JP2009513990A - マイクロチャネル分離用マトリックス、ダイナミックポリマーシステム及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
米国政府は、それぞれ、国立衛生研究所及び全米科学財団からノースウェスタン大学への第1R01HG019770−01及びDMR−0076097に従って、この発明に対する特定の権利を有する。
本発明の別の目的は、単独又は上記の目的とともに、電気浸透流及び/又は分析物−壁相互作用の発生率又は影響を減少させるために、親水性壁コーティングポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、先行技術と比較してより短い時間で配列の読み取り長を増大させるために、マトリクス/壁コーティングシステムとともに関連方法の使用を提供することである。
本発明の他の目的は、より長く、速い配列読み取り、流マイクロチャネル電気泳動を提供する1以上のマトリクス/壁コーティングシステムを提供することである。
−[CH2C(R)C(O)NR’R”]n
(式中、Rは水素原子及びメチルから選択することができ、R’及びR”は独立して、C1〜C8の直線状アルキル基、C1〜C8のアルコキシ置換直線状アルキル基、C1〜C8の分岐状アルキル基及びC1〜C8のアルコキシ置換分岐状アルキル基から選択することができる)
のポリアクリルアミド、それらのコポリマー及びそのようなポリマー及び/又はコポリマーの組み合わせからなる疎水性分離マトリクスと、そのようなマトリクス成分よりもより親水性のポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)(pHMA)からなる疎水性壁コーティング成分とを含むことができる。
本発明の特定の実施形態をさらに理解するために、以下を考慮する。
シーケンシング用最適ポリマーマトリックスを開発することは、マイクロチャネルシステムを商業化するために最も大きな制約のうちの1つである。DNAシーケンシングは、ポリマー鎖がネットワークにオーバーラップし、ネットワークを形成し、絡み合う半希釈ポリマー溶液中で可能であるのみである。オーバーラップ濃度(c*)を、コイル内のポリマー濃度に正確に匹敵するバルク溶液濃度と定義する。方程式(1)は、この定義に基づくc*の推定値を与える。
式(1)から、オーバーラップ濃度は、光散乱のような技術によって、Mw及びRgの双方を測定することによって算出することができる。あるいは、オーバーラップ濃度は、一連のポリマー濃度のゼロせん断粘度を測定し、ログ−ログスケールで粘度対ポリマー濃度をプロットすることによって決定することができる。プロットが非線形になる濃度は、オーバーラップ濃度であり、ネットワークが絡み合う程度では、c/c*比として表わすことができる。
上述のポリマーネットワークパラメータは、絡み合いネットワークにわたってDNAマイグレーションの種々のメカニズムを示すために用いることができる。分離のメカニズムは、ネットワーク中でのブロブのサイズと比較して、DNA分子のRgに依存する。ネットワークの孔サイズより小さいDNAサイズは、繊維の緻密なアレイ中を移動する球体に対するオグストンによって示されたものと類似したメカニズムで、溶液中をマイグレートする。これは、通常、オグストンふるい分けとして呼称されており、自由溶液移動度に対して、DNAの移動度は、
によって、数学的に示すことができる。このメカニズムは、試料の移動度対ポリマー濃度のゲルの自然対数をプロットするファーガソンプロットによって分析される。よって、線の傾斜は、遅滞係数に対する値を与える。
孔サイズより大きなDNAがDNA移動度の偏ったレプテーションモデルに至ったという観察。このモデルは、DNA分子長が変動、つまり変動で偏ったレプテーションに付されたことを考慮することによって、再評価された。これらのモデルは、DNAの移動度が溶液の絡み合いポリマー溶融体に対するレプテーション理論に類似したネットワークによって、曲がりくねると予測される。このメカニズムの重要なパラメータは、低減した電界であり、これは、
によって与えられる。これらのモデルは、一般に、低電界の存在又はε<<1に対して誘導された。BRFモデルに対する移動度の得られた形態は、
によって与えられる。このモデルに関して、臨界DNAサイズは、以下の第1項のDNAサイズが支配して存在し、DNA移動度はサイズ依存性である。
pDMAは、キャピラリ電気泳動器具における有効なシーケンシングマトリックスとして探究されたが、このポリマーは、マイクロチャネルシステムにおけるシーケンシングに対して試験されなかった。ssDNA断片の分離は、対照として、市販のLPAマトリックスとともに、3〜5%の濃度のpDMAを用いたマイクロチャネル電気泳動システムで行われた。サンプルは、37DNA断片サイズを含む25塩基ラダーである。これらの分離での電気泳動図を図3に示す。3%及び4%のpDMAマトリックスが全37のピークを分離した一方、5%のpDMA及びLPAマトリックスは最大のDNA断片を完全には分解しない。そのため、低粘度を有することに加えて、pDMA溶液は、4%のLPAマトリックスよりも良好に、900の塩基まで、25塩基ラダーを分離する。このシステムにおける有効な分離距離は、市販のCAE手段におけるよりも相当小さい、7.5cmである。マイクロチャネルシステムが、より有効な分離を可能にするクロスインジェクターデザインを採用するため、必要とされるチャンネル長が非常に低減され、よって、分離はより速い。
