CN113637116A - 聚合物颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及聚合物颗粒。本发明涉及单分散交联水凝胶聚合物颗粒，其包含由(a)亲水乙烯基单体形成的聚合物；和(b)包含至少两个乙烯基的交联剂。本发明还涉及具有100nm至1500nm的Z‑平均直径的单分散种子颗粒，其包含多个聚N,N‑二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物。还提供了形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒和单分散种子颗粒的方法。
Description
本申请是申请号为201680054042.0、申请日为2016年7月19日、优先权日为2015年7月20日、发明名称为“聚合物颗粒”的专利申请的分案申请。
本发明涉及在生物分析和其他应用中有用的单分散聚合物颗粒，以及用于制备单分散聚合物颗粒的方法中的种子颗粒。本发明还涉及用于制备这样的颗粒的方法，以及在这样的方法中使用的中间体和使用该颗粒的方法，以及其他主题。
背景技术
乳液聚合可用于形成50-1,000nm的相对单分散的聚合物颗粒。但是，单分散聚合物颗粒的形成有着许多重要的限制。首先，所有的颗粒必须以相同批次的一部分并且在相对于聚合时间较短的时间跨度内形成。其次，需要控制生长条件以确保在所有颗粒中聚合物颗粒的生长均是相同的。第三，由于该方法要求单体从大的储存液滴中转移并溶胀成生长的颗粒，所以颗粒或者不交联，或者具有非常低的交联水平，因为更高水平的交联将防止颗粒溶胀。
沉淀或分散聚合可用于产生0.5-10微米的较大颗粒。沉淀聚合在溶解单体但不溶解聚合物的溶剂(例如醇)中进行。当聚合物从溶液中沉淀出来并且在短时间跨度内发生颗粒形成时，可以实现单分散性。需要相对较大量的空间稳定剂来在沉淀后使颗粒稳定。稳定剂的量和类型可以改变颗粒的尺寸，并且可以通过使用高含量的交联剂来获得多孔颗粒。然而，沉淀聚合中的条件难以控制，例如，控制孔隙度是非常困难的，这是当聚合物从溶液中沉淀出来时如何形成孔结构的结果。沉淀聚合的困难意味着在实践中几乎不可能制备具有相同单体组成和孔隙度的多孔颗粒，其尺寸变化非常有限。
解决其中一些问题的一种方式是通过一种两阶段方法来制备交联多孔或固体单分散聚合物颗粒，该方法被称为Ugelstad方法，以已故的John Ugelstad教授命名，其记载于例如EP-B-3905和US-A-4530956中。一种改进的Ugelstad方法记载于WO 00/61647中。在Ugelstad方法中，合适地通过乳液聚合制备的种子颗粒通过种子悬浮聚合分两步转化为单分散颗粒。在第一步中，通过制备相对较低分子量的不溶于水的物质的微细(例如亚微米)水性乳液然后加入与水混溶的有机溶剂(例如丙酮)使不溶于水的物质扩散到种子颗粒中，来使种子颗粒溶胀。方便的是，该不溶于水的物质为热活化聚合引发剂。在第二步中，除去溶剂，将不溶于水的物质锁定在种子颗粒中，并且种子颗粒吸收大量的单体以及交联剂。在例如通过加热使引发剂活化来引发聚合之后，制备了较大的聚合物颗粒。因此，Ugelstad方法包括通过乳液聚合制备种子颗粒以及通过悬浮聚合使种子颗粒膨胀。前述现有技术中记载的最小单分散颗粒具有1μm的平均直径。
在Ugelstad方法的一个简化方案中，增强的溶胀能力可以简单地通过使用低聚种子颗粒来实现，例如其中低聚物重均分子量对应于至多50个单体单元(在聚苯乙烯的情况下分子量为约5000)。这记载于US 4530956中。在WO2010/125170中记载的Ugelstad方法的另一方案中，可以使用低聚种子颗粒来制造平均直径在亚微米范围内的单分散颗粒。
通过如上所述的Ugelstad方法及其变形方案制成的颗粒由疏水单体如苯乙烯通常使用在水性(连续相)体系中的油(不连续相)来制成。因此，所得的聚合物颗粒是疏水的。当用于生物应用时，疏水颗粒遭受非特异性吸收的问题。这意味着疏水聚合物颗粒在用于生物应用之前通常进行表面改性以增加表面的亲水性。
US 2014/0073715记载了制备单分散亲水颗粒的方法。该方法使用在聚合形成颗粒的单体中添加有疏水保护基团的单体，然后除去保护基团。这种方法提供了良好的结果。然而，添加和除去保护基增加了该方法的复杂性，并且可能限制了可用于该方法中的不同类型单体的数量。
显而易见的是，已知的单分散聚合物颗粒和制造这类颗粒的方法受到许多限制。因此需要新的单分散聚合物颗粒和新的制备方法。
本发明的目的在于提供具有低变异系数(CV)和/或低％多分散性的单分散聚合物颗粒以及制备单分散聚合物颗粒的方法。本发明的目的还在于提供适合用于制造这类单分散颗粒的种子颗粒。
发明内容
本发明部分地基于对包含亲水低聚物的种子颗粒可用于形成交联单分散聚合物颗粒的新方法的认识。
根据本发明的第一方面，提供了单分散交联水凝胶聚合物颗粒，其包含由以下形成的聚合物：(a)log Poct/wat(log P)小于约1的亲水乙烯基单体；以及(b)包含至少两个乙烯基的交联剂。
本发明的第二方面提供了具有100nm至1500nm的Z-平均直径的单分散种子颗粒，其中每个种子颗粒包含多个聚N,N-二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物。
本发明的第三方面提供了形成单分散种子颗粒的方法。该方法包括将N,N-二甲基丙烯酰胺、稳定剂、自由基引发剂和链转移剂溶解在有机溶剂中以形成反应混合物；以及加热反应混合物以使引发剂活化；从而形成单分散种子颗粒。
第四方面包括本发明的种子颗粒用于形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的用途。所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒可为交联聚丙烯酰胺颗粒。所述种子颗粒可是第二方面的种子颗粒。所述种子颗粒可是通过第三方面的方法可获得或获得的种子颗粒。
第五方面提供了形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法。所述方法包括在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(a)，所述水溶液还包含含有至少两个乙烯基的交联剂；在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(b)，其中所述有机溶剂不与水混溶，并且其中溶液(a)和溶液(b)中的至少一种包含自由基引发剂；；将溶液(a)和(b)混合以形成油包水乳液(c)并且将单分散种子颗粒添加到乳液中；使单分散种子颗粒在乳液中形成溶胀的颗粒；以及使溶胀的颗粒聚合以形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒。所述种子颗粒可以是第二方面的种子颗粒。所述种子颗粒可以是通过第三方面的方法可获得或获得的种子颗粒。
第六方面提供了形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法。所述方法包括在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(a)，所述水溶液还包含链转移剂；在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(b)，其中所述有机溶剂不与水混溶，并且其中溶液(a)和溶液(b)中的至少一种包含自由基引发剂；将溶液(a)和(b)混合以形成油包水乳液(c)并且将单分散种子颗粒添加到乳液中；使单分散种子颗粒在乳液中形成溶胀的颗粒；使溶胀的颗粒聚合以形成单分散聚合物颗粒；在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(d)，其中所述有机溶剂不与水混溶；在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(e)，所述水溶液还包含含有至少两个乙烯基的交联剂，其中溶液(d)和溶液(e)中的至少一种包含自由基引发剂；将溶液(d)和(e)混合以形成油包水乳液(f)并且将单分散聚合物颗粒添加到乳液中；使单分散聚合物颗粒在乳液中形成溶胀的聚合物颗粒；以及使溶胀的聚合物颗粒聚合以形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒。所述种子颗粒可以是第二方面的种子颗粒。所述种子颗粒可以是通过第三方面的方法可获得或获得的种子颗粒。
第七方面包括可通过第五或第六方面的方法获得的单分散交联水凝胶聚合物颗粒。所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒可通过第五或第六方面的方法获得。
第八方面包括单分散交联水凝胶聚合物颗粒在核酸扩增和/或寡核苷酸测序中的用途。所述核酸扩增可以是聚合酶链式反应(PCR)扩增或乳液PCR扩增。所述寡核苷酸测序可以是基于化学场效应晶体管(chemFET)的测序。所述寡核苷酸测序可以是基于离子敏感场效应晶体管(ISFET)的测序。
第九方面提供了用于核酸扩增的方法，其包括对与连接至本发明的聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的聚核苷酸(多核苷酸)进行引物延伸反应。
本发明的一个实施方案提供了通过本说明书中描述的方法获得的颗粒。
本发明的一个实施方案提供了具有通过本文所公开的方法获得的颗粒特征的颗粒；虽然这样的颗粒可通过本文所述的方法获得，但其特征仅在于其性质，而不在于其制造方法，因此，涉及由其特征限定的颗粒的权利要求的保护范围仅由颗粒的特征来确定而非其实际的制造方法。
本发明的产品、方法和用途不限于刚才提到的主题，而是没有限制地在以下的说明书和权利要求中更全面地描述。
附图说明
以下参照附图进一步描述本发明的实施方案，其中：
图1是本发明的单阶段溶胀颗粒形成方法的示意图，包括示例性单体的图示。
图2是本发明的单阶段颗粒形成方法的示意图。
图3是本发明的两阶段溶胀颗粒形成方法的示意图，包括示例性单体和链转移剂的图示。
图4是本发明的两阶段溶胀颗粒形成方法的示意图。
图5说明了本发明的颗粒在核苷酸测序和/或检测中的用途。
具体实施方式
在整个本说明书的描述和权利要求中，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”以及其变化形式意指“包括但不限于”，并且其并不意在(并且不)排出其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在整个本说明书的描述和权利要求中，单数涵盖复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，该叙述应被理解为考虑复数和单数，除非上下文另有要求。
与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整数、特性、化合物、化学片段或基团应被理解为可适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不兼容。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤均可以以任何组合进行组合，除了其中这些特征和/或步骤中的至少一些是相互排斥的。本发明不限于本文所公开的任何实施方案的细节。本发明延伸至本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征中的任何一个新的特征或任何新的组合，或者如此公开的任何方法或过程的步骤中的任何一个新的步骤或任何新的组合。
读者的注意力应涉及与本申请有关的与本说明书同时提交或在本说明书之前提交的所有文章和文件，并且其与本说明书一起公开供公众查阅，并且所有这些文章和文件的内容均通过引用的方式结合本文。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献均通过引用的方式以其全文结合本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
在一个实施方案中，本发明提供了新的聚合物颗粒，而另一个实施方案提供了可以制备所述新的颗粒的方法。一个实施方案提供了用于形成所述聚合物颗粒的方法中的新的种子颗粒，并且其他实施方案提供了使用可通过该方法获得的聚合物颗粒的方法。
聚合物颗粒形成方法涉及油包水乳液，即悬浮在连续油相中的不连续水相。
因此，本文所述的聚合物颗粒形成方法涉及两种不同的颗粒，即种子颗粒，其经历溶胀和聚合过程形成聚合物颗粒。因此术语“种子颗粒”和“聚合物颗粒”在本文中使用如下：
除非上下文另有要求，否则“种子颗粒”意指可通过分散聚合获得并且用作所述聚合物颗粒形成方法中的中间体的颗粒。
“聚合物颗粒”是指可以通过本文所述的方法中的悬浮聚合由种子颗粒制备的颗粒。
关于聚合物(例如聚合物颗粒)所提及的“水凝胶”意指其中溶胀剂是水的聚合物凝胶。水凝胶聚合物可以在水中吸收其重量的至少20％。水凝胶聚合物可以在水中吸收其重量的至少45％、至少65％、至少85％、至少100％或至少300％。例如，水凝胶聚合物可以在水中吸收其重量的至少1000％、至少1500％或甚至至少2000％。
关于聚合物颗粒(例如水凝胶聚合物颗粒)所提及的“通透的(transparent)”意指所述颗粒是多孔的，并且感兴趣的分子或其他试剂能够容易地扩散通过颗粒的孔隙中的水溶液。例如，本公开内容的交联水凝胶聚合物颗粒可以对寡核苷酸和核酸扩增和测序试剂是通透的，例如即使当聚合酶连接到寡核苷酸时，寡核苷酸也可以部分或全部位于孔隙内。
除非另有说明，否则本说明书中所提及的“平均”直径是指交联聚合物颗粒(例如交联水凝胶聚合物颗粒)的众数直径或者是指种子颗粒的z-平均直径。所述众数直径可以通过盘式离心机，例如通过CPS盘式离心机来测量。所述z-平均直径可以是通过动态光散射(也称为光子相关光谱)测量的z-平均直径。在整个范围内，还进一步公开了其中平均直径是众数直径的实施方案，例如众数直径由光学显微镜测定。
术语“单分散”意指对于多个颗粒(例如至少100个，更优选至少1000个)，颗粒的直径的变异系数(CV)或％多分散性小于20％，例如小于15％，通常小于10％，并且任选地小于8％，例如小于5％。
术语“Mw”为聚合物的重均分子量。其由下式定义：
其中Mi为特定链的分子量，而Ni为该分子量的链的数目。Mw可以使用凝胶渗透色谱法(GPC)相对于具有特定洗脱剂溶剂体系的一组标准聚合物来测量。例如，种子颗粒中的低聚物或聚合物的Mw可通过GPC相对于聚苯乙烯标准物使用带有0.01M的LiBr的DMF作为洗脱剂来测量。
在本说明书中所提及的“多分散性”或“％多分散性”是指源自于“多分散指数”的动态光散射数据的值。所述多分散性指数是由拟合相关数据(例如动态光散射数据)的简单2参数计算的数值，如ISO标准文件13321:1996E和ISO 22412:2008中所定义。多分散性指数是无量纲的并且是折合的，使得小于0.05的值除了使用高度单分散标准物之外很少被看到。样品颗粒的多分散性指数值大于0.7表明样品具有非常宽的尺寸分布，例如颗粒不是单分散的。
如本文所使用的术语“烷基”和“Cx-Cy烷基”(其中x为至少1且小于10，而y为大于10的数字)包括具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链烷基部分。该术语包括，例如甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基、己基等。特别地，烷基可为“C1-C6烷基”，即具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基；或“C1-C4烷基”，即具有1、2、3或4个碳原子的烷基。术语“低级烷基”包括具有1、2、3或4个碳原子的烷基。在化学上可能的情况下，烷基可以任选地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基(oxo)、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。
如本文所使用的术语“log P”是指化合物(例如亲水乙烯基单体)的辛醇-水分配系数(log Poct/wat)。化合物的log P可以通过多种方法中的任何一种来确定。具体而言，对于实施方案中使用的化合物和本文所公开的其他化合物，log P可通过摇瓶法来测量，其记载于J.Sangster,“Octanol-water partition coefficients of simple organiccompounds”,J.Phys.Chem.Ref.Data,第18卷,No.3,1989,1111-1227(其全文通过引用的方式结合本文)的2.1节1116页。Log P还可以使用软件由化合物的结构来计算，例如log P可以使用来自CambridgeSoft Corp的
Ultra 14.0来计算。
聚合物颗粒
本发明包括其中颗粒是聚合物且单分散的实施方案。本发明包括其中颗粒是多孔的实施方案。
颗粒的群体数量可为至少100，例如至少1000。例如，为了测量的目的，颗粒的群体数量可为至少100，例如至少1000。例如，在一些最终使用的应用中，颗粒的群体数量可以方便地为至少100，例如至少1000。
“单分散”意指对于多个颗粒(例如至少100个，更优选至少1000个)，颗粒的直径的变异系数(CV)小于20％，例如小于15％，通常小于10％，并且任选地小于8％，例如小于5％。一类特定的聚合物颗粒的CV小于10％。CV定义为100乘以(标准偏差)除以平均值，其中“平均值”是平均粒径，而标准偏差是粒度的标准偏差。本发明还包括其中“平均值”是z-平均粒径或众数粒径的实施方案。CV优选基于主众数计算。因此，一些低于或高于众数尺寸的颗粒可以在计算中折算，其可例如基于总颗粒数(即可检测颗粒)的约90％计。这种CV测定可以在CPS盘式离心机上进行。
聚合物颗粒可以通过随后在说明书中描述的聚合物颗粒形成方法来制备，例如，通过使用如本文所述的单分散种子颗粒。
现在回到聚合物颗粒，本说明书公开了交联水凝胶聚合物颗粒。交联水凝胶聚合物颗粒的特征在于，当置于为该聚合物的良好溶剂的水溶液中时，颗粒溶胀而不溶解。举例来说，水是包含丙烯酰胺聚合物的水凝胶颗粒的良好溶剂。水凝胶颗粒是亲水性的并在水中溶胀，并且可以制成各种不同的孔隙度。本文公开的交联水凝胶颗粒提供了低非特异性结合、单分散性和孔隙度的组合，其在颗粒用于生物分析时提供许多优点。
通过该方法制备的聚合物颗粒中的交联水平可以表示为在用于悬浮聚合的全部单体中所包含的交联剂单体的重量百分比(重量％)。交联剂单体的重量％可以等于基体聚合物中的交联剂的重量％(即交联剂在交联聚合物颗粒的干重中的重量％)。因此，在用于悬浮聚合的单体为例如单官能丙烯酰胺和双官能丙烯酰胺的情况下，基于双官能丙烯酰胺加上单官能丙烯酰胺的总重量以重量百分比来计算双官能丙烯酰胺(交联剂单体)的百分比。通常的交联水平包括>1重量％的交联剂，例如>2重量％的交联剂，例如>5重量％的交联剂。例如，交联水平可以是>10重量％的交联剂，或>15重量％的交联剂，例如>20重量％的交联剂或>25重量％的交联剂。交联水平还可以是例如5-60重量％的交联剂，例如10-50重量％的交联剂，例如20-40重量％的交联剂或20-30重量％的交联剂。交联水平还可以是1-30重量％的交联剂，例如1-20重量％的交联剂，例如1-10重量％的交联剂；或交联水平也可以是2-30重量％的交联剂，例如2-20重量％的交联剂，例如2-10重量％的交联剂：交联水平例如适合于多孔水凝胶颗粒。
交联度可以是>30重量％的交联剂或>40重量％的交联剂，例如在高度交联的颗粒中。交联水平可以是10-90重量％交联剂，20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂。在高度交联的颗粒中，交联水平可为最高达100重量％的交联剂，例如亲水乙烯基单体可以是交联剂。
如上所述，当置于聚合物的良好溶剂中时，交联颗粒溶胀。肿胀的量(例如以直径增加来衡量)与交联水平有关。具有较高交联度的颗粒的溶胀通常小于由类似的但交联度较低的聚合物制成的颗粒。通过将聚合物颗粒样品与已知的不同交联水平的一系列标准物进行比较，该性质可以用于确定聚合物颗粒样品中的相对交联水平。
颗粒合适地包含通过使一种或多种乙烯基不饱和单体聚合而制备的加成聚合物。所述乙烯基不饱和单体可以包含广义的乙烯基，-CR＝CH2，其中R是H或烷基(例如，其中R是-CH3或-CH2CH3)。乙烯基不饱和单体可以包含乙烯基，-CH＝CH2。单体可以是亲水乙烯基单体，例如log P值小于约1，例如log P值小于约0.5的乙烯基单体。亲水乙烯基单体可以包含广义的乙烯基，-CR＝CH2，其中R是H或烷基(例如，其中R是-CH3或-CH2CH3)。亲水乙烯基单体可以包含乙烯基，-CH＝CH2。单体可以是log P小于约0.6的乙烯基单体。单体可以是logP小于约0.5的乙烯基单体。例如，单体可以是log P小于约0.3或小于约0.2的乙烯基单体，例如单体可以是log P小于约0.1的乙烯基单体。单体可以是log P小于约0的乙烯基单体，例如log P小于约-0.2的乙烯基单体。单体可以是log P为0.5至-2的乙烯基单体，例如logP为0至-2，例如log P为-0.2至-2的乙烯基单体。特别地，单体可以是还包含亲水基团的乙烯基单体，例如丙烯酰胺单体或丙烯酸酯单体。
用于所述颗粒的单体可以是式(I)的至少一种化合物：
其中：
R1为-H、-CH3或-CH2CH3；
R2为-OR3或-N(R4)R5；
R3为-H、-C1-C6烷基或-C1-C6醇；以及
R4和R5彼此独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇。
当R3为-C1-C6烷基或-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，烷基或醇可以被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。例如，当R3为-C1-C6烷基或-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，烷基或醇可以被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自ORa或CO2Ra的取代基取代，任选地其中Ra为H。
当R4和/或R5为-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，其各自均可以独立地被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。例如，当R4和/或R5为-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，其各自均可以独立地被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自ORa或CO2Ra的取代基取代，任选地其中Ra为H。
R1可为-H或-CH3。例如，R1可为-H。
R2可为-OR3。R2可为-N(R4)R5。
R3可为-H。R3可为-C1-C6烷基。例如，R3可为-C1-C6烷基，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。R3可为-C1-C6醇。例如，R3可为-C1-C6醇，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。
R4可为-H或-C1-C6烷基。R4可为-C1-C6烷基。例如，R4可为-C1-C6烷基，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。
R5可为-H或-C1-C6烷基。R5可为-C1-C6烷基。例如，R5可为-C1-C6烷基，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。
例如，式(I)的化合物的log P值可以小于约1，例如log P小于约0.5。式(I)的化合物的log P可以小于约0.6。式(I)的化合物的log P可以小于约0.5。例如，式(I)的化合物的log P可以小于约0.3或小于约0.2，例如式(I)的化合物的log P可以小于约0.1。式(I)的化合物的log P可以小于约0，例如log P小于约-0.2。式(I)的化合物的log P可以为0.5至-2，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2。
单体可以包含至少一个包含伯酰胺基团(-C(O)NH2)的亲水乙烯基单体。
特别地可提及丙烯酰胺单体和/或丙烯酸酯单体。合适的单体包括丙烯酰胺(丙-2-烯酰胺)、N-(羟甲基)丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺、N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、3-丙烯酰胺基丙酸、甲基丙烯酰胺、N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、羟丙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、丙烯酸；以及其他的log P值小于约1(例如log P值小于约0.5)的丙烯酰胺单体、丙烯酸单体、甲基丙烯酰胺单体或甲基丙烯酸单体。
