JP2021121668A - ポリマー粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
乳化重合は、50〜1,000 nmの比較的単分散のポリマー粒子を形成するために使用することができる。しかしながら、単分散ポリマー粒子の形成は、多数の重要な制限を有する。第一に、全ての粒子が、同じバッチの一部として、かつ、重合時間と比べて短いタイムスパン内で、形成されなければならない。第二に、ポリマー粒子の成長が全ての粒子において同一であることを保証するために、成長条件が制御される必要がある。第三に、このプロセスは、モノマーが、大きなリザーバー液滴から移され、成長する粒子へと膨潤されることを必要とするため、粒子は架橋されていないかまたは非常に低い架橋レベルを有する(何故ならば、より高い架橋レベルは粒子膨潤を妨げるためである)。
本発明は、一部分において、親水性オリゴマーを含むシード粒子が、架橋単分散ポリマー粒子を形成するための新規のプロセスにおいて使用され得るという認識に基づく。
本明細書の説明および特許請求の範囲に全体にわたって、単語「含む」および「含有する」ならびにそれらの変形物は、「含むがこれらに限定されない」を意味し、それらは、他の部分、添加剤、コンポーネント、整数またはステップを除外するようには意図されない(かつ除外しない)。本明細書の説明および特許請求の範囲に全体にわたって、単数形は、文脈が特に要求しない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈が特に要求しない限り、本明細書は単数形と同様に複数形も意図すると理解される。
によって定義され、式中、Miは特定の鎖の分子量であり、Niはその分子量の鎖の数である。Mwは、指定の溶離剤溶媒系を用いて、一連の標準ポリマーと比べてのゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を使用して測定され得る。例えば、シード粒子中のオリゴマーまたはポリマーのMwは、0.01 M LiBrを含むDMFを溶離剤として使用して、ポリスチレン標準と比べてのGPCによって測定され得る。
本発明は、粒子がポリマーかつ単分散である態様を含む。本発明は、粒子が多孔性である態様を含む。
であり得、式中、
R1は、-H、-CH3または-CH2CH3であり;
R2は、-OR3または-N(R4)R5であり;
R3は、-H、-C1〜C6アルキル、または-C1〜C6アルコールであり;かつ
R4およびR5は、-H、-C1〜C6アルキル、-C1〜C6ハロアルキル、-C1〜C6アルコールより各々独立して選択される。
であり得、式中、R6は、-C1〜C6アルキル-、-C1〜C6ヘテロアルキル-、-C1〜C6シクロアルキル-、-C1〜C6ヒドロキシアルキル-、-C1〜C6エーテル-、2〜100個のC2〜C3エーテル単位を含むポリエーテルより選択され;
R7およびR8は、-H、-C1〜C6アルキル、-C1〜C6ヘテロアルキル、-C3〜C6シクロアルキル、-C1〜C6ヒドロキシアルキル、または-C1〜C6エーテルより各々独立して選択され;
R9は、-N(R11)C(O)CH=CH2であり;
R10は、-Hおよび-N(R12)C(O)CH=CH2より選択され;かつ
R11およびR12は、-H、-C1〜C6アルキル、-C1〜C6ヘテロアルキル、-C3〜C6シクロアルキル、-C1〜C6ヒドロキシアルキル、または-C1〜C6エーテルより各々独立して選択される。
ポリマー粒子は、特定のシード粒子から出発して、ポリマー粒子形成プロセスによって調製され得る。本出願人は、他のプロセスにおいて典型的に使用されるシード粒子、例えば、ポリスチレンシード粒子は、本発明のプロセスと適合性でないと同定した。従って、本発明は、本発明のポリマー粒子形成プロセスにおける使用に適しているシード粒子を提供する。
ポリマー粒子は、特定のシード粒子から出発して、本明細書に記載されるようなプロセスによって調製され得る。従って、本発明は、単分散シード粒子を調製する方法を提供する。
本発明は、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する方法を提供する。Ugelstadプロセスは、そのような粒子を直接形成するために使用することができず、例えば、何故ならば、Ugelstadプロセスには、粒子が水中油型エマルジョンの油相中で形成されることが必要とされ、一方、ヒドロゲルポリマー粒子および対応の親水性モノマーは優先的に水中に可溶性であるためである。本出願人は、油(連続相)中水(不連続相)型システムを使用する粒子形成プロセスを提供する、本開示の方法を提供することによって、これに取り組んだ。これは、単分散架橋ポリマー粒子を形成するために使用された最初のプロセスを示すと考えられる。
粒子は、多くの適用、例えば、ポリヌクレオチド配列決定、ポリヌクレオチド配列決定、情報保存、カラーイメージング、バイオプロセシング、診断微生物学、バイオセンサーおよび薬物送達において使用することができる。
(a)第1初期化オリゴヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズさせ、プローブ-標的二本鎖を形成させる工程であって、オリゴヌクレオチドプローブが伸長可能なプローブ末端を有し、標的ポリヌクレオチドがポリマー粒子(これは、本明細書に開示されるようなポリマー粒子の集団のメンバーである)へ結合されており、粒子が固体支持体の表面へ共有結合によって結合されている、工程;
(b)伸長オリゴヌクレオチドプローブの第1末端を伸長可能なプローブ末端へライゲートし、それによって、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する伸長された二本鎖を形成する工程であって、伸長オリゴヌクレオチドプローブが切断部位および検出可能標識を含む、工程;
(c)今しがたライゲートされた伸長オリゴヌクレオチドプローブへ結合された標識を検出することによって、標的ポリヌクレオチド中の1つまたは複数のヌクレオチドを同定する工程;
(d)今しがたライゲートされた伸長オリゴヌクレオチドプローブを切断部位で切断し、伸長可能なプローブ末端を生じさせる工程であって、切断が、標識を含む今しがたライゲートされた伸長オリゴヌクレオチドプローブの部分をプローブ-標的二本鎖から除去する、工程;ならびに
(e)標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列が決定されるまで、ステップ(b)、(c)および(d)を繰り返す工程。
(a)プライマーを標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズさせ、プライマー-標的二本鎖を形成する工程であって、標的ポリヌクレオチドがポリマー粒子(これは、本明細書に開示されるようなポリマー粒子の集団のメンバーである)へ5'末端で結合されており、ポリマー粒子が支持体の表面へ共有結合によって結合されている、工程;
(b)プライマー-標的二本鎖とポリメラーゼおよび1つまたは複数の異なるヌクレオチドアナログとを接触させ、ヌクレオチドアナログをプライマーの3'末端上へ組み込み、それによって、伸長されたプライマー鎖を形成する工程であって、組み込まれたヌクレオチドアナログは、ポリメラーゼ反応を終結させ、1つまたは複数のヌクレオチドアナログの各々が、(i)アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルならびにそれらのアナログからなる群より選択される塩基;(ii)切断可能なリンカーを介して塩基またはそのアナログへ結合されたユニークな標識;(iii)デオキシリボース;ならびに(iv)デオキシリボースの3'位の-OH基をキャップする切断可能な化学基を含む、工程;
(c)支持体の表面を洗浄し、あらゆる組み込まれていないヌクレオチドアナログを除去する工程;
(d)今しがた組み込まれたヌクレオチドアナログへ結合されたユニークな標識を検出し、それによって、今しがた組み込まれたヌクレオチドアナログを同定する工程;
(e)任意で、伸長されたプライマー鎖上のあらゆる未反応-OH基を永久にキャップする工程;
(f)今しがた組み込まれたヌクレオチドアナログとユニークな標識との間の切断可能なリンカーを切断する工程;
(g)今しがた組み込まれたヌクレオチドアナログのデオキシリボースの3'位の-OH基をキャップする化学基切断し、-OH基をアンキャップする工程;
(h)支持体の表面を洗浄し、切断された化合物を除去する工程;
(i)ステップ(b)〜(h)を繰り返す工程。
i)少なくともその一部分が、コンジュゲートされた物質(例えば、今しがた記載されたようなもの)へカップリングされている、本開示の粒子の集団を含む、コンジュゲート
ii)物質(例えば、今しがた記載されたようなもの)へ本開示の粒子の集団の少なくとも一部分をカップリングする工程を含む、方法
iii)サブストレートへ本開示の粒子の集団の少なくとも一部分をカップリングする工程を含む、方法。
分子量測定
シード粒子中のオリゴマーの重量平均分子量(Mw)は、ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を使用して行われる測定から決定することができる。GPCにおいて、一連のポリマー粒子標準を実行し、較正曲線を作成するために使用する。オリゴマーのMwは、0.01 M LiBrを含むDMFを溶離剤として使用して、ポリスチレン標準と比べてのGPCによって測定され得る。これらのMw値は、シード粒子のそれとは異なるポリマーの標準(ポリスチレン)に対して計算されるため、計算されたMwは、絶対値ではなく相対値を示す。従って、測定は、再現可能であるが、実際のMwを提供しない。
溶離剤:0.01 M LiBrを含むDMF
プレカラム:PSS GRAM, 10μm, Guard ID 8.0 mm x 50 mm
カラム:PSS GRAM, 10μm, Linear M ID 8.0 mm x 300 mm PSS GRAM, 10μm, Linear M ID 8.0 mm x 300 mm
温度:70℃
ポンプ:PSS SECcurity 1260 HPLCポンプ
流速:1.0 mL/分
注入システム:PSS SECcurity 1260オートサンプラー
注入体積:50μL
サンプル濃度:3.0 g/L
検出器:PSS SECcurity 1260屈折率検出器(RID)
クロマトグラフィーデータシステム:PSS WinGPC UniChrom Version 8.2
異なる分子量を有するポリスチレン標準を上記実験条件下で測定し、較正曲線を得た。次いで、サンプルを実行した。次いで、PS較正曲線に基づいて、サンプルについてMwを計算した。
サンプルのサイズ分布は、ディスク遠心分離を使用して、例えば、機器製造業者によって提供されるプロトコルを使用して、ディスク遠心分離機モデルDC20000におけるCPSディスク遠心分離(商標)を使用して、測定することができる。正確な結果は、分析されるサンプルと同様の密度の標準での較正を必要とし、従って、適切なポリマー標準、例えば、主にポリスチレンを含む本開示の粒子についての一連のコンパクトポリスチレン粒子標準が入手可能である場合にのみ、有用である。測定されるサンプルが、例えば多孔性粒子について、既知でない密度を有する場合、CPSディスク遠心分離によって得られた測定は、再現可能であるが、実際の直径を提供しない。
実施例1
メカニカルブレードスターラーおよび冷却器を備えた250 mL三口丸底フラスコに、5.0 gの蒸留N,N-ジメチルアクリルアミド、4.0 gのKraton G1650、0.20 gの2,2′-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、108.0 gのヘプタン、27.1 gのトルエン、および0.21 mLの1-オクタンチオールを入れた。いったん全てが溶解したら、反応混合物をAr (g)で10分間パージした。次いで、油浴を使用して反応物を70℃へ加熱し、400 rpmで撹拌しながら8時間加熱した。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、521 nmのz平均直径が得られた。
メカニカルブレードスターラーおよび冷却器を備えた500 mL三口丸底フラスコに、10.1 gの蒸留N,N-ジメチルアクリルアミド、8.0 gのKraton G1650、0.40 gの2,2′-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、216.0 gのヘプタン、54.1 gのトルエン、および0.85 mLの1-オクタンチオールを入れた。いったん全てが溶解したら、反応混合物をAr (g)で10分間パージした。次いで、油浴を使用して反応物を70℃へ加熱し、360 rpmで撹拌しながら8時間加熱した。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、733 nmのz平均直径が得られた。分散液中に存在する粒子をさらにGPCによって分析し、8,410のMwが得られた。
