JP2003004702A - 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 - Google Patents
高分解能電気泳動用ゲルの製造方法Info
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- JP2003004702A JP2003004702A JP2001218820A JP2001218820A JP2003004702A JP 2003004702 A JP2003004702 A JP 2003004702A JP 2001218820 A JP2001218820 A JP 2001218820A JP 2001218820 A JP2001218820 A JP 2001218820A JP 2003004702 A JP2003004702 A JP 2003004702A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】高分解能を有する電気泳動用ポリアクリルアミ
ドゲルの製造方法を提供する。 【構成】アクリルアミドモノマー、緩衝液、架橋剤、水
および重合開始剤の存在下に架橋重合させて、電気泳動
用ポリアクリルゲルを製造する方法において、緩衝液が
２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールお
よびグリシンであり、２−アミノ−２−メチル−１，３
−プロパンジオールの濃度が５０〜２００ｍＭであるこ
とならびに２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン
ジオールとグリシンの含有量比が０．４〜５であること
を特徴とする方法
ドゲルの製造方法を提供する。 【構成】アクリルアミドモノマー、緩衝液、架橋剤、水
および重合開始剤の存在下に架橋重合させて、電気泳動
用ポリアクリルゲルを製造する方法において、緩衝液が
２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールお
よびグリシンであり、２−アミノ−２−メチル−１，３
−プロパンジオールの濃度が５０〜２００ｍＭであるこ
とならびに２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン
ジオールとグリシンの含有量比が０．４〜５であること
を特徴とする方法
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質、酵素、ペ
プチド、核酸等の生体高分子の分離・分析または分取に
用いられる電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方
法に関するものである。
プチド、核酸等の生体高分子の分離・分析または分取に
用いられる電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方
法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、電気電気泳動法は、蛋白質や核酸
（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の分離や分取のために頻繁に用いら
れている。これらの目的のために、アガロースゲルやポ
リアクリルアミドゲル等が用いられており、特に後者は
分子篩効果を有するため、現在最も汎用されている。
（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の分離や分取のために頻繁に用いら
れている。これらの目的のために、アガロースゲルやポ
リアクリルアミドゲル等が用いられており、特に後者は
分子篩効果を有するため、現在最も汎用されている。
【０００３】ポリアクリルアミドゲルは、通常アクリル
アミドのような単量体とＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリ
ルアミドのような二官能性または多官能性架橋剤を、重
合開始剤の存在下、緩衝液中で架橋重合させることによ
り作製されている。緩衝液としては、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（以下、トリスと略す）−塩
酸、トリス−グリシン、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ等、
トリス系が最も多く用いられている。
アミドのような単量体とＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリ
ルアミドのような二官能性または多官能性架橋剤を、重
合開始剤の存在下、緩衝液中で架橋重合させることによ
り作製されている。緩衝液としては、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（以下、トリスと略す）−塩
酸、トリス−グリシン、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ等、
トリス系が最も多く用いられている。
【０００４】しかしながら、上述した従来法ではアクリ
ルアミドゲルの分解能が不十分なため、血清蛋白質のよ
うに分子量の接近した蛋白分画を多く有する試料の場合
には、蛋白質の分離が不十分なため、蛋白質の機能解析
