CN105367693B - 一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及毛细管电泳技术领域，具体涉及一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质及其制备方法。本发明提供的一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括聚合物单体为丙烯酰胺，溶剂为去离子水，链转移剂是异丙醇，引发剂是过硫酸铵，催化剂是N,N,N,N‑四甲基二乙胺混合物。本发明提供用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合经透析步骤、冷冻干燥之后在溶胶缓冲液中进行溶胀，筛分介质是聚丙烯酰胺。本发明制备的筛分介质具有良好的筛分性能、溶解能力和高亲水性，有效减少DNA与毛细管管壁之间的吸附作用，具有高分子量、低粘度，便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化，能满足法医STR分析检测的要求。
Description
技术领域
本发明涉及毛细管电泳的筛分介质技术领域，具体涉及一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质及其制备方法。
背景技术
现有技术中，毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径的毛细管柱内加高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦，Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年出现了第一批商品化的毛细管电泳仪。短短几年内，由于毛细管电泳(CE)符合以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶、抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，从而得到了迅速的发展。
毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品在电场下移动速率不同而达到分离目的的液相微分离分析技术，具有分离效率高、分析时间短、样品消耗少等优点。毛细管电泳通常使用石英毛细管，内径范围在50μm至100μm，长度从25cm到75cm。在DNA分离过程中，分离介质起着非常重要的作用，它决定了DNA的迁移特性、分离度、读出长度、重现性、注入时间、注入压力以及毛细管寿命等，因此分离介质的研究是DNA分离与测序工作中最重要的组成部分之一。分离介质可分为凝胶筛分介质和无胶筛分介质(非交联的高分子溶液)两种。1989年首次报道了以水溶性高分子溶液为介质的毛细管电泳成功地分离了dsDNA，自此高分子溶液取代凝胶而作为DNA分离介质得到广泛研究。
理想的DNA分离介质应具备：良好的筛分性能；自涂覆能力，以抑制电渗流以及消除DNA与毛细管管壁之间的吸附作用；良好的溶解能力和高亲水性；高分子量、低粘度，以便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化；在碱性条件下具有良好的化学稳定性。现已形成以聚丙烯酰胺(LPA)和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)为主，其他多种高分子聚合物为辅的无胶筛分体系。
STR分型及ssDNA测序分析使用的溶液通常以一定浓度的线性均聚物作为溶质。亲水性聚合物以非共价方式吸附到毛细管内壁，抑制电渗流并能避免DNA与内壁的相互作用。LPA具有高亲水性和优良的DNA分离能力。但是它还有高粘度、在高PH值条件下易于水解等缺点。我们在聚合丙烯酰胺时严格控制聚合反应温度、时间等影响因素，通过控制分子量从而提高LPA的缠结热稳定性，发挥其高亲水性及良好的筛分能力。
中国专利CN102220599B公开了一种聚合物链的准互穿聚合物网络，所述聚合物链包括:
(a)长链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在800kDa～1200kDa的范围；(b)短链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在20kDa～60kDa的范围；和(c)丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链，所述无规共聚物在所述长链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链(a)和所述短链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链(b)的存在下通过将丙烯酰胺单体和N，N二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合制备，所述无规共聚物的分子量大小在1MDa～10MDa的范围，其中在所述丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无视共聚物链中，所述单体丙烯酰胺和所述单体N，N一二甲基丙烯酰胺的重量比为90：10～99.9：O.1；其中，所述长链、短链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)和所述丙烯酰胺和N，N一二甲基丙烯酰胺的无视共聚物链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准互穿聚合物网络，并且其中，所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联，和其中所述无视共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)与所述长链聚(N，N二甲基丙烯酰胺)和所述短链聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)两者之和的重量比是50：50～99：10。但是，该专利还存在分辨率低、稳定性差的问题。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供制备的筛分介质可用于STR分型、ssDNA测序的毛细管电泳分离，本发明提供一种制备具有高分辨率、高稳定性、低粘度的毛细管电泳无胶筛分介质及其制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂，所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为20-30g：180-270ml：5.24-7.86ml：1.0-2.0ml：1.0-2.0ml，得到无胶筛分介质。
进一步地，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml。