单体可以包含单体的混合物。例如，单体可以包含至少一种如上定义的单体和至少一种可相容的官能单体。相应的官能单体是如本文所定义的亲水乙烯基单体，其包含羧酸(-COOH)、伯胺或仲胺。
在高度交联的颗粒中，单体可以是或包括交联剂，例如如本文其他处所定义的交联剂。例如，单体可以是或包括式(IIa)或(IIb)的至少一种化合物。
官能单体可以是log P值小于约1的乙烯基单体，例如log P小于约0.5的乙烯基单体，其包含羧酸或伯胺。官能单体可以是log P小于约0.6的乙烯基单体。官能单体可以是log P小于约0.5的乙烯基单体。例如，官能单体可以是log P小于约0.3或小于约0.2的乙烯基单体，例如官能单体可以是log P小于约0.1的乙烯基单体。官能单体可以是log P小于约0的乙烯基单体，例如log P小于约-0.2的乙烯基单体。官能单体可以是log P为0.5至-2的乙烯基单体，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2的乙烯基单体。官能单体可以是包含羧酸或伯胺的式(I)的化合物。官能单体可以是包含羧酸或伯胺的丙烯酰胺单体。合适的官能单体包括3-丙烯酰胺基丙酸、4-丙烯酰胺基丁酸、5-丙烯酰胺基戊酸、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺和丙烯酸。
在存在至少一种官能单体的情况下，官能单体的量可以为约0.1至约100mol％，例如约0.2至约50mol％，例如约0.5至约40mol％或约1至约30mol％(例如约2至约20mol％)。官能单体的量可以为约0.1至约10重量％，例如约0.2至约5重量％，例如约0.5至约2重量％。所述重量％可以指在用于聚合过程中的全部单体中所包含的官能单体的重量百分比。全部单体可以例如包含不是所述至少一种官能单体的亲水乙烯基单体、交联剂和官能单体。
交联可以通过引入包含至少两个(例如两个)乙烯基(-CH＝CH2)作为共聚单体的交联剂来实现。所述交联剂可以是式(IIa)或(IIb)的至少一种化合物：
其中R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6杂烷基、-C1-C6环烷基-、-C1-C6羟烷基-、-C1-C6醚-、包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚；
R7和R8各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚；
R9为-N(R11)C(O)CH＝CH2；
R10选自-H和-N(R12)C(O)CH＝CH2；以及
R11和R12各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚。
交联剂可以是式(IIa)的至少一种化合物。交联剂可以是式(IIb)的至少一种化合物。
在化学上可能的情况下，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12可以独立地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H、C1-C4烷基和C1-C4烯基。
R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6杂烷基-、-C1-C6环烷基-、-C1-C6羟烷基-和-C1-C6醚-。R6可以选自-C1-C6烷基-和-C1-C6羟烷基-。R6可为-C1-C6烷基-，例如-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-或-(CH2)4-，例如-(CH2)2-。R6可为-C1-C6羟烷基-，例如-C(OH)H-、-(C(OH)H)2-、-(C(OH)H)3-或-(C(OH)H)4-，例如-(C(OH)H)2-。
R6可为-C1-C6杂烷基-，任选地其中杂原子是胺(例如叔胺)。例如，在杂原子上被C(O)Ra取代的-C1-C6杂烷基，任选地其中杂原子是胺，例如R6可为-CH2CH2N(C(O)CH＝CH2)CH2CH2-。
当R6是聚醚时，聚醚可以是直链或支链的。R6可以是包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚，例如包含2至50个C2-C3醚单元的聚醚。R6可以是包含2至100个C2醚单元的聚醚，例如包含2至50个C2醚单元的聚醚。例如，R6可以是-(CH2)r(OCH2CH2)nO(CH2)s，其中r和s各自独立地为2或3(例如2)；并且n为1至100的整数(例如1至50或1至25；例如5至50或5至25)。不希望受任何理论的束缚，认为包含聚醚的交联剂(例如其中R6是聚醚)在水相中具有优异的溶解性。这意味着，尽管这类交联剂可用于提供低交联水平的颗粒(例如1-20重量％的交联剂，或1-10重量％的交联剂)，但是这类包含聚醚的交联剂特别适合用于提供包含相对较高交联水平的颗粒，例如>20重量％的交联剂，>25重量％的交联剂或>30重量％的交联剂。例如，交联水平可为10-90重量％的交联剂，20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂。
R7和/或R8和/或R11和/或R12可为H。例如，R7和/或R8可为H。例如，R11和/或R12可为H。
式(II)的化合物的log P值可以小于约1，例如log P小于约0.5。式(II)的化合物的log P可以小于约0.6。式(II)的化合物的log P可以小于约0.5。例如，式(II)的化合物的log P可以小于约0.3或小于约0.2，例如式(II)的化合物的log P可以小于约0.1。式(II)的化合物的log P可以小于约0，例如log P小于约-0.2。式(II)的化合物的log P可以为0.5至-2，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2。
用于本发明的颗粒中的示例性交联剂包括N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、Ν,Ν'-亚乙基双(丙烯酰胺)、哌嗪二丙烯酰胺、甘油1,3-二甘油化物二丙烯酸酯(glycerol 1,3-diglycerolate diacrylate)、N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)、4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)、N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺。示例性交联剂N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)和4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)，(特别是N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺)特别适合用于高度交联的颗粒和机械上更稳定的颗粒，例如交联水平为至少20重量％的交联剂(例如交联水平为至少30重量％的交联剂)的颗粒。本发明的一个实施方案包括使用交联剂的组合。作为具体的单体，可以提及的是丙烯酰胺(丙-2-烯酰胺)，其中N,N'-(1,2-二羟基双丙烯酰胺)为合适的交联剂。作为具体的单体，可以提及的是羟甲基丙烯酰胺，其中N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺为合适的交联剂。作为具体的单体，可以提及的是羟乙基丙烯酰胺，其中N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺为合适的交联剂。
交联剂可以是不包含伯胺、仲胺、羟基或羧酸的化合物。交联剂可以是不包含伯胺、仲胺、羟基或羧酸的式(IIa)或式(IIb)的化合物。
表1列出了可使用的许多示例性单体和交联剂。表2列出了许多其他单体。表1和表2中列出的单体的log P值使用来自CambridgeSoft Corp的软件
Ultra14.0测定。在本发明的实施方案的一些颗粒中，例如由于单体的log P值的缘故，不使用表2的单体。此外，表2的单体丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸可以常规地用于Ugelstad方法，因此这些单体和具有较高log P值的其他单体可能较不优选用于本发明的颗粒，其可以用本文所述的聚合物颗粒形成方法来制备。
表1：示例性单体和交联剂
交联水凝胶聚合物颗粒中的交联水平可以表示为在用于聚合的全部单体中所包含的交联剂单体的重量百分比(重量％)。通常的交联水平包括>1重量％的交联剂，例如>2重量％的交联剂，例如>5重量％的交联剂。例如，交联水平可以是>10重量％的交联剂，或>15重量％的交联剂，例如>20重量％的交联剂(例如>30重量％的交联剂或>40重量％的交联剂)。交联水平还可以是1-60重量％的交联剂，例如5-30重量％的交联剂。例如，交联水平可以是5-60重量％的交联剂，例如10-50重量％的交联剂。交联水平也可以是，例如15-40重量％的交联剂，例如20-40重量％的交联剂，例如20-30重量％的交联剂。交联水平可以是10-90重量％的交联剂，20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂；例如在高度交联的颗粒中。交联水平还可以是1-30重量％的交联剂，例如1-20重量％的交联剂，例如1-10重量％的交联剂。交联水平还可以是2-30重量％的交联剂，例如2-20重量％的交联剂，例如2-10重量％的交联剂。在高度交联的颗粒中，交联水平可为最高达100重量％的交联剂，例如亲水乙烯基单体可以是交联剂。
在一个实施方案中，在颗粒具有至少1μm的直径的情况下，颗粒的平均直径可为至少500nm，例如至少600nm，任选地至少800nm。
在一个实施方案中，在颗粒具有不超过2μm的直径的情况下，颗粒的平均直径可为不超过10μm，例如不超过5μm，任选地不超过3μm。
在一个实施方案中，本发明包括平均直径为0.5μm至10μm的一类聚合物颗粒，例如0.8μm至5μm。
聚合物颗粒的尺寸和尺寸分布可以如下文在标题“分析方法”下所描述进行测定。
本公开内容包括孔隙度为至少5％，例如至少10％的多孔聚合物颗粒。本公开内容包括孔隙度为20％至95％，特别是30％至90％，例如40％至90％，例如50％至80％的多孔颗粒。
由于丙烯酰胺和丙烯酸酯聚合物的密度为约1.3g/mL，而水的密度为约1g/mL，所以可以在确定水凝胶聚合物颗粒的密度后来计算孔隙度。多孔聚合物颗粒可以对溶剂化分子是通透的，例如多孔聚合物颗粒可以对寡核苷酸和核酸扩增试剂和测序试剂(例如引物、核苷酸和聚合酶)是通透的。
在一个实施方案中，颗粒包含官能团。官能团可以选自羟基、羧酸(-COOH)、伯胺或仲胺。在一个实施方案中，官能团由亲水乙烯基单体(例如式(I)的化合物)而不是交联剂(例如式(IIa)或式(IIb)的化合物)提供。可以对官能团进行增强来促进与靶分析物(例如寡核苷酸)或靶受体的结合。本文在与“颗粒的使用”相关的部分中描述了对本发明的颗粒的官能团进行增强的示例性方法。
在一个实施方案中，颗粒包含一个或多个连接至颗粒的寡核苷酸。寡核苷酸可以通过连接体(linker)连接至颗粒上。例如，每个(或一部分)颗粒可以包含多个连接至颗粒上的寡核苷酸。对于每个单个颗粒，多个寡核苷酸可以是相同的。例如，第一颗粒可以包含多个具有连接至所述第一颗粒的第一序列的寡核苷酸，并且第二颗粒可以包含多个具有连接至所述第二颗粒的第二序列的寡核苷酸。在本发明的颗粒是多孔的实施方案中，寡核苷酸可以连接至颗粒的外表面上，或连接在孔内，或连接在整个颗粒基质上。孔可以具有足够的尺寸以使得颗粒对寡核苷酸、相关分子和其他试剂通透，从而使寡核苷酸可以部分或全部位于孔内，即使当聚合酶连接至寡核苷酸时也是如此。
在水溶液的典型温度范围内，本发明的颗粒可以是稳定的(即耐聚合物降解)。单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以在最高达约100℃的温度下是稳定的。例如，单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以在约0℃至约100℃的温度范围内是稳定的。
种子颗粒
聚合物颗粒可以由特定的种子颗粒开始通过聚合物颗粒形成方法来制备。申请人已经确定，通常用于其他方法中的种子颗粒，例如聚苯乙烯种子颗粒，与本发明的方法不相容。因此，本发明提供了适用于本发明的聚合物颗粒形成方法的种子颗粒。
在一个实施方案中，种子颗粒是单分散的。种子颗粒包含多个聚N,N-二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物且z-平均直径为100nm至1,500nm。每个种子颗粒可包含多于1×105(例如多于1×106)个聚N,N-二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物，例如每个种子颗粒可包含多于5×106个聚N,N-二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物。
种子颗粒的z-平均直径可为150nm至1,300nm。例如，种子颗粒的z-平均直径可为300nm至1,100nm。
当通过GPC相对于聚苯乙烯标准物测量时，低聚物的重均分子量(Mw)为约2,000Da至约100,000Da。除了所述的Mw范围之外或作为另外一种选择，每种低聚物的聚合物可包含约30至2,000(例如约60至约1,000或约80至约500)个单体单元。
种子颗粒低聚物的Mw可小于100,000Da，任选小于50,000Da，进一步任选小于40,000Da，例如小于30,000Da。Mw可大于4,000Da，任选大于5,000Da，进一步任选大于6,000Da，如在大于8,000Da的情况下，例如大于10,000Da。例如，Mw可为5,000Da至70,000Da，例如6,000Da至60,000Da，例如7,000Da至50,000Da或8,000Da至40,000Da。
不希望受到任何理论的束缚，认为种子颗粒的低聚物的Mw是种子颗粒的重要特征。例如，可能必需具有在所述范围内的种子颗粒低聚物的Mw来提供在本文所述的颗粒形成方法过程中形成单分散聚合物颗粒的种子颗粒。如果种子颗粒聚合物具有更高的分子量，例如因为在种子颗粒形成过程中未使用链转移剂(例如对于M.Babic和D.Horak,Macromolecular Reaction Engineering,2007,1,86-94的单分散微球)，则该颗粒不适合用于本发明的方法，例如因为由这种方法产生的颗粒可能不是单分散的，例如CV可能大于20％。
种子颗粒可以具有根据本文公开的形成种子颗粒的方法形成的种子颗粒的特征。例如，种子颗粒可以具有在有机溶剂中在稳定剂和链转移剂存在下通过N,N-二甲基丙烯酰胺的自由基引发聚合形成的种子颗粒的特征。
种子颗粒的制备
聚合物颗粒可以由特定的种子颗粒开始通过本文所述的方法制备。因此本发明提供了制备单分散种子颗粒的方法。
单分散种子颗粒可以通过以下方法制备，所述方法包括将N,N-二甲基丙烯酰胺、稳定剂、自由基引发剂和链转移剂溶解在有机溶剂中以形成反应混合物；并且加热反应混合物以使引发剂活化，由此形成单分散种子颗粒。
在该方法中，一旦在合适的容器中形成反应混合物，则典型地将该反应混合物混合，例如在加热步骤期间用搅拌器混合。
优选地，聚合反应在包含最小量的氧气的反应混合物中发生。因此，可以在加热反应混合物之前，将反应混合物清除氧气。清除可以包括用化学惰性气体喷射。惰性气体可以是氮气或稀有气体(例如氦气、氖气、氩气、氪气或氙气)。例如，惰性气体可以是氩气、氦气或氮气，例如氩气或氮气。
该方法可被认为是反沉淀聚合，其中亲水种子颗粒从有机溶剂中沉淀出来。稳定剂可以防止种子颗粒的聚集，有助于形成单分散种子颗粒。合适的稳定剂的选择取决于稳定剂溶解在有机溶剂中的能力。稳定剂可以是苯乙烯和聚烯烃的嵌段共聚物，例如基于苯乙烯和乙烯/丁烯的三嵌段共聚物，例如由苯乙烯和乙烯/丁烯组成的线性三嵌段共聚物。稳定剂可以是由聚(乙烯-共-丁烯)中间嵌段和聚苯乙烯外侧嵌段组成的三嵌段共聚物。示例性的稳定剂包括Kraton A1535H、Kraton G1650M、Kraton G1652M或Kraton G1657M，或其组合。
自由基引发剂可以是过氧化物引发剂或偶氮引发剂，例如在升高的温度下分解的过氧化物引发剂或偶氮引发剂。示例性的自由基引发剂包括2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)、2,2'-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)、过氧化二苯甲酰等。自由基引发剂可以是2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)。反应混合物可以被加热至的温度取决于自由基引发剂活化的温度。加热反应混合物使引发剂活化可以包括将反应混合物加热至至少40℃的温度，例如加热至至少50℃的温度，例如加热至至少60℃的温度，或者例如加热至至少70℃的温度。例如，当自由基引发剂是2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)时，可将反应混合物加热至至少50℃的温度或至少60℃的温度。
通过与生长中的聚合物链的自由基反应使链终止并且将孤电子转移至衍生自链转移剂的自由基物种，链转移剂的添加降低了种子颗粒的聚合物的分子量。然后所述衍生自链转移剂的自由基物种可以与单体反应而由单体形成自由基，然后其可以与另一单体反应而开始形成新的聚合物链。链转移剂可以是硫醇或卤代烷。例如，链转移剂可以选自硫醇(例如1-辛硫醇、己硫醇、6-巯基-1-己醇、苄硫醇)、烷基硫醇(例如1-辛硫醇、己硫醇)、四氯化碳和溴三氯甲烷。例如，链转移剂可以是1-辛硫醇。链转移剂的总添加量可为1mol/10mol单体至1mol/300mol单体，例如1mol/20mol单体至1mol/100mol单体，例如约1mol链转移剂/30mol单体。链转移剂的添加时间对于获得单分散种子颗粒是重要的：链转移剂应该在聚合引发之前(即在自由基引发剂活化之前)存在于反应混合物中。该发现是出人意料的，因为对于在常规Ugelstad方法中使用的种子颗粒(例如聚苯乙烯种子颗粒)，应当在颗粒形成开始之后添加链转移剂(如果添加的话)，如WO 2010/125170中所教导，其通过引用的方式结合本文。
有机溶剂可以包含烷烃组分和芳族化合物组分的混合物。有机溶剂可以包含单一组分，例如烷烃组分或芳族化合物组分。烷烃组分可以是或包括己烷、庚烷或辛烷。芳族化合物组分可以是或者包含C1-C10烷基取代的苯基或C1-C8二烷基取代的苯基，例如C1-C4烷基取代的苯基，例如甲苯。当有机溶剂包括单一组分并且该组分为芳族化合物组分时，芳族化合物组分可以是C4-C12烷基取代的苯基或C2-C8二烷基取代的苯基。烷烃组分可以是庚烷并且芳族化合物组分可以是甲苯。烷烃组分和芳族化合物组分可以以约0.5:1至约20:1的烷烃组分:芳族化合物组分的重量比存在，例如烷烃组分:芳族化合物组分的重量比可以为约1:1至约15:1，例如约1:1至约10:1。
反应混合物可以包含：约2重量％至约5重量％的量的N,N-二甲基丙烯酰胺；约1重量％至约5重量％的量的稳定剂；约0.01重量％至约4重量％(例如约0.05重量％至约0.25重量％)的量的自由基引发剂；以及约0.05重量％至约0.25重量％的量的链转移剂。
然后可以使单分散种子颗粒经历颗粒形成方法，例如如下所述：
颗粒的制备
本发明提供了形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法。Ugelstad方法不能用于直接形成这样的颗粒，例如因为Ugelstad方法要求颗粒在水包油乳液的油相中形成，而水凝胶聚合物颗粒和相应的亲水单体应优先可溶于水。申请人已经通过提供本公开内容的方法解决了这个问题，其提供了使用油(连续相)包水(不连续相)体系的颗粒形成方法。据信这代表了用于形成单分散交联聚合物颗粒的第一个这种方法。
在一个实施方案中，本发明提供了形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法。该方法包括在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(a)，所述水溶液还包含含有至少两个乙烯基的交联剂；在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(b)，其中所述有机溶剂不与水混溶，并且其中溶液(a)和(b)中的至少一种包含自由基引发剂；；将溶液(a)和(b)混合以形成油包水乳液(c)并且将单分散种子颗粒添加到乳液中；使单分散种子颗粒在乳液中形成溶胀的颗粒；以及使溶胀的颗粒聚合以形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒。如下所述，该方法可以被认为是单阶段方法，因为其包括单一的溶胀步骤和单一的聚合步骤。
溶液(a)可以通过首先在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液，然后添加交联剂来形成；交联剂可以在亲水乙烯基单体之前添加；或亲水乙烯基单体和交联剂可以大约同时添加到溶液中。类似地，稳定剂和自由基引发剂可以大约同时或依次添加到溶液(b)中。
在本公开内容的上下文中，当将至少5重量％的水与有机溶剂混合时，如果有机溶剂和水分离成两个单独的相，则认为有机溶剂不与水混溶。
该方法涉及用在油连续相中的水性不连续相来使种子颗粒溶胀。图1(用特定单体说明)和图2(更一般地说明)提供了该方法的示意图，其可以被认为是单阶段方法，因为其包括单一的溶胀步骤和单一的聚合步骤。图1和图2中所示的方法方便地分成2个步骤，单分散种子颗粒100的溶胀形成溶胀的颗粒110，以及在溶胀的种子颗粒中的单体的聚合形成交联水凝胶聚合物颗粒120。在第一步之前，形成油包水乳液。所述油包水乳液通过将包含示例性单体丙烯酰胺101和示例性交联剂1,2-二羟基双丙烯酰胺102的水溶液与包含空间稳定剂的油相混合来形成，其中当搅动水相和油相时形成乳液(例如通过搅拌)。如果需要(非常)高度交联的颗粒，也可以用交联剂代替单体，使得存在于油包水乳液中的唯一单体是交联单体(即交联剂，例如1,2-二羟基双丙烯酰胺102)。油包水乳液通常还含有可以添加到油相中的引发剂。引发剂是在活化时会引发单体和交联剂聚合的化合物。单分散种子颗粒100包含聚N,N-二甲基丙烯酰胺131的非交联低聚物并且被认为是“活化的种子颗粒”。种子颗粒100可以如本申请中其他处所述来制备。在第一步中，将单分散种子颗粒100添加到油包水乳液中，并将该乳液搅动一段时间(例如至少30分钟或至少1小时，通常4-48小时)。在此段时间期间，单体101和交联剂102扩散到活化的种子颗粒100中形成溶胀的种子颗粒110。溶胀的种子颗粒110包含至少单体101、交联剂102和来自活化的种子颗粒100的聚合物的混合物。溶胀的种子颗粒110还可以包含其他组分，例如一种或多种致孔剂，如果包含在油包水乳液中，则其可以进入颗粒。例如，在所示的方法中，水也存在于溶胀的种子颗粒110中，并且该水可以被认为是致孔剂。第二步包括单体101和交联剂102的聚合形成交联水凝胶聚合物颗粒120。在第二步中，通过使引发剂活化来引发聚合，例如通过加热乳液。
提供活化的种子颗粒是成功的Ugelstad方法的关键特征。种子颗粒的活化通常通过添加溶解度非常低的有机化合物作为乳液来产生熵活化的种子颗粒而提供。然而，申请人已出人意料地确定，该额外的活化步骤在所述方法中不是必需的，例如其中种子颗粒包含聚N,N-二甲基丙烯酰胺的低聚物。
溶胀对于颗粒形成方法的实施方案而言是关键的。在该方法中，单体和(当存在时)致孔剂需要在连续相中具有有限的溶解度。如果单体和致孔剂在连续相中具有太高的溶解度，则所述溶解度不会帮助驱动单体(和任选的致孔剂)进入种子并形成溶胀的颗粒。另一方面，如果单体(和任选的致孔剂)在连续相中的溶解度不足，则通过连续相的扩散可以忽略不计，因此单体不可能向种子传质，阻碍了溶胀的颗粒的形成。完成溶胀的时间，即直到所有单体(和任选的致孔剂)共定位至种子颗粒上的时间，将高度取决于诸如温度、溶解度和粘度的因素，并且因此将随体系而变化。因此，允许单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤的典型时间尺度将在30分钟至48小时之间变化。例如，在该方法的一个实施方案中，允许单分散种子颗粒溶胀的步骤可以进行至少30分钟，例如至少1小时。允许单分散种子颗粒溶胀的步骤可以进行至少4小时、至少8小时或至少12小时。溶胀时间的上限不认为是关键的，例如相信可以使用几天的溶胀时间，例如3天或2天。
