JPWO2015093301A1 - ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルを備えた電気泳動装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルの作製方法の一実施形態、並びに当該ゲルを備えた電気泳動装置の一実施形態を以下に説明する。
本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、タンパク質の分離は起こらず濃縮を受ける濃縮ゲル(スタッキングゲル)と、当該濃縮ゲルとは異なるpHに調整されたタンパク質の分離がおこなわれる分離ゲルとを含有する。なお、本発明におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび分離ゲルのほかに他のゲル(層)を含み得る。
本実施形態1におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される濃縮ゲルは、pHが、pH6.0〜pH8.8の範囲に調整されている。より好ましくは、pH6.6〜pH7.5の範囲に調整され、一例としてpH6.8に調整されている。このようにpH条件が調整された濃縮ゲルでは、タンパク質は分離されずに濃縮を受ける。なお、濃縮の原理は周知であるため、ここでの説明は省略する。
本実施形態1におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される分離ゲルは、pHが8.0〜9.2の範囲に調整されている。より好ましくは、pHが8.4〜8.8の範囲に調整され、一例としてpH8.8に調整されている。このようにpH条件が調整された分離ゲルでは、濃縮ゲルによって濃縮されたタンパク質サンプルの分離が起こる。なお、分離の原理は周知であるためここでの説明は省略する。
SDS−PAGE用ゲルである本実施形態1におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、従来周知のSDS−PAGE用ゲルの作製方法を提供して作製することができる。
次に、本発明に係る電気泳動装置の一実施形態として、自動化二次元電気泳動装置400を例に挙げて説明する。
一次元目電気泳動部410には、複数の槽が設けられている。一次元目電気泳動部410について、図5を用いて更に説明する。
二次元目電気泳動部420には、上述したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル(SDS−PAGE用ゲル)10が具備されており、SDS−PAGE用ゲル10において、一次元目電気泳動部410から搬送された等電点電気泳動ゲル200に含まれた分離サンプルが、第1方向と異なる第2方向にさらに分離(SDS−PAGE)される。
本発明の他の実施形態を説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については説明を省略する。
本発明の他の実施形態を説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については説明を省略する。
本発明の態様1に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル(SDS−PAGE用10)は、濃縮ゲル5および上記濃縮ゲルとは異なるpHに調整されている分離ゲル4を含み、上記濃縮ゲル5および上記分離ゲル4のうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴としている。
マウス肝臓組織から試料タンパク質を調製した。まず、マウス肝臓組織から、血管および血液溜をなるべく避けて0.4gの試料を秤取り、氷上で冷却した5mLガラステフロン(登録商標)ホモジナイザーに入れた。ホモジナイザー内の試料に、4℃に冷却した5〜6倍量(2mL)の溶解バッファー(50mMトリスHCl(pH7.6)、20%グリセロール、0.3M NaCl)およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、氷上で摩砕した(3000〜4000rpm)。その後、1000×gで10分間、4℃で遠心分離した。上清を回収した後、16000×gで30分間、4℃で遠心分離した。再度上清を回収し、タンパク質定量を行い、濃度を算定した後、−80℃で保存した。
図1に示すようなゲル作製器具を用いて、SDS−PAGE用ゲル(10)を作製した。まず、1mmのスペーサーおよびパッキンを挟んだ2枚のガラス板(1)をクリップ(2)によって固定した。注入管(3)から、ガラス板の間に、pH8.8のトリス緩衝液を含むアクリルアミドモノマー溶液(9.7%アクリルアミド、0.3%ビスアクリルアミド、375mM Tris−HCl(pH8.8)、0.1%TEMED、0.05%APS)を添加して、約7割まで充填した後、表層に水を重層して、30分間室温にて重合を行い、分離ゲルを形成した。
シャープマニファクチュアリングシステム社製のAuto2Dにより二次元電気泳動を行なった。実施例としては、2.において作製した二層のSDS−PAGE用ゲルを用い、比較例としては、保存性を考慮して作製されている市販の一層(pH8.8)のSDS−PAGE用ゲルを用いた。
Step1:200V,5分間一定
Step2:1000V,5分間リニアグラジエント
Step3:1000V,5分間一定
Step4:4000V,10分間リニアグラジエント
Step5:4000V,10分間一定
Step6:7000V,10分間リニアグラジエント
Step7:7000V,20分間一定
その後、2次元電気目電気泳動は、次の通りとした。
Step1:10mA、10分間一定
Step2:20mA、35分間
二次元電気泳動結果を図7に示す。比較例に係るSDS−PAGE用ゲル(図7の(b))では、スポットが縦に伸びる現象が発生していた。これは、非還元条件下の抗体が約160kDaと非常に大きな分子であることに起因する。一方、実施例に係るSDS−PAGE用ゲル(図7の(a))では、濃縮ゲルにおいて濃縮効果が得られるため、抗体を試料とした場合でも、スポットが縦に伸びる現象を抑制することができた(図7の(a))。
2 クリップ
3 チューブ
4 分離ゲル
5 濃縮ゲル
10 SDS−PAGE用ゲル(ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル)