LPAと比較して分離速度が速くなったことに加えて、pDMAは、高価で長時間かかるかもしれない共有結合的にチャネル壁を被覆する必要を解消する自己コーティングマトリクスとして作用することができる。ダイナミックに吸着されたポリマー壁コーティングは、それらのコストを低減させ、より簡便な実施のため、高いスループット環境のための共有結合コーティングよりも一層魅力的である。しかし、pDMAコーティングは、若干疎水性で、試料と相互に作用するかもしれない。電気浸透流及び試料−壁相互作用は低減させることができるため、pHEAの親水性が壁コーティングを良好にする。
絡み合いポリマー溶液によるDNA分離は、上述した2つのメカニズムを経由して進行すると考えられる。小さなDNA断片がオグストンふるい分けによってポリマーネットワークを通してふるいにかけられる傾向があり、一方、DNAレプテーションはより大きな断片に対する分離メカニズムである。レプテーションは、より高解像度分離を提供し、高性能シーケンシングのための望ましいメカニズムに違いない。これにより、高濃度でのより小さなメッシュサイズが、レプテーションメカニズム開始点をより小さなDNAサイズにシフトさせるため、より小さなDNAサイズをシーケンスするためになぜ高濃度を必要とするかを説明することができる。類似の理由により、低濃度がより長い読み取りのためになぜ必要とされるかについて説明することができる。メカニズムが、配向レプテーションにシフトするため、マトリックスにおける全ての分解能が失われる。この移行はメッシュサイズ(Eq8参照)に依存するため、DNAは、より高いポリマー濃度のためにより小さいサイズで配向する傾向がある。
3%のpDMAマトリックスは、2つのより高い濃度よりもさらに拡大した移動度のプロットについて線形領域を示し、それでも、このマトリックスに対する読み取り長は、通常、非常に低い。この1つの理由は、より高いポリマー濃度が上述したように小さいDNAサイズのより良好な分離に必要とされるからである。より大きなDNAサイズに対する分離パフォーマンスに影響するもう1つの要因は、ポリマーネットワークの絡み合いの強さである。通常、所定の分子量で、ポリマー濃度が増大し、鎖がより絡み合うため、絡み合いネットワークの強度が増大し、よって、より大きなDNAサイズをシーケンスするためにメッシュサイズをより大きくする必要がある場合、より高いモル質量ポリマーがより有効である。また、絡み合い強度は、個々の鎖のコイルサイズにも影響を受ける。pDMA鎖は、一般に、LPAのようなより親水性ポリマーより小さいコイルサイズを有する。
マイクロチャネル電気泳動のために、以下の非限定的な実施例及びデータは、疎水性分離マトリックスポリマー成分及び親水性壁コーティングポリマー成分の使用を含む、本発明の組成物、システム、方法及び/又は装置に関連する種々の観点及び特長を示す。先行技術との比較において、本発明の組成物、方法、システム及び/又は装置は、意外で、予想外で、対照的な結果及びデータを提供する。発明の有用性は、ここで用いることができるいくつかのポリマー成分、組成物及び装置の使用によって示される一方、匹敵する結果が、種々の他のポリマー成分、組成物及び装置でえることができる当業者によって理解され、それは本発明の範囲に相当するようである。
PDMA合成
高分子量pDMA分離マトリックスポリマーを、モノマーN,N−ジメチルアクリルアミド(99+%純度でMonomer-Polymer & Dajac Labs (Feasterville, PA USA)から購入)から合成した。DI水中の4重量%モノマー溶液を、47℃に設定された水浴中で、30分間N2流で脱気し、続いて、V−50(2,2’−アゾビス(2−アミジノプロパン)二塩化水素(和光純薬、リッチモンド、VA、US)で開始した。16時間後、粘稠ポリマー溶液を、10日間、頻繁な水交換で透析した100000MWカットオフ透析膜に移した。透析後、サンプルを凍結乾燥し、1MDaを超えるモル質量で、固体pDMAポリマーを回収した。本発明の種々の他のマトリックスポリマー及び共重合体は市販であるか、上述したように、対応するモノマーから又は本発明を認識する当業者によく知られているようなその既知の合成技術もしくはそれらの改変を用いた類似の方法で製造することができる。
pHEA合成
壁−コーティングポリマー(pHEA)を合成するために、N−ヒドロキシエチルアクリルアミドモノマーを、Cambrex(商品名:Duramide(登録商標)で販売)から45%溶液として購入した。モノマーの最終濃度が0.5wt%となるように、モノマー溶液の若干を100mL量に薄めた。モノマー溶液を、25℃に設定された水浴で、30分間、N2流で脱気した。脱気の後、反応を、10wt%アンモニウム過硫酸溶液(Amresco Inc、ソロン、OH、USA)の100μL及び10重量%のTEMED(Amresco)100μLを加えることによって開始した。16時間反応を進行させ、その後、ポリマー溶液を、10日間、頻繁な水交換で透析した100000MWカットオフ透析膜に移した。透析後、溶液を凍結乾燥し、1MDaを超えるモル質量で固体ポリマーを回収した。
ポリマー分子量の特徴付け