允许单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤可以包括将乳液混合，例如将乳液在基本上全部的溶胀时间内混合。允许单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤可以在约10℃至约60℃的温度下进行，例如在约10℃至约40℃的温度下进行，在约15℃至约30℃的温度下进行。例如，混合可以在约10℃至约60℃的温度下进行，例如在约10℃至约40℃的温度下进行，例如在约15℃至约30℃的温度下进行。
溶液(a)在水溶液中包含至少2重量％的亲水乙烯基单体。所述水溶液可以是水。水溶液可以包含水和最高达50重量％(例如最高达30重量％或最高达25重量％，例如最高达20重量％，任选最高达10重量％)的与水混溶的有机溶剂。与水混溶的有机溶剂可以是C1-C4醇，例如乙醇或甲醇，例如甲醇。与水混溶的有机溶剂可以是C2-C4腈，例如乙腈。
亲水乙烯基单体可以包含广义的乙烯基，-CR＝CH2，其中R是烷基(例如，其中R是-CH3或-CH2CH3)。亲水乙烯基单体可以包含乙烯基，-CH＝CH2。亲水乙烯基单体可以是log P值小于约1，例如log P小于小于约0.5的乙烯基单体。单体可以是log P小于约0.6的乙烯基单体。单体可以是log P小于约0.5的乙烯基单体。例如，单体可以是log P小于约0.3或小于约0.2的乙烯基单体，例如单体可以是log P小于约0.1的乙烯基单体。单体可以是log P小于约0的的乙烯基单体，例如log P小于约-0.2的乙烯基单体。单体可以是log P为0.5至-2的乙烯基单体，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2的乙烯基单体。特别地，单体可以是还包含亲水基团的乙烯基单体，例如丙烯酰胺单体或丙烯酸酯单体。
该方法中使用的单体可以是式(I)的至少一种化合物，其中R1是-H、-CH3或-CH2CH3；R2是-OR3或-N(R4)R5；；R3是-H、-C1-C6烷基或-C1-C6醇；并且R4和R5各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇。
当R3为-C1-C6烷基或-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，烷基或醇可以被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。例如，当R3为-C1-C6烷基或-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，烷基或醇可以被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自ORa或CO2Ra的取代基取代，任选地其中Ra为H。
当R4和/或R5为-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，其各自均可以独立地被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。例如，当R4和/或R5为-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇时，在化学上可能的情况下，其各自均可以独立地被1至5个(例如1、2、3或4个)在每种情况下各自独立地选自ORa或CO2Ra的取代基取代，任选地其中Ra为H。
R1可为-H或-CH3。例如，R1可为-H。
R2可为-OR3。R2可为-N(R4)R5。
R3可为-H。R3可为-C1-C6烷基。例如，R3可为-C1-C6烷基，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。R3可为-C1-C6醇。例如，R3可为-C1-C6醇，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。
R4可为-H或-C1-C6烷基。R4可为-C1-C6烷基。例如，R4可为-C1-C6烷基，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。
R5可为-H或-C1-C6烷基。R5可为-C1-C6烷基。例如，R5可为-C1-C6烷基，其被1或2个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、卤素、氰基、NRaRa、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基，例如其中Ra为-H。
式(I)的化合物的log P值可以小于约1，例如log P小于约0.5。式(I)的化合物的log P可以小于约0.6。式(I)的化合物的log P可以小于约0.5。例如，式(I)的化合物的logP可以小于约0.3或小于约0.2，例如式(I)的化合物的log P可以小于约0.1。式(I)的化合物的log P可以小于约0，例如log P小于约-0.2。式(I)的化合物的log P可以为0.5至-2，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2。
单体可以包含至少一个包含伯酰胺基团(-C(O)NH2)的亲水乙烯基单体。
特别地可提及丙烯酰胺单体和/或丙烯酸单体。合适的单体包括丙烯酰胺(丙-2-烯酰胺)、N-(羟甲基)丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺、N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、3-丙烯酰胺基丙酸、甲基丙烯酰胺、N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、羟丙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、丙烯酸；以及其他的log P值小于约1(例如log P值小于约0.5)的丙烯酰胺单体、丙烯酸单体、甲基丙烯酰胺单体或甲基丙烯酸单体。
溶液(a)可以包含不超过60重量％的亲水乙烯基单体。例如，溶液(a)可以包含不超过55重量％或50重量％的亲水乙烯基单体。例如，溶液(a)可以包含不超过45重量％或40重量％的亲水乙烯基单体；例如溶液(a)可以包含不超过30重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少5重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过50重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过50重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过30重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的乙烯基单体且不超过30重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过15重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含约10重量％的亲水乙烯基单体。
亲水乙烯基单体可以包含单体的混合物。例如，单体可以包含至少一种如上定义的单体和至少一种相容的官能单体。相应的官能单体是如本文所定义的亲水乙烯基单体，其包括羧酸(-COOH)、伯胺或仲胺。官能单体可以是log P值小于约1(例如log P小于约0.5)的乙烯基单体，其包括羧酸或伯胺。官能单体可以是log P小于约0.6的乙烯基单体。官能单体可以是log P小于约0.5的乙烯基单体。例如，官能单体可以是log P小于约0.3或小于约0.2的乙烯基单体，例如官能单体可以是log P小于约0.1的乙烯基单体。官能单体可以是log P小于约0的乙烯基单体，例如log P小于约-0.2。官能单体可以是log P为0.5至-2的乙烯基单体，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2。官能单体可以是包含羧酸或伯胺的式(I)的化合物。官能单体可以是包含羧酸或伯胺的丙烯酰胺单体。合适的官能单体包括3-丙烯酰胺基丙酸、4-丙烯酰胺基丁酸、5-丙烯酰胺基戊酸、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺以及丙烯酸。
在存在至少一种官能单体的情况下，官能单体的量可以为约0.1至约100mol％，例如约0.2至约50mol％，例如约0.5至约40mol％或约1至约30mol％(例如约2至约20mol％)。官能单体的量可以为约0.1至约10mol％，例如约0.2至约5mol％，例如约0.5至约2mol％。mol％可以指包含在溶液(a)(即在水中包含至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液)的全部亲水乙烯基单体中的官能单体的摩尔百分比。
在高度交联的颗粒中，单体可以是或包括交联剂。例如，单体可以是或包括至少一种式(IIa)或式(IIb)的化合物。
所述方法中使用的交联剂可以包含至少两个(例如2个)乙烯基(-CH＝CH2)。所述方法中使用的交联剂可以是式(IIa)或式(IIb)的至少一种化合物，其中R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6杂烷基-、-C1-C6环烷基-、-C1-C6羟烷基-、-C1-C6醚-或包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚；且R7和R8各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚；R9为-N(R11)C(O)CH＝CH2；R10选自-H和-N(R12)C(O)CH＝CH2；且R11和R12各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚。
交联剂可以是式(IIa)的至少一种化合物。交联剂可以是至少一种式(IIb)的化合物。
在化学上可能的情况下，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12可以独立地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H、C1-C4烷基和C1-C4烯基。
R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6杂烷基-、-C1-C6环烷基-、-C1-C6羟烷基-和-C1-C6醚-。R6可以选自-C1-C6烷基-和-C1-C6羟烷基-。R6可为-C1-C6烷基-，例如-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-或-(CH2)4-，例如-(CH2)2-。R6可为-C1-C6羟烷基-，例如-C(OH)H-、-(C(OH)H)2-、-(C(OH)H)3-或-(C(OH)H)4-，例如-(C(OH)H)2-。
R6可为-C1-C6杂烷基-，任选地其中杂原子是胺(例如叔胺)。例如，在杂原子上被C(O)Ra取代的-C1-C6杂烷基，任选地其中杂原子是胺，例如R6可为-CH2CH2N(C(O)CH＝CH2)CH2CH2-。
当R6是聚醚时，聚醚可以是直链或支链的。R6可以是包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚，例如包含2至50个C2-C3醚单元的聚醚。R6可以是包含2至100个C2醚单元的聚醚，例如包含2至50个C2醚单元的聚醚。例如，R6可以是-(CH2)r(OCH2CH2)nO(CH2)s，其中r和s各自独立地为2或3(例如2)；并且n为1至100的整数(例如5至50或5至25)。不希望受到任何理论的束缚，认为包含聚醚的交联剂(例如其中R6是聚醚)在水相中具有优异的溶解性。这意味着，尽管这类交联剂可用于提供低交联水平的颗粒(例如1-20重量％的交联剂，或1-10重量％的交联剂)，但是这样的包含聚醚的交联剂特别适合用于提供包含相对较高交联水平的颗粒，例如>20重量％的交联剂，>25重量％的交联剂或>30重量％的交联剂。例如，交联水平可为10-90重量％的交联剂，20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂。
R7和/或R8和/或R11和/或R12可为H。例如，R7和/或R8可为H。例如，R11和/或R12可为H。
式(II)的化合物的log P值可以小于约1，例如log P小于约0.5。式(II)的化合物的log P可以小于约0.6。式(II)的化合物的log P可以小于约0.5。例如，式(II)的化合物的log P可以小于约0.3或小于约0.2，例如式(II)的化合物的log P可以小于约0.1。式(II)的化合物的log P可以小于约0，例如log P小于约-0.2。式(II)的化合物的log P可以为0.5至-2，例如log P为0至-2，例如log P为-0.2至-2。
所述方法的实施方案中使用的示例性交联剂包括N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、N,N'-亚乙基双(丙烯酰胺)、哌嗪二丙烯酰胺、甘油1,3-二甘油基二丙烯酸酯、N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)、4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)、N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺。示例性交联剂N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)和4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)(例如N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺)特别适合用于高度交联的颗粒和机械上更稳定的颗粒，即交联水平为至少20重量％的交联剂(例如交联水平为至少30重量％的交联剂)的颗粒。实施方案还可以包括使用交联剂的组合。
交联剂可以是不包含伯胺、仲胺、羟基或羧酸的化合物。交联剂可以是不包含伯胺、仲胺、羟基或羧酸的式(IIa)或式(IIb)的化合物。
通过所述方法形成的交联水凝胶聚合物颗粒中的交联水平可以表示为在用于聚合的全部单体中所包含的交联剂单体的重量百分比(重量％)。通常的交联水平包括>5重量％的交联剂，例如>10重量％的交联剂，或>15重量％的交联剂，例如>20重量％的交联剂。交联水平还可以是，例如5-60重量％的交联剂，例如10-50重量％的交联剂。交联水平也可以是，例如15-40重量％的交联剂，例如20-40重量％的交联剂，例如20-30重量％的交联剂。因此，溶液(a)可以包含的以重量％计的交联剂的量对应于亲水乙烯基单体的量的5-60％，例如亲水乙烯基单体的量的10-50％。因此，溶液(a)可以包含的以重量％计的交联剂的量对应于例如亲水乙烯基单体的量的15-40％，例如亲水乙烯基单体的量的20-40％，例如亲水乙烯基单体量的20-30％。
例如在高度交联的颗粒中，交联水平可以是>30重量％的交联剂或>40重量％的交联剂(例如>50重量％的交联剂)。交联水平可以是10-90重量％的交联剂、20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂。在高度交联的颗粒中，交联水平可以最高达100重量％的交联剂，例如亲水乙烯基单体可以是交联剂，例如亲水乙烯基单体和交联剂可以是相同化合物。因此，溶液(a)可以包含的以重量％计的交联剂的量对应于亲水乙烯基单体的量的20-80％，例如亲水乙烯基单体的量的25-60％。
作为具体的亲水乙烯基单体，可以提及丙烯酰胺(丙-2-烯酰胺)，其中1,2-二羟基双丙烯酰胺是合适的交联剂。作为具体的亲水乙烯基单体，可以提及羟甲基丙烯酰胺，其中N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺是合适的交联剂。作为具体的亲水乙烯基单体，可以提及羟乙基丙烯酰胺，其中N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺是合适的交联剂。
稳定剂可以是或包括非离子表面活性剂，例如非离子聚合物表面活性剂。非离子表面活性剂可以包含至少一种低聚物表面活性剂。例如，非离子表面活性剂可以包含低聚物表面活性剂。非离子聚合物或低聚物表面活性剂可以包含至少一个聚氧乙烯基团或至少一个聚氧丙烯基团。非离子聚合物表面活性剂可以包含至少一个聚氧乙烯基团。非离子低聚物表面活性剂可以包含至少一个聚氧乙烯基团或至少一个聚氧丙烯基团。稳定剂可以选自或包括hypermer 2296、Abil WE09、Abil EM90和脱水山梨糖醇单油酸酯(Span 80)。
聚合可以包括使自由基引发剂活化。自由基引发剂通常通过加热形成会引发聚合反应的自由基来活化，然而也可以使用其他活化方法，例如辐射。使自由基引发剂活化可以包括加热包含溶胀的颗粒的乳液。加热通常包括将乳液加热至温度高于允许单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤的温度。加热可以包括加热至至少40℃的温度，例如加热至至少50℃的温度，例如至少60℃的温度或至少70℃的温度。
自由基引发剂可以是或包括过氧化物引发剂或偶氮引发剂。例如，自由基引发剂可以是过氧化物引发剂。例如，自由基引发剂可以是偶氮引发剂。示例性的自由基引发剂为2,2'-偶氮双-2,4-二甲基戊腈。示例性的自由基引发剂为2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)。自由基引发剂可以存在于溶液(a)中。自由基引发剂可以存在于溶液(b)中。自由基引发剂可以以约0.1重量％至约1.5重量％的量存在于乳液中。例如，自由基引发剂可以以约0.6重量％至约1.2重量％的量存在于乳液中；例如在乳液中自由基引发剂可以约0.8％的量存在于乳液中。
在形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法中使用的有机溶剂可以包含(或由其组成)至少一种脂族烃、脂族碳酸酯、脂族酯、脂族醚、芳族烃或硅酮，或其组合。例如，有机溶剂可以包含(或由其组成)脂族烃、脂族碳酸酯、脂族酯、脂族醚、芳族烃和硅酮中的至少两种；或有机溶剂可以包含(或由其组成)脂族烃、脂族碳酸酯、脂族酯、脂族醚、芳族烃和硅酮中的至少三种。有机溶剂可以包含(或由其组成)庚烷和甲苯的混合物。有机溶剂可以包含(或由其组成)脂族烃的混合物。有机溶剂可以包含(或由其组成)双(2-乙基己基)碳酸酯。有机溶剂可以包含(或由其组成)双(2-乙基己基)碳酸酯、脂族烃和芳族烃。有机溶剂可以包含(或由其组成)双(2-乙基己基)己二酸酯。
添加到油包水乳液(c)中的单分散种子颗粒可以具有根据本文公开的制备单分散种子颗粒的方法形成的单分散种子颗粒的特征。添加到油包水乳液(c)中的单分散种子颗粒可以是根据本文公开的制备单分散种子颗粒的方法形成的单分散种子颗粒。单分散种子颗粒可以是本公开内容的单分散种子颗粒，例如本发明的单分散种子颗粒。
在一个实施方案中，本发明提供了形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法。所述方法包括在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(a)，所述水溶液还包含链转移剂；在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(b)，其中所述有机溶剂不与水混溶，并且其中溶液(a)和溶液(b)中的至少一种包含自由基引发剂；将溶液(a)和(b)混合以形成油包水乳液(c)并且将单分散种子颗粒添加到乳液中；使单分散种子颗粒在乳液中形成溶胀的颗粒；使溶胀的颗粒聚合以形成单分散聚合物颗粒；在有机溶剂中形成稳定剂溶液(d)，其中所述有机溶剂不与水混溶；在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(e)，所述水溶液还包含含有至少两个乙烯基的交联剂，其中溶液(d)和溶液(e)中的至少一种包含自由基引发剂；将溶液(d)和(e)混合以形成油包水乳液(f)并且将单分散聚合物颗粒添加到乳液中；使单分散聚合物颗粒在乳液中形成溶胀的聚合物颗粒；以及使溶胀的聚合物颗粒聚合以形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒。如下所述，该方法可以被认为是两阶段方法，因为其包括第一溶胀步骤和第一聚合步骤，随后是第二溶胀步骤和第二聚合步骤。与单阶段方法相比，两阶段方法可以提供大的单分散交联水凝胶交联聚合物颗粒。
类似于单阶段方法，两阶段方法涉及用在油连续相中的水性不连续相来使种子颗粒溶胀。图3(用特定单体说明)和图4(更一般地说明)提供了该方法的示意图，其可以被认为是两阶段方法，因为其包括两个溶胀步骤和两个聚合步骤。图3和4中所示的方法方便地分成4个步骤：用单体103和链转移剂105使单分散种子颗粒100溶胀形成溶胀的(单分散)种子颗粒110；在溶胀的种子颗粒中的单体的聚合形成(未交联的)亲水聚合物颗粒130；用单体103和交联剂102使亲水聚合物颗粒溶胀形成溶胀的亲水聚合物颗粒140；以及在水凝胶聚合物颗粒中的单体的聚合形成交联水凝胶聚合物颗粒150。在第一步之前，形成油包水乳液。所述油包水乳液通过将包含单体(例如羟甲基丙烯酰胺103)和链转移剂(例如1-硫代甘油105)与包含空间稳定剂的油相混合来形成，其中当搅动(例如通过搅拌)水相和油相时形成乳液。油包水乳液通常还含有可已经添加到油相和/或水相中的引发剂。引发剂是在活化时会引发单体聚合的化合物。单分散种子颗粒100包含聚N,N-二甲基丙烯酰胺131的非交联低聚物并且被认为是“活化的种子颗粒”。种子颗粒100可以如本申请中其他处所述来制备。
在第一步中，将单分散的种子颗粒100添加到油包水乳液中，并将乳液搅动一段时间(例如至少30分钟或至少1小时，通常4-48小时)。在此段时间期间，单体103和链转移剂105扩散到活化的种子颗粒100中形成溶胀的种子颗粒110。溶胀的种子颗粒110包含至少单体103、链转移剂105和来自活化的种子颗粒100的聚合物的混合物。溶胀的种子颗粒110还可以包含其他组分，例如一种或多种致孔剂，如果其包含在油包水乳液中，则可以进入颗粒。例如，在所示的方法中，水也存在于溶胀的种子颗粒110中，并且该水可以被认为是致孔剂。第二步包括聚合单体103的聚合形成(未交联的)亲水聚合物颗粒130。在第二步中，通过使引发剂活化来引发聚合，例如通过加热乳液。链转移剂105的存在使得水凝胶聚合物颗粒中的聚羟甲基丙烯酰胺132(例如低聚物)的聚合物相对较短。这些相对较短的聚合物与缺少交联相结合意味着亲水聚合物颗粒130可以充当适合用于又一轮的溶胀和聚合的较大的“活化种子颗粒”。亲水聚合物颗粒含有聚羟甲基丙烯酰胺132的聚合物的非交联的相对较短的聚合物以及聚N,N-二甲基丙烯酰胺131的非交联低聚物(通常比例较小)。
在第三步之前，形成油包水乳液。所述油包水乳液通过将包含单体(例如羟甲基丙烯酰胺103)和交联剂(例如1,2-二羟基双丙烯酰胺102)与包含空间稳定剂的油相混合来形成。如果需要(非常)高度交联的颗粒，也可以用交联剂代替单体，使得存在于油包水乳液中的唯一单体是交联单体(即交联剂)。油包水乳液通常还含有可以添加到油相或水相中引发剂。引发剂是在活化时会引发单体和交联剂聚合的化合物。在第三步(第二轮溶胀)中，将亲水聚合物颗粒130添加到油包水乳液中，并将该乳液搅动一段时间(例如至少30分钟或至少1小时，通常4-48小时)。在此段时间期间，单体103和交联剂102扩散到亲水聚合物颗粒130中形成溶胀的水凝胶聚合物颗粒140。溶胀的亲水聚合物颗粒140包含至少单体103、交联剂102和来自亲水聚合物颗粒130的聚合物的混合物。溶胀的水凝胶聚合物颗粒140还可以包含其他组分，例如一种或多种成孔剂，如果包含在油包水乳液中，则其可以进入颗粒。例如，在所示的方法中，水也存在于溶胀的种子颗粒110中，并且该水可以被认为是致孔剂。第四步包括单体103和交联剂102的聚合形成交联水凝胶聚合物颗粒104。在第四步中，通过使引发剂活化来引发聚合，例如通过加热乳液。
单体、链转移剂、自由基引发剂、稳定剂、交联剂、有机溶剂和任选的致孔剂各自可以如本文其他处所定义。单体可以是或包括羟基甲基丙烯酰胺或羟乙基丙烯酰胺。链转移剂可以是或包括1-硫代甘油。自由基引发剂可以是或包括偶氮双甲基戊腈，例如2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)。稳定剂可以是或包括Hypermer 2296、Abil WE09和Abil EM90。交联剂可以是1,2-二羟基双丙烯酰胺或N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺。