メカニカルアンカースターラーおよび冷却器を備えた2 Lジャケット付丸底フラスコに、36.6 gの蒸留N,N-ジメチルアクリルアミド、27.7 gのKraton G1650、1.4 gの2,2′-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、747.2 gのヘプタン、186.9 gのトルエン、および2.56 gの1-オクタンチオールを入れた。いったん全てが溶解したら、反応混合物をAr (g)で30分間パージした。次いで、反応物を、リアクターへ接続された温度制御水浴を使用して71℃へ加熱し、350 rpmで撹拌しながら15時間加熱した。最初の2.5時間の加熱の間、低フローのAr (g)を維持した。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、1035 nmのz平均直径が得られた。分散液中に存在する粒子をさらにGPCによって分析し、10,300のMwが得られた。
方法を実施例1の通りに行い、但し、反応混合物を加熱し、一晩350 rpmで撹拌した。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、387 nmのz平均直径が得られた。分散液中に存在する粒子をさらにGPCによって分析し、22,400のMwが得られた。
方法を実施例4の通りに行い、但し、1-オクタンチオールを添加せず、即ち、反応混合物は、1-オクタンチオールを含有しなかった。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、238 nmのz平均直径が得られた。分散液中に存在する粒子をさらにGPCによって分析し、403,000のMwが得られた。
方法を実施例4の通りに行った。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、358 nmのz平均直径が得られた。分散液中に存在する粒子をさらにGPCによって分析し、21,200のMwが得られた。
実施例7
0.8 wt%開始剤を使用してヘプタン/トルエン中で形成された100 mLバッチのミクロンサイズのアクリルアミド粒子。
0.5 wt%開始剤を使用してヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのアクリルアミド粒子。
代替の安定剤を使用してヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのアクリルアミド粒子。
高温での膨潤を使用して無極性溶媒中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのアクリルアミド粒子。
より高いアクリルアミドが含有量を使用してヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのアクリルアミド粒子。
Linpar 10-13中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのアクリルアミド粒子。
ヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのヒドロキシメチルアクリルアミド粒子。
ヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのTRISアクリルアミド粒子。
ヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのミクロンサイズのヒドロキシエチルメタクリレート粒子。
シード粒子の非存在下で、ヘプタン/トルエン中で形成された10 mLバッチのアクリルアミド生成物。
溶液1(モノマー相):撹拌子を備えた100 mL Duranフラスコに、0.9 gのN,N′-(1,2-ジヒドロキシエチレン)ビスアクリルアミド(DHEBA)および39 gのH2Oを入れた。混合物を、全てのDHEBAが溶解するまで、撹拌しながら約40℃へ加熱し、続いて4.4 gのアクリルアミド(AAm)を添加した。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り、但し、AAmをヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)へ変えた。
溶液1(モノマー相):撹拌子を備えた100 mL Duranフラスコに、0.95 gのN,N′-(1,2-ジヒドロキシエチレン)ビスアクリルアミド(DHEBA)および18 gのH2Oを入れた。混合物を、全てのDHEBAが溶解するまで撹拌しながら約40℃へ加熱し、続いて4.8 gのアクリルアミド(AAm)を添加した。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り、但し、AAmを2.5 g AAmおよび0.03 gの3-アクリルアミドプロピオン酸(AAmPA)へ変えた。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り、但し、AAmをN-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド(HEMAAm)で置き換えた。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り、但し、H2Oを、H2O中10%メタノールへ変えた。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り、但し、AAmをメタクリルアミド(MAAm)へ変えた。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り。
溶液1(モノマー相):実施例17における通り、但し、AAmをヒドロキシエチルアクリレート(HEA)と交換した。
実施例31
メカニカルアンカースターラーおよび冷却器を備えた2 Lジャケット付丸底フラスコに、34.6 gの蒸留N,N-ジメチルアクリルアミド、27.6 gのKraton G1650、1.5 gの2,2′-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、747.9 gのヘプタン、187.0 gのトルエン、および1.2 gの1-オクタンチオールを入れた。いったん全てが溶解したら、反応混合物をAr (g)で60分間パージした。次いで、反応物を、リアクターへ接続された温度制御水浴を使用して71℃へ加熱し、400 rpmで撹拌しながら16時間加熱した。結果として生じた分散液を動的光散乱によって分析し、360 nmのz平均直径が得られた。
実施例32
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、1.7 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、0.02 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、0.26 gのN,N′-(1,2-ジヒドロキシエチレン)ビスアクリルアミド(DHEBA)、および22.9 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):実施例32における通り。
実施例34
溶液1(モノマー相):500 mL Duranフラスコに、28.6 gのヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)、0.95 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、19.7 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および29.4 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):500 mL Duranフラスコに、27.0 gのヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)、2.6 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、19.7 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および49.3 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):500 mL Duranフラスコに、24.8 gのヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)、5.0 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、19.9 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および49.7 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、1.8 gのヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)、0.7 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、4.9 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および17.3 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、12.3 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および12.4 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、2.1 gのヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)、0.3 gのアクリル酸(AA)、4.9 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および17.3 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
実施例40
段階1:架橋剤の非存在下での粒子の膨潤および重合
溶液1(12 wt%ヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)ストック溶液):125 gのヒドロキシメチルアクリルアミドモノマー(48%溶液)および375 gのDI水を、透明な均質溶液が形成されるまで、混合した。
溶液5(第2安定剤溶液):溶液3と同じ。
段階1:架橋剤の非存在下での粒子の膨潤および重合
溶液1(24 wt%ヒドロキシメチルアクリルアミド(HMAAm)ストック溶液):25 gヒドロキシメチルアクリルアミドモノマー(48%溶液)および25 gのDI水を、透明な均質溶液が形成されるまで、混合する。
実施例40における通り、但し、50 wt% HMAAmストック溶液を使用した。
段階1:架橋剤の非存在下での粒子の膨潤および重合
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、16.0 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、0.3 gの1-チオグリセロール、および8.3 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液5(第2モノマー相):250 mL Duranフラスコに、7.1 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、2.4 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および14.2 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
段階1:架橋剤の非存在下での粒子の膨潤および重合
溶液1(モノマー相):実施例42における通り。
溶液5(第2モノマー相):250 mL Duranフラスコに、7.0 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、2.3 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、および14.1 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