分子量分布を、タンデムゲル−浸透クロマトグラフィ−マルチ角度レーザー光散乱(GPC−MALLS)で測定した。希釈ポリマー溶液を、SB−806HQ、SB−804HQ、及びSB−802.5HQを直列につないだShodex OH Pakカラムを用いてGPC(ウォーターズ社、ミルフォード、MA、USA)において、最初に分別した。分別後、GPCからの廃水を、直接、DAWN DSPレーザー光度計に、次いで、Optilab DSP干渉計屈折計(両器具は、Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA USAから)に流す。特徴付けの間、100μLの希釈(1mg/mL)溶液(0.1MのNaCl、50mMのNa2HPO4及び200ppmのNaN3からなる移動相)を、器具に注入し、0.300mL/分で流す。GPC MALLSデータを、Wyatt Technologiesから得たASTRAソフトウェアを使用して処理した。合成したポリマーを、モル質量、回転半径及び多分散係数によって全て特徴付けした。
pHEAコーティングの適用
Albarghouthiらによって示されたプロトコルに従って、マイクロチャネルを、最初に1MのHCl溶液で充填し、15分間放置した。1MのHCl溶液の除去後、チャンネルを脱イオン水で洗浄し、次いで、pHEAコーティング溶液で充填し、15分間放置した。pHEAコーティング溶液は、脱イオン水中のポリマー0.1%w/vの水溶液である。コーティングは、1×10-5cm2/Vsより小さい電気浸透流を与える経路をもたらす。
マイクロチャネル/マイクロチップ電気泳動
ssM13mp18シーケンシング断片及びssDNA ET−900ラダー(双方、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ USA)の分析を、ACLARA Biosciences(マウンテンビュー、CA、USA)によって、この研究所のための特注のマイクロチャネル電気泳動システムにおいて行った。このシステムは、レーザーによって誘導された蛍光(LIF)によって、感光性多色検出を可能にする。そのシステムは、2つのサブシステムから構成され、電気システムはマイクロ流体装置に電圧を供給し、光学サブシステムは、チャンネル内のポイントに収束させたレーザーを通すことにより、蛍光分子の検出を可能にする。これら2つのサブシステムは、いずれも、LabViewソフトウェアで書き込まれた単一のプログラムを使用してコントロールすることができる。
電気システムを、4つの電極の独立した制御を可能にする高圧電源で作動させる。各電極は、0〜4.5kVの間に設定することができるか、回路から切断することができる(「浮遊」)。ソフトウェアによって、ユーザーは、設定された時間の間、全4つの電極の電圧を、所望の電圧設定ポイントに設定することができ、複数の電圧及び時間ステップを、複雑なチップ機能又は種々の分離方法のために、順番に使うことができる。光学サブシステムは、蛍光体がJDS Uniphase Series 221430sl single-line, 488nmアルゴンイオンレーザ(San Jose, CA USA)によって励起される共焦、落射蛍光からなる。ミラーは、反転TE200、落射蛍光顕微鏡にレーザービームを導くために用いられる。光線を、次いで、帯域フィルターに通し、二色性のミラーで反射され、ニコン10x/0.45顕微鏡対物レンズによって、直径約10μmのレーザスポットを生じるマイクロ流体チャネルの中央に集束させる。放出された蛍光を、同じ対物レンズによって集束し、二色性ミラー、その後1秒、広帯域フィルター(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)に通過させる。フィルターに通された光のスペクトルは、透過格子によってそれを指向し、高量子効率に集束させることによって測定し、532×64ピクセルの電荷結合素子(CCD)を−15℃に冷却する(浜松社、Brigewater、NJ USA)。ピクセルビンニングを、特定の範囲にわたる放出強度を定量化するためにCCDカメラからのデータに適用し、溶媒のラマン散乱ラインによって較正する。データ収集は、10〜50Hzの範囲で達成することができる。CCD出力を収集し、ビンニングし、低パスフィルタリングし、LabViewに書き込まれたプログラムを用いて保存した。
実験を、Micronit Microfluidics BV(Enschede、オランダ)から購入した、7.5cm有効分離距離を有する単一チャネルガラスマイクロチップを用いて行った。チャンネルを、最初に15分間、1MのHClですすぎ、続いて0.1%(w/v)のポリマー溶液を15分間充填することによって、pDMA又はpHEAのいずれかで被覆した。ssDNAの分離及びシーケンシングを、7Mの尿素、Pop−5(登録商標)マトリックス(Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA USA) 及びベックマンLongRead(登録商標)LPAマトリクス(Amersham)を含むTTEバッファ(50mMのトリス、50mMのTAPS及び2mMのEDTA)中、3〜5%(w/v)の範囲の濃度で、pDMA(Mw=3.4MDa)及びLPA(Mw=2.5MDa)マトリックスで行った。各操作のために、235V/cmの電界を、サンプル注入前に60秒に印加する。また、混合モル質量pDMAマトリックスを、1%又は2%の低モル質量pDMA及び3%〜4%の高モル質量pDMAで配合した。100μmオフセットでオフセットTインジェクターを用いて、サンプルを100V/cmで40秒間注入した。分離を、サンプル及びサンプル廃棄用ウェルに、38V/cmのバックバイアスを印加して、235V/cmで行った。チップを、操作中、50℃に維持した。ベースコールを、NNIM Basecaller (NNIM, LLC, SaltLake County, UT USA)及びSequencher v 4.0.5(Gene Codes Corp., AnnArbor, MI USA)を用いて完了した。そのようなpDMAマトリックスは、6〜7分間で、約500〜約600塩基のシーケンシング読み取り長をもたらし、一方、市販のマトリックスは、約400塩基以上のシーケンシングをしない。