溶液(a)可以包含不超过60重量％的亲水乙烯基单体。例如，溶液(a)可以包含不超过55重量％或50重量％的亲水乙烯基单体。例如，溶液(a)可以包含不超过45重量％或40重量％的亲水乙烯基单体；例如溶液(a)可以包含不超过30重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少5重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过50重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过50重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过30重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含至少8重量％的乙烯基单体且不超过30重量％的亲水乙烯基单体。溶液(a)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过15重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(a)可以包含约10重量％的亲水乙烯基单体。
溶液(e)可以包含不超过60重量％的亲水乙烯基单体。例如，溶液(e)可以包含不超过55重量％或50重量％的亲水乙烯基单体。例如，溶液(e)可以包含不超过45重量％或40重量％的亲水乙烯基单体；例如溶液(e)可以包含不超过30重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少2重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少5重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(e)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过50重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(e)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过50重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(e)可以包含至少8重量％的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过30重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(e)可以包含至少8重量％的乙烯基单体且不超过30重量％的亲水乙烯基单体。溶液(e)可以包含至少2重量％(例如5重量％)的亲水乙烯基单体且不超过15重量％的亲水乙烯基单体，例如溶液(e)可以包含约10重量％的亲水乙烯基单体。
在高度交联的颗粒中，溶液(e)的亲水乙烯基单体可以是或包括交联剂。例如，单体可以是或包括至少一种式(IIa)或(IIb)的化合物。
通过该方法形成的交联水凝胶聚合物颗粒中的交联水平可以表示为在用于聚合(即在第二聚合步骤中)的全部单体中所包含的交联剂单体的重量百分比(重量％)。交联剂单体的重量％可以等于基体聚合物中的交联剂的重量％(即交联剂在交联聚合物颗粒的干重中的重量％)。通常的交联水平包括>5重量％的交联剂，例如>10重量％的交联剂，或>15重量％的交联剂，例如>20重量％的交联剂(例如>30重量％的交联剂)。交联水平还可以是例如5-60重量％的交联剂，例如10-50重量％的交联剂。交联水平还可以是例如15-40重量％的交联剂，例如20-40重量％的交联剂，例如20-30重量％的交联剂。交联水平可以是20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂；例如在高密度颗粒中。因此，溶液(e)可以包含的以重量％计的交联剂的量对应于亲水性烯基单体的量的5-60％，例如亲水乙烯基单体的量的10-50％。因此，溶液(e)可以包含的以重量％计的交联剂的量对应于例如亲水乙烯基单体的量的15-40％，例如亲水乙烯基单体的量的20-40％，例如亲水乙烯基单体量的20-30％。
例如在高度交联的颗粒中，交联水平可以是>30重量％的交联剂或>40重量％的交联剂(例如>50重量％的交联剂)。交联水平可以是10-90重量％的交联剂、20-80重量％的交联剂或25-75重量％的交联剂，例如25-60重量％的交联剂或30-50重量％的交联剂。在高度交联的颗粒中，交联水平可以最高达100重量％的交联剂，例如溶液(e)中的亲水乙烯基单体可以是交联剂，例如亲水乙烯基单体和交联剂可以是相同化合物。溶液(e)可以包含的以重量％计的交联剂的量对应于亲水乙烯基单体的量的20-80％，例如亲水乙烯基单体的量的25-60％。
自由基引发剂可以以约0.1重量％至约1.5重量％的量存在于每种或至少一种乳液中。例如，自由基引发剂可以以约0.6重量％至约1.2重量％的量存在于每种或至少一种乳液中；例如自由基引发剂在每种或至少一种乳液中可以以约0.8重量％的量存在于每种乳液或至少一种乳液中。
通过与生长中的聚合物链的自由基反应使链终止并且将孤电子转移至衍生自链转移剂的自由基物种，链转移剂的添加降低了种子颗粒的聚合物的分子量。然后所述衍生自链转移剂的自由基物种可以与单体反应而由单体形成自由基，然后其可以与另一单体反应而开始形成新的聚合物链。链转移剂可以是硫醇或卤代烷。例如，链转移剂可以选自硫醇(例如1-硫代甘油、1-辛硫醇、己硫醇、6-巯基-1-己醇、苄硫醇)、烷基硫醇(例如1-辛硫醇、己硫醇)和硫代多元醇。例如，链转移剂可以是或包括1-硫代甘油。链转移剂的总添加量可为1mol/10mol单体至1mol/300mol单体，例如1mol/20mol单体至1mol/100mol单体，例如约1mol链转移剂/30mol单体。
根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以是多孔的。例如，所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的孔隙度可以为至少5％，例如至少10％。本公开内容包括孔隙度为20％至95％，特别是30％至90％，例如40％至90％，例如50％至80％的多孔单分散交联水凝胶聚合物颗粒。所形成的多孔单分散交联水凝胶聚合物颗粒可对溶剂化分子是通透的，例如多孔单分散交联水凝胶聚合物颗粒可对寡核苷酸和核酸扩增试剂和测序试剂(例如引物、核苷酸和聚合酶)是通透的。
根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的众数直径可以为0.5μm至10μm，例如0.5μm至5μm。所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的众数直径可以为至少500nm，例如至少600nm，任选为至少800nm，如在直径为至少1μm的颗粒的情况下。根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的众数直径可以不超过10μm，例如不超过5μm，任选地不超过3μm，如在直径不超过2μm的颗粒的情况下。根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的尺寸和尺寸分布可以如下文在标题“分析方法”下所描述进行测定。
根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的CV可以小于20％，例如小于15％。例如，颗粒的CV可以小于10％，例如CV小于8％，例如CV小于5％。
根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以包含官能团。官能团可以选自羟基、羧酸(-COOH)、伯胺或仲胺。在一个实施方案中，官能团由亲水乙烯基单体(例如式(I)的化合物)而不是交联剂(例如式(IIa)或式(IIb)的化合物)提供。可以对官能团进行增强来促进与靶分析物(例如寡核苷酸)或靶受体的结合。本文在与“粒子的使用”相关的部分中描述了对颗粒的官能团进行增强的示例性方法。
根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以包含连接至颗粒的寡核苷酸。寡核苷酸可以通过连接体连接至单分散交联水凝胶聚合物颗粒上。例如，每个(或一部分)单分散水凝胶聚合物颗粒可以包含多个连接至颗粒上的寡核苷酸。对于每个单个交联水凝胶聚合物颗粒，多个寡核苷酸可以是相同的。例如，第一交联水凝胶聚合物颗粒可以包含多个具有连接至第一颗粒的第一序列的寡核苷酸，并且第二交联水凝胶聚合物颗粒可以包含多个具有连接至第二交联水凝胶聚合物颗粒的第二序列的寡核苷酸。在单分散交联水凝胶聚合物颗粒是多孔的情况下，寡核苷酸可以连接至颗粒的外表面上，或连接在孔内。孔可以具有足够的尺寸以使得颗粒对寡核苷酸通透，从而使寡核苷酸可以部分或全部位于孔内，即使当聚合酶连接至寡核苷酸时也是如此。
根据本发明的方法形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒在水溶液的通常温度范围内可以是稳定的(即耐聚合物降解)。所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以在最高达约100℃的温度下是稳定的。例如，所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒可以在约0℃至约100℃的温度范围内是稳定的。
本发明的一个实施方案提供了通过本文所述的制备方法获得的颗粒或具有通过本文所述的制备方法获得的颗粒的特征的颗粒。
本文所述的聚合物颗粒形成方法可以被加工为高度可重复和可缩放的。因此，本发明可以实现批次间以及批次内的一致性，这是工业应用的先决条件。本发明还可以生产例如中试规模批次，例如至少300g以及千克规模的工业批次。
本文所述的聚合物颗粒形成方法可以始终如一地进行，而没有实际上可能出现的与乳液聚合有关的问题，例如颗粒的团聚以及产品的变化。
颗粒的用途
所述颗粒可以用于许多应用中，例如，多核苷酸测序、多核苷酸测序、信息存储、彩色成像、生物处理、诊断微生物学、生物传感器和药物递送。
可以使聚合物颗粒活化以促进与靶分析物例如多核苷酸的共轭(结合，conjugation)。除了以下描述的方法之外，合适的活化和生物共轭方法记载于G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,2013(第3版),Academic Press，其内容通过引用的方式以其全文结合本文。
例如，可以对聚合物颗粒上的官能团进行增强以允许与靶分析物或分析物受体结合。在一个具体的实例中，聚合物颗粒的官能团可以用能够将官能团转化成可经历亲核或亲电取代的反应性部分的试剂来修饰。例如，聚合物颗粒上的羟基可以通过用磺酸酯基团或氯替代至少一部分羟基来活化。示例性的磺酸酯基团可以衍生自tresyl、甲磺酰基、甲苯磺酰基或甲苯磺酰氯，或其任意组合。磺酸酯可以起到允许亲核试剂替代磺酸酯的作用。磺酸酯可进一步与释放的氯反应来提供氯化基团，其可用于共轭颗粒的过程中。在另一个实例中，在聚合物颗粒包含胺基团或羧酸基团(例如来自官能单体)的情况下，可以使胺基团或羧酸基团活化。
例如，靶分析物或分析物受体可以通过用磺酸酯基团或其他活化基团进行亲核取代而与聚合物颗粒结合。在具体的实例中，用亲核试剂如胺或硫醇封端的靶分析物受体可经历亲核取代以替代聚合物颗粒表面上的磺酸基团。作为活化的结果，可以形成共轭颗粒。
在另一个实例中，磺化颗粒可以进一步与单官能或多官能的单亲核或多亲核试剂反应，其可形成与颗粒的连接，同时保持包含亲电基团(如马来酰亚胺)的寡核苷酸的亲核活性。另外，通过与包含多亲电基团的试剂连接(所述多亲电基团随后连接至包含亲核基团的寡核苷酸)，残余的亲核活性可以转化为亲电活性。
在另一个实例中，在聚合期间，含有官能团的单体(官能单体)可以包含在单体混合物中。官能单体可以包括例如含有羧酸、酯、卤素或其他胺反应性基团的丙烯酰胺。酯基可以在与胺寡核苷酸反应之前水解。
其他活化化学包括结合多个步骤来将特定官能团转化以适应特定的所需连接。例如，磺酸酯修饰的羟基可以通过几种方法转化成亲核基团。在一个实例中，磺酸酯与叠氮化物阴离子的反应产生叠氮化物取代的亲水聚合物。所述叠氮化物可以直接用于通过可以在有或没有铜催化下进行的“CLICK”化学而共轭至乙炔取代的生物分子上。任选地，叠氮化物可以通过例如用氢催化还原或用有机膦还原而转化为胺。然后可以用多种试剂如二异氰酸酯、双-NHS酯、三聚氯氰或其组合将所得的胺转化为亲电基团。在一个实例中，使用二异氰酸酯在聚合物和连接体之间产生脲连接，其产生残余的异氰酸酯基团，其能够与氨基取代的生物分子反应而在连接体和生物分子之间产生脲连接。在另一个实例中，使用双-NHS酯在聚合物和连接体之间产生酰胺键，并且残留的NHS酯基能够与氨基取代的生物分子反应而在连接体和生物分子之间产生酰胺键。在另一个实例中，使用三聚氯氰在聚合物和连接体之间产生氨基-三嗪连接，并且两个残留的氯-三嗪基团中的一个能够与氨基取代的生物分子反应而在连接体和生物分子之间产生氨基-三嗪连接。其他亲核基团可以通过磺酸酯活化结合颗粒中。例如，磺化颗粒与硫代苯甲酸阴离子的反应以及随后的硫代苯甲酸酯的水解将巯基结合颗粒中，其随后可与马来酰亚胺取代的生物分子反应而产生与生物分子的硫代-琥珀酰亚胺连接。巯基还可以与溴乙酰基反应。
生物分子在耐熔的(refractory)或聚合物底物(基底，substrate)上的共价连接可以使用与生物分子上的亲核部分偶联的底物上的亲电部分或与生物分子上的亲电连接偶联的底物上的亲核连接来产生。由于感兴趣的最常见的生物分子的亲水性质，这些偶联所选择的溶剂是水或含有一些水溶性有机溶剂的水，以便使生物分子分散到底物上。特别地，多核苷酸由于其多阴离子性质而通常在水体系中与底物偶联。因为水通过将亲电试剂水解成无活性部分用于共轭而与亲核试剂竞争亲电试剂，因此水性体系通常导致偶联产物产率低，其中产率基于偶联的亲电部分。当需要高产率的反应偶合物的亲电部分时，需要高浓度的亲核试剂来驱动反应并减轻水解，导致亲核试剂利用低效。在多核酸的情况下，磷酸盐的金属抗衡离子可以用亲脂性抗衡离子替代，以有助于将生物分子溶解在极性非反应性非水溶剂中。这些溶剂可以包括酰胺或脲如甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰胺、吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N,N,N',N'-四甲基脲、N,N'-二甲基-N,N'-三亚甲基脲或其组合；碳酸酯如碳酸二甲酯、碳酸亚丙基酯或其组合；醚如四氢呋喃；亚砜和砜如二甲基亚砜、二甲基砜或其组合；位阻醇如叔丁醇；或其组合。亲脂性阳离子可以包括四烷基铵或四芳基铵阳离子如四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵、四丁基铵、四戊基铵、四己基铵、四庚基铵、四辛基铵以及其烷基和芳基的混合，四芳基鏻阳离子如四苯基鏻，四烷基砷或四芳基砷如四苯基砷，以及三烷基锍阳离子如三甲基锍，或其组合。通过金属阳离子与亲脂性阳离子的交换将多核酸转化为有机溶剂可溶性材料可以通过多种标准阳离子交换技术来进行。
可以使聚合物颗粒活化以促进与靶分析物例如多核苷酸的共轭。例如，可以对交联水凝胶聚合物颗粒上的官能团进行增强以允许与靶分析物或分析物受体结合。在一个具体的实例中，聚合物的官能团可以用能够将亲水聚合物官能团转化成可以进行亲核或亲电取代的反应性部分的试剂来修饰。特别地，在聚合物颗粒具有羧基官能团的情况下，可以使其活化以促进共轭，例如与生物分子的共轭，如核酸。
在颗粒用包含羟基的共聚单体来形成的实施方案中，亲水颗粒上的羟基可以通过用磺酸酯基团或氯替代至少一部分羟基来活化。示例性的磺酸酯基团可以衍生自tresyl、甲磺酰基、甲苯磺酰基或者甲苯磺酰氯，或其任意组合。磺酸酯可以起到允许亲核试剂替代磺酸酯的作用。磺酸酯可以进一步与释放的氯反应来提供氯化基团，其可用于共轭颗粒的过程中。在另一个实例中，可以使亲水聚合物上的胺基团活化。
例如，靶分析物或分析物受体可以通过用磺酸酯基团进行亲核取代而与亲水聚合物结合。在具体的实例中，用亲核试剂如胺或硫醇封端的靶分析物受体可以进行亲核取代以替代亲水聚合物表面上的磺酸基团。作为活化的结果，可以形成共轭颗粒。
在另一个实例中，在颗粒由包含胺的单体来形成的情况下，亲核氨基可以用双官能双亲电部分(例如二异氰酸酯或双-NHS酯)来修饰，产生对亲核试剂具有反应性的亲水颗粒。
当与多核苷酸共轭时，聚合物颗粒可以包含为至少7×104/μm3的多核苷酸密度，其称为核苷酸密度。例如，核苷酸密度可以是至少105/μm3，如至少106/μm3，至少5×106/μm3，至少8×106/μm3，至少1×107/μm3或甚至至少3×107/μm3。在另一个实例中，核苷酸密度可以不大于1015/μm3。
这样的聚合物颗粒可用于多种分离技术和分析技术。特别地，聚合物颗粒可用于结合多核苷酸。此类结合多核苷酸可用于从溶液中分离多核苷酸或可用于分析技术，如测序。在图5所示的具体实例中，这种聚合物颗粒可以在测序技术中用作多核苷酸的载体。例如，颗粒可以使用荧光测序技术来固定多核苷酸用于测序。在另一个实例中，聚合物颗粒可以使用离子传感技术来固定多个多核苷酸副本用于测序。
通常，可以对聚合物颗粒进行处理以包含生物分子，包括核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可以结合或连接至生物分子。生物分子的末端或任何内部部分可以结合或连接至聚合物颗粒。聚合物颗粒可以使用连接化学来结合或连接至生物分子。连接化学包括共价键或非共价键，包括离子键、氢键、亲和键、偶极-偶极键、范德华键和疏水键。连接化学包括结合配偶体之间的亲和力，例如在以下之间的亲和力：抗生物素蛋白部分和生物素部分；抗原表位和抗体或其免疫反应性片段；抗体和半抗原；地高辛(digoxigen)部分和抗地高辛抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏子；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白质A；或寡核苷酸或多核苷酸及其相应的补体。
如图5所示，可以将多个聚合物颗粒204(例如本公开内容的单分散交联水凝胶聚合物颗粒)与多个多核苷酸202一起置于溶液中。可以使所述多个颗粒204活化或制备为与多核苷酸202结合。例如，颗粒204可以包含对多个所述多核苷酸202的一部分多核苷酸补充的寡核苷酸。
在一个具体的实施方案中，聚合物颗粒和多核苷酸进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。例如，分散相液滴206或208形成为乳液的一部分，并且可以包含颗粒或多核苷酸。在一个实例中，多核苷酸202和亲水颗粒204相对于彼此以低浓度和比例提供，使得单个多核苷酸202可能与单个聚合物颗粒204位于相同的分散相液滴内。其他液滴，如液滴208，可以包含单个聚合物颗粒并且不包含多核苷酸。每个液滴206或208均可以包含足以促进多核苷酸的复制的酶、核苷酸、盐或其他组分。或者，可以使用扩增技术，例如有或没有乳液的重组酶聚合酶扩增(RPA)。
一方面，本发明提供了本发明的交联水凝胶聚合物颗粒在核酸扩增中的用途。
在实施方案中，用于核酸扩增的方法包括：在与连接至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的多核苷酸上进行引物延伸反应。在实施方案中，聚合物颗粒是本公开内容的单分散交联水凝胶聚合物颗粒。在实施方案中，用于核酸扩增的方法包括：(a)提供连接至单股(stranded)寡核苷酸(例如引物寡核苷酸)的聚合物颗粒；(b)提供单股模板多核苷酸；(c)将单股寡核苷酸与单股模板多核苷酸杂交(hybridize)；(d)使所述单股模板多核苷酸与聚合酶和至少一个核苷酸在适合于所述聚合酶催化至少一个核苷酸聚合至单股寡核苷酸上的条件下接触，从而产生延伸的单股寡核苷酸。在实施方案中，所述方法还包括：(e)从延伸的单股寡核苷酸中除去(例如变性)单股模板多核苷酸，使得单股寡核苷酸保持连接至聚合物颗粒；(f)将剩余的单股寡核苷酸与第二单股模板多核苷酸杂交；以及(g)使第二单股模板多核苷酸与第二聚合酶和第二至少一个核苷酸在适合于第二聚合酶催化第二至少一个核苷酸聚合至单股寡核苷酸上的条件下接触，从而产生随之的延伸的单股寡核苷酸。在实施方案中，步骤(e)、(f)和(g)可以重复至少一次。在实施方案中，聚合酶和第二聚合酶包括热稳定聚合酶。在实施方案中，适合于核苷酸聚合的条件包括在升高的温度下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在实施方案中，适合于核苷酸聚合的条件包括在交替温度(例如升高的温度和相对较低的温度)下进行核苷酸聚合步骤(例如步骤(d)或(g))。在实施方案中，交替温度在60-95℃的范围内。在实施方案中，温度循环可以是约10秒至约5分钟，或约10分钟，或约15分钟或更长。在实施方案中，用于核酸扩增的方法可以产生一个或多个聚合物颗粒，每个聚合物颗粒连接至多个模板多核苷酸，所述多个模板多核苷酸包含对单股模板多核苷酸或与第二单股模板多核苷酸补充的序列。在实施方案中，每个聚合物颗粒可以与多个单股寡核苷酸(例如捕获寡核苷酸)连接。在实施方案中，步骤(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)可以用多个单股多核苷酸进行。在实施方案中，单股寡核苷酸的至少一部分包含对单股多核苷酸的至少一部分补充(或部分补充)的核苷酸序列。在实施方案中，用于核酸扩增的方法(如上所述)可以在油相(例如分散相液滴)中的水相溶液中进行。
PCR后，形成颗粒，如颗粒210，其可以包含聚合物颗粒212和多核苷酸的多个副本(copy)214。为了清楚起见，大多数多核苷酸214被示于颗粒210的外表面上。然而，也如图所示，多核苷酸可以在颗粒210内延伸(或位于其内)。例如，水凝胶和亲水颗粒可以具有相对于水的低浓度的聚合物，并且因此可以是相对多孔的。其可以在颗粒210的内部和整个颗粒210上包含多核苷酸片段，并且多核苷酸可以位于孔隙和其他开口中。特别地，颗粒210可以允许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物的扩散。每个颗粒高数量的多核苷酸产生更好的信号。
在实施方案中，可以收集并清洗来自破乳过程的聚合物颗粒以准备测序。可以通过使生物素部分(例如，连接至与聚合物颗粒连接的扩增的多核苷酸模板)与抗生物素蛋白部分接触并从缺少生物素化模板的聚合物颗粒中分离来进行收集。所收集的携带双链模板多核苷酸的聚合物颗粒可以变性，以产生用于测序的单股模板多核苷酸。变性步骤可以包括用碱(例如NaOH)、甲酰胺或吡咯烷酮处理。
测序可以通过检测核苷酸添加来进行。核苷酸添加可以使用诸如荧光发射方法或离子检测方法的方法来检测。例如，一组荧光标记的核苷酸可以被提供至系统216并且可以迁移至井(well)218。还可以向井218提供激发能量。当核苷酸被聚合酶捕获并被添加到延伸引物的末端时，核苷酸的标记可以发荧光，指示添加了哪种类型的核苷酸。本文所述的这些和其他测序方法可以与用于核酸扩增的方法组合。例如，在用步骤(a)-(g)描述的用于核酸扩增的方法中，所述方法可以包括通过检测核苷酸添加来进行测序的步骤(h)。
在替代的实例中，可将包括单一类型核苷酸的溶液相继进料。响应于核苷酸添加，井218的局部环境中的pH可能变化。这种pH变化可以通过离子敏感场效应晶体管(ISFET)来检测。如此，可以使用pH的变化来产生指示与颗粒210的多核苷酸互补的核苷酸的顺序的信号。
特别地，测序系统可以包括设置在离子传感器(如场效应晶体管(FET))的整个传感器板上的一个井或多个井。在实施方案中，系统包括装载到设置在离子传感器(例如FET)的传感器板上的井中的一个或多个聚合物颗粒，或者装载到设置在离子传感器(例如FET)的传感器板上的多个井中的一个或多个聚合物颗粒。在实施方案中，FET可以是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包括充当化学传感器的场效应晶体管的类型。chemFET具有MOSFET晶体管的结构模拟，其中栅电极上的电荷通过化学方法施加。“ISFET”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(如H+)变化时，通过晶体管的电流会相应变化。
回到图5，在一个实例中，井阵列的井218可以可操作地连接到测量装置。例如，对于荧光发射方法，井218可以可操作地耦合到光检测装置。在离子检测的情况下，井218的下表面可以设置在离子传感器(如场效应晶体管(例如chemFET))的整个传感器板上。