実施例44
N,N-ビス(2-アクリルアミドエチル)アクリルアミド(BAAmEAAm)の合成。ジエチレントリアミン(14.63g; 142 mmol)を200 mLアセトニトリル中に溶解した。炭酸カリウム(64.68g; 468 mmol)を添加し、反応混合物を氷浴で0℃へ冷却した。塩化アクリロイル(36.3 mL, 447 mmol)をおよそ45分間にわたって滴下した。氷浴を除去し、反応物を周囲温度で2時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾過ケーキを200 mL CH2Cl2でリンスした。阻害剤(フェノチアジン、10.1 mg)を濾液へ添加し、その後、揮発性物質を25℃にて減圧下で除去した。粗製物質を、ジクロロメタン中メタノールの勾配を使用してシリカゲル上のドライフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有するフラクションをプールし、9.9 mgのフェノチアジンを添加し、その後、最後に、生成物を真空下で乾燥させた。収量12.97 g。
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、3.1 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、0.7 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、3.7 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、0.3 gのN,N-ビス(2-アクリルアミドエチル)アクリルアミド(BAAmEAAm)および17 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、3.0 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、0.7 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、3.7 gのN,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド(EGBEAAm)、0.2 gの4-アームPEG-アクリルアミドおよび17 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
溶液1(モノマー相):250 mL Duranフラスコに、1.8 gのヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAAm)、0.7 gのアクリルアミドプロピオン酸(AAPA)、2.5 gのN,N-ビス(2-アクリルアミドエチル)アクリルアミド(BAAmEAAm)および20 gのH2Oを入れた。全てが溶解するまで、混合物を振盪した。
実施例48
NMP中の実施例32の粒子の懸濁液7200μLへ、22.6 mgのO-(N-スクシンイミジル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TSTU)、27μLのトリブチルアミン、およびNMPを最終体積7.5 mLまで添加する。室温で1時間振盪後、懸濁液を15,000 rpmで50分間遠心分離する。結果として生じたペレットから上澄みを除去し、ペレットを4 mLの新鮮なNMP中へ再懸濁し、15,000 rpmで1時間遠心分離する。上澄みを、NHSエステル活性化ヒドロゲルから除去し、ペレットを得る。4 mL NMP洗浄/スピンをもう1回繰り返す。
実施例48の通り、但し、実施例33の粒子の懸濁液7300μLを使用した。
実施例50
5’-アミン末端化30merオリゴヌクレオチド(これは、各オリゴヌクレオチドリン酸基についてテトラブチルアンモニウム対イオンを有する)の5.17 mM NMP溶液の193.4μL分の量を、実施例48からのカルボキシレートNHSエステルヒドロゲルペレットへ添加する。この懸濁液をNMPで9.976 mLへ希釈する。NMP中42 mMトリブチルアミンの23.8マイクロリットルの添加後(総反応体積10 mL)、反応槽を66℃で16時間サーモミキサー中でかき混ぜる。それに10 mLの水を添加し、室温へ冷却し、この混合物へ10 mLの0.25 M NaOHを添加する。それを室温で15分間サーモミキサー中でかき混ぜ、1 mLの50xTEを添加し、続いて50分間遠心分離し、上澄みを除去する。結果として生じるペレットを10ミリリットルの1xTE中に再懸濁し、続いて50分間遠心分離し、上澄みを除去する。この時点で、ヒドロゲルペレットを10 mLの1xTEバッファー中に再懸濁し、80℃で1時間加熱し;遠心分離(15,000 rpmで50分間)および上澄みの除去後、コンジュゲートされたヒドロゲルを、上記のように、10 mLの1xTEで洗浄し、続いて50分間遠心分離し、上澄みを除去する。結果として生じるペレットを14 mLの脱イオン水中に再懸濁し、後の使用のために5μmシリンジフィルターで濾過する。
実施例50における通り、但し、実施例49からのカルボキシレートNHSエステルヒドロゲルペレットを使用した。
実施例52
より多くの情報についてはthermofisher.com上のユーザーガイドを参照し、以下は簡単な説明である。コンジュゲートされた粒子を、エマルジョンPCRによってサイズ100〜120塩基対のDNAライブラリーでテンプレート化した。530 v1スタンダードIon Chef(商標)試薬および消耗品を使用して、自動Ion Chef(商標)機器において、テンプレート化を行った。粒子を手動でチップ上へロードし、配列決定をIon Proton(商標)シーケンサーにおいて行った。実施例50におけるコンジュゲートされた粒子からの配列決定からの重要なメトリクス: 総読み取り 1.4 M、生の読み取り正確度 98.6%、およびAQ20平均値 75塩基(正しくない塩基コールの確率1%)。実施例51におけるコンジュゲートされた粒子からの配列決定からの重要なメトリクス: 総読み取り 3.0 M、生の読み取り正確度 98.7%、およびAQ20平均値 83塩基。
実施例52
より多くの情報についてはthermofisher.com上のユーザーガイドを参照し、以下は簡単な説明である。コンジュゲートされた粒子を、エマルジョンPCRによってサイズ100〜120塩基対のDNAライブラリーでテンプレート化した。530 v1スタンダードIon Chef(商標)試薬および消耗品を使用して、自動Ion Chef(商標)機器において、テンプレート化を行った。粒子を手動でチップ上へロードし、配列決定をIon Proton(商標)シーケンサーにおいて行った。実施例50におけるコンジュゲートされた粒子からの配列決定からの重要なメトリクス: 総読み取り 1.4 M、生の読み取り正確度 98.6%、およびAQ20平均値 75塩基(正しくない塩基コールの確率1%)。実施例51におけるコンジュゲートされた粒子からの配列決定からの重要なメトリクス: 総読み取り 3.0 M、生の読み取り正確度 98.7%、およびAQ20平均値 83塩基。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕(a)約1未満のlog P oct/wat (log P)を有する親水性ビニルモノマー;および
(b)少なくとも2つのビニル基を含む架橋剤
から形成されたポリマーを含む、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子。
〔2〕親水性ビニルモノマーが約0.6未満のlog Pを有し、任意で、log Pが約0.3未満であり、さらに任意で、log Pが約0未満である、前記〔1〕記載のポリマー粒子。
〔3〕親水性ビニルモノマーが0.5〜-2のlog Pを有し、任意で、log Pが0〜-2である、前記〔1〕または前記〔2〕記載のポリマー粒子。
〔4〕親水性ビニルモノマーが、アクリルアミドモノマーおよび/またはアクリレートモノマーである、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔5〕親水性ビニルモノマーが、少なくとも1つの式(I)の化合物:
を含み、式中、
R 1 が、-H、-CH 3 または-CH 2 CH 3 であり;
R 2 が、-OR 3 または-N(R 4 )R 5 であり;
R 3 が、-H、-C 1 〜C 6 アルキル、または-C 1 〜C 6 アルコールであり;かつ
R 4 およびR 5 が、-H、-C 1 〜C 6 アルキル、-C 1 〜C 6 ハロアルキル、-C 1 〜C 6 アルコールより各々独立して選択され、
R 3 および/またはR 4 および/またはR 5 が、化学的に可能である場合、1〜5個の置換基によって各々独立して置換されてもよく、該置換基は各出現で各々独立して以下:オキソ、=NR a 、=NOR a 、ハロ、ニトロ、シアノ、NR a R a 、NR a S(O) 2 R a 、NR a CONR a R a 、NR a CO 2 R a 、OR a ;SR a 、S(O)R a 、S(O) 2 OR a 、S(O) 2 R a 、S(O) 2 NR a R a 、CO 2 R a C(O)R a 、CONR a R a 、C 1 〜C 4 -アルキル、C 2 〜C 4 -アルケニル、C 2 〜C 4 -アルキニル、C 1 〜C 4 ハロアルキルより選択され;R a は、HおよびC 1 〜C 4 アルキルより各出現で独立して選択される、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔6〕R 1 が-Hまたは-CH 3 であり、任意で、R 1 が-Hである、前記〔5〕記載のポリマー粒子。
〔7〕R 2 が-OR 3 である、前記〔5〕または前記〔6〕記載のポリマー粒子。
〔8〕R 3 が-Hである、前記〔5〕〜〔7〕のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔9〕R 4 が-Hまたは-C 1 〜C 6 アルキルであり、任意で、R 4 が-Hである、前記〔5〕〜〔8〕のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔10〕R 5 が-Hまたは-C 1 〜C 6 アルキルであり得、任意で、R 5 が-Hである、前記〔5〕〜〔9〕のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔11〕親水性ビニルモノマーが、少なくとも1つのアクリルアミドモノマー、アクリリックモノマー、メタクリルアミドモノマー、またはメタクリリックモノマーより選択されるかまたはこれを含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔12〕親水性ビニルモノマーが、アクリルアミド、ヒドロキシメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、3-アクリルアミドプロパン酸、メタクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド、(3-アミノプロピル)メタクリルアミド、または2-ヒドロキシエチルアクリレートより選択されるかまたはこれを含み;任意で、親水性ビニルモノマーが、アクリルアミド(プロパ-2-エンアミド)、ヒドロキシメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、トリスヒドロキシメチルメタクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレートおよびアクリル酸のうちの少なくとも1つより選択されるかまたはこれを含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔13〕親水性ビニルモノマーが第1級アミド基(-C(O)NH 2 )を含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔14〕架橋剤が、二官能性、三官能性または四官能性アクリルアミドであり、任意で、架橋剤が二官能性アクリルアミドである、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔15〕架橋剤が、少なくとも1つの式(IIa)または(IIb)の化合物:
を含み、式中、
R 6 が、-C 1 〜C 6 アルキル-、-C 1 〜C 6 ヘテロアルキル-、-C 1 〜C 6 シクロアルキル-、-C 1 〜C 6 ヒドロキシアルキル-、-C 1 〜C 6 エーテル-、または2〜100個のC 2 〜C 3 エーテル単位を含むポリエーテルより選択され;