レオロジー
ゼロ−剪断粘度を、デジタル制御された再循環水浴(Julabo USA Inc., Allentown, PA, USA)に接続されたペルティエコントローラで温度を維持することにより、温度を維持しながら、Anton Paar Physica MCR 300 (Ashland, VA, USA)を用いて測定した。制御された剪断応力及び剪断率掃引を、25〜50℃の温度範囲にわたって、コーン−プレート(モデルCP50−1)装備及びダブルギャップクエット(モデルDG26.7)装備で実行した。ゼロ−剪断粘度対ポリマー濃度曲線を、この器具を用いて創出した(図2参照)。
画像顕微鏡法
DNAを、YOYO−1(Molecular Probes, Eugene, OR USA)で蛍光標識した。すべてのタンパク質及び糖試薬を、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA USA)から購入し、48kbpのdsλDNAを、インビトロゲン(San Diego, CA USA)から購入し、ベタメルカプトエタノール(BME)を、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USAから購入した。標識方法では、dsDNAの5〜10の塩基対につき約1つの標識を行った。蛍光標識したDNAを観察するために、着色溶液を、溶媒化するために24時間混合しておいた、カタラーゼ保存液、グルコースオキシダーゼ保存液、BME、20%のグルコースバッファ及びポリマー溶液に混合した。一晩穏やかに混合した後、ポリマー/DNA溶液を、画像化するために準備した。
DNAを画像化するために用いたハイブリッドチップを、Sylgard 184のポリ(ジメチルシロキサン)(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA USA)マイクロチャネル及び1.5の厚いガラスカバースリップ(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA USA)で構成した。PDMAチャネルを、プレポリマー:硬化剤を10:1の重量比で混合することにより形成した。脱気したScotch Magic Tape(登録商標)の幅狭ストライプ上に注ぎ、一晩真空チャンバで硬化させた。硬化したPDMAを0.5cm長の正方形に切断し、カバースリップに取り付けた。得られたチャネルは、約50〜60ミクロンの深さであった。
DNAマイグレーションを、ミシガン大学(Albarghouthi, M. N., Stein, T. M. & Barron, A. E. (2003) Electrophoresis 24: 1166-1175; de Carmejane, O., Yamaguchi, Y., Todorov, T. I.& Morris, M. D. (2001) Electrophoresis 22: 2433-2441)のモリス研究室をモデルする自家製システムを用いて視覚化した。画像処理システムは、ニコンCFI 100x/N.A.1.4油浸入顕微鏡対物レンズを装備したニコンTE200(Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA)反転落射蛍光顕微鏡からなる。DNA蛍光を、青色光励起フィルターキューブ(460nm〜500nm)(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)で、順次熱吸収フィルターによって集束した100ワットの水銀灯光源を使って行った。DNAから放出された蛍光を、0.5インチのCCD(510nmのロングパスフィルタ(Chroma Technology, Brattleboro, VT USA)及びVS4 1845 Generation 3イメージ増倍管(Videoscope International, Dulles, VA USA)によるTM 6710 CLカメラ(JAI Pulnix, Sunnyvale, CA USA)で収集した。高速度カメラは、648×484ピクセルの全空間分解能で、120フレーム/秒が可能な可調フレーム速度を有する。全ての画像を、XCAP−STD(EPIX INC, Buffalo Grove, IL USA)ソフトウェアを利用するPIXCI制御盤(EPIX INC., Buffalo Grove, IL USA)によって、直接コンピュータに30フレーム/秒で取り込んだ。電気泳動電圧を、Micronitから購入した高電圧電源を用いて行った。ポリマーマトリックス中をマイグレートする単一のDNA分子を、この技術を用いて画像化することができる。
ダイナミックpHEAポリマーでプレコートしたマイクロチャネルを使って、4%(w/v)のポリ(N−メトキシエチルアクリルアミド)(pNMEA)ポリマー溶液を、シーケンシングマトリクスとしてチャネルに充填した。7.5cm長の分離チャネルにおいて、温度を50℃、電界を235V/cmに設定した場合、540塩基のDNAシーケンシング読み取り長が、約6.5分間で98.5%の精度で達成することができる。ベースコールを、NNIM ベースコーラ及びシーケンサー4.0.5版によって実行した(シーケンシング電気泳動図は図示せず)。