涉及通过检测核苷酸结合(incorporation)的离子副产物进行测序的示例性系统是Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪(Life Technologies)，其是基于离子的测序系统，其通过检测作为核苷酸结合的副产物产生的氢离子来对核酸模板进行测序。通常，氢离子作为在通过聚合酶的模板依赖性核酸合成期间产生的核苷酸结合的副产物而释放。IonTorrent PGMTM或ProtonTM测序仪通过检测核苷酸结合的氢离子副产物来检测核苷酸结合。Ion Torrent PGMTM或ProtonTM测序仪可以包含多个待测序的模板多核苷酸，每个模板置于阵列中相应的测序反应孔内。阵列的孔可以各自偶联至至少一个离子传感器，其可以检测H+离子的释放或作为核苷酸结合的副产物产生的溶液pH的变化。离子传感器包括偶联至离子敏感检测层的场效应晶体管(FET)，其可以感测H+离子的存在或溶液pH的变化。离子传感器可以提供指示核苷酸结合的输出信号，其可以表示为电压变化，其大小与相应孔或反应室中的H+离子浓度相关。不同的核苷酸类型可以连续地流入反应室，并且可以通过聚合酶以由模板序列确定的顺序结合至延伸引物(或聚合位点)。每个核苷酸结合可以伴随着反应孔中的H+离子的释放，以及伴随着局部pH的变化。H+离子的释放可由传感器的FET记录，其产生指示发生核苷酸结合的信号。未在特定的核苷酸流动期间结合的核苷酸可能不会产生信号。来自FET的信号的幅度也可以与结合延伸的核酸分子中的特定类型的核苷酸的数目相关，从而允许分辨均聚物区域。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室，同时横跨多个孔或反应室的结合监测可以允许仪器同时分辨许多核酸模板的序列。
另一种测序系统是Applied Biosystems的SOLiDTM测序系统(通过寡核苷酸连接和检测进行测序)，其使用逐步循环连接用于高通量DNA测序。在这种基于珠粒的系统中，装载有DNA模板的珠粒(即聚合物颗粒)经历使用4色荧光标记的八聚体探针的顺序连接和切割反应。这些探针连续传送并用于查询DNA链上的二核苷酸位置。希望支持更高的珠粒密度以促进每次仪器运行的珠粒事件的数量的增加和探针化学的改进，从而提高测序保真度。
通过寡核苷酸连接(ligation)和检测进行测序包括将核酸靶标连接至交联的聚合物颗粒(珠粒)上，随后将多个颗粒固定至表面上。每种核酸-珠共轭物包含独特的DNA序列，这种类型的测序技术公开于国际公开No.WO 2006/084132 A2(通过引用的方式结合至本文)。
珠粒连接至载体的方法使用了不可逆地涂有链霉亲和素的平板玻璃显微镜载玻片。使载有核酸的珠粒与生物素化的核苷酸接触(例如，在连接至珠粒之后通过生物素化的dNTP's和末端脱氧转移酶作用于DNA靶标上来获得)。生物素化的珠粒与链霉亲和素涂覆的载玻片培养使得通过链霉亲和素与生物素的相互作用将珠粒固定在载玻片上。在动力学上，这是一种非常有效的链接方案，有时在DNA序列测定所需的条件下会观察到载玻片上珠粒的运动。当珠粒以高密度存在于载玻片上(例如，最高达100,000珠/mm2)并被查询多次(例如，最高达25次)时，任何显着的珠粒运动都可以妨碍在密集珠粒群内的随后的扫描中对特定珠粒的强烈识别。
因此，US 2009/0099027(相当于WO2009/026546，两者均通过引用的方式结合本文)记载了用于珠粒固定的共价体系，其减少了在测序和其他形式的基因分析期间珠粒的运动。该方法包括：使底物表面上的亲核基团与包含多个亲电基团的分子反应，从而在底物表面上提供一个或多个自由亲电基团；以及使颗粒材料表面上的亲核基团与基底表面上的所述一个或多个自由亲电基团反应，以将颗粒材料共价连接至底物。
US 2009/0099027记载了用多官能亲电试剂修饰亲核(更特别是氨基官能)表面。例如，通过使表面基团与(氨基丙基)三烷氧基硅烷反应，硅酸盐玻璃显微镜载玻片的亲电表面可以容易地转化成亲核表面。
已经共价连接至交联聚合物珠粒的DNA靶标核酸可以在连接至珠粒之后通过氨基烷基dNTP's和末端脱氧转移酶作用于DNA靶标上进行修饰。然后，DNA靶标上的亲核氨基基团可以与载体表面的残余亲电基团反应，以在珠粒和玻璃表面之间形成多个稳定的共价键。
已经发现，可以在含有亲电基团的表面和含有亲核基团的颗粒之间形成稳定的共价键。另外，在碱性条件下，可以将含有来自氨基-dNTP's和末端脱氧转移酶在DNA靶标上的作用的亲核氨基的珠粒固定修饰的表面上。例如，包含已用苯1,4-二异硫氰酸酯活化的氨基的表面可用于固定具有亲核基团的珠粒。另外，共价连接看起来相当稳定，没有观察到珠粒运动。
表面固定的珠粒可用于基于通过连接沿着单股模板的双链延伸的重复循环的分析核酸序列的方法。这种类型的测序方法公开于美国专利Nos.5,750,341；5,969,119；和6,306,597B1以及国际公开No.WO 2006/084132 A2。这些出版物中的每一个均通过引用的方式以其全文结合本文。此外，前述出版物中所描述的技术可用于分析(例如，测序)连接至如本文所述结合至载体的颗粒的核酸模板。固定的珠粒可用于不必须采用连接步骤的测序方法，例如使用具有可移除的阻断基团的经标记的核苷酸进行测序，所述阻断基团防止了多核苷酸链延伸(例如，美国专利Nos.6,664,079；6,232,465；和7,057,026，其各自均通过引用的方式以其全文结合至本文)。固定的珠粒可用于多种技术，其中珠粒上的信号通过多个循环重复检测。
用于SOLiD测序的珠粒可以是本公开内容的单分散交联水凝胶颗粒。因此，一个实施方案包括在前一段落中提及的出版物中公开的方法和产品中使用所述单分散颗粒，并且本申请的申请人认为所有这些用途、方法和产品均落入本发明中，并且保留索赔权利。在SOLiD测序中使用亚微米颗粒能够使更大密度的颗粒连接至玻璃表面(例如玻璃面板或显微镜载玻片)。还包括在一个实施方案中的是实施SOLiD测序的方法，其使用本公开内容的单分散颗粒，例如其中本公开内容的单分散亚微米偶联至核酸靶标并固定在表面上，例如玻璃表面。固定化方法并不重要，并且可以是共价或非共价的，非共价偶联的实例是通过链霉亲和素/抗生物素蛋白-生物素结合。共价偶联可以例如如US 2009/0099027和WO2009026546中所记载，但是可以使用任何其他适合用于共价偶联的技术。因此，包括在一个实施方案中的是形成产品(制品)的方法，其包括将本公开内容的单分散亚微米颗粒偶联至核酸，并且任选地还包括将所得到的载有核酸的颗粒固定在表面上，例如玻璃表面。该核酸可以用作测序中的靶标，例如使用SOLiD测序。
例如，提供了一种方法，其包括：
(a)使第一初始化(initializing)寡核苷酸探针与靶多核苷酸杂交形成探针-靶双重体(duplex)，其中所述寡核苷酸探针具有可延伸探针末端，其中所述靶多核苷酸连接至聚合物颗粒，所述聚合物颗粒是如本文公开的聚合物群体的成员，并且其中所述颗粒共价连接至固体载体的表面；
(b)将延伸寡核苷酸探针的第一末端连接至所述可延伸探针末端，从而形成含有延伸寡核苷酸探针的延伸双重体，其中所述延伸寡核苷酸探针包含切割位点(cleavagesite)和可检测标记；
(c)通过检测连接至刚刚连接的延伸寡核苷酸探针的标记来识别靶多核苷酸中的一个或多个核苷酸；
(d)在切割位点切割刚刚连接的延伸寡核苷酸探针以产生可延伸探针末端，其中切割除去包含来自探针-靶双重体的标记的刚刚连接的延伸寡核苷酸探针的一部分；以及
(e)重复步骤(b)、(c)和(d)，直到确定靶多核苷酸中的核苷酸序列。
还提供了对核酸进行测序的方法，包括：
(a)使引物与靶多核苷酸杂交形成引物-靶双重体，其中所述靶多核苷酸在5'末端连接至聚合物颗粒，所述聚合物颗粒是如本文公开的聚合物颗粒群体的成员，并且其中所述聚合物颗粒共价连接至载体的表面；
(b)使引物-靶双重体与聚合酶和一种或多种不同的核苷酸类似物接触以将核苷酸类似物结合引物的3'末端上，从而形成延伸引物链，其中结合的核苷酸类似物使聚合酶反应终止，并且其中所述一个或多个核苷酸类似物中的每一个均包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶及其类似物的碱(base)；(ii)通过可切割接头连接体连接至碱或其类似物的独特标记；(iii)脱氧核糖；以及(iv)在脱氧核糖的3'-位上封端-OH基团的可切割化学基团；
(c)洗涤载体表面以除去任何未结合的核苷酸类似物；
(d)检测连接至刚刚结合的核苷酸类似物的独特标记，从而识别刚刚结合的核苷酸类似物；
(e)任选地，永久封端延伸引物股上的任何未反应的-OH基团；
(f)切割刚刚结合的核苷酸类似物和独特标记之间的可切割连接体；
(g)切割刚刚结合的核苷酸类似物的脱氧核糖的3'-位上封端-OH基团的化学基团，以不封端-OH基团；
(h)洗涤载体表面以除去切割化合物；
(i)重复步骤(b)-(h)。
本公开内容的聚合物颗粒可用于涉及聚合物颗粒的任何核酸测序方法中。一个实施方案包括与核酸偶联的本公开内容的颗粒以及对核酸进行测序的方法，其包括将核酸偶联至本公开内容的颗粒群体。核酸可以是DNA或RNA。
本公开内容包括包含多个本公开内容的单分散颗粒的产品(例如制品)，所述单分散颗粒例如通过链霉亲和素-生物素连接、抗生物素蛋白-生物素连接或通过共价键偶联至底物，例如玻璃表面，例如如US 2009/0099027和WO2009/026546中所记载。颗粒可以通过核酸与底物偶联。本公开内容包括使用本公开内容的单分散亚微米颗粒来制造这样的产品。一个实施方案包括使用US 2009/0099027和WO2009/026546中所记载的连接化学将本公开内容的单分散亚微米颗粒连接至基底，并且申请人保留要求使用这种化学及其产物的方法的权利。因此，本说明书通过引用包括US2009/0099027和WO2009026546的公开内容。
因此，实施方案包括其中本公开内容的官能化的单分散聚合物颗粒经历一个或多个进一步反应以获得期望的产物的方法。其他实施例包括这些产品在应用中的用途。
考虑到本公开内容的颗粒可能具有的质量和特性的一致性，其可以用于包括实施与共轭物质相关的过程的方法，例如所述物质选自标记物、生物分子和生物结构，例如生物分子如氨基酸、糖、核苷酸和核苷以及通过将两个或更多个这样的单体缩合在一起而制成的多聚体，例如多肽、蛋白质、多糖、寡核苷酸和核酸。作为标记物，可以提及染料，例如荧光染料、猝灭剂、酶和半导体纳米晶体。本发明的实施例包括这样的用途以及：
(i)包含本公开内容的颗粒群体的共轭物，所述颗粒群体的至少一部分偶联至共轭物质，如刚刚描述的那些物质
(ii)包括将本公开内容的颗粒群体的至少一部分偶联至物质的方法，例如刚刚描述的那些物质
(iii)包括将本公开内容的颗粒群体的至少一部分偶联至底物的方法。
本发明包括以下实施方式：
1.单分散交联水凝胶聚合物颗粒，其包含由以下形成的聚合物：
(a)log Poct/wat(log P)小于约1的亲水乙烯基单体；
以及
(b)包含至少两个乙烯基的交联剂。
2.项1的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体的log P小于约0.6，任选地其中log P小于约0.3，进一步任选地其中log P小于约0。
3.项1或项2的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体的log P为0.5至-2，任选地其中log P为0至-2。
4.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体为丙烯酰胺单体和/或丙烯酸酯单体。
5.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体包括式(I)的至少一种化合物：
其中：
R1为-H、-CH3或-CH2CH3；
R2为-OR3或-N(R4)R5；
R3为-H、-C1-C6烷基或-C1-C6醇；以及
R4和R5彼此独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇，
其中，在化学上可能的情况下，R3和/或R4和/或R5任选地各自独立地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。
6.项5的聚合物颗粒，其中R1为-H或-CH3，任选地其中R1为-H。
7.项5或项6的聚合物颗粒，其中R2为-OR3。
8.项5至7中任一项的聚合物颗粒，其中R3为-H。
9.项5至8中任一项的聚合物颗粒，其中R4为-H或-C1-C6烷基，任选地其中R4为-H。
10.项5至9中任一项的聚合物颗粒，其中R5可为-H或-C1-C6烷基，任选地其中R5为-H。
11.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体选自或包括至少一种丙烯酰胺单体、丙烯酸单体、甲基丙烯酰胺单体或甲基丙烯酸单体。
12.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体选自或包括丙烯酰胺、羟甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酰胺、[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、3-丙烯酰胺基丙酸、甲基丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、或丙烯酸2-羟乙酯；任选地其中亲水乙烯基单体选自或包括丙烯酰胺(丙-2-烯酰胺)、羟甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酰胺、三羟甲基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-羟乙酯和丙烯酸中的至少一种。
13.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体包括伯酰胺基团(-C(O)NH2)。
14.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂为双官能、三官能或四官能丙烯酰胺，任选地其中所述交联剂为双官能丙烯酰胺。
15.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂包括式(IIa)或(IIb)的至少一种化合物：
其中R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6杂烷基、-C1-C6环烷基-、-C1-C6羟烷基-、-C1-C6醚-或包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚；
R7和R8各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚；
R9为-N(R11)C(O)CH＝CH2；
R10选自-H和-N(R12)C(O)CH＝CH2；以及
R11和R12各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚；
任选地其中，在化学上可能的情况下，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12中的一个或多个独立地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H、C1-C4烷基和C1-C4烯基。
16.项15的化合物，其中R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6羟烷基-和包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚，任选地其中R6选自-C1-C6烷基-和-C1-C6羟烷基-，进一步任选地其中R6为-C1-C6羟烷基-。
17.项15或项16的化合物，其中R6选自-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-或-(CH2)4-，任选地其中R6为-(CH2)2-。
18.项15至17中任一项的化合物，其中R6选自-C(OH)H-、-(C(OH)H)2-、-(C(OH)H)3-或-(C(OH)H)4-，任选地其中R6为-(C(OH)H)2-。
19.项15或项16的化合物，其中R6为(CH2)r(OCH2CH2)nO(CH2)s，其中r和s各自独立地为2或3，并且n为1至100的整数。
20.项19的化合物，其中r和s各自为2并且n为1至50的整数。
21.项15至20中任一项的聚合物颗粒，其中R7和/或R8为H。
22.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂的log P值小于约1，任选地log P值小于约0.5，进一步任选地log P值小于约0。
23.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂是或包括N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、Ν,Ν'-亚乙基双(丙烯酰胺)、甘油1,3-二甘油化物二丙烯酸酯、哌嗪二丙烯酰胺、N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)、4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)和/或N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺。
24.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂是或包括1,2-二羟基双丙烯酰胺。
25.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂是或包括N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)和4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)，任选地其中所述交联剂是或包括N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺。
26.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联剂不包含伯胺、仲胺、羟基或羧酸。
27.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述交联水平为1-60重量％的交联剂，任选地1-30重量％的交联剂；或其中所述交联水平为10-90重量％的交联剂，任选地25-60重量％的交联剂。
28.项1至3中任一项的聚合物颗粒，其中所述亲水乙烯基单体为如项14至26任一项中所定义的交联剂。
29.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述聚合物颗粒是多孔的。
30.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述聚合物颗粒的平均直径为0.5μm至10μm，任选地为0.5μm至5μm。
31.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中变异系数(CV)小于20％，任选地其中CV小于15％。
32.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中所述颗粒包含连接至所述颗粒的寡核苷酸。
33.前述项中任一项的聚合物颗粒，其中每个所述颗粒包含连接至所述颗粒的多个寡核苷酸，任选地其中所述多个寡核苷酸对于每个单个颗粒是相同的。
34.具有100nm至1500nm的Z-平均直径的单分散种子颗粒，其中每个种子颗粒包含多个聚N,N-二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物。
35.项34的种子颗粒，其中所述低聚物的重均分子量(Mw)为2,000Da至100,000Da。
36.项34或35的种子颗粒，其中所述低聚物的Mw为5,000Da至70,000Da；任选地为6,000Da至40,000Da；进一步任选地为7,000Da至50,000Da或为8,000Da至40,000Da。
37.项34至36中任一项的种子颗粒，其中所述颗粒具有在有机溶剂中在稳定剂和链转移剂的存在下通过N,N-二甲基丙烯酰胺的自由基引发聚合形成的种子颗粒的特征。
38.项34至37中任一项的种子颗粒用于形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的用途，任选地其中所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒是交联聚丙烯酰胺颗粒。
39.项38的用途，其中所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒如项1至33中任一项进一步所定义。
40.形成单分散种子颗粒的方法，其包括：
将N,N-二甲基丙烯酰胺、稳定剂、自由基引发剂和链转移剂溶解在有机溶剂中以形成反应混合物；以及
加热反应混合物使引发剂活化，
从而形成单分散种子颗粒。
41.项40的方法，其中所述稳定剂是苯乙烯和聚烯烃的嵌段共聚物，任选地其中所述稳定剂是由聚(乙烯-共-丁烯)中间嵌段和聚苯乙烯外侧嵌段组成的三嵌段共聚物。
42.项40或项41的方法，其中所述稳定剂选自或包括Kraton A1535H、KratonG1650M、Kraton G1652M或Kraton G1657M。
43.项40至42中任一项的方法，其中所述自由基引发剂是过氧化物引发剂或偶氮引发剂。
44.项40至43中任一项的方法，其中所述自由基引发剂选自2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)、2,2'-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)、过氧化二苯甲酰，任选地其中所述自由基引发剂是2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)。
45.项40至44中任一项的方法，其中加热反应混合物使引发剂活化包括加热至至少40℃，任选地加热至至少50℃，进一步任选地加热至至少60℃。
46.项40至45中任一项的方法，其中所述链转移剂是硫醇或卤代烷，任选地其中所述链转移剂是烷基硫醇。
47.项40至46中任一项的方法，其中所述链转移剂选自1-辛硫醇、己硫醇、6-巯基-1-己醇、苄硫醇、四氯化碳和溴三氯甲烷。
48.项40至47中任一项的方法，其中所述链转移剂是1-辛硫醇。
49.项40至48中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括烷烃组分和芳族组分的混合物。
50.项49的方法，其中所述烷烃组分和芳族组分以约0.5:1至约20:1的烷烃组分:芳族组分的重量比存在，任选地其中烷烃组分:芳族组分的重量比为约1:1至约10:1。
51.项49或项50的方法，其中所述烷烃组分是庚烷并且所述芳族组分是甲苯。
52.项40至51中任一项的方法，其中所述反应混合物包含：
约2重量％至约5重量％的量的N,N-二甲基丙烯酰胺；
约1重量％至约5重量％的量的稳定剂；
约0.01重量％至约4重量％的量的自由基引发剂；以及
约0.05重量％至约0.25重量％的量的链转移剂。
53.项52的方法，其中所述N,N-二甲基丙烯酰胺的重量％大于所述稳定剂的重量％。
54.项40至53中任一项的方法，其中在加热所述反应混合物之前，对所述反应混合物清除氧气。
55.项54的方法，其中所述清除氧气包括用化学惰性气体喷射，任选地其中所述化学惰性气体选自氩气、氦气或氮气。
56.形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法，其包括：
在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(a)，所述溶液还包含含有至少两个乙烯基的交联剂；
在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(b)，其中所述有机溶剂不与水混溶，并且其中溶液(a)和溶液(b)中的至少一种包含自由基引发剂；将溶液(a)和(b)混合以形成油包水乳液(c)并且将单分散种子颗粒添加到乳液中；
使单分散种子颗粒在乳液中形成溶胀的颗粒；以及
使溶胀的颗粒聚合以形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒。
57.项56的方法，其中所述亲水乙烯基单体如项1至13或28任一项中所进一步定义。
58.项56或57的方法，其中所述交联剂如项14至26任一项中所进一步定义。
59.项56至58中任一项的方法，其中所述稳定剂是非离子表面活性剂，任选地其中所述非离子表面活性剂是非离子聚合物表面活性剂。
60.项59的方法，其中所述非离子聚合物表面活性剂包含至少一个聚氧乙烯基团或至少一个聚氧丙烯基团。
61.项59或60的方法，其中所述稳定剂包含至少一个聚氧乙烯基团。
62.项59至61中任一项的方法，其中所述非离子聚合物表面活性剂为低聚物表面活性剂。
63.项56至62中任一项的方法，其中所述稳定剂选自hypermer 2296、Abil EM90和脱水山梨糖醇单油酸酯。
64.项56至63中任一项的方法，其中所述自由基引发剂是过氧化物引发剂或偶氮引发剂。
65.项56至64中任一项的方法，其中所述自由基引发剂是2,2'-偶氮双-2,4-二甲基戊腈。