R 7 およびR 8 が、-H、-C 1 〜C 6 アルキル、-C 1 〜C 6 ヘテロアルキル、-C 3 〜C 6 シクロアルキル、-C 1 〜C 6 ヒドロキシアルキル、または-C 1 〜C 6 エーテルより各々独立して選択され;
R 9 が、-N(R 11 )C(O)CH=CH 2 であり;
R 10 が、-Hおよび-N(R 12 )C(O)CH=CH 2 より選択され;かつ
R 11 およびR 12 が、-H、-C 1 〜C 6 アルキル、-C 1 〜C 6 ヘテロアルキル、-C 3 〜C 6 シクロアルキル、-C 1 〜C 6 ヒドロキシアルキル、または-C 1 〜C 6 エーテルより各々独立して選択され; 任意で、R 6 、R 7 、R 8 、R 9 、R 10 、R 11 およびR 12 のうちの1つまたは複数が、化学的に可能である場合、1〜5個の置換基によって独立して置換され、該置換基は各出現で各々独立して以下:オキソ、=NR a 、=NOR a 、ハロ、ニトロ、シアノ、NR a R a 、NR a S(O) 2 R a 、NR a CONR a R a 、NR a CO 2 R a 、OR a ;SR a 、S(O)R a 、S(O) 2 OR a 、S(O) 2 R a 、S(O) 2 NR a R a 、CO 2 R a C(O)R a 、CONR a R a 、C 1 〜C 4 -アルキル、C 2 〜C 4 -アルケニル、C 2 〜C 4 -アルキニル、C 1 〜C 4 ハロアルキルより選択され;R a は、H、C 1 〜C 4 アルキルおよびC 1 〜C 4 アルケニルより各出現で独立して選択される、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔16〕R 6 が、-C 1 〜C 6 アルキル-、-C 1 〜C 6 ヒドロキシアルキル-、および2〜100個のC 2 〜C 3 エーテル単位を含むポリエーテルより選択され、任意で、R 6 が、-C 1 〜C 6 アルキル-および-C 1 〜C 6 ヒドロキシアルキル-より選択され、さらに任意で、R 6 が-C 1 〜C 6 ヒドロキシアルキル-である、前記〔15〕記載の化合物。
〔17〕R 6 が、-CH 2 -、-(CH 2 ) 2 -、-(CH 2 ) 3 -、または-(CH 2 ) 4 -より選択され、任意で、R 6 が-(CH 2 ) 2 -である、前記〔15〕または前記〔16〕記載の化合物。
〔18〕R 6 が、-C(OH)H-、-(C(OH)H)2-、-(C(OH)H)3-、または-(C(OH)H)4-より選択され、任意で、R 6 が-(C(OH)H)2-である、前記〔15〕〜〔17〕のいずれか一項記載の化合物。
〔19〕R 6 が(CH 2 ) r (OCH 2 CH 2 ) n O(CH 2 ) s であり、
rおよびsが、各々独立して2または3であり、かつ
nが、1〜100の整数である、前記〔15〕または前記〔16〕記載の化合物。
〔20〕rおよびsが各々2であり、nが1〜50の整数である、前記〔19〕記載の化合物。
〔21〕R 7 および/またはR 8 がHである、前記〔15〕〜〔20〕のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔22〕架橋剤が、約1未満のlog P値、任意で約0.5未満のlog P値、さらに任意で約0未満のlog P値を有する、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔23〕架橋剤が、N,N′-(1,2-ジヒドロキシエチレン)ビスアクリルアミド、N,N′-メチレンビス(アクリルアミド)、N,N′-エチレンビス(アクリルアミド)、グリセロール1,3-ジグリセロレートジアクリレート、ピペラジンジアクリルアミド、N,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド、ポリエチレングリコールジアクリルアミド(MW≦2000)、4-アームPEG-アクリルアミド(MW≦2000)、および/またはN,N-ビス(2-アクリルアミドエチル)アクリルアミドであるかまたはこれを含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔24〕架橋剤が、1,2-ジヒドロキシビス-アクリルアミドであるかまたはこれを含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔25〕架橋剤が、N,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド、ポリエチレングリコールジアクリルアミド(MW≦2000)および4-アームPEG-アクリルアミド(MW≦2000)であるかまたはこれを含み、任意で、架橋剤が、N,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミドであるかまたはこれを含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔26〕架橋剤が、第1級アミン、第2級アミン、ヒドロキシまたはカルボン酸を含まない、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔27〕架橋レベルが、1〜60%wt架橋剤、任意で1〜30%wt架橋剤である;または、架橋レベルが、10〜90%wt架橋剤、任意で25〜60%wt架橋剤である、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔28〕親水性ビニルモノマーが、前記〔14〕〜〔26〕のいずれか一項に定義されるような架橋剤である、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔29〕多孔性である、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔30〕0.5μm〜10μm、任意で0.5μm〜5μmの平均直径を有する、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔31〕変動係数(CV)が20%未満であり、任意で、CVが15%未満である、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔32〕粒子が、粒子へ結合されたオリゴヌクレオチドを含む、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔33〕粒子の各々が、粒子へ結合された複数のオリゴヌクレオチドを含み、任意で、該複数のオリゴヌクレオチドが、各個々の粒子について同一である、前記態様のいずれか一項記載のポリマー粒子。
〔34〕100 nm〜1500 nmのZ平均直径を有する単分散シード粒子であって、各シード粒子が、ポリN,N-ジメチルアクリルアミドの複数の未架橋オリゴマーを含む、単分散シード粒子。
〔35〕オリゴマーが、2,000 Da〜100,000 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、前記〔34〕記載のシード粒子。
〔36〕オリゴマーが、5,000 Da〜70,000 Da;任意で6,000 Da〜40,000 Da;さらに任意で7,000 Da〜50,000 Daまたは8,000 Da〜40,000 DaのMwを有する、前記〔34〕または〔35〕記載のシード粒子。
〔37〕粒子が、安定剤および連鎖移動試薬の存在下で、有機溶媒中でのN,N-ジメチルアクリルアミドのラジカル開始重合によって形成されたシード粒子の特徴を有する、前記〔34〕〜〔36〕のいずれか一項記載のシード粒子。
〔38〕単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成するための前記〔34〕〜〔37〕のいずれか一項記載のシード粒子の使用であって、任意で、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、架橋ポリアクリルアミド粒子である、使用。
〔39〕単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、前記〔1〕〜〔33〕のいずれか一項にさらに定義される通りである、前記〔38〕記載の使用。
〔40〕単分散シード粒子を形成する方法であって:
N,N-ジメチルアクリルアミド、安定剤、ラジカル開始剤および連鎖移動剤を有機溶媒中に溶解し、反応混合物を形成する工程;ならびに
反応混合物を加熱して開始剤を活性化する工程、
を含み、それによって単分散シード粒子を形成する、方法。
〔41〕安定剤が、スチレンとポリオレフィンのブロックコポリマーであり、任意で、安定剤が、ポリ(エチレン-co-ブチレン)の中央ブロックおよびポリスチレンの外側ブロックからなるトリブロックコポリマーである、前記〔40〕記載の方法。
〔42〕安定剤が、Kraton A1535H、Kraton G1650M、Kraton G1652M、またはKraton G1657Mより選択されるかまたはこれを含む、前記〔40〕または前記〔41〕記載の方法。
〔43〕ラジカル開始剤が、過酸化物開始剤またはアゾ開始剤である、前記〔40〕〜〔42〕のいずれか一項記載の方法。
〔44〕ラジカル開始剤が、2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、2,2'-アゾジ(2-メチルブチロニトリル)、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)、過酸化ジベンゾイルより選択され、任意で、ラジカル開始剤が2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)である、前記〔40〕〜〔43〕のいずれか一項記載の方法。
〔45〕反応混合物を加熱して開始剤を活性化する工程が、少なくとも40℃へ加熱すること、任意で少なくとも50℃へ加熱すること、さらに任意で少なくとも60℃へ加熱することを含む、前記〔40〕〜〔44〕のいずれか一項記載の方法。
〔46〕連鎖移動試薬がチオールまたはハロアルカンであり、任意で、連鎖移動剤がアルキルチオールである、前記〔40〕〜〔45〕のいずれか一項記載の方法。
〔47〕連鎖移動試薬が、1-オクタンチオール、ヘキサンチオール、6-メルカプト-1-ヘキサノール、ベンジルチオール、四塩化炭素およびブロモトリクロロメタンより選択される、前記〔40〕〜〔46〕のいずれか一項記載の方法。
〔48〕連鎖移動試薬が1-オクタンチオールである、前記〔40〕〜〔47〕のいずれか一項記載の方法。
〔49〕有機溶媒が、アルカン成分および芳香族成分の混合物を含む、前記〔40〕〜〔48〕のいずれか一項記載の方法。
〔50〕アルカン成分および芳香族成分が、約0.5:1〜約20:1のアルカン成分:芳香族成分の重量比で存在し、任意で、アルカン成分:芳香族成分の重量比が約1:1〜約10:1である、前記〔49〕記載の方法。
〔51〕アルカン成分がヘプタンであり、芳香族成分がトルエンである、前記〔49〕または前記〔50〕記載の方法。
〔52〕反応混合物が:
約2%wt〜約5%wtの量のN,N-ジメチルアクリルアミド;
約1%wt〜約5%wtの量の安定剤;
約0.01%wt〜約4%wtの量のラジカル開始剤;および
約0.05%wt〜約0.25%wtの量の連鎖移動試薬
を含む、前記〔40〕〜〔51〕のいずれか一項記載の方法。
〔53〕N,N-ジメチルアクリルアミドの%wtが安定剤の%wtより大きい、前記〔52〕記載の方法。
〔54〕反応混合物を加熱する前に、反応混合物から酸素をパージする、前記〔40〕〜〔53〕のいずれか一項記載の方法。
〔55〕前記酸素をパージすることが、化学的不活性ガスを散布することを含み、任意で、化学的不活性ガスが、アルゴン、ヘリウムまたは窒素より選択される、前記〔54〕記載の方法。
〔56〕単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する方法であって、以下の工程を含む、方法:
水溶液中少なくとも2%wtの親水性ビニルモノマーの溶液(a)を形成する工程であって、溶液が、少なくとも2つのビニル基を含む架橋剤もまた含む、工程;
有機溶媒中の安定剤の溶液(b)を形成する工程であって、有機溶媒は水中に混和性ではなく、溶液(a)および溶液(b)のうちの少なくとも1つがラジカル開始剤を含む、工程;
溶液(a)および(b)を混合して油中水型エマルジョン(c)を形成し、エマルジョンへ単分散シード粒子を添加する工程;
単分散シード粒子がエマルジョン中で膨潤粒子を形成することを可能にする工程;ならびに
膨潤粒子を重合して単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する工程。