マイクロチップでのシーケンシングDNAに加えて、本発明のポリマーシステム(例えば、pDMAマトリックス及びpHEAダイナミックコーティング)は、ABI 3100市販装置にて、22cmキャピラリで用いる。全てのシーケンシング操作は、50℃の温度、250V/cmの電界で行った。市販のPOP(登録商標)−6マトリクスに対して、生のシーケンシングデータは、4%の混合モル質量のpDMA(1%の低モル質量及び3%の高モル質量)が迅速にシーケンスできることを示す。そのようなpDMAマトリックス分離は、より迅速なシーケンシングがキャピラリ器具で可能であることを示すPOP(登録商標)−6マトリックスでよりも3倍速い。シーケンシング結果を表4に示す。4%混合モル質量pDMA及びPOP(登録商標)−6(双方とも4%pHEA被覆キャピラリ)を比較している。分離は、混合モル質量pDMAで非常に速い。このマトリックスは、約22分間で650の塩基をシーケンシングした。ベースコールは、NN1Mベースコーラ及びシーケンサー4.0.5版を使って完了させた(4%混合モル質量でのシーケンシング気泳動図は図示せず)。
Claims (35)
- 式 −[CH2C(R)C(O)NR’R”]n−
(式中、RはH及びメチルから選択され、R’及びR”は独立してC1〜約C8の直鎖アルキル基、C1〜約C8のアルコキシ置換直鎖アルキル基、C1〜約C8の分岐アルキル基及びC1〜約C8のアルコキシ置換分岐アルキル基及びそれらのコポリマーから選択される)
のポリアクリルアミドを含む疎水性分離マトリクス成分と
ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)を含む親水性壁コーティング成分とを含有し、
前記ポリアクリルアミドは少なくとも部分的に水溶性である、マイクロチャネル電気泳動用DNAシーケンシング又はゲノタイピング組成物。 - マトリクス成分は、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)及びポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)コポリマーから選択される請求項1の組成物。
- マトリクス成分は、水性媒体中に約3%(w/v)〜約5%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含む請求項2の組成物。
- マトリクス成分は、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含む請求項3の組成物。
- マトリクス成分は、約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含む請求項3の組成物。
- ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)成分を含む疎水性分離マトリクス成分と、ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)成分を含む壁コーティング成分とを含有するシーケンシング組成物。
- マトリクス成分は、水性媒体中に約3%(w/v)〜約5%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含む請求項6の組成物。
- マトリクス成分は、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)及び約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含む請求項7の組成物。
- ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)を含む疎水性分離マトリクス成分と、
ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)を含む親水性壁コーティング成分と、
内径が約10ミクロン〜約150ミクロンのマイクロ寸法のキャピラリ及び約10ミクロン〜約150ミクロンの範囲のマイクロチャネルを有するマイクロ流体電気泳動チップから選択されるマイクロチャネル基体とを含んでなるDNA及びRNA分離用マイクロチャネル電気泳動システム。 - マトリクス成分は、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)と、約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)とを含む請求項9のシステム。
- ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)が基体と接触してなる請求項10のシステム。
- 約3%(w/v)から約5%(w/v)のシステムを含むポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)と、ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)成分とを含むシステムを準備し、
マイクロチャネル電気泳動キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を前記システムに導入し、及び
