体・検体希釈液・トロンビン含有試薬の混合液中の濃度は、１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは３０〜１２０ｍＭである。検体希釈液中に含有させる場合検体希釈液中の濃度は、１０〜９００ｍＭ、好ましくは３０〜４００ｍＭ、さらに好ましくは、５０〜２００ｍＭである。
プロトロンビン時間測定の場合、正常血漿（活性約１００％）を測定したとき、９〜６０秒、好ましくは９〜３０秒、さらに好ましくは１０〜１６秒の凝固時間が得られるように反応液中に含有させることが好ましい。活性化部分トロンボプラスチン時間測定においては正常血漿を測定したとき、１５〜８０秒、好ましくは１５〜６０秒、さらに好ましくは２０〜５０秒の凝固時間が得られるように反応液中に含有させることが好ましい。その他の血液凝固能検査に関しても、測定方法に適した凝固時間が得られるように反応液中に含有させればよい。

血液凝固能検査に用いる検体希釈液及び血液凝固活性化剤含有試薬を含む血液凝固能測定試薬には、本発明の血液凝固時間延長剤以外に、公知の高分子多糖類、及び合成高分子類を含有することができる。

高分子多糖類の具体例としては、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストラン２０００００、デキストラン５０００００等のデキストラン、フィコール等を例示することができる。また、これら高分子多糖類は１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。これら高分子多糖類の添加量は、前記血液凝固能測定試薬中の濃度が０．０１〜１０Ｗ／Ｖ％であることが好適で、より好ましくは０．１〜５Ｗ／Ｖ％である。
合成高分子類の具体例としては、ポリビニルアルコール５００、ポリビニルアルコール１５００、ポリビニルアルコール２０００等のポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール８０００、ポリエチレングリコール２００００等のポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドン等を挙げることができる。これら合成高分子類は１種もしくは２種以上を組み合わせて用いることができる。これら合成高分子類の添加量は、特に限定されないが、前記血液凝固能測定試薬中の濃度が０．０１〜１０Ｗ／Ｖ％であることが好適で、より好ましくは０．１〜５Ｗ／Ｖ％である。

前記血液凝固能測定試薬には、本発明の血液凝固時間延長剤以外にも緩衝剤、カルシウムイオン、抗凝固薬のアンタゴニスト等を含有することもできる。

緩衝剤の具体例としては、ｐＨ４〜９の範囲に緩衝能をもつ緩衝剤を適宜選択して用いる。例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳなどのグッド緩衝剤、クエン酸、リン酸、酢酸、イミダゾール、バルビタール、ＧＴＡ等から１種もしくは２種以上を組み合わせて選択し用いることができる。これら緩衝剤の添加量は、緩衝能を有する量であれば特に限定されないが、前記血液凝固能測定試薬中の濃度が１〜１０００ｍＭであることが好適で、より好ましくは５〜５００ｍＭである。

カルシウムイオンとしては、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルクロン酸カルシウム、酒石酸カルシウム等の水溶性のカルシウム化合物が用いられる。これらカルシウム化合物は１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。カルシウム化合物の使用量は、凝固反応を補助できる量であれば良く、特に限定されないが、前記血液凝固能測定試薬中の濃度が５ｍＭ〜１００ｍＭであることが好適で、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。

抗凝固剤のアンタゴニストとしては、プロタミン、ポリブレン（Polybrene）（ヘキサジメトリンブロマイド）等が用いられる。これら抗凝固剤のアンタゴニストは１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。抗凝固剤のアンタゴニストの使用量は、検体血漿に含まれる抗凝固剤、例えばヘパリン等を十分に中和できる量であれば良く、特に限定されないが、前記血液凝固能測定試薬中の濃度が１０^-5〜１０^-2Ｗ／Ｖ％であることが好適で、より好ましくは５×１０^-4〜５×１０^-3Ｗ／Ｖ％である。

また、前記血液凝固能測定試薬は液状品、凍結品又は乾燥品であってもよく、さらに乾燥品は精製水又は緩衝液を添加することにより溶解される。
また前記血液凝固能測定試薬には適当な防腐剤を添加してもよい。防腐剤としては、シプロフロキサシン、プロピオン酸、安息香酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、プロクリン３００等の中から１種もしくは２種以上を組み合わせて選択し用いることができる。また、必要に応じて塩化ナトリウム等の塩や、アミノ酸、糖等の一般的な安定化剤等を含ませてもよい。
上記に記載の濃度は、溶液品中の濃度を記載しているが、乾燥品等は使用時に水又は緩衝液等で溶解したときの濃度を記載している。