〔57〕親水性ビニルモノマーが、前記〔1〕〜〔13〕または〔28〕のいずれか一項にさらに定義される通りである、前記〔56〕記載の方法。
〔58〕架橋剤が、前記〔14〕〜〔26〕のいずれか一項にさらに定義される通りである、前記〔56〕または〔57〕記載の方法。
〔59〕安定剤が非イオン界面活性剤であり、任意で、非イオン界面活性剤が非イオンポリマー界面活性剤である、前記〔56〕〜〔58〕のいずれか一項記載の方法。
〔60〕非イオンポリマー界面活性剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基または少なくとも1つのポリプロピレンオキシ基を含む、前記〔59〕記載の方法。
〔61〕安定剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基を含む、前記〔59〕または〔60〕記載の方法。
〔62〕非イオンポリマー界面活性剤がオリゴマー界面活性剤である、前記〔59〕〜〔61〕のいずれか一項記載の方法。
〔63〕安定剤が、Hypermer 2296、Abil EM90およびソルビタンモノオレエートより選択される、前記〔56〕〜〔62〕のいずれか一項記載の方法。
〔64〕ラジカル開始剤が過酸化物開始剤またはアゾ開始剤である、前記〔56〕〜〔63〕のいずれか一項記載の方法。
〔65〕ラジカル開始剤が2,2’-アゾビス-2,4-ジメチルバレロニトリルである、前記〔56〕〜〔64〕のいずれか一項記載の方法。
〔66〕有機溶媒が、脂肪族炭化水素、脂肪族カーボネート、脂肪族エステル、脂肪族エーテル、芳香族炭化水素、もしくはシリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、前記〔56〕〜〔65〕のいずれか一項記載の方法。
〔67〕有機溶媒が、ヘプタンおよびトルエンの混合物;脂肪族炭化水素の混合物;任意で脂肪族および芳香族炭化水素と混合された、炭酸ビス(2-エチルヘキシル);またはアジピン酸ビス(2-エチルヘキシル)を含む、前記〔56〕〜〔66〕のいずれか一項記載の方法。
〔68〕単分散シード粒子が、前記〔40〕〜〔55〕のいずれか一項記載の方法に従って形成された単分散シード粒子の特徴を有する、前記〔56〕〜〔67〕のいずれか一項記載の方法。
〔69〕単分散シード粒子が、前記〔40〕〜〔55〕のいずれか一項記載の方法に従って形成される、前記〔56〕〜〔67〕のいずれか一項記載の方法。
〔70〕溶液(a)が、60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、前記〔56〕〜〔69〕のいずれか一項記載の方法。
〔71〕溶液(a)が、少なくとも2%wt、かつ60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含み、任意で、溶液(a)が、少なくとも5%wt、かつ45%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、前記〔56〕〜〔70〕のいずれか一項記載の方法。
〔72〕溶液(a)が約10%wtの親水性ビニルモノマーを含む、前記〔56〕〜〔71〕のいずれか一項記載の方法。
〔73〕開始剤が、約0.1%wt〜約1.5%wtの量でエマルジョン中に存在し、任意で、開始剤が、約0.6%wt〜約1.2%wtの量でエマルジョン中に存在し、さらに任意で、開始剤が、約0.8%wtの量でエマルジョン中に存在する、前記〔56〕〜〔72〕のいずれか一項記載の方法。
〔74〕重合が、ラジカル開始剤を活性化することを含む、前記〔56〕〜〔72〕のいずれか一項記載の方法。
〔75〕ラジカル開始剤を活性化することが、膨潤粒子を含むエマルジョンを加熱することを含み、任意で、この加熱が、少なくとも40℃の温度へ加熱することを含む、前記〔74〕記載の方法。
〔76〕単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップを、少なくとも30分間、任意で少なくとも1時間行う、前記〔56〕〜〔75〕のいずれか一項記載の方法。
〔77〕単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップが、エマルジョンを混合することを含み、任意で、この混合を30℃以下の温度で行い、任意で、この混合を約15℃〜約25℃の温度で行う、前記〔56〕〜〔76〕のいずれか一項記載の方法。
〔78〕単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する方法であって、以下の工程を含む、方法:
水溶液中少なくとも2%wtの親水性ビニルモノマーの溶液(a)を形成する工程であって、水溶液が連鎖移動剤もまた含む、工程;
有機溶媒中の安定剤の溶液(b)を形成する工程であって、有機溶媒は水中に混和性ではなく、溶液(a)および溶液(b)のうちの少なくとも1つがラジカル開始剤を含む、工程;
溶液(a)および(b)を混合して油中水型エマルジョン(c)を形成し、エマルジョンへ単分散シード粒子を添加する工程;
単分散シード粒子がエマルジョン中で膨潤粒子を形成することを可能にする工程;
膨潤粒子を重合して単分散ポリマー粒子を形成する工程;
有機溶媒中の安定剤の溶液(d)を形成する工程であって、有機溶媒は水中に混和性ではない、工程;
水溶液中少なくとも2%wtの親水性ビニルモノマーの溶液(e)を形成する工程であって、水溶液が、少なくとも2つのビニル基を含む架橋剤もまた含み、溶液(d)および溶液(e)のうちの少なくとも1つがラジカル開始剤を含む、工程;
溶液(d)および(e)を混合して油中水型エマルジョン(f)を形成し、エマルジョンへ単分散ポリマー粒子を添加する工程;
単分散ポリマー粒子がエマルジョン中で膨潤ポリマー粒子を形成することを可能にする工程;ならびに
膨潤ポリマー粒子を重合して単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する工程。
〔79〕溶液(a)の親水性ビニルモノマーが、前記〔1〕〜〔13〕のいずれか一項にさらに定義される通りである、前記〔78〕記載の方法。
〔80〕溶液(e)の親水性ビニルモノマーが、前記〔1〕〜〔13〕または〔28〕のいずれか一項にさらに定義される通りであり;任意で、溶液(a)および溶液(e)の親水性ビニルモノマーが同じである、前記〔78〕または前記〔79〕記載の方法。
〔81〕架橋剤が、前記〔14〕〜〔26〕のいずれか一項にさらに定義される通りである、前記〔78〕〜〔80〕のいずれか一項記載の方法。
〔82〕各安定剤が非イオン界面活性剤であり、任意で、各非イオン界面活性剤が非イオンポリマー界面活性剤である、前記〔78〕〜〔82〕のいずれか一項記載の方法。
〔83〕非イオンポリマー界面活性剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基または少なくとも1つのポリプロピレンオキシ基を含む、前記〔82〕記載の方法。
〔84〕各安定剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基を含む、前記〔82〕または〔83〕記載の方法。
〔85〕各非イオンポリマー界面活性剤がオリゴマー界面活性剤である、前記〔82〕〜〔84〕のいずれか一項記載の方法。
〔86〕各安定剤が、Hypermer 2296、Abil WE09、またはAMBNおよびAbil EM90より選択される、前記〔78〕〜〔85〕のいずれか一項記載の方法。
〔87〕連鎖移動剤が、チオールまたはハロアルカンより選択され、任意で、連鎖移動剤がチオポリオールである、前記〔78〕〜〔86〕のいずれか一項記載の方法。
〔88〕連鎖移動試薬が、1-チオグリセロール、1-オクタンチオール、ヘキサンチオール、6-メルカプト-1-ヘキサノール、ベンジルチオール、四塩化炭素およびブロモトリクロロメタンより選択され;任意で、連鎖移動剤が1-チオグリセロールである、前記〔78〕〜〔87〕のいずれか一項記載の方法。
〔89〕ラジカル開始剤が過酸化物開始剤またはアゾ開始剤である、前記〔78〕〜〔88〕のいずれか一項記載の方法。
〔90〕ラジカル開始剤が、2,2’-アゾビス-2,4-ジメチルバレロニトリル、および/または2,2'-アゾジ(2-メチルブチロニトリル)(AMBN)である、前記〔78〕〜〔89〕のいずれか一項記載の方法。
〔91〕有機溶媒が、脂肪族炭化水素、脂肪族カーボネート、脂肪族エステル、脂肪族エーテル、芳香族炭化水素、もしくはシリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、前記〔78〕〜〔90〕のいずれか一項記載の方法。
〔92〕有機溶媒が、ヘプタンおよびトルエンの混合物;脂肪族炭化水素の混合物;任意で脂肪族および芳香族炭化水素と混合された、炭酸ビス(2-エチルヘキシル);またはアジピン酸ビス(2-エチルヘキシル)を含む、前記〔78〕〜〔91〕のいずれか一項記載の方法。
〔93〕単分散シード粒子が、前記〔40〕〜〔55〕のいずれか一項記載の方法に従って形成された単分散シード粒子の特徴を有する、前記〔78〕〜〔92〕のいずれか一項記載の方法。
〔94〕単分散シード粒子が、前記〔40〕〜〔55〕のいずれか一項記載の方法に従って形成される、前記〔78〕〜〔92〕のいずれか一項記載の方法。
〔95〕溶液(a)および/または溶液(e)が、60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、前記〔78〕〜〔94〕のいずれか一項記載の方法。
〔96〕溶液(a)および/または溶液(e)が、少なくとも2%wt、かつ60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含み、任意で、溶液(a)および/または溶液(e)が、少なくとも5%wt、かつ45%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、前記〔78〕〜〔95〕のいずれか一項記載の方法。
〔97〕溶液(a)および/または溶液(e)が約10%wtの親水性ビニルモノマーを含む、前記〔78〕〜〔96〕のいずれか一項記載の方法。
〔98〕開始剤が、約0.1%wt〜約1.5%wtの量でエマルジョン中に存在し、任意で、開始剤が、約0.6%wt〜約1.2%wtの量でエマルジョン中に存在し、さらに任意で、開始剤が、約0.8%wtの量でエマルジョン中に存在する、前記〔78〕〜〔97〕のいずれか一項記載の方法。
〔99〕各重合が、ラジカル開始剤を活性化することを含む、前記〔78〕〜〔98〕のいずれか一項記載の方法。
〔100〕ラジカル開始剤を活性化することが、膨潤粒子を含むエマルジョンを加熱することを含み、任意で、この加熱が、少なくとも40℃の温度へ加熱することを含む、前記〔99〕記載の方法。
〔101〕単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップを、少なくとも30分間、任意で少なくとも1時間行う、前記〔78〕〜〔100〕のいずれか一項記載の方法。
〔102〕単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップが、エマルジョンを混合することを含み、任意で、この混合を30℃以下の温度で行い、任意で、この混合を約15℃〜約25℃の温度で行う、前記〔78〕〜〔101〕のいずれか一項記載の方法。
〔103〕形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が多孔性である、前記〔56〕〜〔102〕のいずれか一項記載の方法。
〔104〕形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、0.5μm〜10μmまたは1μM〜10μmのモード径、任意で0.5μm〜5μmまたは1μm〜5μmのモード径を有する、前記〔56〕〜〔103〕のいずれか一項記載の方法。
〔105〕形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の変動係数(CV)が20%未満であり、任意で、CVが15%未満である、前記〔56〕〜〔104〕のいずれか一項記載の方法。
〔106〕形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、官能基を含み、任意で、官能基が、ヒドロキシル、カルボン酸(-COOH)、第1級アミンまたは第2級アミンより選択される、前記〔56〕〜〔105〕のいずれか一項記載の方法。
〔107〕単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子へ1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む、前記〔106〕記載の方法。
