CN102276853B

CN102276853B - 一种具备毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶及其制备方法

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Publication number: CN102276853B
Application number: CN2011101154111A
Authority: CN
Inventors: 赵兴春; 叶健; 姜伯玮
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2011-05-05
Filing date: 2011-05-05
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-05-05
Also published as: CN102276853A

Abstract

本发明公开了一种具有毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶的制备方法。本发明提供的制备方法是在溶胶缓冲液中，将自涂敷聚合物和聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物混合，得到所述共混共聚物凝胶。采用该方法制备的共混共聚物凝胶能够在毛细管电泳过程中具有良好的分离能力和具有毛细管内壁自涂敷能力，能够有效减少毛细管内壁对DNA分子的吸附，增加毛细管的使用寿命。

Description

一种具备毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具备毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶及其制备方法。

背景技术

毛细管电泳是一种快速高效分离手段。带电物质在电场的作用下，从毛细管的一端移动到另一端。

毛细管凝胶电泳是分离大分子物质最有效方法之一，如生物大分子RNA和DNA，多肽，蛋白质等。毛细管凝胶电泳通常使用石英毛细管，内径范围在50微米至200微米，长度从10cm到100cm。为保护被分析物不被吸附，同时消除毛细管的电渗流，毛细管内壁通常涂有一保护层。最常用的涂层是聚丙烯酰胺涂层。毛细管凝胶电泳分离介质性质决定大分子物质的分离度。例如，聚丙烯酰胺凝胶对DNA片段的分离效果较好。

高分子量聚丙烯酰胺是目前所有聚合物中DNA分离度最好的介质。可以分离DNA片段达1200碱基数。但聚丙烯酰胺不具有自涂敷能力。必须在毛细管内壁上加涂层，消除毛细管内壁对DNA的吸附和电渗流，才能有效的分离DNA片段。利用聚丙烯酰胺作为筛分介质的主要优点是：重复性好，分离能力强，化学性质稳定。但是聚丙烯酰胺也有很多不足之处。例如它没有自涂敷能力，使用的毛细管必须有涂层保护。另外，由高分子量聚丙烯酰胺制备的凝胶粘度较高，需要高压才能将凝胶灌入毛细管中。

聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)也有很强的分离DNA片段的能力，并且使用聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)时毛细管内壁不需要涂涂层保护。聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)对DNA片段的分离效果略低于聚丙烯酰胺。但是聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)凝胶具有很强的自涂敷能力，可消除DNA的吸附和降低电渗流。聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)凝胶的粘度远远低于聚丙烯酰胺凝胶。

若把这两种聚合物有机地结合起来，就可得到理想的DNA分离介质。但由于聚丙烯酰胺和聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)两者的极性不同，这两种聚合物通过简单的机械混合很难得到均匀混合体，而会呈现出微观两相不互溶现象。Barbier V等，Electrophoresis 2002，23：1441-1449，公开了有机地把这两种性质不同的聚合物结合到一起。以聚丙烯酰胺为主链，以聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)为支链合成梳形聚合物。这种梳形聚合物能够有效地抑制电渗流，不需要在毛细管内壁加任何涂层，就能有效的分离DNA片段。但是此合成方法比较复杂。

理想的筛分介质需要很强的亲水性、适度的粘度，还要具有自涂敷功能。目前合成的均聚物无法同时满足上述条件。无规共聚物是把两种或者两种以上的聚合物有机结合到一起的常用办法。共聚物同时具备了两种聚合物的特征。因此，把具有筛分能力的聚合物和自涂敷功能的聚合物合成为共聚物，就可成为满足以上条件的一种新型的毛细管电泳分离筛分介质，尤其是用于DNA片段的分离。当采用丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺共聚形成共聚物时，就同时对DNA具有良好的分离能力和具有毛细管内壁自涂敷能力。但是无规共聚是随机的，不能保证两种聚合物均匀分布，不同批次合成的无规共聚物的涂层能力可能也不相同，因而产品的质量难以保证。而一些科研团体或商业机构采用共混制备方法进行凝胶的制备，即将两种单体的聚合物按照一定比例直接混合形成具备两种聚合物特质的新凝胶特别是当两者比例大小不同时，无规共聚物对DNA片段分离效果也不尽相同。实验研究发现，当丙烯酰胺的含量较高时，共聚物对DNA的分离效果较好。但当该共聚物中的N，N-二甲基丙烯酰胺含量减少到一定程度，N，N-二甲基丙烯酰胺的比例太低，无规共聚物的自涂敷功能会受到影响，分离效果也随之降低。无规共聚物分子量的大小和浓度也直接影响到DNA片段的分离。一般来说，胶的浓度升高，有利于小片段DNA的分离。胶的分子量的增加，有利于大片段DNA的分离。