が完全でなく、高分解能のアクリルアミドゲルの要望が
極めて強かった。
ルアミドゲルの分解能が不十分なため、血清蛋白質のよ
うに分子量の接近した蛋白分画を多く有する試料の場合
には、蛋白質の分離が不十分なため、蛋白質の機能解析
が完全でなく、高分解能のアクリルアミドゲルの要望が
極めて強かった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は
血清蛋白質のように多数の蛋白分画を有する試料の解析
が可能な高分解能を有するポリアクリルアミドゲルの製
造方法を提供することを目的とする。
血清蛋白質のように多数の蛋白分画を有する試料の解析
が可能な高分解能を有するポリアクリルアミドゲルの製
造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【問題を解決するための手段】本発明は、上記のような
従来技術の欠点に鑑み、高分解能の性能を有する電気泳
動用ゲルの製造方法を提供することを目的として鋭意研
究した結果、完成したものである。
従来技術の欠点に鑑み、高分解能の性能を有する電気泳
動用ゲルの製造方法を提供することを目的として鋭意研
究した結果、完成したものである。
【０００７】本発明は、アクリルアミドモノマー、緩衝
液、架橋剤、水および重合開始剤の存在下に架橋重合さ
せて、電気泳動用ポリアクリルゲルを製造するにあた
り、緩衝液が２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオールおよびグリシンであり、２−アミノ−２−メ
チル−１，３−プロパンジオールの濃度が５０〜２００
ｍＭであることならびに２−アミノ−２−メチル−１，
３−プロパンジオールとグリシンの含有量比が０．４〜
５であることを特徴とする方法に関するものである。
液、架橋剤、水および重合開始剤の存在下に架橋重合さ
せて、電気泳動用ポリアクリルゲルを製造するにあた
り、緩衝液が２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオールおよびグリシンであり、２−アミノ−２−メ
チル−１，３−プロパンジオールの濃度が５０〜２００
ｍＭであることならびに２−アミノ−２−メチル−１，
３−プロパンジオールとグリシンの含有量比が０．４〜
５であることを特徴とする方法に関するものである。
【０００８】電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製造
するにあたり、緩衝液のｐＨは６．０〜８．５が好まし
い。ｐＨが６．０未満であるとゲルの分解能が低下し、
ｐＨが８．５超の場合ゲルの分解能はさほど低下しない
ものの、ゲルが加水分解を受けやすくなり、ゲルの耐久
性が低下するので好ましくない。緩衝液のｐＨ調製には
塩酸あるいは酢酸のような有機酸を用いることができる
が、塩酸が好ましい
するにあたり、緩衝液のｐＨは６．０〜８．５が好まし
い。ｐＨが６．０未満であるとゲルの分解能が低下し、
ｐＨが８．５超の場合ゲルの分解能はさほど低下しない
ものの、ゲルが加水分解を受けやすくなり、ゲルの耐久
性が低下するので好ましくない。緩衝液のｐＨ調製には
塩酸あるいは酢酸のような有機酸を用いることができる
が、塩酸が好ましい
【０００９】本発明の方法で製造される電気泳動用ポリ
アクリルアミドゲルを、蛋白質または複合等質の分析ま
たは分離に用いる場合には、陰イオン界面活性剤を含有
させることが必須である。陰イオン界面活性剤を含有さ
せることにより、蛋白質または複合等質の効率的な分離
とそれらの分子量測定が可能となる。陰イオン界面活性
剤としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
（以下、ＳＤＳと略す）のようなドデシル硫酸塩が好ま
しい。陰イオン界面活性剤の添加量は、アクリルアミド
モノマー、架橋剤、緩衝液および水を含む成分に対し
て、０．０５％〜１．５％に範囲が好ましい。電気泳動
用ポリアクリルアミドゲルを、ＤＮＡの分離に用いる場
合には、陰イオン界面活性剤の添加は不要である。
アクリルアミドゲルを、蛋白質または複合等質の分析ま
たは分離に用いる場合には、陰イオン界面活性剤を含有
させることが必須である。陰イオン界面活性剤を含有さ
せることにより、蛋白質または複合等質の効率的な分離
とそれらの分子量測定が可能となる。陰イオン界面活性
剤としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
（以下、ＳＤＳと略す）のようなドデシル硫酸塩が好ま
しい。陰イオン界面活性剤の添加量は、アクリルアミド
モノマー、架橋剤、緩衝液および水を含む成分に対し
て、０．０５％〜１．５％に範囲が好ましい。電気泳動
用ポリアクリルアミドゲルを、ＤＮＡの分離に用いる場
合には、陰イオン界面活性剤の添加は不要である。
【０００１０】電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製
造するにあたり、緩衝液中の２−アミノ−２−メチル−
１，３−プロパンジオールの濃度およびの２−アミノ−
２−メチル−１，３−プロパンジオールとグリシン含有
量比は、ポリアクリルアミドゲルの分解能に非常に影響
する。２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ールの濃度が５０未満あるいは２００ｍＭ超の場合、お