10’ ゲル収納部
40 ゲル付き保持体
200 等電点電気泳動ゲル
400 自動化二次元電気泳動装置
410 一次元目電気泳動部(第一泳動部)
411 第一試薬槽
412 第2試薬槽
420 二次元目電気泳動部(第二泳動部)
421 下部絶縁板
422 上部絶縁板
428a 第1緩衝液槽
428b 第2緩衝液槽
429a 第1電極
429b 第2電極
Claims (9)
- 濃縮ゲルおよび上記濃縮ゲルとは異なるpHに調整されている分離ゲルを含み、
上記濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴とするポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。 - 上記濃縮ゲルに、pKaが、6.2〜8.5の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることを特徴とする請求項1に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
- 上記分離ゲルに、pKaが、8.5〜9.3の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることを特徴とする請求項1または2に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
- 上記濃縮ゲルのpHは、6.6〜7.5の範囲に調整されており、
上記分離ゲルのpHは、8.4〜8.8の範囲に調整されていることを特徴とする請求項1〜3の何れか一項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。 - ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであることを特徴とする請求項1から4までの何れか1項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、
陰極と、
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極とは反対側に配置された陽極と、
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側に添加される陰極バッファーと、を備えている電気泳動装置。 - 上記陰極バッファーは、フロントイオンおよびトレイリングイオンを含んでいることを特徴とする請求項6に記載の電気泳動装置。
- 上記陰極バッファーのバッファー濃度は、20〜50mMの範囲に調整されており、
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度は、150〜500mMの範囲に調整されていることを特徴とする請求項6または7に記載の電気泳動装置。 - 一次元目の電気泳動をおこなう第一泳動部と、二次元目の電気泳動をおこなう第二泳動部とを有し、
上記第二泳動部の電気泳動用ゲルが上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであることを特徴とする請求項6から8までの何れか1項に記載の電気泳動装置。
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---|---|---|---|---|
JP2003004702A (ja) * | 2001-06-15 | 2003-01-08 | Bio Meito:Kk | 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 |
JP2005308450A (ja) * | 2004-04-19 | 2005-11-04 | Enbitekku Japan:Kk | ゲル電気泳動分析システム、ゲル電気泳動分析方法および陰極バッファー溶液 |
JP2006162405A (ja) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 二次元電気泳動方法 |
WO2009025135A1 (ja) * | 2007-08-17 | 2009-02-26 | Hymo Corporation | 電気泳動用プレキャストゲル、その製造方法及びその使用方法 |
JP2013040792A (ja) * | 2011-08-11 | 2013-02-28 | Sharp Corp | 電気泳動ゲルチップならびにその製造方法および製造キット |
WO2013133083A1 (ja) * | 2012-03-05 | 2013-09-12 | シャープ株式会社 | 電気泳動用ゲルの製造方法および電気泳動用ゲルの製造装置 |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003004702A (ja) * | 2001-06-15 | 2003-01-08 | Bio Meito:Kk | 高分解能電気泳動用ゲルの製造方法 |
JP2005308450A (ja) * | 2004-04-19 | 2005-11-04 | Enbitekku Japan:Kk | ゲル電気泳動分析システム、ゲル電気泳動分析方法および陰極バッファー溶液 |
JP2006162405A (ja) * | 2004-12-07 | 2006-06-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 二次元電気泳動方法 |
WO2009025135A1 (ja) * | 2007-08-17 | 2009-02-26 | Hymo Corporation | 電気泳動用プレキャストゲル、その製造方法及びその使用方法 |
JP2013040792A (ja) * | 2011-08-11 | 2013-02-28 | Sharp Corp | 電気泳動ゲルチップならびにその製造方法および製造キット |
WO2013133083A1 (ja) * | 2012-03-05 | 2013-09-12 | シャープ株式会社 | 電気泳動用ゲルの製造方法および電気泳動用ゲルの製造装置 |
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