〔108〕前記〔40〕〜〔55〕のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、単分散シード粒子。
〔109〕前記〔56〕〜〔107〕のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子。
〔110〕核酸増幅における、前記〔1〕〜〔33〕または前記〔109〕のいずれか一項記載の単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の使用。
〔111〕核酸増幅が、オリゴヌクレオチドを複数のオリゴヌクレオチドへ増幅することを含み、任意で、複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の少なくとも1つへ結合される、前記〔110〕記載の使用。
〔112〕核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅またはエマルジョンPCR増幅を含む、前記〔110〕または〔111〕記載の使用。
〔113〕オリゴヌクレオチド配列決定における、前記〔1〕〜〔33〕または前記〔109〕のいずれか一項記載の単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の使用。
〔114〕オリゴヌクレオチド配列決定が、化学電界効果トランジスタ(chemFET)に基づく配列決定またはイオン感応性電界効果トランジスタ(ISFET)に基づく配列決定を含む、前記〔113〕記載の使用。
〔115〕単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、約10℃〜約100℃の温度範囲で安定している、前記〔110〕〜〔114〕のいずれか一項記載の使用。
〔116〕粒子が多孔性であり、オリゴヌクレオチドならびに核酸増幅および配列決定試薬に対してトランスペアレントである、前記〔110〕〜〔115〕のいずれか一項記載の使用。
〔117〕ポリマー粒子へ結合されているオリゴヌクレオチドへハイブリダイズされているポリヌクレオチドに対してプライマー伸長反応を行う工程を含む、核酸増幅のための方法であって、ポリマー粒子が、前記〔1〕〜〔33〕または前記〔109〕のいずれか一項記載の単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子である、方法。
〔118〕(a)単鎖オリゴヌクレオチドへ結合されたポリマー粒子を提供する工程;
(b)単鎖テンプレートポリヌクレオチドを提供する工程;
(c)単鎖オリゴヌクレオチドを単鎖テンプレートポリヌクレオチドへハイブリダイズさせる工程;および
(d)ポリメラーゼが単鎖オリゴヌクレオチド上への少なくとも1つのヌクレオチドの重合を触媒するために適した条件下で、単鎖テンプレートポリヌクレオチドとポリメラーゼおよび少なくとも1つのヌクレオチドとを接触させ、伸長された単鎖オリゴヌクレオチドを生じさせる工程
を含む、前記〔117〕記載の方法。
〔119〕(e)単鎖オリゴヌクレオチドがポリマー粒子へ結合されたままとなるように、伸長された単鎖オリゴヌクレオチドから単鎖テンプレートポリヌクレオチドを除去する(例えば、変性させる)工程;
(f)残存している単鎖オリゴヌクレオチドを第2の単鎖テンプレートポリヌクレオチドへハイブリダイズさせる工程;および
(g)第2のポリメラーゼが単鎖オリゴヌクレオチド上への第2の少なくとも1つのヌクレオチドの重合を触媒するために適した条件下で、第2の単鎖テンプレートポリヌクレオチドと第2のポリメラーゼおよび第2の少なくとも1つのヌクレオチドとを接触させ、次の伸長された単鎖オリゴヌクレオチドを生じさせる工程
をさらに含む、前記〔118〕記載の方法。
〔120〕(h)ヌクレオチド付加を検出することによって配列決定する工程
をさらに含む、前記〔117〕〜〔119〕のいずれか一項記載の方法。
〔121〕ヌクレオチド付加を検出することが、付加された蛍光ヌクレオチドからの蛍光発光を検出すること、またはポリマー粒子の局所環境におけるpH変化を検出することを含む、前記〔120〕記載の方法。
〔122〕ヌクレオチド付加を検出することが、イオンセンサーを用いてポリマー粒子の局所環境におけるpH変化を検出することを含み、任意で、イオンセンサーが電界効果トランジスタ(FET)であり、さらに任意で、イオンセンサーが化学電界効果トランジスタ(ChemFET)またはイオン感応性電界効果トランジスタ(ISFET)である、前記〔121〕記載の方法。
Claims (122)
- (a)約1未満のlog Poct/wat(log P)を有する親水性ビニルモノマー;および
(b)少なくとも2つのビニル基を含む架橋剤
から形成されたポリマーを含む、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子。 - 親水性ビニルモノマーが約0.6未満のlog Pを有し、任意で、log Pが約0.3未満であり、さらに任意で、log Pが約0未満である、請求項1記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが0.5〜-2のlog Pを有し、任意で、log Pが0〜-2である、請求項1または請求項2記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが、アクリルアミドモノマーおよび/またはアクリレートモノマーである、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが、少なくとも1つの式(I)の化合物:
を含み、式中、
R1が、-H、-CH3または-CH2CH3であり;
R2が、-OR3または-N(R4)R5であり;
R3が、-H、-C1〜C6アルキル、または-C1〜C6アルコールであり;かつ
R4およびR5が、-H、-C1〜C6アルキル、-C1〜C6ハロアルキル、-C1〜C6アルコールより各々独立して選択され、
R3および/またはR4および/またはR5が、化学的に可能である場合、1〜5個の置換基によって各々独立して置換されてもよく、該置換基は各出現で各々独立して以下:オキソ、=NRa、=NORa、ハロ、ニトロ、シアノ、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa;SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2Ra C(O)Ra、CONRaRa、C1〜C4-アルキル、C2〜C4-アルケニル、C2〜C4-アルキニル、C1〜C4ハロアルキルより選択され;Raは、HおよびC1〜C4アルキルより各出現で独立して選択される、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。 - R1が-Hまたは-CH3であり、任意で、R1が-Hである、請求項5記載のポリマー粒子。
- R2が-OR3である、請求項5または請求項6記載のポリマー粒子。
- R3が-Hである、請求項5〜7のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- R4が-Hまたは-C1〜C6アルキルであり、任意で、R4が-Hである、請求項5〜8のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- R5が-Hまたは-C1〜C6アルキルであり得、任意で、R5が-Hである、請求項5〜9のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが、少なくとも1つのアクリルアミドモノマー、アクリリックモノマー、メタクリルアミドモノマー、またはメタクリリックモノマーより選択されるかまたはこれを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが、アクリルアミド、ヒドロキシメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、3-アクリルアミドプロパン酸、メタクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド、(3-アミノプロピル)メタクリルアミド、または2-ヒドロキシエチルアクリレートより選択されるかまたはこれを含み;任意で、親水性ビニルモノマーが、アクリルアミド(プロパ-2-エンアミド)、ヒドロキシメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、トリスヒドロキシメチルメタクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレートおよびアクリル酸のうちの少なくとも1つより選択されるかまたはこれを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが第1級アミド基(-C(O)NH2)を含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、二官能性、三官能性または四官能性アクリルアミドであり、任意で、架橋剤が二官能性アクリルアミドである、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、少なくとも1つの式(IIa)または(IIb)の化合物:
を含み、式中、
R6が、-C1〜C6アルキル-、-C1〜C6ヘテロアルキル-、-C1〜C6シクロアルキル-、-C1〜C6ヒドロキシアルキル-、-C1〜C6エーテル-、または2〜100個のC2〜C3エーテル単位を含むポリエーテルより選択され;
R7およびR8が、-H、-C1〜C6アルキル、-C1〜C6ヘテロアルキル、-C3〜C6シクロアルキル、-C1〜C6ヒドロキシアルキル、または-C1〜C6エーテルより各々独立して選択され;
R9が、-N(R11)C(O)CH=CH2であり;
R10が、-Hおよび-N(R12)C(O)CH=CH2より選択され;かつ
R11およびR12が、-H、-C1〜C6アルキル、-C1〜C6ヘテロアルキル、-C3〜C6シクロアルキル、-C1〜C6ヒドロキシアルキル、または-C1〜C6エーテルより各々独立して選択され; 任意で、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12のうちの1つまたは複数が、化学的に可能である場合、1〜5個の置換基によって独立して置換され、該置換基は各出現で各々独立して以下:オキソ、=NRa、=NORa、ハロ、ニトロ、シアノ、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa;SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2Ra C(O)Ra、CONRaRa、C1〜C4-アルキル、C2〜C4-アルケニル、C2〜C4-アルキニル、C1〜C4ハロアルキルより選択され;Raは、H、C1〜C4アルキルおよびC1〜C4アルケニルより各出現で独立して選択される、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。 - R6が、-C1〜C6アルキル-、-C1〜C6ヒドロキシアルキル-、および2〜100個のC2〜C3エーテル単位を含むポリエーテルより選択され、任意で、R6が、-C1〜C6アルキル-および-C1〜C6ヒドロキシアルキル-より選択され、さらに任意で、R6が-C1〜C6ヒドロキシアルキル-である、請求項15記載の化合物。
- R6が、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、または-(CH2)4-より選択され、任意で、R6が-(CH2)2-である、請求項15または請求項16記載の化合物。
- R6が、-C(OH)H-、-(C(OH)H)2-、-(C(OH)H)3-、または-(C(OH)H)4-より選択され、任意で、R6が-(C(OH)H)2-である、請求項15〜17のいずれか一項記載の化合物。
- R6が(CH2)r(OCH2CH2)nO(CH2)sであり、
rおよびsが、各々独立して2または3であり、かつ
nが、1〜100の整数である、請求項15または請求項16記載の化合物。 - rおよびsが各々2であり、nが1〜50の整数である、請求項19記載の化合物。