よび２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオー
ルとグリシンの含有量比が０．４未満または５超の場
合、いずれもゲルの分解能は低下するので好ましくな
い。
造するにあたり、緩衝液中の２−アミノ−２−メチル−
１，３−プロパンジオールの濃度およびの２−アミノ−
２−メチル−１，３−プロパンジオールとグリシン含有
量比は、ポリアクリルアミドゲルの分解能に非常に影響
する。２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ールの濃度が５０未満あるいは２００ｍＭ超の場合、お
よび２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオー
ルとグリシンの含有量比が０．４未満または５超の場
合、いずれもゲルの分解能は低下するので好ましくな
い。
【０００１１】本発明に用いることができるアクリルア
ミド系モノマーの例としては、アクリルアミド、Ｎ−メ
チルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミ
ド等がある。これらのモノマーを単独で、あるいは２種
以上を混合して用いることができる。これらのモノマー
中で、アクリルアミドが特に好ましい
ミド系モノマーの例としては、アクリルアミド、Ｎ−メ
チルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミ
ド等がある。これらのモノマーを単独で、あるいは２種
以上を混合して用いることができる。これらのモノマー
中で、アクリルアミドが特に好ましい
【０００１２】架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミド（以下、ＢＩＳと略す）、Ｎ，Ｎ’−
プロピレンビスアクリルアミド、ジアクリルアミドジメ
チルエーテル、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリルシスタミン等を
用いることができる。これらの架橋剤のうちで、ＢＩＳ
が好ましい。架橋剤の添加量は、モノマーの重量に対し
２〜１０％が好ましい。
スアクリルアミド（以下、ＢＩＳと略す）、Ｎ，Ｎ’−
プロピレンビスアクリルアミド、ジアクリルアミドジメ
チルエーテル、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリルシスタミン等を
用いることができる。これらの架橋剤のうちで、ＢＩＳ
が好ましい。架橋剤の添加量は、モノマーの重量に対し
２〜１０％が好ましい。
【０００１３】本発明の方法で製造される電気泳動用ポ
リアクリルゲルのモノマー水溶液に、ゲルに弾力性を付
与することを目的に水溶性ポリマーを添加することがで
きる。水溶性ポリマーとしては、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等
を添加することができる。
リアクリルゲルのモノマー水溶液に、ゲルに弾力性を付
与することを目的に水溶性ポリマーを添加することがで
きる。水溶性ポリマーとしては、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等
を添加することができる。
【０００１４】本発明の方法で製造される電気泳動用ポ
リアクリルアミドゲルのモノマー水溶液に、泳動バンド
（分画）幅の広がりおよびバンドの歪曲を防止するため
に、グリセリン、グルコース、サッカロース、トレハロ
ースなどの多価アルコールを添加することができる。
リアクリルアミドゲルのモノマー水溶液に、泳動バンド
（分画）幅の広がりおよびバンドの歪曲を防止するため
に、グリセリン、グルコース、サッカロース、トレハロ
ースなどの多価アルコールを添加することができる。
【０００１５】モノマーの重合に適用されるラジカル重
合は、ラジカル重合開始剤および還元剤の併用、ラジカ
ル重合開始剤と光増感剤の併用あるいは紫外線照射など
によって行われる。これらの重合法の中で、ペルオキソ
二硫酸アンモニウム（以下、ＡＰＳと略す）、ペルオキ
ソ二硫酸アルカリ金属塩、過酸化水素等のラジカル重合
開始剤とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジ
アミン（以下，ＴＥＭＥＤと略す）等の還元剤を併用す
る方法が最も好ましい。ラジカル重合開始剤としては、
ＡＰＳ重合好ましい。この過酸化物と還元剤の添加量
は、モノマー水溶液に対に対し、０．３〜３％が好まし
い。
合は、ラジカル重合開始剤および還元剤の併用、ラジカ
ル重合開始剤と光増感剤の併用あるいは紫外線照射など
によって行われる。これらの重合法の中で、ペルオキソ
二硫酸アンモニウム（以下、ＡＰＳと略す）、ペルオキ
ソ二硫酸アルカリ金属塩、過酸化水素等のラジカル重合
開始剤とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジ
アミン（以下，ＴＥＭＥＤと略す）等の還元剤を併用す
る方法が最も好ましい。ラジカル重合開始剤としては、
ＡＰＳ重合好ましい。この過酸化物と還元剤の添加量
は、モノマー水溶液に対に対し、０．３〜３％が好まし
い。
【０００１６】本発明の方法で製造される電気泳動用ポ
リアクリルアミドゲルは、ゲル濃度として、モノマー、
架橋剤、緩衝液および水からなるモノマー水溶液の容積