DNAシーケンシング反応生成物成分及びRNA成分から選択される混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で、前記システムに接触させることを含む電気泳動DNA及びRNA分離用ポリマー壁コーティング及び分離マトリクスシステムの使用方法。 - マトリクス成分は、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)と、約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)とを含む請求項12の方法。
- ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)が基体と接触してなる請求項13の方法。
- ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)は水性媒体中に存在する請求項14の方法。
- システムは、DNAシーケンシングバッファを含み、前記混合物は、DNA分子を含む請求項12の方法。
- 一本鎖DNAを分離し、前記DNA配列成分の一つは、約800までの塩基を含み、前記分離は、時間とマイクロチャネル長の機能である請求項16の方法。
- マイクロ寸法のキャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体と、
その上のポリマーシステムとを含み、
前記システムは、該システムの約3%(w/v)〜約5%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)成分と、ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)とを含むマイクロチャネル電気泳動装置。 - マトリクス成分は、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)と、約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)とを含む請求項18の装置。
- ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)が基体に適用されてなる請求項18の装置。
- マイクロ寸法キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を準備し、
親水性ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)壁コーティング成分を基体に結合させ、
疎水性ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)マトリクス成分を基体に導入し、該マトリクス成分は少なくとも部分的に可溶性であり、
DNAシーケンシング成分及びマトリクス成分の混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で接触させ、前記ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)の分子量及び濃度は、少なくとも、前記混合物中でDNA成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションに少なくとも部分的に十分である、
DNA分離速度を早めるためのポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)の使用方法。 - 分離は、一時的な絡み合い結合及びレプテーションの組み合わせである請求項21の方法。
- DNA成分は、マイグレーション時間の約50%の一時的な絡み合い結合によって及びそのようなマイグレーション時間の約50%のレプテーションによってマイグレートする請求項22の方法。
- DNAマイグレーションダイナミックスを、蛍光染色されたDNA分子の落射蛍光画像顕微鏡によってモニターする請求項22の方法。
- マトリクスは、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)と、約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチアクリルアミド)とを含む請求項22の方法。
- マイグレーションは、DNA電気泳動移動度対マトリクスにわたるDNA分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴付けられ、分子サイズは塩基及び塩基対の1つにおけるものである請求項25の方法。
- DNA分子サイズは、約200塩基〜約800塩基の範囲であり、前記プロットの線形領域は、約−0.40〜−0.60の傾きを有する請求項26の方法。
- マイクロチャネル電気泳動キャピラリ及びマイクロ流体電気泳動チップから選択される基体を準備し、
親水性ポリ(N−ヒドロキシエチルアクリルアミド)壁コーティング成分を基体に結合させ、
疎水性分離マトリクス成分を基体に導入し、該マトリクス成分は請求項1のポリアクリルアミド、それらのコポリマー、ポリアクリルアミドの組み合わせ、コポリマーの組み合わせ及びポリアクリルアミドといずれかの前記コポリマーとの組み合わせから選択され、該マトリクス成分は、少なくとも部分的に可溶性であり、
DNAシーケンシング成分及びマトリクス成分の混合物を、前記混合物の電気泳動分離のために少なくとも部分的に十分な印加電圧及び時間で接触させ、前記ポリアクリルアミドの分子量及び濃度は、少なくとも、前記混合物中でDNA成分の一時的な絡み合い結合及びレプテーションに少なくとも部分的に十分である、