66.项56至65中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括脂族烃、脂族碳酸酯、脂族酯、脂族醚、芳族烃或硅酮、或其组合中的至少一种。
67.项56至66中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括庚烷和甲苯的混合物；脂族烃的混合物；双(2-乙基己基)碳酸酯，任选地与脂族和芳族烃混合；或双(2-乙基己基)己二酸酯。
68.项56至67中任一项的方法，其中所述单分散种子颗粒具有根据项40至55中任一项的方法形成的单分散种子颗粒的特征。
69.项56至67中任一项的方法，其中所述单分散种子颗粒根据项40至55中任一项的方法形成。
70.项56至69中任一项的方法，其中溶液(a)包含不超过60重量％的亲水乙烯基单体。
71.项56至70中任一项的方法，其中溶液(a)包含至少2重量％的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体，任选地其中溶液(a)包含至少5重量％的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体。
72.项56至71中任一项的方法，其中溶液(a)包含约10重量％的亲水乙烯基单体。
73.项56至72中任一项的方法，其中所述引发剂以约0.1重量％至约1.5重量％的量存在于乳液中，任选地其中所述引发剂以约0.6重量％至约1.2重量％的量存在于乳液中，进一步任选地其中所述引发剂以约0.8重量％的量存在于乳液中。
74.项56至72中任一项的方法，其中所述聚合包括使所述自由基引发剂活化。
75.项74的方法，其中使所述自由基引发剂活化包括加热包含溶胀的颗粒的乳液，任选地其中所述加热包括加热至至少40℃的温度。
76.项56至75中任一项的方法，其中使所述单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤进行至少30分钟，任选地至少1小时。
77.项56至76中任一项的方法，其中使所述单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤包括将所述乳液混合，任选地其中所述混合在不超过30℃的温度下进行，任选地其中所述混合在约15℃至约25℃的温度下进行。
78.形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的方法，其包括：
在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(a)，所述水溶液还包含链转移剂；
在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(b)，其中所述有机溶剂不与水混溶，并且其中溶液(a)和溶液(b)中的至少一种包含自由基引发剂；
将溶液(a)和(b)混合以形成油包水乳液(c)并且将单分散种子颗粒添加到乳液中；
使单分散种子颗粒在乳液中形成溶胀的颗粒；
使溶胀的颗粒聚合以形成单分散聚合物颗粒；
在有机溶剂中形成稳定剂的溶液(d)，其中所述有机溶剂不与水混溶；
在水溶液中形成至少2重量％的亲水乙烯基单体的溶液(e)，所述水溶液还包含含有至少两个乙烯基的交联剂，其中溶液(d)和溶液(e)中的至少一种包含自由基引发剂；
将溶液(d)和(e)混合以形成油包水乳液(f)并且将单分散聚合物颗粒添加到乳液中；
使单分散聚合物颗粒在乳液中形成溶胀的聚合物颗粒；以及
使溶胀的聚合物颗粒聚合以形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒。
79.项78的方法，其中溶液(a)的亲水乙烯基单体如项1至13任一项中所进一步定义。
80.项78或项79的方法，其中溶液(e)的亲水乙烯基单体如项1至13或28任一项中所进一步定义；任选地其中溶液(a)和溶液(e)的亲水性乙烯基单体是相同的。
81.项78至80中任一项的方法，其中所述交联剂如项14至26任一项中所进一步定义。
82.项78至82中任一项的方法，其中每种稳定剂均是非离子表面活性剂，任选地其中每种非离子表面活性剂均是非离子聚合物表面活性剂。
83.项82的方法，其中所述非离子聚合物表面活性剂包含至少一个聚氧乙烯基团或至少一个聚氧丙烯基团。
84.项82或83的方法，其中每种稳定剂均包含至少一个聚氧乙烯基团。
85.项82至84中任一项的方法，其中每种非离子聚合物表面活性剂均是低聚物表面活性剂。
86.项78至85中任一项的方法，其中每种稳定剂均选自Hypermer 2296、Abil WE09或AMBN和Abil EM90。
87.项78至86中任一项的方法，其中所述链转移剂选自硫醇或卤代烷，任选地其中所述链转移剂是硫代多元醇。
88.项78至87中任一项的方法，其中所述链转移剂选自1-硫代甘油、1-辛硫醇、己硫醇、6-巯基-1-己醇、苄硫醇、四氯化碳和溴三氯甲烷；任选地其中所述链转移剂是1-硫代甘油。
89.项78至88中任一项的方法，其中所述自由基引发剂是过氧化物引发剂或偶氮引发剂。
90.项78至89中任一项的方法，其中所述自由基引发剂是2,2'-偶氮双-2,4-二甲基戊腈和/或2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)。
91.项78至90中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括脂族烃、脂族碳酸酯、脂族酯、脂族醚、芳族烃或硅酮、或其组合中至少一种。
92.项78至91中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括庚烷和甲苯的混合物；脂族烃的混合物；双(2-乙基己基)碳酸酯，任选地与脂族和芳族烃混合；或双(2-乙基己基)己二酸酯。
93.项78至92中任一项的方法，其中所述单分散种子颗粒具有根据项40至55中任一项的方法形成的单分散种子颗粒的特征。
94.项78至92中任一项的方法，其中所述单分散种子颗粒根据项40至55中任一项的方法形成。
95.项78至94中任一项的方法，其中溶液(a)和/或溶液(e)包含不超过60重量％的亲水乙烯基单体。
96.项78至95中任一项的方法，其中溶液(a)和/或溶液(e)包含至少2重量％的亲水乙烯基单体且不超过60重量％的亲水乙烯基单体，任选地其中溶液(a)和/或溶液(e)包含至少5重量％的亲水乙烯基单体且不超过45重量％的亲水乙烯基单体。
97.项78至96中任一项的方法，其中溶液(a)和/或溶液(e)包含约10重量％的亲水乙烯基单体。
98.项78至97中任一项的方法，其中所述引发剂以约0.1重量％至约1.5重量％的量存在于乳液中，任选地其中所述引发剂以约0.6重量％至约1.2重量％的量存在于乳液中，进一步任选地其中所述引发剂以约0.8重量％的量存在于乳液中。
99.项78至98中任一项的方法，其中每次聚合均包括使所述自由基引发剂活化。
100.项99的方法，其中使所述自由基引发剂活化包括加热包含溶胀的颗粒的乳液，任选地其中所述加热包括加热至至少40℃的温度。
101.项78至100中任一项的方法，其中使所述单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤进行至少30分钟，任选地至少1小时。
102.项78至101中任一项的方法，其中使所述单分散种子颗粒形成溶胀的颗粒的步骤包括将所述乳液混合，任选地其中所述混合在不超过30℃的温度下进行，任选地其中所述混合在约15℃至约25℃的温度下进行。
103.项56至102中任一项的方法，其中所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒是多孔的。
104.项56至103中任一项的方法，其中所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的众数直径为0.5μm至10μm或1μM至10μm，任选地众数直径为为0.5μm至5μm或1μm至5μm。
105.项56至104中任一项的方法，其中所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒的变异系数(CV)小于20％，任选地其中CV小于15％。
106.项56至105中任一项的方法，其中所形成的单分散交联水凝胶聚合物颗粒包含官能团，任选地其中所述官能团选自羟基、羧酸(-COOH)、伯胺或仲胺。
107.项106的方法，其还包括将一种或多种寡核苷酸连接至所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒。
108.可通过项40至55中任一项的方法获得的单分散种子颗粒。
109.可通过项56至107中任一项的方法获得的单分散交联水凝胶聚合物颗粒。
110.项1至33或项109中任一项的单分散交联水凝胶聚合物颗粒在核酸扩增中的用途。
111.项110的用途，其中所述核酸扩增包括将寡核苷酸扩增成多个寡核苷酸，任选地其中将所述多个寡核苷酸的至少一部分连接至所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒中的至少一个。
112.项110或111的用途，其中所述核酸扩增包括聚合酶链式反应(PCR)扩增或乳液PCR扩增。
113.项1至33或项109中任一项的单分散交联水凝胶聚合物颗粒在寡核苷酸测序中的用途。
114.项113的用途，其中所述寡核苷酸测序包括基于化学场效应晶体管(chemFET)的测序或基于离子敏感场效应晶体管(ISFET)的测序。
115.项110至114中任一项的用途，其中所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒在约10℃至约100℃的温度范围内是稳定的。
116.项110至115中任一项的用途，其中所述颗粒是多孔的并且对寡核苷酸和核酸扩增和测序试剂是通透的。
117.用于核酸扩增的方法，其包括对与连接至聚合物颗粒的寡核苷酸杂交的聚核苷酸进行引物延伸反应，其中所述聚合物颗粒是项1至33或项109中任一项的单分散交联水凝胶聚合物颗粒。
118.项117的方法，其中所述方法包括：
(a)提供连接至单股寡核苷酸的聚合物颗粒；
(b)提供单股模板多核苷酸；
(c)将单股寡核苷酸与单股模板多核苷酸杂交；和
(d)使所述单股模板多核苷酸与聚合酶和至少一个核苷酸在适合于所述聚合酶催化至少一个核苷酸聚合至单股寡核苷酸上的条件下接触，从而产生延伸的单股寡核苷酸。
119.项118的方法，其中所述方法还包括：
(e)从延伸的单股寡核苷酸中除去(例如变性)单股模板多核苷酸，使得单股寡核苷酸保持连接至聚合物颗粒；
(f)将剩余的单股寡核苷酸与第二单股模板多核苷酸杂交；以及
(g)使第二单股模板多核苷酸与第二聚合酶和第二至少一个核苷酸在适合于第二聚合酶催化第二至少一个核苷酸聚合至单股寡核苷酸上的条件下接触，从而产生随之的延伸的单股寡核苷酸。
120.项117至119中任一项的方法，其还包括：
(h)通过检测核苷酸添加来进行测序。
121.项120的方法，其中所述检测核苷酸添加包括检测来自所添加的荧光核苷酸的荧光发射或检测聚合物颗粒的局部环境中的pH变化。
122.项121的方法，其中所述检测核苷酸添加包括用离子传感器检测聚合物颗粒的局部环境中的pH变化，任选地其中离子传感器是场效应晶体管(FET)，进一步任选地其中所述离子传感器是化学场效应晶体管(ChemFET)或离子敏感场效应晶体管(ISFET)。
分析方法
分子量测量
种子颗粒中的低聚物的重均分子量(Mw)可以通过使用凝胶渗透色谱法(GPC)进行的测量来测定。在GPC中，运行一系列聚合物颗粒标准物并用于产生校准曲线。低聚物的Mw可以通过GPC相对于聚苯乙烯标准物使用含有0.01M LiBr的DMF作为洗脱剂来测量。由于这些Mw值是相对于不同于种子颗粒的聚合物的聚合物的标准物(聚苯乙烯)计算的，因此计算的Mw代表相对值而不是绝对值。因此测量结果是可重复的，但不能提供实际的Mw。
本文提供的实施例中使用的GPC方法的概要如下。使用以下实验条件：
洗脱液：含有0.01M LiBr的DMF
预柱：PSS GRAM，10μm，Guard ID 8.0mm×50mm
柱：PSS GRAM，10μm，线性M ID 8.0mm×300mm PSS GRAM，10μm，线性M ID 8.0mm×300mm
温度：70℃
泵：PSS SECcurity 1260HPLC泵
流速：1.0mL/min
注射系统：PSS SECcurity 1260自动进样器
注射体积：50μL
样品浓度：3.0g/L
检测器：PSS SECcurity 1260折射率检测器(RID)
色谱数据系统：PSS WinGPC UniChrom版本8.2
在以上实验条件下测量具有不同分子量的聚苯乙烯标准物以获得校准曲线。然后运行样品。然后基于PS校准曲线计算样品的Mw。
尺寸和尺寸分布
样品的尺寸分布可以使用盘式离心来测量，例如使用由仪器制造商提供的方案在Disc Centrifuge Model DC20000上的CPS Disc CentrifugationTM。准确的结果需要用与被分析的样品相似的密度的标准物进行校准，并且因此只有在适合的聚合物标准物可用的情况下才能使用，例如用于本公开内容的颗粒的主要包含聚苯乙烯的一组密实的聚苯乙烯颗粒标准物。在被测量样品具有未知的密度的情况下，例如对于多孔颗粒，则通过CPS盘式离心获得的测量结果是可重现的，但不能提供实际的直径。
本文提供的实施例中使用的CPS Disc CentrifugationTM的概况如下，其中使用三种不同的实验方法，基于例如待分析的颗粒的尺寸和孔隙度来选择合适的方法。
CPS方法1(例如实施例32，33)：在来自CPS仪器的CPS DC20000上以7500rpm的盘转速和在1.5g/L SDS(aq)中的3-7重量％的蔗糖的梯度进行盘式离心分析。使用来自CPS仪器的Auto Gradient泵制造梯度，注射梯度的体积为16-17mL。在注射之前，将样品在MilliQ-H2O中稀释至约0.01重量％。用于分析的方法具有以下设置：最大直径4.0μm，最小直径0.2μm，颗粒密度1.032g/mL，颗粒折射率1.4，颗粒吸收0，颗粒非球形度1，校准标准直径1.069μm，校准标准密度1.052，标准半值(standard half-with)0.15μm，液体密度1.016g/mL，液体折射率1.343。
所报告的尺寸是吸收峰的直径，并且CV是通过设定主峰周围的边界来确定的。
CPS方法2(例如实施例8，9，16-30)：在来自CPS仪器的CPS DC20000上以7500rpm的盘转速和在1.5g/L SDS(aq)中的3-7重量％的蔗糖的梯度进行盘式离心分析。使用来自CPS仪器的Auto Gradient泵制造梯度，注射梯度的体积为16-17mL。用于分析的方法具有以下设置：最大直径6.0μm，最小直径0.05μm，颗粒密度1.032g/mL，颗粒折射率1.032，颗粒吸收0，颗粒非球形度1，校准标准直径0.486μm，校准标准密度1.052，标准半值0.15μm，液体密度1.016g/mL，液体折射率1.343。
所报告的尺寸是吸收峰直径，并且CV是通过设定主峰周围的边界来确定的。
CPS方法3(例如实施例34-47)：在来自CPS仪器的CPS DC20000上以10000rpm的盘转速和在1.5g/L SDS(aq)中的8-24重量％的蔗糖的梯度进行盘式离心分析。使用来自CPS仪器的Auto Gradient泵制造梯度，注射梯度的体积为16-17mL。在注射之前，将样品在MilliQ-H2O中稀释至约0.01重量％。用于分析的方法具有以下设置：最大直径4.0μm，最小直径0.1μm，颗粒密度1.6g/mL，颗粒折射率1.592，颗粒吸收0.2，颗粒非球形度1，校准标准直径1.098，校准标准密度1.6，标准半值0.2μm，液体密度1.06g/mL，液体折射率1.355。
所报告的尺寸是吸收峰的直径，并且CV是通过设定主峰周围的边界来确定的。
光子相关光谱学(PCS)可用于获得z-平均形式的颗粒的流体动力学直径。测量与颗粒密度无关，并且基于小颗粒的布朗运动。纳米颗粒的PCS测量可以例如用MalvernZetaSizer Nano-ZS，Model ZEN3600获得。进一步的细节和方法可以见于MalvernZetasizer Nano系列手册(通过引用的方式以其全文结合至本文)。
可用于测定颗粒的尺寸和尺寸分布的另一种技术是光学显微法。可以通过将包含珠粒的水溶液置于显微镜载玻片上，然后以合适的放大倍数(例如，100×或更高)捕获珠粒的图像，并使用图像分析软件分析珠粒的尺寸来制备珠粒的群体。
本文提供的实施例中使用的光学显微法的概要如下。通过将0.12mm，9mm直径的Secure-SealTM间隔物夹在盖玻片和Secure-SealTM杂交腔室垫片之间来制备显微法样品。将所形成的空腔填充8μL的用150mM NaCl稀释的珠粒，然后短时间离心并连接至显微镜载玻片上。然后使用100X透镜在Olympus 1X81倒置显微镜上进行相差光学显微法。使用μManager的基于Matlab的宏来自动收集多个图像。收集失焦图像作为背景并从相差图像中扣除。然后使用Otsu方法对背景扣除的图像进行阈值化，以识别用于尺寸分析的单个珠粒。使用具有标准尺寸的绿色荧光聚苯乙烯珠粒通过荧光显微法来校准所测量的珠粒尺寸。然后使用一系列Alexa 488标记的水凝胶珠粒来校准相对尺寸(contrast size)与荧光尺寸。
光学显微法是用于测量颗粒的尺寸的优选方法，因为其提供独立于颗粒密度的测量。盘离式心分析是测量颗粒的尺寸分布(CV)的优选方法，因为光学显微法是基于图像分析的，并且图像中人为因素的存在可导致人为的高CV。
实施例
种子颗粒的合成
实施例1
向配备有机械桨式搅拌器和冷凝器的250mL三颈圆底烧瓶中装入5.0g经蒸馏的N,N-二甲基丙烯酰胺、4.0g Kraton G1650、0.20g 2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、108.0g庚烷、27.1g甲苯和0.21mL 1-辛硫醇。一旦所有物质均溶解后，将反应混合物用Ar(g)吹扫10min。然后使用油浴将反应物加热至70℃并加热8小时，同时以400rpm搅拌。所得的分散体通过动态光散射分析，得到521nm的z-平均直径。
实施例2
向配备有机械和桨式搅拌器和冷凝器的500mL三颈圆底烧瓶中装入10.1g经蒸馏的N,N-二甲基丙烯酰胺、8.0g Kraton G1650、0.40g 2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、216.0g庚烷、54.1g甲苯和0.85mL 1-辛硫醇。一旦所有物质均溶解后，将反应混合物用Ar(g)吹扫10min。然后使用油浴将反应物加热至70℃并加热8小时，同时以360rpm搅拌。所得的分散体通过动态光散射分析，得到733nm的z-平均直径。存在于分散体中的颗粒也通过GPC分析，得到8,410的Mw。
实施例3
向配备有机械锚式搅拌器和冷凝器的2L夹套圆底烧瓶中装入36.6g经蒸馏的N,N-二甲基丙烯酰胺、27.7g Kraton G1650、1.4g 2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、747.2g庚烷、186.9g甲苯和2.56g 1-辛硫醇。一旦所有物质均溶解后，将反应混合物用Ar(g)吹扫30min。然后使用连接至反应器的温控水浴将反应物加热至71℃并加热15h，同时以350rpm搅拌。在加热的第一个2.5h期间，保持低流量的Ar(g)。所得的分散体通过动态光散射分析，得到1035nm的z-平均直径。存在于分散体中的颗粒也通过GPC分析，得到10,300的Mw。
实施例4
该方法按照实施例1进行，但将反应混合物加热并在350rpm下搅拌过夜。所得的分散体通过动态光散射分析，得到387nm的z-平均直径。存在于分散体中的颗粒也通过GPC分析，得到22,400的Mw。
实施例5(对比例)
该方法按照实施例4进行，但不添加1-辛硫醇，即反应混合物不含有任何1-辛硫醇。所得的分散体通过动态光散射分析，得到238nm的z-平均直径。存在于分散体中的颗粒也通过GPC分析，得到403,000的Mw。
实施例6
该方法按照实施例4进行。所得的分散体通过动态光散射分析，得到358nm的z-平均直径。存在于分散体中的颗粒也通过GPC分析，得到21,200的Mw。
由低分子量种子颗粒合成聚合物颗粒
实施例7
使用0.8重量％的引发剂在庚烷/甲苯中形成的100mL批量的微米级丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的丙烯酰胺(AAm)储备溶液(stock solution))：将50g丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量10g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加70g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。在温和搅拌下将0.8g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液3(单体相)：将0.5g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至20g溶液1(10重量％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将溶液4转移至具有搅拌器的100mL反应器中，并且将8.1g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h)。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例8
使用0.5重量％的引发剂在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的微米级丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的丙烯酰胺(AAm)储备溶液)：将50g丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。在温和搅拌下将0.05g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液、300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)。将管涡旋并离心。除去上清液并用300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)洗涤沉淀物三次。随后在甲醇/去离子水混合物(50:50)中进行一次洗涤并且在去离子水中进行两次洗涤，然后将沉淀物重新悬浮在200μL去离子水中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释20倍来进行，并且从28幅图像中收集图像统计，得到2.3μm的众数直径。使用CPS方法2的相对盘式离心直径经测定为2.8μm，其CV＝3.0％(主峰)。
实施例9
使用替代的稳定剂在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的微米级丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的丙烯酰胺(AAm)储备溶液)：将50g丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Abil EM 90(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。在温和搅拌下将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10溶液％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液，管用甲苯填充至2mL标记并离心。除去上清液后，将沉淀物再分散在甲苯中并离心。此外使用甲苯进行两次洗涤，随后使用去离子水进行两次洗涤。最后将沉淀物再分散在去离子水中至总体积2mL，并且产物使用光学显微法和盘式离心来分析。从10幅图像中收集显微法图像统计，得到2.6μm的众数直径。使用CPS方法2的相对盘式离心直径经测定为3.3μm，其CV＝3.9％。
实施例10
使用在升高的温度下溶胀在非极性溶剂中形成的10mL批量的微米级丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的丙烯酰胺(AArm)储备溶液)：将50g丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在50℃下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例11
使用较高的丙烯酰胺含量在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的微米级丙烯酰胺颗粒。