但是无规共聚是随机的，不能保证两种聚合物均匀分布，不同批次合成的无规共聚物的涂层能力可能也不相同，因而产品的质量难以保证。我们在丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺无规共聚物中加入少量的聚N，N-二甲基丙烯酰胺就得到了共混共聚物，这种共混共聚物能制备均匀稳定的胶，具有很好的涂层效果。

发明内容

本发明的目的在于提供具有毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶的制备方法。

本发明提供的制备方法是在溶胶缓冲液中，将自涂敷聚合物和聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物混合，得到所述共混共聚物凝胶。

上述自涂敷聚合物和所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物的质量配比是(0.8-1.2)∶(8-12)，优选配比是1∶10。

进一步讲，所述溶胶缓冲液、所述自涂敷聚合物和所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物的配比是(400-600)ml∶(0.8-1.2)g∶(8-12)g，优选配比是500ml∶1g∶10g。

上述自涂敷聚合物可以是聚N，N-二甲基丙烯酰胺。

上述聚N，N-二甲基丙烯酰胺的粘均分子量可以为10-100万，优选为30万。

上述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物为聚N，N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物。

上述聚N，N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物是由N，N-二甲基丙烯酰胺单体和丙烯酰胺单体在引发剂存在下反应得到的聚合物；所述N，N-二甲基丙烯酰胺单体和丙烯酰胺单体的质量配比为(0.8-1.2)∶(8-12)，优选配比是1∶10。

上述引发剂为过硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基二乙胺的混合物；所述N，N-二甲基丙烯酰胺单体、丙烯酰胺单体、硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的配比是1g∶10g∶10mg∶10μl。

上述反应是在无氧条件下进行的；所述反应的温度是20-30℃，优选为25℃，所述反应的时间为20-30小时，优选为24小时；所述聚N，N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物的粘均分子量为140万。

上述溶胶缓冲液是由电泳缓冲液、变性剂和水组成；每10ml溶胶缓冲液优选由1ml电泳缓冲液、3.8g变性剂和5ml水混匀制备得到；所述变性剂是尿素、甲酰胺和/或SDS；所述电泳缓冲液是美国Amresco公司的A.C.E Buffer。

上述的方法制备的共混共聚物凝胶也属于本发明的保护范围。

图1和2显示：内标峰型尖锐，分离度好，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象。采用该方法制备的共混共聚物凝胶能够在毛细管电泳过程中具有良好的分离能力和具有毛细管内壁自涂敷能力，能够有效减少毛细管内壁对DNA分子的吸附，增加毛细管的使用寿命。该共混共聚物凝胶制备方法简单，快速、经济，所制备的共混共聚物凝胶能够在DNA片段毛细管电泳过程有效避免电渗现象，且具备较好的筛分性质，完全能够实现法医DNA检验领域STR荧光片段分析的目的。

附图说明

图1为实施例3制备得到的凝胶进行Typer^TM500分子量内标的检测的峰图。

图2为Typer^TM15等位基因Ladder的检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、自涂敷聚合物(聚N，N-二甲基丙烯酰胺)的制备

在250mL圆底烧瓶中加入5g N，N-二甲基丙烯酰胺单体、13mL甲醇、37mL去离子水、5mg过硫酸铵(APS)和搅拌子，通氦气1个小时除去体系中的氧气。然后通过注射器加入5μL的N，N，N’，N’-四甲基二乙胺(TEMED)，在室温下反应18小时。反应结束后，加入20mL水，然后用冰丙酮沉淀聚合物，再用水溶解聚合物，透析一星期(用截留分子量为7000的透析膜)，然后冷冻干燥得到白色固体。用乌氏粘度计测量聚合物的粘均分子量为30万。

实施例2、聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物(聚N，N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物)的制备

在250mL圆底烧瓶中加入1g N，N-二甲基丙烯酰胺单体、10g丙烯酰胺单体，80mL去离子水、10mg过硫酸铵(APS)和搅拌子，通氦气1个小时除去体系中的氧气。然后通过注射器加入10μL的N，N，N’，N’-四甲基二乙胺(TEMED)，在室温(25℃)下反应24小时。反应结束后，然后用丙酮沉淀聚合物，再用水溶解聚合物，透析一星期(用截留分子量为7000的透析膜)，然后冷冻干燥得到白色固体。用乌氏粘度计测量聚合物的粘均分子量为140万(测试条件按照聚丙烯酰胺的方法测试，参照国标GB 12005.1 聚丙烯酰胺特性粘数的测定方法)。

实施例3、共混共聚物凝胶的制备

一、溶胶缓冲液获得

1.量取5ml无菌水在一个干净的20ml玻璃瓶。

2.称量3.8g尿素(超纯级)。将尿素加入到一个含有水的瓶子中。盖盖子，手动温和摇匀直到所有的尿素溶解。

3.加入1ml 10倍Running Buffer(购于美国Amresco公司的A.C.E Buffer货号K761)，温和震荡，得到10ml溶胶缓冲液。

二、共混共聚物凝胶(溶胶缓冲液∶聚N，N-二甲基丙烯酰胺∶聚N，N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物＝500ml∶1g∶10g)