に対し、モノマーおよび架橋剤の合計量が、３〜４０％
の範囲で用いられる。また、重合温度は２０〜５０℃が
好ましい。
リアクリルアミドゲルは、ゲル濃度として、モノマー、
架橋剤、緩衝液および水からなるモノマー水溶液の容積
に対し、モノマーおよび架橋剤の合計量が、３〜４０％
の範囲で用いられる。また、重合温度は２０〜５０℃が
好ましい。
【０００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、基本的には以下の構成
からなる。すなわち、アクリルアミドモノマー、緩衝
液、架橋剤、水および重合開始剤の存在下に架橋重合さ
せて、電気泳動用ポリアクリルゲルを製造する方法にお
いて、緩衝液が２−アミノ−２−メチル−１，３−プロ
パンジオールおよびグリシンであり、２−アミノ−２−
メチル−１，３−プロパンジオールの濃度が５０〜２０
０ｍＭであることならびに２−アミノ−２−メチル−
１，３−プロパンジオール（以下、ＡＭＰＤと略す）と
グリシンの含有量比が０．４〜５であることを特徴とす
る方法である。上記発明を実施例に基づき詳細に説明す
るが、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではな
い。
からなる。すなわち、アクリルアミドモノマー、緩衝
液、架橋剤、水および重合開始剤の存在下に架橋重合さ
せて、電気泳動用ポリアクリルゲルを製造する方法にお
いて、緩衝液が２−アミノ−２−メチル−１，３−プロ
パンジオールおよびグリシンであり、２−アミノ−２−
メチル−１，３−プロパンジオールの濃度が５０〜２０
０ｍＭであることならびに２−アミノ−２−メチル−
１，３−プロパンジオール（以下、ＡＭＰＤと略す）と
グリシンの含有量比が０．４〜５であることを特徴とす
る方法である。上記発明を実施例に基づき詳細に説明す
るが、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではな
い。
【０００１８】
【実施例および比較例】縦１０ｃｍ、横１０ｃｍの平面
状ガラス板２枚の間に、縦１０ｃｍ、横１ｃｍ、厚さ１
ｍｍのガラス製スペーサーをガラス板縁辺部に、および
厚さ１ｍｍの凹型のコームをガラス板の上部に、それぞ
れ挟んだガラスプレートを作成した。次に、表１記載の
濃度のアクリルアミドおよびＢＩＳのモノマーに、本発
明の緩衝液および比較例として従来技術の緩衝液（トリ
ス−塩酸系緩衝液）を加えて、モノマー水溶液を調製し
た。このモノマー水溶液にＡＰＳ４００ｐｐｍおよびＴ
ＥＭＥＤ３９０ｐｐｍを添加し、スターラーで攪拌した
後、当該水溶液をペリスタポンプでガラスプレートに注
入した。２５℃で２時間重合させ、電気泳動用ポリアク
リルアミドゲルを製造した。
状ガラス板２枚の間に、縦１０ｃｍ、横１ｃｍ、厚さ１
ｍｍのガラス製スペーサーをガラス板縁辺部に、および
厚さ１ｍｍの凹型のコームをガラス板の上部に、それぞ
れ挟んだガラスプレートを作成した。次に、表１記載の
濃度のアクリルアミドおよびＢＩＳのモノマーに、本発
明の緩衝液および比較例として従来技術の緩衝液（トリ
ス−塩酸系緩衝液）を加えて、モノマー水溶液を調製し
た。このモノマー水溶液にＡＰＳ４００ｐｐｍおよびＴ
ＥＭＥＤ３９０ｐｐｍを添加し、スターラーで攪拌した
後、当該水溶液をペリスタポンプでガラスプレートに注
入した。２５℃で２時間重合させ、電気泳動用ポリアク
リルアミドゲルを製造した。
【０００１９】上記のように製造して得られた、２種類
のポリアクリルアミドゲルを用いてヒト血清蛋白質を電
気泳動した。血清蛋白質は、２０％０．５Ｍトリス−塩
酸、４％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、２
０％グリセロールおよび０．０７％ブロムフェノールブ
ルーから成るサンプル処理用緩衝液を血清蛋白質に対し
て等量加えた後、９５℃で３分間熱処理したものを泳動
用試料とした。泳動用緩衝液は、トリス−グリシン−Ｓ
ＤＳ緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、
０．１％ＳＤＳ）を用いた。電気泳動は、２００Ｖの定
電圧で約１時間行った。染色は、０．２５％クマシーブ
リリアントブルーＧ２５、１０％酢酸、５０％メタノー
ル水溶液中で２時間行った。脱色は、７％酢酸、２５％
メタノール水溶液中で、時々新しい溶液に交換しなが
ら、一昼夜行った。上記の方法で得られた泳動像の写真
を、図１（本発明の方法）および図２（従来技術の方
法）に示した。なお、写真の電気泳動像は、すべて同じ
ヒト血清である。これらの写真から判るように、本発明
の方法で製造したゲルの電気泳動像から明確に確認でき
るバンドは８本であるのに対し、従来技術によるそれは
４本と、本発明の方法によるゲルの分解能が優れている
ことが明らかである。
のポリアクリルアミドゲルを用いてヒト血清蛋白質を電
気泳動した。血清蛋白質は、２０％０．５Ｍトリス−塩
酸、４％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、２
０％グリセロールおよび０．０７％ブロムフェノールブ
ルーから成るサンプル処理用緩衝液を血清蛋白質に対し
て等量加えた後、９５℃で３分間熱処理したものを泳動
用試料とした。泳動用緩衝液は、トリス−グリシン−Ｓ
ＤＳ緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、