- R7および/またはR8がHである、請求項15〜20のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、約1未満のlog P値、任意で約0.5未満のlog P値、さらに任意で約0未満のlog P値を有する、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、N,N′-(1,2-ジヒドロキシエチレン)ビスアクリルアミド、N,N′-メチレンビス(アクリルアミド)、N,N′-エチレンビス(アクリルアミド)、グリセロール1,3-ジグリセロレートジアクリレート、ピペラジンジアクリルアミド、N,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド、ポリエチレングリコールジアクリルアミド(MW≦2000)、4-アームPEG-アクリルアミド(MW≦2000)、および/またはN,N-ビス(2-アクリルアミドエチル)アクリルアミドであるかまたはこれを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、1,2-ジヒドロキシビス-アクリルアミドであるかまたはこれを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、N,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミド、ポリエチレングリコールジアクリルアミド(MW≦2000)および4-アームPEG-アクリルアミド(MW≦2000)であるかまたはこれを含み、任意で、架橋剤が、N,N'-((エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ビス(エタン-2,1-ジイル))ジアクリルアミドであるかまたはこれを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋剤が、第1級アミン、第2級アミン、ヒドロキシまたはカルボン酸を含まない、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 架橋レベルが、1〜60%wt架橋剤、任意で1〜30%wt架橋剤である;または、架橋レベルが、10〜90%wt架橋剤、任意で25〜60%wt架橋剤である、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 親水性ビニルモノマーが、請求項14〜26のいずれか一項に定義されるような架橋剤である、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 多孔性である、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 0.5μm〜10μm、任意で0.5μm〜5μmの平均直径を有する、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 変動係数(CV)が20%未満であり、任意で、CVが15%未満である、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 粒子が、粒子へ結合されたオリゴヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 粒子の各々が、粒子へ結合された複数のオリゴヌクレオチドを含み、任意で、該複数のオリゴヌクレオチドが、各個々の粒子について同一である、前記請求項のいずれか一項記載のポリマー粒子。
- 100 nm〜1500 nmのZ平均直径を有する単分散シード粒子であって、各シード粒子が、ポリN,N-ジメチルアクリルアミドの複数の未架橋オリゴマーを含む、単分散シード粒子。
- オリゴマーが、2,000 Da〜100,000 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、請求項34記載のシード粒子。
- オリゴマーが、5,000 Da〜70,000 Da;任意で6,000 Da〜40,000 Da;さらに任意で7,000 Da〜50,000 Daまたは8,000 Da〜40,000 DaのMwを有する、請求項34または35記載のシード粒子。
- 粒子が、安定剤および連鎖移動試薬の存在下で、有機溶媒中でのN,N-ジメチルアクリルアミドのラジカル開始重合によって形成されたシード粒子の特徴を有する、請求項34〜36のいずれか一項記載のシード粒子。
- 単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成するための請求項34〜37のいずれか一項記載のシード粒子の使用であって、任意で、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、架橋ポリアクリルアミド粒子である、使用。
- 単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、請求項1〜33のいずれか一項にさらに定義される通りである、請求項38記載の使用。
- 単分散シード粒子を形成する方法であって:
N,N-ジメチルアクリルアミド、安定剤、ラジカル開始剤および連鎖移動剤を有機溶媒中に溶解し、反応混合物を形成する工程;ならびに
反応混合物を加熱して開始剤を活性化する工程、
を含み、それによって単分散シード粒子を形成する、方法。 - 安定剤が、スチレンとポリオレフィンのブロックコポリマーであり、任意で、安定剤が、ポリ(エチレン-co-ブチレン)の中央ブロックおよびポリスチレンの外側ブロックからなるトリブロックコポリマーである、請求項40記載の方法。
- 安定剤が、Kraton A1535H、Kraton G1650M、Kraton G1652M、またはKraton G1657Mより選択されるかまたはこれを含む、請求項40または請求項41記載の方法。
- ラジカル開始剤が、過酸化物開始剤またはアゾ開始剤である、請求項40〜42のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤が、2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、2,2'-アゾジ(2-メチルブチロニトリル)、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)、過酸化ジベンゾイルより選択され、任意で、ラジカル開始剤が2,2’-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)である、請求項40〜43のいずれか一項記載の方法。
- 反応混合物を加熱して開始剤を活性化する工程が、少なくとも40℃へ加熱すること、任意で少なくとも50℃へ加熱すること、さらに任意で少なくとも60℃へ加熱することを含む、請求項40〜44のいずれか一項記載の方法。
- 連鎖移動試薬がチオールまたはハロアルカンであり、任意で、連鎖移動剤がアルキルチオールである、請求項40〜45のいずれか一項記載の方法。
- 連鎖移動試薬が、1-オクタンチオール、ヘキサンチオール、6-メルカプト-1-ヘキサノール、ベンジルチオール、四塩化炭素およびブロモトリクロロメタンより選択される、請求項40〜46のいずれか一項記載の方法。
- 連鎖移動試薬が1-オクタンチオールである、請求項40〜47のいずれか一項記載の方法。
- 有機溶媒が、アルカン成分および芳香族成分の混合物を含む、請求項40〜48のいずれか一項記載の方法。
- アルカン成分および芳香族成分が、約0.5:1〜約20:1のアルカン成分:芳香族成分の重量比で存在し、任意で、アルカン成分:芳香族成分の重量比が約1:1〜約10:1である、請求項49記載の方法。
- アルカン成分がヘプタンであり、芳香族成分がトルエンである、請求項49または請求項50記載の方法。
- 反応混合物が:
約2%wt〜約5%wtの量のN,N-ジメチルアクリルアミド;
約1%wt〜約5%wtの量の安定剤;
約0.01%wt〜約4%wtの量のラジカル開始剤;および
約0.05%wt〜約0.25%wtの量の連鎖移動試薬
を含む、請求項40〜51のいずれか一項記載の方法。 - N,N-ジメチルアクリルアミドの%wtが安定剤の%wtより大きい、請求項52記載の方法。
- 反応混合物を加熱する前に、反応混合物から酸素をパージする、請求項40〜53のいずれか一項記載の方法。
- 前記酸素をパージすることが、化学的不活性ガスを散布することを含み、任意で、化学的不活性ガスが、アルゴン、ヘリウムまたは窒素より選択される、請求項54記載の方法。
- 単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する方法であって、以下の工程を含む、方法:
水溶液中少なくとも2%wtの親水性ビニルモノマーの溶液(a)を形成する工程であって、溶液が、少なくとも2つのビニル基を含む架橋剤もまた含む、工程;
有機溶媒中の安定剤の溶液(b)を形成する工程であって、有機溶媒は水中に混和性ではなく、溶液(a)および溶液(b)のうちの少なくとも1つがラジカル開始剤を含む、工程;
溶液(a)および(b)を混合して油中水型エマルジョン(c)を形成し、エマルジョンへ単分散シード粒子を添加する工程;
単分散シード粒子がエマルジョン中で膨潤粒子を形成することを可能にする工程;ならびに
膨潤粒子を重合して単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する工程。 - 親水性ビニルモノマーが、請求項1〜13または28のいずれか一項にさらに定義される通りである、請求項56記載の方法。
- 架橋剤が、請求項14〜26のいずれか一項にさらに定義される通りである、請求項56または57記載の方法。
- 安定剤が非イオン界面活性剤であり、任意で、非イオン界面活性剤が非イオンポリマー界面活性剤である、請求項56〜58のいずれか一項記載の方法。
- 非イオンポリマー界面活性剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基または少なくとも1つのポリプロピレンオキシ基を含む、請求項59記載の方法。
- 安定剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基を含む、請求項59または60記載の方法。
- 非イオンポリマー界面活性剤がオリゴマー界面活性剤である、請求項59〜61のいずれか一項記載の方法。
- 安定剤が、Hypermer 2296、Abil EM90およびソルビタンモノオレエートより選択される、請求項56〜62のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤が過酸化物開始剤またはアゾ開始剤である、請求項56〜63のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤が2,2’-アゾビス-2,4-ジメチルバレロニトリルである、請求項56〜64のいずれか一項記載の方法。
- 有機溶媒が、脂肪族炭化水素、脂肪族カーボネート、脂肪族エステル、脂肪族エーテル、芳香族炭化水素、もしくはシリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項56〜65のいずれか一項記載の方法。
- 有機溶媒が、ヘプタンおよびトルエンの混合物;脂肪族炭化水素の混合物;任意で脂肪族および芳香族炭化水素と混合された、炭酸ビス(2-エチルヘキシル);またはアジピン酸ビス(2-エチルヘキシル)を含む、請求項56〜66のいずれか一項記載の方法。
- 単分散シード粒子が、請求項40〜55のいずれか一項記載の方法に従って形成された単分散シード粒子の特徴を有する、請求項56〜67のいずれか一項記載の方法。
- 単分散シード粒子が、請求項40〜55のいずれか一項記載の方法に従って形成される、請求項56〜67のいずれか一項記載の方法。
- 溶液(a)が、60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、請求項56〜69のいずれか一項記載の方法。
- 溶液(a)が、少なくとも2%wt、かつ60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含み、任意で、溶液(a)が、少なくとも5%wt、かつ45%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、請求項56〜70のいずれか一項記載の方法。
- 溶液(a)が約10%wtの親水性ビニルモノマーを含む、請求項56〜71のいずれか一項記載の方法。
- 開始剤が、約0.1%wt〜約1.5%wtの量でエマルジョン中に存在し、任意で、開始剤が、約0.6%wt〜約1.2%wtの量でエマルジョン中に存在し、さらに任意で、開始剤が、約0.8%wtの量でエマルジョン中に存在する、請求項56〜72のいずれか一項記載の方法。
- 重合が、ラジカル開始剤を活性化することを含む、請求項56〜72のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤を活性化することが、膨潤粒子を含むエマルジョンを加熱することを含み、任意で、この加熱が、少なくとも40℃の温度へ加熱することを含む、請求項74記載の方法。