4.称量0.02g实施例1的聚N，N-二甲基丙烯酰胺并加入瓶中，

5.再称量0.2g聚N，N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物，并加入瓶中，

6.温和震荡瓶子，并混合所有成分，然后1000rpm离心15min，所有的内容物将在瓶底。

7.使用磁力搅拌器(Corning公司)以低速60rpm过夜搅拌。

8.过夜摇匀后，带有泡沫的溶液透过5μm的尼龙滤器(CameoNS，Osmonics)，过滤使用氮气压力。收集滤过物入一干净的瓶中。

9.过滤后的溶液离心去除气体，1000rpm/60min，得到2.2％的共混共聚物凝胶。含量计算方法为：(0.2+0.02)g/10ml＝2.2％。

10.4℃储存，防止尿素的降解。

实施例4

Typer^TM500分子量内标的检测

1.采用实施例3中制备的凝胶；

2.在AB 3130型遗传分析仪上进行DNA片段分离的的电泳条件

电泳电压是15kV；

进样时间是10s

毛细管长度是36cm；

电泳温度是60℃。

3、换新配的Running buffer(购于美国Amresco公司的A.C.E Buffer货号K761，稀释至10倍)和Typer^TM15分子量内标(Typer^TM500(购自公安部物证鉴定中心)1μL内标+20μL去离子甲酰胺)。

4、将本发明制备的凝胶装入胶瓶中，并将注胶管置于胶瓶中，固定好。

5、启动自动换胶系统。

6、按照操作说明进行毛细管电泳检测

其电泳结果如图1所示，Typer^TM500内标峰型尖锐，分离度好，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象。

实施例5

Typer^TM15等位基因Ladder的检测

1.采用实施例3中制备的凝胶；

2.在AB 3130型遗传分析仪上进行DNA片段分离的的电泳条件

电泳电压是15kV；

进样时间是10s

毛细管长度是36cm；

电泳温度是60℃。

3、换新配的Running buffer(购于美国Amresco公司的A.C.E Buffer货号K761，稀释至10倍)和Typer^TM15(购自公安部物证鉴定中心)分子量内标(1μL内标+20μL去离子甲酰胺)。

5、启动自动换胶系统。

6、按照操作说明进行毛细管电泳检测

其电泳结果如图2所示，Ladder峰型尖锐，分离度好，能够分离长度仅相差1bp的DNA片段，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象，无丢峰现象。

Claims

1.具有毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶的制备方法，是在溶胶缓冲液中，将自涂敷聚合物和聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物混合，得到所述共混共聚物凝胶；所述自涂敷聚合物和所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物的质量配比是（0.8-1.2）：（8-12），；所述自涂敷聚合物是聚N,N-二甲基丙烯酰胺；所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物为聚N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溶胶缓冲液、所述自涂敷聚合物和所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物的配比是（400-600） mL：（0.8-1.2）g：（8-12）g。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述自涂敷聚合物和所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物的质量配比是1：10；所述溶胶缓冲液、所述自涂敷聚合物和所述聚合了自涂敷聚合物单体的筛分聚合物的配比是 500mL：1g：10g。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述聚N,N-二甲基丙烯酰胺的粘均分子量为10-100万。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述聚N,N-二甲基丙烯酰胺的粘均分子量为30万。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述聚N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物是由N,N-二甲基丙烯酰胺单体和丙烯酰胺单体在引发剂存在下反应得到的聚合物；所述N,N-二甲基丙烯酰胺单体和丙烯酰胺单体的质量配比为（0.8-1.2）：（8-12）。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述N,N-二甲基丙烯酰胺单体和丙烯酰胺单体的质量配比为1：10。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述引发剂为过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基二乙胺的混合物；所述N,N-二甲基丙烯酰胺单体、丙烯酰胺单体、过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的配比是1g：10g：10mg：10μ L。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反应是在无氧条件下进行的；所述反应的温度是20-30℃，所述反应的时间为20-30小时；所述聚N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺无规共聚物的粘均分子量为140万。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述反应的温度是25℃，所述反应的时间为24小时。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述溶胶缓冲液是由电泳缓冲液、变性剂和水组成；所述变性剂是尿素、甲酰胺和/或SDS；所述电泳缓冲液是美国Amresco公司的A.C.E Buffer。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：每 10mL溶胶缓冲液由1mL电泳缓冲液、3.8g变性剂和5mL水混匀制备得到。

13.权利要求1-12中任一所述的方法制备的共混共聚物凝胶。