DNA分離速度を早めるための疎水性ポリマーの使用方法。 - 分離は、一時的な絡み合い結合及びラプテーションの組み合わせである請求項28の方法。
- DNA成分は、マイグレーション時間の約50%の一時的な絡み合い結合によって及びそのようなマイグレーション時間の約50%のレプテーションによってマイグレートする請求項29の方法。
- DNAマイグレーションダイナミックスを、蛍光染色されたDNA分子の落射蛍光画像顕微鏡によってモニターする請求項29の方法。
- マトリクス成分は、ポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)及びそれらのコポリマーから選択される請求項28の方法。
- マトリクスは、約3〜約5MDaの範囲の重量平均モル質量の約3%(w/v)のポリ(N,N−ジメチルアクリルアミド)と、約200〜約300kDaの範囲の重量平均モル質量の約1%(w/v)〜約2%のポリ(N,N−ジメチアクリルアミド)とを含む請求項31の方法。
- マイグレーションは、DNA電気泳動移動度対マトリクスにわたるDNA分子サイズのログ−ログプロットの線形領域によって特徴付けられ、前記分子サイズは、塩基及び塩基対の1つにおけるものである請求項33の方法。
- DNA分子サイズは、約200塩基〜約800塩基の範囲であり、前記プロットの線形領域は、約−0.40〜−0.60の傾きを有する請求項34の方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013179337A1 (ja) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | 株式会社 日立製作所 | 焼結磁石及びその製造方法 |
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Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8038907B2 (en) * | 2005-06-28 | 2011-10-18 | The Ohio State University Research Foundation | Aligned nanostructured polymers |
US20090130746A1 (en) * | 2007-10-25 | 2009-05-21 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microchannel surface coating |
US8871524B2 (en) * | 2009-08-12 | 2014-10-28 | Caliper Life Sciences, Inc. | Methods of performing a sizing analysis using a corrected sizing ladder |
CN102276853B (zh) * | 2011-05-05 | 2013-03-27 | 公安部物证鉴定中心 | 一种具备毛细管自涂敷作用的共混共聚物凝胶及其制备方法 |
CN102274690B (zh) * | 2011-05-05 | 2014-07-02 | 公安部物证鉴定中心 | 一种毛细管电泳缓冲液及其制备方法 |
CN102276852B (zh) * | 2011-05-05 | 2013-08-21 | 公安部物证鉴定中心 | 一种毛细管动态包被聚合物凝胶及其制备方法 |
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003507543A (ja) * | 1999-08-21 | 2003-02-25 | キアリ,マルチェッラ | ダイナミックコーティング |
JP2003523499A (ja) * | 1999-01-12 | 2003-08-05 | スペクトラメディックス コーポレイション | キャピラリーゲル電気泳動のためのコポリマー |
WO2003076922A1 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-18 | Symyx Technologies, Inc. | Copolymers for use in capillary electrophoretic separation media |
JP2004505275A (ja) * | 2000-08-02 | 2004-02-19 | カリパー・テクノロジーズ・コープ. | 高スループット分離に基づく分析システム |
WO2004104054A1 (en) * | 2003-05-15 | 2004-12-02 | Applera Corporation | Poly and copoly (n-vinylamide)s and their use in capillary electrophoresis |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2246127B (en) * | 1990-04-20 | 1994-06-08 | Branko Kozulic | Improvements in or relating to acrylic monomers |
ATE323113T1 (de) * | 1999-07-02 | 2006-04-15 | Symyx Technologies Inc | Polymerverzweigungen zur immobilisierung von molekülen auf oberflächen oder substraten, wobei die polymere wasserlösliche oder wasserdispergierbare segmente und sonden aufweisen |