溶液1(40重量％的丙烯酰胺(AAm)储备溶液)：将200g丙烯酰胺单体和300g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在50 0C下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例12
在Linpar 10-13中形成的10mL批量的微米级丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的丙烯酰胺(AAm)储备溶液)：将50g丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g Linpar 10-13(以下称为溶剂)。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g PDMAAm颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在50℃下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例13
在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的微米级羟甲基丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的N-羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)储备溶液)：将50g羟甲基丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的HMAAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例14
在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的微米级TRIS丙烯酰胺颗粒。
溶液1(10重量％的TRIS丙烯酰胺(TRIS)储备溶液)：将50g TRIS丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的TRIS储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例15
在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的微米级甲基丙烯酸羟乙酯颗粒。
溶液1(10重量％的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)储备溶液)：将50g甲基丙烯酸羟乙酯单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，然后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的HEMA储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。在温和搅拌下，将0.01g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g实施例2的种子颗粒的悬浮液(约7重量％的干含量-以下称为种子)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
实施例16(对比例)
在不存在种子颗粒的情况下在庚烷/甲苯中形成的10mL批量的丙烯酰胺产物。
溶液1(10重量％的丙烯酰胺(AAm)储备溶液)：将50g丙烯酰胺单体和450g水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，随后添加7g 1:1(体积比)庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液3(单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(交联剂，以下称为DHEBA)添加至2g溶液1(10重量％的AAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(来自Wako Chemicals的自由基引发剂，以下称为V-65)添加至溶液中。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，在温和搅拌/旋转下使乳液在室温下溶胀过夜(～16h)。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液、300μL甲苯和1200μL去离子水。将管涡旋并离心。除去上清液并用300μL甲苯和去离子水(添加至2mL线)洗涤沉淀物两次。随后在去离子水中进行两次洗涤，最后将沉淀物重新悬浮在200μL去离子水中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释10倍来进行，并且从25幅图像中收集图像统计。宽的分布使得难以使用显微法来测定尺寸的真实值。使用CPS方法2的相对盘式离心直径经测定为1.4μm，其CV＝30％。
实施例17
溶液1(单体相)：向配备有搅拌棒的100mL Duran烧瓶中添加0.9g N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺(DHEBA)和39g H2O。在搅拌下将混合物加热至-40℃直至全部DHEBA均溶解，随后添加4.4g丙烯酰胺(AAm)。
溶液2(稳定剂)：将0.8g 2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)、9g Span 80、33g甲苯和33g庚烷添加至250mL Duran烧瓶中，并且振摇直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将20g溶液1添加至溶液2中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和5g实施例4)的种子颗粒装入至配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的三颈圆底烧瓶中，并在100rpm和22℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶10min，然后加热至70℃，同时在50rpm下搅拌7h。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液，并且管用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)填充。将管涡旋并离心。除去上清液并用NMP洗涤沉淀物两次，用去离子水洗涤两次，最后将沉淀物重新悬浮在150μL去离子水中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。显微法通过在150mM NaCl(aq)中将再分散的样品稀释100倍来进行，得到1.3μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.5μm的直径，其CV＝6.5％(主峰)。
实施例18
溶液1(单体相)：如实施例17。
溶液2(稳定剂)：将0.8g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、9g Hypermer 2296、64g十二烷添加至250mL Duran烧瓶中并振摇直至全部溶解。
溶液3(乳液)：如实施例17，但聚合24h。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液、300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)。将管涡旋并离心。除去上清液并用300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)洗涤沉淀物三次。随后在甲醇/去离子水混合物(50:50)中进行一次洗涤并且在去离子水中进行两次洗涤，最后将沉淀物重新悬浮在100μL去离子水中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。显微法通过在150mM NaCl(aq)中将再分散的样品稀释100倍用于显微来进行，得到1.0μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.4μm的直径，其CV＝5.2％(主峰)。
实施例19
溶液1(单体相)：如实施例17。
溶液2(稳定剂)：将0.8g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、9g Abil WE09、13g矿物油和52g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)分别添加至250mL Duran烧瓶中并振荡直至全部溶解。
溶液3(乳液)：如实施例17。
再分散和分析：如实施例18，但最后再分散在50μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释30倍用于显微法，得到1.0μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.7μm的直径，其CV＝6.4％(主峰)。
实施例20
溶液1(单体相)：如实施例17，但将AAm改为羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例17。
再分散和分析：如实施例18，但最后再分散在50μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释30倍用于显微法，得到1.0μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.7μm的直径，其CV＝6.4％(主峰)。
实施例21
溶液1(单体相)：在配备有搅拌棒的100mL Duran烧瓶中装入0.95g N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺(DHEBA)和18g H2O。在搅拌下将混合物加热至-40℃直至全部DHEBA均溶解，随后添加4.8g丙烯酰胺(AAm)。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例17。
再分散和分析：如实施例18，但最后再分散在50μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释30倍用于显微法，得到1.3μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到2.5μm的直径，其CV＝5.6％(主峰)。
实施例22
溶液1(单体相)：如实施例17。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例17，但使用21g溶液1和4g实施例6的种子颗粒。
再分散和分析：如实施例17。显微法通过在150mM NaCl(aq)中将再分散的产物稀释200倍用于显微法，得到1.2μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到2.0μm的直径，其CV＝5.7％(主峰)。
实施例23
溶液1(单体相)：如实施例17，但将AAm改为2.5g AAm和0.03g 3-丙烯酰胺基丙酸(AAmPA)。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例22。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在150μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释200倍用于显微法，得到1.3μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.7μm的直径，其CV＝8.0％(主峰)。
羧酸基团的反应：将50μL再分散的珠粒添加至2mL eppendorf管中，用NMP洗涤两次，然后再分散在100μL NMP中。作为第一步，添加40μL在NMP中的100mM N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐溶液，并将该管以1000rpm的转速置于热混合器中1小时。在第二步中添加20μL Alexafluor 488尸胺(cadaverine)(1mg于250μLNMP中)，并将该管以1000rpm的转速置于热混合器中1小时。珠粒用NMP洗涤三次，用H2O洗涤三次。然后将珠粒再分散在1000mL的150mM NaCl(aq)中，并且最后在150mM NaCl(aq)中稀释10倍。使用相差和荧光显微法进行成像，证实存在反应性基团。作为对照实验，用上述染色方案处理来自实施例22的珠粒，得到在荧光显微法中不可见的珠粒。
实施例24
溶液1(单体相)：如实施例17，但AAm用N-(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺(HEMAAm)代替。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例22。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在150μL中，并在150mM NaCl(aq)中稀释200倍用于显微法，得到1.2μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.7μm的直径，其CV＝5.8％(主峰)。
实施例25
溶液1(单体相)：如实施例17，但将H2O改为在H2O中的10％的甲醇。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例22。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在150μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释200倍用于显微法，得到1.3μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.9μm的直径，其CV＝6.7％(主峰)。
实施例26
溶液1(单体相)：如实施例17，但将AAm改为甲基丙烯酰胺(MAAm)。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例22。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在100μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释400倍进行显微法，得到1.3μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.8μm的直径，其CV＝9.3％(主峰)。
实施例27
溶液1(单体相)：如实施例17。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例22，但在20℃搅拌1h而不是过夜。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在100μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释400倍用于显微法，得到1.1μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.7μm的直径，其CV＝6.1％(主峰)。
实施例28(对比例)
溶液1(单体相)：如实施例17。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例17，但使用24g溶液1和1g实施例5的种子颗粒。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在200μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释100倍用于显微法，得到1.6μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到3.1μm的直径，其CV＝28％(主峰)。
实施例29(对比例)
溶液1(单体相)：如实施例17。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例17，但使用实施例5的种子颗粒(而不是来自实施例4的种子颗粒)。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在200μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释100倍用于显微法，得到1.6μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到3.1μm的直径，其CV＝28％(主峰)。
实施例30
溶液1(单体相)：如实施例17，但将AAm替换为丙烯酸羟乙酯(HEA)。
溶液2(稳定剂)：如实施例19。
溶液3(乳液)：如实施例22。
再分散和分析：如实施例17，但最后再分散在100μL中，并且在150mM NaCl(aq)中稀释10倍用于显微法，得到1.2μm的众数直径。通过使用CPS方法2的盘式离心进行表征，得到1.6μm的直径，其CV＝6.1％(主峰)。
种子颗粒的合成
实施例31
向配备有机械锚式搅拌器和冷凝器的2L夹套圆底烧瓶中装入34.6g经蒸馏的N,N-二甲基丙烯酰胺、27.6g Kraton G1650、1.5g 2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、747.9g庚烷、187.0g甲苯和1.2g 1-辛硫醇。一旦所有物质均溶解后，将反应混合物用Ar(g)吹扫60min。然后使用连接至反应器的温控水浴将反应物加热至71℃并加热16h，同时以400rpm搅拌。所得的分散体通过动态光散射分析，得到360nm的z-平均直径。
高度可溶胀的颗粒
实施例32
溶液1(单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入1.7g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、0.02g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、0.26g N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺(DHEBA)和22.9gH2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：将1.76g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、24g Abil WE09、26g矿物油和104g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至250mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将71g溶液2添加至溶液1中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和4.17g PDMAAm种子(实施例31)装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的1L夹套圆底烧瓶中，并在100rpm和20℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在50rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将50g粗产物和150g N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)添加至250mL离心烧瓶中。烧瓶振摇90min，随后以10000rpm离心15min。除去上清液并将产物再用NMP洗涤一次，用H2O洗涤3次，最后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.04重量％的浓度来进行，并且从4幅图像中收集图像统计，得到1.3μm的众数直径。使用CPS方法1的相对盘式离心直径经测定为1.6μm，其CV＝8.0％。
转移至NMP：将20g于H2O中的颗粒悬浮液分至2×50mL的离心管中，将管用NMP填充并以10000rpm离心10min。除去上清液，随后在NMP中再洗涤3次，最后再悬浮在NMP中。
实施例33
溶液1(单体相)：如实施例32。
溶液2(稳定剂)：如实施例32。
溶液3(乳液)：如实施例32。
再分散和分析：将50g粗产物和150g N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)添加至250mL离心烧瓶中。烧瓶振摇90min，随后以10000rpm离心15min。除去上清液并将产物再用NMP洗涤一次，用H2O洗涤3次，最后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.05重量％的浓度来进行，并且从25幅图像中收集图像统计，得到1.6μm的众数直径。使用CPS方法1的相对盘式离心直径经测定为1.7μm，其CV＝6.6％。
转移至NMP：如实施例32。
较不易溶胀的颗粒
实施例34
溶液1(单体相)：在500mL Duran烧瓶中装入28.6g羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)、0.95g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、19.7g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-1,2-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和29.4g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：将3.8g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、48g Abil WE09、53g矿物油和210g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至600mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将262g溶液2添加至溶液1中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和40g PDMAAm种子(实施例31)装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的1L夹套圆底烧瓶中，并在100rpm和22℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在64rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将粗产物分至2×250mL的离心烧瓶中并以5000rpm离心15min以及以7000rpm离心10min。除去上清液并将颗粒再分散在异丙醇中。然后将再分散的颗粒分至总共6×250mL的离心瓶中，用异丙醇洗涤4次，并用H2O洗涤6次，最后再分散在H2O中。然后通过三种不同的过滤网织物过滤颗粒：Sefar Nitex 03-64/32、Sefar Nitex 03-30/18和Sefar Nitex 03-1/1。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mMNaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从18幅图像中收集图像统计，得到0.91μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.54μm，其CV＝6.2％。
实施例35
溶液1(单体相)：在500mL Duran烧瓶中装入27.0g羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)、2.6g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、19.7g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和49.3g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：如实施例34。