- 単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップを、少なくとも30分間、任意で少なくとも1時間行う、請求項56〜75のいずれか一項記載の方法。
- 単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップが、エマルジョンを混合することを含み、任意で、この混合を30℃以下の温度で行い、任意で、この混合を約15℃〜約25℃の温度で行う、請求項56〜76のいずれか一項記載の方法。
- 単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する方法であって、以下の工程を含む、方法:
水溶液中少なくとも2%wtの親水性ビニルモノマーの溶液(a)を形成する工程であって、水溶液が連鎖移動剤もまた含む、工程;
有機溶媒中の安定剤の溶液(b)を形成する工程であって、有機溶媒は水中に混和性ではなく、溶液(a)および溶液(b)のうちの少なくとも1つがラジカル開始剤を含む、工程;
溶液(a)および(b)を混合して油中水型エマルジョン(c)を形成し、エマルジョンへ単分散シード粒子を添加する工程;
単分散シード粒子がエマルジョン中で膨潤粒子を形成することを可能にする工程;
膨潤粒子を重合して単分散ポリマー粒子を形成する工程;
有機溶媒中の安定剤の溶液(d)を形成する工程であって、有機溶媒は水中に混和性ではない、工程;
水溶液中少なくとも2%wtの親水性ビニルモノマーの溶液(e)を形成する工程であって、水溶液が、少なくとも2つのビニル基を含む架橋剤もまた含み、溶液(d)および溶液(e)のうちの少なくとも1つがラジカル開始剤を含む、工程;
溶液(d)および(e)を混合して油中水型エマルジョン(f)を形成し、エマルジョンへ単分散ポリマー粒子を添加する工程;
単分散ポリマー粒子がエマルジョン中で膨潤ポリマー粒子を形成することを可能にする工程;ならびに
膨潤ポリマー粒子を重合して単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子を形成する工程。 - 溶液(a)の親水性ビニルモノマーが、請求項1〜13のいずれか一項にさらに定義される通りである、請求項78記載の方法。
- 溶液(e)の親水性ビニルモノマーが、請求項1〜13または28のいずれか一項にさらに定義される通りであり;任意で、溶液(a)および溶液(e)の親水性ビニルモノマーが同じである、請求項78または請求項79記載の方法。
- 架橋剤が、請求項14〜26のいずれか一項にさらに定義される通りである、請求項78〜80のいずれか一項記載の方法。
- 各安定剤が非イオン界面活性剤であり、任意で、各非イオン界面活性剤が非イオンポリマー界面活性剤である、請求項78〜82のいずれか一項記載の方法。
- 非イオンポリマー界面活性剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基または少なくとも1つのポリプロピレンオキシ基を含む、請求項82記載の方法。
- 各安定剤が、少なくとも1つのポリエチレンオキシ基を含む、請求項82または83記載の方法。
- 各非イオンポリマー界面活性剤がオリゴマー界面活性剤である、請求項82〜84のいずれか一項記載の方法。
- 各安定剤が、Hypermer 2296、Abil WE09、またはAMBNおよびAbil EM90より選択される、請求項78〜85のいずれか一項記載の方法。
- 連鎖移動剤が、チオールまたはハロアルカンより選択され、任意で、連鎖移動剤がチオポリオールである、請求項78〜86のいずれか一項記載の方法。
- 連鎖移動試薬が、1-チオグリセロール、1-オクタンチオール、ヘキサンチオール、6-メルカプト-1-ヘキサノール、ベンジルチオール、四塩化炭素およびブロモトリクロロメタンより選択され;任意で、連鎖移動剤が1-チオグリセロールである、請求項78〜87のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤が過酸化物開始剤またはアゾ開始剤である、請求項78〜88のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤が、2,2’-アゾビス-2,4-ジメチルバレロニトリル、および/または2,2'-アゾジ(2-メチルブチロニトリル)(AMBN)である、請求項78〜89のいずれか一項記載の方法。
- 有機溶媒が、脂肪族炭化水素、脂肪族カーボネート、脂肪族エステル、脂肪族エーテル、芳香族炭化水素、もしくはシリコーン、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項78〜90のいずれか一項記載の方法。
- 有機溶媒が、ヘプタンおよびトルエンの混合物;脂肪族炭化水素の混合物;任意で脂肪族および芳香族炭化水素と混合された、炭酸ビス(2-エチルヘキシル);またはアジピン酸ビス(2-エチルヘキシル)を含む、請求項78〜91のいずれか一項記載の方法。
- 単分散シード粒子が、請求項40〜55のいずれか一項記載の方法に従って形成された単分散シード粒子の特徴を有する、請求項78〜92のいずれか一項記載の方法。
- 単分散シード粒子が、請求項40〜55のいずれか一項記載の方法に従って形成される、請求項78〜92のいずれか一項記載の方法。
- 溶液(a)および/または溶液(e)が、60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、請求項78〜94のいずれか一項記載の方法。
- 溶液(a)および/または溶液(e)が、少なくとも2%wt、かつ60%wt以下の親水性ビニルモノマーを含み、任意で、溶液(a)および/または溶液(e)が、少なくとも5%wt、かつ45%wt以下の親水性ビニルモノマーを含む、請求項78〜95のいずれか一項記載の方法。
- 溶液(a)および/または溶液(e)が約10%wtの親水性ビニルモノマーを含む、請求項78〜96のいずれか一項記載の方法。
- 開始剤が、約0.1%wt〜約1.5%wtの量でエマルジョン中に存在し、任意で、開始剤が、約0.6%wt〜約1.2%wtの量でエマルジョン中に存在し、さらに任意で、開始剤が、約0.8%wtの量でエマルジョン中に存在する、請求項78〜97のいずれか一項記載の方法。
- 各重合が、ラジカル開始剤を活性化することを含む、請求項78〜98のいずれか一項記載の方法。
- ラジカル開始剤を活性化することが、膨潤粒子を含むエマルジョンを加熱することを含み、任意で、この加熱が、少なくとも40℃の温度へ加熱することを含む、請求項99記載の方法。
- 単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップを、少なくとも30分間、任意で少なくとも1時間行う、請求項78〜100のいずれか一項記載の方法。
- 単分散シード粒子が膨潤粒子を形成することを可能にするステップが、エマルジョンを混合することを含み、任意で、この混合を30℃以下の温度で行い、任意で、この混合を約15℃〜約25℃の温度で行う、請求項78〜101のいずれか一項記載の方法。
- 形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が多孔性である、請求項56〜102のいずれか一項記載の方法。
- 形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、0.5μm〜10μmまたは1μM〜10μmのモード径、任意で0.5μm〜5μmまたは1μm〜5μmのモード径を有する、請求項56〜103のいずれか一項記載の方法。
- 形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の変動係数(CV)が20%未満であり、任意で、CVが15%未満である、請求項56〜104のいずれか一項記載の方法。
- 形成された単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、官能基を含み、任意で、官能基が、ヒドロキシル、カルボン酸(-COOH)、第1級アミンまたは第2級アミンより選択される、請求項56〜105のいずれか一項記載の方法。
- 単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子へ1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを結合する工程をさらに含む、請求項106記載の方法。
- 請求項40〜55のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、単分散シード粒子。
- 請求項56〜107のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子。
- 核酸増幅における、請求項1〜33または請求項109のいずれか一項記載の単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の使用。
- 核酸増幅が、オリゴヌクレオチドを複数のオリゴヌクレオチドへ増幅することを含み、任意で、複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の少なくとも1つへ結合される、請求項110記載の使用。
- 核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅またはエマルジョンPCR増幅を含む、請求項110または111記載の使用。
- オリゴヌクレオチド配列決定における、請求項1〜33または請求項109のいずれか一項記載の単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子の使用。
- オリゴヌクレオチド配列決定が、化学電界効果トランジスタ(chemFET)に基づく配列決定またはイオン感応性電界効果トランジスタ(ISFET)に基づく配列決定を含む、請求項113記載の使用。
- 単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子が、約10℃〜約100℃の温度範囲で安定している、請求項110〜114のいずれか一項記載の使用。
- 粒子が多孔性であり、オリゴヌクレオチドならびに核酸増幅および配列決定試薬に対してトランスペアレントである、請求項110〜115のいずれか一項記載の使用。
- ポリマー粒子へ結合されているオリゴヌクレオチドへハイブリダイズされているポリヌクレオチドに対してプライマー伸長反応を行う工程を含む、核酸増幅のための方法であって、ポリマー粒子が、請求項1〜33または請求項109のいずれか一項記載の単分散架橋ヒドロゲルポリマー粒子である、方法。
- (a)単鎖オリゴヌクレオチドへ結合されたポリマー粒子を提供する工程;
(b)単鎖テンプレートポリヌクレオチドを提供する工程;
(c)単鎖オリゴヌクレオチドを単鎖テンプレートポリヌクレオチドへハイブリダイズさせる工程;および
(d)ポリメラーゼが単鎖オリゴヌクレオチド上への少なくとも1つのヌクレオチドの重合を触媒するために適した条件下で、単鎖テンプレートポリヌクレオチドとポリメラーゼおよび少なくとも1つのヌクレオチドとを接触させ、伸長された単鎖オリゴヌクレオチドを生じさせる工程
を含む、請求項117記載の方法。 - (e)単鎖オリゴヌクレオチドがポリマー粒子へ結合されたままとなるように、伸長された単鎖オリゴヌクレオチドから単鎖テンプレートポリヌクレオチドを除去する(例えば、変性させる)工程;
(f)残存している単鎖オリゴヌクレオチドを第2の単鎖テンプレートポリヌクレオチドへハイブリダイズさせる工程;および
(g)第2のポリメラーゼが単鎖オリゴヌクレオチド上への第2の少なくとも1つのヌクレオチドの重合を触媒するために適した条件下で、第2の単鎖テンプレートポリヌクレオチドと第2のポリメラーゼおよび第2の少なくとも1つのヌクレオチドとを接触させ、次の伸長された単鎖オリゴヌクレオチドを生じさせる工程
をさらに含む、請求項118記載の方法。 - (h)ヌクレオチド付加を検出することによって配列決定する工程
をさらに含む、請求項117〜119のいずれか一項記載の方法。 - ヌクレオチド付加を検出することが、付加された蛍光ヌクレオチドからの蛍光発光を検出すること、またはポリマー粒子の局所環境におけるpH変化を検出することを含む、請求項120記載の方法。
- ヌクレオチド付加を検出することが、イオンセンサーを用いてポリマー粒子の局所環境におけるpH変化を検出することを含み、任意で、イオンセンサーが電界効果トランジスタ(FET)であり、さらに任意で、イオンセンサーが化学電界効果トランジスタ(ChemFET)またはイオン感応性電界効果トランジスタ(ISFET)である、請求項121記載の方法。
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