进一步地，所述无胶筛分介质是聚丙烯酰胺。
本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)：将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺混合物；
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml；在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；
步骤2)：对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液中进行溶胀步骤；
步骤3)：再经抽滤步骤获得所述筛分介质，所述抽滤步骤是将溶胀后的溶液经0.2μm的尼龙滤器过滤，所述筛分介质是聚丙烯酰胺。
进一步地，步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中通入高纯氮气条件，反应时间为10-60分钟，聚合反应温度为35℃。
进一步地，所述反应时间为90分钟。
进一步地，所述溶胶缓冲液为浓度配比是：0.5M：0.5M：0.02M：7M的三羟甲基氨基甲烷、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、乙二胺四乙酸钙离络合剂和尿素溶液。
进一步地，步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透析袋进行透析。
进一步地，所述聚丙烯酰胺重均分子量范围为10-100KDa。
进一步地，所述聚丙烯酰胺重均分子量为20-40KDa。
与现有技术相比，优越效果在于：本发明制备的筛分介质具有良好的筛分性能，具有良好的溶解能力和高亲水性，能够有效的减少DNA与毛细管管壁之间的吸附作用，高分子量、低粘度，便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化，完全满足现阶段法医STR分析检测的目的要求。
附图说明
图1为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的1H-NMR谱图，其中溶剂为D2O；
图2为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的LIZ500电泳结果图谱；
图3为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的Ladder电泳结果图谱；
图4为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的9947A电泳结果图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
具体说明本发明提供的一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂，所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵(APS)，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)的配比为(20-30)g：(180-270)ml：(5.24-7.86)ml：(1.0-2.0)ml：(1.0-2.0)ml，得到无胶筛分介质，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)的配比为25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml，优选。所述无胶筛分介质是聚丙烯酰胺(LPA)，结构式如下：
本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1)：将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵(APS)，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)；
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)的配比为(20-30)g：(180-270)ml：(5.24-7.86)ml：(1.0-2.0)ml：(1.0-2.0)ml；在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；
步骤2)：对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液中进行溶胀步骤；
步骤3)：经抽滤后获得所述筛分介质，所述抽滤是将溶胀后的溶液经0.2μm的尼龙滤器过滤，所述筛分介质是聚丙烯酰胺(LPA)。步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中通入高纯氮气条件，反应时间为10-60分钟，聚合反应温度为35℃，本实施例的所述反应时间为90分钟。所述溶胶缓冲液为浓度配比是：0.5M：0.5M：0.02M：7M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、乙二胺四乙酸钙离络合剂(EDTA)和尿素溶液，其中步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透析袋进行透析。本发明中，所述聚丙烯酰胺重均分子量(Mw)范围为10-100KDa，优选所述聚丙烯酰胺重均分子量(Mw)为20-40KDa。
实施例2
本实施例中，所用试剂主要来自Sigma-Aldrich公司(USA)。具体操作是按照在如下步骤制备：在圆底烧瓶中加入222ml去离子水与6.55ml异丙醇(分析纯)在35℃下通入高纯氮气(99.99％)对溶液除氧10分钟。然后依次加入25g丙烯酰胺(AM)、1.25ml 10％(v/v)的N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)和1.25ml 10％(w/v)的过硫酸铵(APS)，500rpm下进行磁力搅拌，反应90min后，溶液呈蜂蜜粘稠状。选用截留分子量为12-14KDa的透析袋(Spectra/por#2，Spectrum公司，USA)透析三天。透析后聚合物溶液经-60℃冷冻干燥72小时，得到白色固体即为筛分介质，反应得率约为80％。
实施例3筛分介质的表征
11H-NMR光谱仪：用D2O作溶剂，对聚合物(白色固体)进行表征，如图1所示。从图1中可以看出聚合物(聚丙烯酰胺)的结构正确，并且纯度高，不含有单体和溶剂等杂质。
2凝胶渗透色谱仪(GPC)：聚合物经Waters BreezeTM 2HPLC系统测试分析，柱子是Waters Ultrahydrogel Linear Column，泵是Waters 1515，PDA检测器，流动相是水，测试结果见表1。
表1凝胶渗透色谱仪(GPC)测试结果
实施例4凝胶的配制
1溶胶缓冲液的配制：