本発明の血液凝固能測定試薬を用いて血液凝固能を測定するには、常法に従えばよい。フィブリノゲン測定を例にとれば、標準液を検体希釈液で５倍、１０倍、２０倍に希釈する（希釈倍率は適宜調整することが可能である）。次に各希釈標準液２容を３７℃で３分間加温し、予め３７℃に加温したトロンビン試薬１容を加え、凝固時間を測定する。次に各々の希釈標準液の測定値をグラフにプロットする。血漿検体を検体希釈液で１０倍希釈し（希釈倍率は適宜調整することが可能である）、希釈検体を同様に測定し、得られた凝固時間をもとに、グラフから濃度を求めることができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
（１）凝固時間延長作用の確認
トロンビン時間法で血漿検体中のフィブリノゲン濃度を測定する場合、一般的にトロンビンを血漿に添加して凝固時間を測定し、フィブリノゲン濃度既知の標準液による検量線から濃度を求める。手順としては、検体血漿１０μＬに対して９０μＬの検体希釈液を添加・混合した後、血液凝固活性化剤含有試薬として５０μＬのトロンビン含有試薬を添加し、凝固時間を測定する。

本実施例では、血漿検体として市販正常血漿（コアグトロールＮ、Ｓｙｓｍｅｘ社製）を、トロンビン含有試薬としてコアグピアＦｂｇトロンビン試薬（積水メディカル社製）を、また凝固時間測定装置として全自動血液凝固時間分析装置 コアグレックス８００（Ｓｙｓｍｅｘ社製）を使用した。本機器は、散乱光検出法を採用しており、凝固時間とともに、散乱光強度の経時変化データをも取得することができる。

検体希釈液として、ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７．５)を用いた場合、市販正常血漿は数秒で凝固した（４．６秒）。血液凝固時間延長剤として、アミノグアニジン塩酸塩をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加すると、従来法である塩化ナトリウム及び臭化ナトリウムと同様に、添加濃度依存的に凝固時間が延長した（図３に結果を示す）。すなわち、本発明は従来法と同等の凝固時間延長作用を有することが分かる。

（２）光強度変化量の確認
散乱光強度変化量の極大値をΔＨとして算出し、凝固時間との関係を図４に示した。凝固時間が延長するのに伴い、従来法である塩化ナトリウム及び臭化ナトリウムではΔＨが著しく低下するのに対し、本発明ではΔＨは大きいまま維持された。すなわち、同程度の凝固時間で比較すると、従来法に比べ本発明のほうが散乱光強度の変化量が増大し、凝固時間をより正確に測定できることが分かる。

実施例２
同程度の凝固時間が得られるように、血液凝固時間延長剤の添加濃度を調節した検体希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ７．５）を用いて、実施例１と同様に正常市販血漿を測定した。従来法と本発明の散乱光強度変化量極大値のΔＨと、測定の同時再現性の比較結果を、表１に示した。従来法と比較して、本発明の血液凝固時間延長剤、すなわちアルギニン塩酸塩、アルギニンメチルエステル、グアニジン塩酸塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩、アミノグアニジン塩酸塩がΔＨを飛躍的に向上させ、さらに測定の精度（同時再現性等）についても向上させていることがわかる。また、測定の精度（同時再現性等）向上効果については、アミノグアニジン塩酸塩が特に優れていることが判明した。

実施例３
血液凝固時間延長剤として塩化ナトリウムを含む検体希釈液を従来法Ａ、従来法Ａに、更に光強度変化量増強剤としてポリエチレングリコール（分子量２００００）（以下、ＰＥＧ２００００という）を含有させた検体希釈液を従来法Ｂとし、血液凝固時間延長剤と光強度変化量増強剤を兼ねたアミノグアニジン塩酸塩（本発明）を採用した検体希釈液と比較した。なお、いずれの場合も緩衝液としてはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた。また、従来法Ｂでは、ＰＥＧ２００００の添加量が多いと粘性が高まり、分取精度が低下するおそれがあることから、添加濃度は０．１％とした。それぞれの検体希釈液を使用して、実施例１と同様に市販正常血漿の凝固時間を測定した結果、図５に示すような散乱光の強度変化曲線を得た。また、凝固時間とΔＨを表２に示した。ＰＥＧ２００００を添加した従来法Ｂでは、添加しなかった従来法Ａに比べ、散乱光強度の変化量が大きくなったが、本発明の採用により散乱光強度変化量はさらに飛躍的に向上し、凝固時間をより正確に測定できることが分かる。

Claims (6)

1. 下記工程を含む血液凝固能測定方法：
   血漿検体と、血液凝固活性化剤と、アミノグアニジン又はその酸付加塩とを含有する反応液を調製する工程；及び
   反応液の濁度変化を検出することにより血液凝固時間を測定する工程。
2. 前記濁度変化が散乱光量検出法により検出される、請求項１記載の方法。
3. 前記アミノグアニジン又はその酸付加塩が血液凝固能測定用検体希釈液とともに前記反応液に添加される、請求項１又は２記載の方法。
4. 前記検体希釈液がフィブリノゲン測定用検体希釈液である請求項３記載の方法。
5. 血液凝固活性化剤がトロンビンである請求項４記載の方法。
6. 血液凝固能測定がフィブリノゲン測定法による血液凝固能測定である、請求項４又は５記載の方法。