０．１％ＳＤＳ）を用いた。電気泳動は、２００Ｖの定
電圧で約１時間行った。染色は、０．２５％クマシーブ
リリアントブルーＧ２５、１０％酢酸、５０％メタノー
ル水溶液中で２時間行った。脱色は、７％酢酸、２５％
メタノール水溶液中で、時々新しい溶液に交換しなが
ら、一昼夜行った。上記の方法で得られた泳動像の写真
を、図１（本発明の方法）および図２（従来技術の方
法）に示した。なお、写真の電気泳動像は、すべて同じ
ヒト血清である。これらの写真から判るように、本発明
の方法で製造したゲルの電気泳動像から明確に確認でき
るバンドは８本であるのに対し、従来技術によるそれは
４本と、本発明の方法によるゲルの分解能が優れている
ことが明らかである。
【０００２０】
【発明の効果】本発明の方法により製造された電気泳動
用ポリアクリルアミドゲルは、非常に高分解能性を有し
ているので、従来では解析不能であった血清蛋白質のよ
うな、分子量の接近した蛋白質を多く含有する試料中の
蛋白質の機能解析が可能となった。
用ポリアクリルアミドゲルは、非常に高分解能性を有し
ているので、従来では解析不能であった血清蛋白質のよ
うな、分子量の接近した蛋白質を多く含有する試料中の
蛋白質の機能解析が可能となった。
【図１】本発明の方法によるヒト血清蛋白質の電気泳動
像
像
【図２】従来法の技術によるによるヒト血清蛋白質の電
気泳動像
気泳動像
Claims (3)
- 【請求項１】アクリルアミドモノマー、緩衝液、架橋
剤、水および重合開始剤の存在下に架橋重合させて電気
泳動用ポリアクリルゲルを製造する方法において、緩衝
液が２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオー
ルおよびグリシンであり、２−アミノ−２−メチル−
１，３−プロパンジオールの濃度が５０〜２００ｍＭで
あることならびに２−アミノ−２−メチル−１，３−プ
ロパンジオールとグリシンの含有量比が０．４〜５であ
ることを特徴とする方法 - 【請求項２】緩衝液のｐＨが６．０〜８．５であること
を特徴とする請求項１に記載の方法 - 【請求項３】ポリアクリルアミドゲルがさらに蛋白質の
変性剤としてドデシル硫酸塩を含むことを特徴とする請
求項１に記載の方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001218820A JP2003004702A (ja) | 2001-06-15 | 2001-06-15 | 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001218820A JP2003004702A (ja) | 2001-06-15 | 2001-06-15 | 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003004702A true JP2003004702A (ja) | 2003-01-08 |
Family
ID=19052936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001218820A Pending JP2003004702A (ja) | 2001-06-15 | 2001-06-15 | 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003004702A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004333190A (ja) * | 2003-05-01 | 2004-11-25 | Hitachi High-Technologies Corp | 電気泳動装置 |
| EP2180316A1 (en) * | 2007-08-17 | 2010-04-28 | Hymo Corporation | Precast gel for electrophoresis, method for production thereof, and use thereof |
| JP2014092450A (ja) * | 2012-11-02 | 2014-05-19 | Sharp Corp | 電気泳動用分離媒体 |
| WO2016190321A1 (ja) * | 2015-05-25 | 2016-12-01 | シャープ株式会社 | 電気泳動ゲル、電気泳動キット、電気泳動装置および電気泳動方法 |
| JPWO2015093301A1 (ja) * | 2013-12-16 | 2017-03-16 | シャープ株式会社 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルを備えた電気泳動装置 |
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| CN107831313A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-03-23 | 广州和实生物技术有限公司 | 立显蛋白电泳预制胶片剂的制备及应用 |
-
2001
- 2001-06-15 JP JP2001218820A patent/JP2003004702A/ja active Pending
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