1)10X电泳缓冲液称取6.05g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、12.16g N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、0.74g EDTA加入到含80ml去离子水的100ml容量瓶中混匀，加入去离子水定容至100ml；
2)1X电泳缓冲液称量19g尿素(分析纯)。加入到一个干净的100ml容量瓶中，加入25ml去离子水，手动温和摇匀直到所有尿素溶解。加入5ml 10X电泳缓冲液，温和振荡，加入去离子水定容至50ml。
2凝胶的配制：
称取白色固体状的聚丙烯酰胺2g，加入50ml 1X电泳缓冲液，过夜进行溶胀。使用0.2μm的滤器过滤，收集过滤物放入一个干净的容量瓶中，摄氏温度4℃保存，防止尿素降解。
实施例5电泳检测
LIZ 500分子量内标的检测：
1、采用配制的凝胶；
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测；
电泳条件：毛细管长度是16X36cm，电泳电压是15KV，电泳温度是60℃；
3、换新配置的1X Running Buffer(310and 31xx Running Buffer,AppliedBiosystems，USA)；
4、启动自动换胶系统；
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图2所示，电泳结果经GeneMapper ID-X(Applied Biosystems，USA)分析，可见LIZ 500内标峰型尖锐，分离度好，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象。
等位基因Ladder的检测：
1、采用配制的凝胶；
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测；
电泳条件：毛细管长度是16X36cm，电泳电压是15KV，电泳温度是60℃；
3、换新配置的1X Running Buffer(310and 31xx Running Buffer,AppliedBiosystems，USA)；
4、启动自动换胶系统；
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图3所示，电泳结果经GeneMapper ID-X(Applied Biosystems，USA)分析，可见等位基因Ladder峰型尖锐，分离度好，能够分离长度相差1bp的DNA片段，无杂峰、无拖尾现象，无丢峰现象。
进行9947A的检测：
1、采用配制的凝胶；
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测；
电泳条件：毛细管长度是16X36cm，电泳电压是15KV，电泳温度是60℃；
3、换新配置的1X Running Buffer(310and 31xx Running Buffer,AppliedBiosystems，USA)；
4、启动自动换胶系统；
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图4所示，电泳结果经(GeneMapper ID-X(Applied Biosystems，USA)分析，可见9947A分型正确，峰型尖锐，分离度好，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象，无丢峰现象。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，特征在于，所述无胶筛分介质为由聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂制得的聚丙烯酰胺聚合物，所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺配比为20-30g：180-270ml：5.24-7.86ml：1.0-2.0ml：1.0-2.0ml，得到无胶筛分介质。
2.根据权利要求1所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质，其特征在于，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml。
3.一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1)：将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺；
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为20-30g：180-270ml：5.24-7.86ml：1.0-2.0ml：1.0-2.0ml；在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；所述无氧环境是在反应容器中通入高纯氮气条件，聚合反应温度为35℃；
步骤2)：对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液中进行溶胀步骤；
步骤3)：再经抽滤步骤后获得所述筛分介质，所述抽滤步骤是将溶胀后的溶液经0.2μm的尼龙滤器过滤，所述筛分介质是聚丙烯酰胺。
4.根据权利要求3所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，其特征在于，所述溶胶缓冲液为浓度配比是：0.5M：0.5M：0.02M：7M的三羟甲基氨基甲烷、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、乙二胺四乙酸和尿素溶液。
5.根据权利要求3所述一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透析袋进行透析。
6.根据权利要求3述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺重均分子量范围为10-100KDa。
7.根据权利要求6所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺重均分子量为20-40KDa。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yu Lijuan Inventor after: Nie Yancha Inventor after: Jiang Bowei Inventor after: Zhao Ying Inventor after: Rong Haibo Inventor after: Guan Hua Inventor before: Yu Lijuan Inventor before: Nie Yancha Inventor before: Jiang Bowei |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |