CN102276852A - 一种毛细管动态包被聚合物凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛细管动态包被聚合物凝胶及其制备方法。本发明提供的毛细管电泳的筛分介质的制备方法，是在溶胶缓冲液中，将疏水性聚合物和亲水性聚合物混合，得到所述筛分介质。本发明所制备的凝胶能够在保证较高分辨率的前提下，具有动态涂层的能力，兼具筛分能力与动态涂层能力。

Description

一种毛细管动态包被聚合物凝胶及其制备方法

技术领域

本发明提供一种能够动态包被毛细管的凝胶的组分及配制方法。该聚合物是一种筛分聚合物及一种包被聚合物的混合物。本发明的聚合物具有毛细管自涂层作用及生物大分子筛分的作用。

背景技术

毛细管电泳是一种在生命科学应用最为广泛的生物分子分离技术。目前，可应用于遗传学领域，进行DNA测序，SNP检测，DNA片段分析等。由于具有高效的热消散，毛细管电泳可实现带电物质的高效、快速分离。带电物质将受到两种电泳迁移力的作用。一种是电泳迁移率，它取决于电场及电场强度本身。另一种电渗作用，它能够在不受迁移率影响的情况下，使中性和离子性物质以一个固定的速度，向电极一端移动。

电渗流的强度在很大程度上取决于表面的电荷以及毛细管表面附近的粘度。这些性质受毛细管管壁物质组成、缓冲液、分离介质、pH值等条件的影响。在使用硅包毛细管的情况下，在离子化后，毛细管内壁负电荷会吸附一层正电荷(Buffer中)。在电位的影响下，这些移动的离子流向阴极。一定容积的溶液也流向这个位置以维持电中性。电渗流控制的抑制提高了毛细管电泳分离的分辨力。如不能抑制电渗效应将导致分离不完全，特别是核酸和蛋白的分离。

基于融合硅的经验，硅表面硅羟基的离子化将产生负电荷表面。已有多种用于抑制硅毛细管中电渗作用的处理方法被纷纷研制出来，通过抑制电渗能够最小化被分析样本与毛细管内壁之间的相互作用。也就是说减少了电荷的产生。

为了抑制电渗与DNA与毛细管内壁作用，在使用毛细管电泳进行DNA测序时，控制毛细管内表面需要使用憎水筛分聚合物，如聚丙烯酰胺和羟乙基纤维素。永久性的共价修饰和动态的暂时性的修饰这两种方式都可以应用于毛细管内壁的修饰。然而，形成共价包被的工艺比较复杂，且浪费时间，同时，在多次反复使用的过程中，包被层的化学稳定性仍然是很难解决的问题。为了减少DNA检测费用，提高重复性和稳定性，有必要采用吸附包被去取代昂贵的不理想的共价包被法。

发明内容

本发明的目的在于提供毛细管电泳的筛分介质的制备方法。

本发明提供的毛细管电泳的筛分介质的制备方法，是在溶胶缓冲液中，将疏水性聚合物和亲水性聚合物混合，得到所述筛分介质。该筛分介质是一种毛细管动态包被聚合物凝胶。

进一步，上述疏水性聚合物和亲水性聚合物的质量配比是(0.8-1.2)∶(8-12)，优选配比是1∶10。

更进一步，所述溶胶缓冲液、所述疏水性聚合物和所述亲水性聚合物的配比是(450-550)ml∶(0.8-1.2)g∶(8-12)g，优选配比是500ml∶1g∶10g。

在具体实施例中，上述疏水性聚合物可以是由二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺在引发剂存在下反应得到的聚合物。

上述二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的质量配比可以为(2-4)∶(6-8)，优选质量比为3∶7。

上述引发剂为过硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基二乙胺的混合物。

在实施例中，上述二乙基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的配比是1.5g∶3.5g∶0.005g∶0.01ml。

上述反应是在无氧条件下进行的，所述反应的温度为30-40℃，优选为35℃；所述反应的时间为8-12小时，优选为10小时。

在具体实施例中，上述亲水性聚合物可以为线性聚丙烯酰胺；优选是，所述线性聚丙烯酰胺的数均分子量为414kDa、重均分子量为3105kDa、多分散性为7.5。

上述溶胶缓冲液是由电泳缓冲液、变性剂和水组成；每50ml溶胶缓冲液优选由5ml 10倍所述电泳缓冲液、19g变性剂和25ml水混匀制备得到；所述10倍电泳缓冲液的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：0.5M Tris、0.5M TAPS、0.02M EDTA-Na₂；所述变性剂优选是尿素、甲酰胺和/或SDS。

优选地是，上述制备方法还包括疏水性聚合物和亲水性聚合物混合步骤之后的摇匀、过滤和去除气体。

上述过滤是将所述摇匀后的溶液经5μm的尼龙滤器过滤。

上述的方法制备的筛分介质属于本发明的保护范围之内。

进行毛细管电泳所使用的筛分介质通常是一种混合的非交联聚合物，这种聚合主要应起到两种作用：一是包被毛细管内壁；二是作为一种分离的介质。聚合物的成分包括一系列不同亲水性/疏水性的聚合物。其中包含一种主要起包被作用的成分(包被聚合物)，还包含一种起筛分作用的成分(筛分聚合物)。每种成分的聚合物可以是共聚物或同聚物，还可以是共聚物和同聚物的混合物。

聚合物可以是自然存在的聚合物，也可以是修饰过的自然存在的聚合物或人工合成的聚合物。聚合物的化合将产生水溶性不同的聚合物，特别注意的是聚丙烯酰胺的交联，在交联时，混合物中聚丙烯酰胺将因其N位取代的不同而不同。

聚合物水溶性因筛分聚合物(亲水性更强)与包被聚合物(亲水性弱)的不同而不同。筛分聚合物包括，聚丙烯酰胺、聚醚、多糖类如羟乙基纤维素、琼脂糖、葡聚糖等；包被聚合物可以包括同聚合和共聚体，两者皆可自然生成，或对自然生成的聚合进行修饰，也可人工合成，包被聚合物包括丙烯酰胺的聚合物(包括甲基丙烯酰胺)，取代纤维素，取代可以是甲基和羟基或是两者皆发生，如二甲基聚丙烯酰胺、二乙基聚丙烯酰胺、氧化聚乙烯、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；包被共聚物包括两至三种单体，通常是如下单体中的两种：N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、N-哌啶基甲基丙烯酰胺、N-吡咯烷基甲基丙烯酰胺等。

混合聚合物时，应避免沉淀的产生。所使用的缓冲液应与毛细管电泳过程所使用的缓冲液兼容。缓冲液包括Tris碱，双(三羟甲基)氨基甲烷，硼酸盐，EDTA，MOPS，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，柠檬酸三钠，磷酸钾、磷酸钠、等。每种组分将以0.001-0.5M的浓度存在于缓冲液中，可能是0.075-0.15M，而其他组分如EDTA，DETPA等将以0.001-0.005M的浓度存在。除其他加入物外，需加入一种变性剂进行dsDNA变性(DNA测序或序列分析)如尿素，甲酰胺，SDS。变性剂的量依变性剂种类、电泳条件，所分析的物质成分的不同而不同。一般变性剂的量在0.2-50(w/v)。

对于水溶性较差的聚合物，必须在其与溶液混合时进行强烈搅拌，然后进行过滤。对于可溶性强的聚合物，离心后进行过滤就足以形成澄清的溶液了。两种溶液然后以1∶1-10的比例混合，可以是1∶10。应尽量避免沉淀的产生。通过分阶段的混匀成分避免沉淀的产生，然后取出残渣或沉淀物。

实验证明：本发明所制备的凝胶能够在保证较高分辨率的前提下，具有动态涂层的能力，兼具筛分能力与动态涂层能力(图1)。

附图说明

图1为实施例3制备得到的凝胶进行Typer^TM500分子量内标的检测的峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、疏水性动态包被共聚物的制备

疏水性动态包被聚合物是一种非交联的聚合物，由含自由基的溶液聚合而成。聚合反应在一种单体水相溶液中进行，如二乙基丙烯酰胺与二甲基丙烯酰胺(3∶7)。单体的浓度应低于10g/100ml。具体步骤如下：

在圆底烧瓶中加入1.5g二乙基丙烯酰胺与3.5g二甲基丙烯酰胺，然后加入60mL的超纯水，用高纯氦气(99.99％)对溶液进行除氧1个小时。然后通过注射器加入0.005g过硫酸铵(APS)和0.01mL N，N，N’，N’-四甲基二乙胺(TEMED)为引发剂，在35℃下反应10小时，然后对溶液进行透析和冻干除去多余的水分和未反应的单体，获得固体形态的聚合物(疏水性动态包被共聚物)。研究发现这种聚合物具有理想的筛分和包被能力。

实施例2：可溶性高的聚合物的制备(线性聚丙烯酰胺)

在一个圆底烧瓶中，加入5g丙烯酰胺、0.1g span80、20g矿物油和0.005g过硫酸铵(APS)，加入搅拌子在600rpm下搅拌30min，体系呈乳液状态。通入高纯氦气除氧一个小时，通过注射器加入0.01mL N，N，N’，N’-四甲基二乙胺(TEMED)催化反应然后把圆底烧瓶放在35℃油浴中在氦气保护下反应18小时。反应结束后，用丙酮去沉淀聚丙烯酰胺，用丙酮在漏斗上冲洗沉淀数次，最后用真空烘箱在45℃下干燥12小时，得到白色粉末固体(亲水性筛分聚合物)，转化率约40％。经凝胶渗透色谱仪(GPC)测试分子量为Mn＝414kDa，Mw＝3105kDa，多分散性为7.5。

实施例3：混合筛分介质(1∶10疏∶亲)的制备

一、10倍电泳缓冲液的配制

1.称取6.05g Tris碱、12.16g N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(超纯级)、0.74gEDTA-Na₂加入到含80ml无菌水的100ml容量瓶中混匀，加入无菌水定容至100mL，形成10倍电泳缓冲液，其中Tris终浓度0.5M、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸终浓度0.5M、EDTA-Na₂终浓度0.02M。

二、溶胶缓冲液的配制

2.称25ml无菌水在一个干净的100ml玻璃瓶。

3.称量19g尿素(超纯级)，加入到步骤2的100ml玻璃瓶中。盖上盖子，手动温和摇匀直到所有的尿素溶解。

4.加入5ml本实施例步骤1配制的10倍电泳缓冲液溶液，温和震荡，得到50ml溶胶缓冲液。

三、筛分介质制备

5.称量实施例1中的0.1g疏水性动态包被共聚物并加入上述瓶中。

6.称量实施例2中的1g亲水性筛分聚合物的制备，并加入上述瓶中。

7.温和震荡瓶子，并混合所有成分。然后1000rpm离心15min，所有的内容物将在瓶底。

8.过夜震荡(12小时)步骤7的瓶子，使用磁力搅拌器(Corning公司)以低速60rpm运行，得到带有泡沫的溶液。

9.过夜摇匀后，带有泡沫的溶液透过5μm的尼龙滤器(CameoNS，Osmonics)，过滤使用氮气压力。收集滤过物入一干净的瓶中。

10.过滤后的溶液离心(1000rpm、离心60min)去除气体，得到混合筛分介质，也即2％的凝胶。计算方法为：1g亲水性筛分聚合物质量/50mL溶胶缓冲液＝2％。

11.4℃储存，防止尿素的降解。

实施例4、Typer^TM500分子量内标的检测

1.采用实施例3中制备的凝胶；

2.在AB3130型遗传分析仪上进行DNA片段分离的的电泳条件

电泳电压是15kV；

进样时间是10s

毛细管长度是36cm；

电泳温度是60℃。

3、换新配的Running buffer(实施例3步骤一制备的电泳缓冲液稀释10倍后的溶液)和Typer^TM15(公安部物证鉴定中心)分子量内标(1uμL内标+20μL去离子甲酰胺)。

4、将实施例3制备的2％的凝胶装入胶瓶中，并将注胶管置于胶瓶中，固定好。

5、启动自动换胶系统。

6、按照操作说明进行毛细管电泳检测

其电泳结果如图1所示，2％的凝胶对Typer^TM500分子量内标能够实现良好的分离。实施例3所制备的凝胶能够在保证较高分辨率的前提下，具有动态涂层的能力，兼具筛分能力与动态涂层能力。

Claims (10)

1.毛细管电泳的筛分介质的制备方法，是在溶胶缓冲液中，将疏水性聚合物和亲水性聚合物混合，得到所述筛分介质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述疏水性聚合物和亲水性聚合物的质量配比是(0.8-1.2)∶(8-12)，优选配比是1∶10。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述溶胶缓冲液、所述疏水性聚合物和所述亲水性聚合物的配比是(450-550)ml∶(0.8-1.2)g∶(8-12)g，优选配比是500ml∶1g∶10g。

4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述疏水性聚合物是由二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺在引发剂存在下反应得到的聚合物；所述二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的质量配比为(2-4)∶(6-8)，优选质量比为3∶7。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述引发剂为过硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基二乙胺的混合物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述二乙基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的配比是1.5g∶3.5g∶0.005g∶0.01ml。

7.如权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述反应是在无氧条件下进行的；所述反应的温度为30-40℃，优选为35℃；所述反应的时间为8-12小时，优选为10小时。

8.如权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述亲水性聚合物为线性聚丙烯酰胺；优选是，所述线性聚丙烯酰胺的数均分子量为414kDa、重均分子量为3105kDa、多分散性为7.5。

9.如权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述溶胶缓冲液是由电泳缓冲液、变性剂和水组成；每50ml溶胶缓冲液优选由5ml 10倍所述电泳缓冲液、19g变性剂和25ml水混匀制备得到；所述10倍电泳缓冲液的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：0.5M Tris、0.5M TAPS、0.02M EDTA-Na₂；所述变性剂优选是尿素、甲酰胺和/或SDS。

10.权利要求1-9中任一所述的方法制备的筛分介质。

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