US6414136B1 (en) * | 1999-10-06 | 2002-07-02 | Prolinx, Inc. | Removal of dye-labeled dideoxy terminators from DNA sequencing reactions |
US6787016B2 (en) * | 2000-05-01 | 2004-09-07 | Aclara Biosciences, Inc. | Dynamic coating with linear polymer mixture for electrophoresis |
US20030087290A1 (en) * | 2002-01-14 | 2003-05-08 | Tarlov Michael J. | Bio-affinity porous matrix in microfluidic channels |
IL164366A0 (en) * | 2002-04-03 | 2005-12-18 | Mitsubishi Rayon Co | Biological substance-immobilized gel and microarray using the same |
US7007710B2 (en) * | 2003-04-21 | 2006-03-07 | Predicant Biosciences, Inc. | Microfluidic devices and methods |
US20060108225A1 (en) * | 2004-11-19 | 2006-05-25 | Stephen Carson | High conductivity sieving matrices for high resolution biomolecule separations |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003523499A (ja) * | 1999-01-12 | 2003-08-05 | スペクトラメディックス コーポレイション | キャピラリーゲル電気泳動のためのコポリマー |
JP2003507543A (ja) * | 1999-08-21 | 2003-02-25 | キアリ,マルチェッラ | ダイナミックコーティング |
JP2004505275A (ja) * | 2000-08-02 | 2004-02-19 | カリパー・テクノロジーズ・コープ. | 高スループット分離に基づく分析システム |
WO2003076922A1 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-18 | Symyx Technologies, Inc. | Copolymers for use in capillary electrophoretic separation media |
WO2004104054A1 (en) * | 2003-05-15 | 2004-12-02 | Applera Corporation | Poly and copoly (n-vinylamide)s and their use in capillary electrophoresis |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6011033615; Methal N. Albarghouthi(外4名): 'Poly-N-hydoroxyethylacrylamide(polyDuramide): A novel, hydrophilic, self-coating polymer matrix for' Electrophoresis Vol. 23, No. 10, 200205, p. 1429-1440 * |
JPN6011033617; Methal N. Albarghouthi(外2名): 'Poly-N-hydroxyethylacrylamide as a novel, adsorbed coating for protein separation by capillary elect' Electrophoresis Vol. 24, No. 7-8, 200304, p. 1166-1175 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013179337A1 (ja) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | 株式会社 日立製作所 | 焼結磁石及びその製造方法 |
WO2013186864A1 (ja) | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 株式会社 日立製作所 | 焼結磁石及びその製造方法 |
JP2015078978A (ja) * | 2013-09-11 | 2015-04-23 | 株式会社分光科学研究所 | 計測方法及び計測装置 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
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