溶液3(乳液)：如实施例34。
再分散和分析：将粗产物分至2×250mL的离心烧瓶中并以5000rpm离心25min。除去上清液并将颗粒再分散在异丙醇中。然后将再分散的颗粒分至总共6×250mL的离心瓶中，用异丙醇洗涤4次，并用H2O洗涤5次，最后再分散在H2O中。然后通过两种不同的过滤网织物过滤颗粒：Sefar Nitex 03-30/18和Sefar Nitex 03-1/1。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从21幅图像中收集图像统计，得到0.90μm众数直径。使用CPS方法3的相对盘离心机直径经测定为0.53μm，其CV＝5.2％。
实施例36
溶液1(单体相)：在500mL Duran烧瓶中装入24.8g羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)、5.0g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、19.9g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和49.7g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：将3.8g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、52g Abil WE09、57g矿物油和228g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至1000mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将284g溶液2添加至溶液1中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和17g PDMAAm种子(实施例31)装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的1L夹套圆底烧瓶中，并在100rpm和25℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在62rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将粗产物分至2×250mL的离心烧瓶中并以3000rpm离心10min以及以5000rpm离心20min。除去上清液并将颗粒再分散在异丙醇中。然后将再分散的颗粒分至总共6×250mL的离心瓶中，用异丙醇洗涤4次，并用H2O洗涤6次，最后再分散在H2O中。然后通过两种不同的过滤网织物过滤颗粒：Sefar Nitex 03-30/18和Sefar Nitex 03-1/1。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从30幅图像中收集图像统计，得到1.0μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.57μm，其CV＝6.3％。
实施例37
溶液1(单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入1.8g羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)、0.7g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、4.9g N,N-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和17.3g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：将2.8g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、35g Abil WE09、38g矿物油和153g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至400mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将66g溶液2添加至溶液1中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和9.9g PDMAAm种子(实施例31)装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的1L夹套圆底烧瓶中，并在100rpm和19℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在55rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将粗产物添加至250mL离心烧瓶中并以5000rpm离心20min。除去上清液并将颗粒再分散在异丙醇中。然后将再分散的颗粒分至总共2×250mL的离心瓶中，用异丙醇洗涤3次，并用H2O洗涤6次，最后再分散在H2O中。然后通过两种不同的过滤网织物过滤颗粒：Sefar Nitex 03-30/18和Sefar Nitex 03-1/1。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从21幅图像中收集图像统计，得到0.84μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.41μm，其CV＝9.5％。
实施例38
溶液1(单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入12.3g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和12.4g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：如实施例37。
溶液3(乳液)：如实施例37。
再分散和分析：如实施例37。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从24幅图像中收集图像统计，得到0.85μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.50μm，其CV＝8.7％。
实施例39
溶液1(单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入2.1g羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)、0.3g丙烯酸(AA)、4.9g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和17.3g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：如实施例37。
溶液3(乳液)：如实施例37。
再分散和分析：如实施例37。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从21幅图像收集图像统计，得到0.85μm众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.42μm，其CV＝7.6％。
2-阶段颗粒
实施例40
阶段1：在不存在交联剂的情况下的颗粒的溶胀和聚合
溶液1(12重量％的羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)储备溶液)：将125g羟甲基丙烯酰胺单体(48％的溶液)和375g DI水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(单体相)：将5μL 1-硫代甘油添加至2g溶液1(25重量％的HMAAm储备溶液)中。然后将该溶液加热至～40℃以促进混合。在温和搅拌下，将0.08g偶氮双二甲基戊腈(V-65)添加至溶液中。
溶液3(稳定剂)：称量1g Hypermer 2296(稳定剂)，然后添加7g 1:1(体积比)的庚烷:甲苯(以下称为溶剂或H/T)混合物。搅拌稳定剂溶液直至获得均匀的溶液。
溶液4(乳液相)：使用Ultraturrax将溶液2和3混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。在乳化之后，将0.81g PDMAAm种子(实施例3)添加至乳液中，并且在温和搅拌/旋转下使含有种子的乳液在室温下溶胀过夜(～16h))。溶胀之后，将溶液4在50℃下在搅拌下聚合7h。
阶段2：交联颗粒的二次溶胀和聚合
溶液5(第二稳定剂溶液)：与溶液3相同。
溶液6(第二单体相)：将0.05g 1,2-二羟基双丙烯酰胺(DHEBA)添加至8mL溶液1(25重量％的HMAAm储备溶液)中。然后将溶液加热至～40℃以促进混合。在温和搅拌下，将0.05g偶氮双二甲基戊腈(V-65)添加至溶液中。
溶液7(第二乳液相)：使用Ultraturrax将溶液5和6混合1分钟，然后在冰上超声处理3分钟(6×30sec间隔)(Branson digital sonifier 450CE，幅度40％)。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液、300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)。将管涡旋并离心。除去上清液并用300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)洗涤沉淀物三次。随后在甲醇/去离子水混合物(50:50)中进行一次洗涤并且在去离子水中进行两次洗涤，然后将沉淀物重新悬浮在150μL去离子水中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释10倍来进行，并且从21幅图像中收集图像统计，得到4.0μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.69μm，其CV＝3.4％。
实施例41
阶段1：在不存在交联剂的情况下的颗粒的溶胀和聚合
溶液1(24重量％的羟甲基丙烯酰胺(HMAAm)储备溶液)：将25g羟甲基丙烯酰胺单体(48％的溶液)和25g DI水混合直至形成澄清且均匀的溶液。
溶液2(单体相)：如实施例40，但使用20μL 1-硫代甘油。
溶液3(稳定剂)：如实施例40。
溶液4(乳液相)：如实施例40。
阶段2：交联颗粒的二次溶胀和聚合
如实施例40，但使用50重量％的HMAAm储备溶液。
再分散和分析：向2mL eppendorf管中添加300μL聚合乳液、300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)。将管涡旋并离心。除去上清液并用300μL庚烷/甲苯混合物(50:50)和1200μL甲醇/去离子水混合物(50:50)洗涤沉淀物三次。随后在甲醇/去离子水混合物(50:50)中进行一次洗涤并且在去离子水中进行两次洗涤，然后将沉淀物重新悬浮在200μL去离子水中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释10倍来进行，并且从21幅图像中收集图像统计，得到3.4μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.89μm，其CV＝3.8％。
实施例42
阶段1：在不存在交联剂的情况下的颗粒的溶胀和聚合
溶液1(单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入16.0g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、0.3g1-硫代甘油和8.3g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：将2.6g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、32g Abil WE09、35g矿物油和139g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至250mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将65g溶液2添加至溶液1中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和10.3g PDMAAm种子装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的250mL三颈圆底烧瓶中，并在100rpm和20℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在53rpm下搅拌7h。
阶段2：交联颗粒的二次溶胀和聚合
溶液5(第二单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入7.1g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、2.4g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和14.2g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液6(第二稳定剂)：将2.6g的2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、34g AbilWE09、37g矿物油和147g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至400mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液7(第二乳液)：将69g溶液6添加至溶液5中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液7和7.7g聚合溶液3装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的250mL三颈圆底烧瓶中，并在100rpm和22℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在56rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将粗产物添加至250mL离心烧瓶中并以5000rpm离心30min。除去上清液并将颗粒再分散在异丙醇中。然后将再分散的颗粒用异丙醇洗涤2次，并用H2O洗涤14次，然后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.05重量％的浓度来进行，并且从97幅图像中收集图像统计，得到5.6μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为2.0μm，其CV＝7.5％。
实施例43
阶段1：在不存在交联剂的情况下的颗粒的溶胀和聚合
溶液1(单体相)：如实施例42。
溶液2(稳定剂)：将2.6g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、32g Hypermer2296、88g甲苯和89g庚烷添加至400mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：如实施例42，但使用本实施例的溶液。
阶段2：交联颗粒的二次溶胀和聚合
溶液5(第二单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入7.0g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、2.3g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)和14.1g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液6(第二稳定剂)：将0.96g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、12g Hypermer2296、34g甲苯和34g庚烷添加至250mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液7(第二乳液)：将67g溶液6添加至溶液5中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液7和7.7g聚合溶液3装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的250mL三颈圆底烧瓶中，并在100rpm和22℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在55rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将粗产物添加至250mL离心烧瓶中并以3000rpm离心5min。除去上清液并将颗粒再分散在异丙醇中。然后将再分散的颗粒用异丙醇洗涤3次，并用H2O洗涤10次，最后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.02重量％的浓度来进行，并且从72幅图像中收集图像统计，得到4.4μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为1.3μm，其CV＝7.1％。
多官能交联剂
实施例44
N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺(BAAmEAAm)的合成。
将二亚乙基三胺(14.63g；142mmol)溶于200mL乙腈中。添加碳酸钾(64.68g；468mmol)，并将反应混合物用冰浴冷却至0℃。在约45分钟内滴加丙烯酰氯(36.3mL，447mmol)。移除冰浴并将反应物在环境温度下搅拌2小时。过滤反应混合物，并且滤饼用200mL CH2Cl2冲洗。将抑制剂(吩噻嗪，10.1mg)添加至滤液中，然后在25℃下减压除去挥发物。粗物质通过在二氧化硅上的干燥快速色谱法使用在二氯甲烷中的甲醇梯度来纯化。合并含有产物的级分，并添加9.9mg吩噻嗪，最后在真空下干燥产物。产量12.97g。
实施例45
溶液1(单体相)：在250ml Duran烧瓶中装入3.1g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、0.7g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、3.7g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,2-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)、0.3g N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺(BAAmEAAm)和17g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：将2.6g 2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)、32g Abil WE09、35g矿物油和140g二乙基己基碳酸酯(Tegosoft DEC)添加至250mL烧杯中，并用磁力搅拌棒混合直至全部溶解。
溶液3(乳液)：将65g溶液2添加至溶液1中，随后使用Ultraturrax混合1min。通过使用来自Hielscher Ultrasound Technology的UP 200s进行超声处理来进行进一步的乳化，循环设定为0.9且幅度设定为40％。在下一步骤中，将溶液3和9.87g的PDMAAm种子(实施例31)装入配备有冷凝器、机械搅拌器和气体入口的250mL三颈圆底烧瓶中，并在100rpm和20℃下搅拌过夜。最后用Ar(g)吹扫烧瓶30min，然后加热至70℃，同时在53rpm下搅拌7h。
再分散和分析：将70g粗产物与500mL H2O和2-丁醇一起添加至1000mL离心烧瓶中，随后振摇30min。然后离心混合物，并除去顶部的2-丁醇相，随后另外添加2×200ml 2-丁醇洗涤。然后将悬浮液分至6×250mL的离心瓶中并用H2O洗涤6次，最后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从25幅图像中收集图像统计，得到0.82μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.43μm，其CV＝4.6％。
实施例46
溶液1(单体相)：在250ml Duran烧瓶中装入3.0g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、0.7g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、3.7g N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2-二基))二丙烯酰胺(EGBEAAm)、0.2g 4臂PEG-丙烯酰胺和17g的H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：如实施例45。
溶液3(乳液)：如实施例45。
再分散和分析：将70g粗产物与500mL H2O和2-丁醇一起添加至1000mL离心烧瓶中，随后振摇60min。然后离心混合物，并除去顶部的2-丁醇相，随后另外用2-丁醇洗涤一次。然后将悬浮液用H2O洗涤5次，最后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从11幅图像中收集图像统计，得到0.86μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.41μm，其CV＝6.0％。
实施例47
溶液1(单体相)：在250mL Duran烧瓶中装入1.8g羟乙基丙烯酰胺(HEAAm)、0.7g丙烯酰胺基丙酸(AAPA)、2.5g N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺(BAAmEAAm)和20g H2O。振摇混合物直至全部溶解。
溶液2(稳定剂)：如实施例45。
溶液3(乳液)：如实施例45。
再分散和分析：将70g粗产物与500mL H2O和2-丁醇一起添加至1000mL离心烧瓶中，随后振摇60min。然后离心混合物，并除去顶部的2-丁醇相，随后另外用2-丁醇洗涤一次。然后将悬浮液分至6×250mL的离心瓶中，并用H2O洗涤5次，最后再分散在H2O中。产物使用光学显微法和盘式离心来分析。明视野显微法通过在150mM NaCl溶液中将再分散的产物稀释至0.01重量％的浓度来进行，并且从24幅图像中收集图像统计，得到0.67μm的众数直径。使用CPS方法3的相对盘式离心直径经测定为0.39μm，其CV＝6.4％。
含有羧酸酯基团的水凝胶的活化。
实施例48
向7200μL实施例32的颗粒于NMP的悬浮液中添加22.6mg O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)、27μL三丁胺以及NMP至最终体积为7.5mL。在室温下振摇1h后，将悬浮液以15,000rpm离心50min。将上清液从所得沉淀物中除去，并且将沉淀物重新悬浮在4mL新鲜NMP中，并以15,000rpm离心1h。将上清液从包含NHS酯活化的水凝胶的所得沉淀物中除去。重复4mL NMP洗涤/旋转一次。
实施例49
按照实施例48，但使用7300μL实施例33的颗粒的悬浮液。
水凝胶与胺末端DNA探针的共轭
实施例50
将量为193.4μL 5'-胺封端的30聚体寡核苷酸(对于每个寡核苷酸磷酸基团具有四丁基铵抗衡离子)的5.17mM NMP溶液添加至来自实施例48的羧酸NHS酯水凝胶沉淀物中。将悬浮液用NMP稀释至9.976mL。在添加23.8微升的42mM的于NMP中的三丁胺后，总反应体积为10mL，将反应容器在66℃的热混合器中搅动16h。添加10mL水并冷却至室温，向该混合物中添加10mL 0.25M NaOH。在室温下在热混合器中搅动15min，并添加1mL 50xTE，随后离心50min，并除去上清液。将所得沉淀物重新悬浮在10毫升1xTE中，随后离心50min，并除去上清液。此时，将水凝胶沉淀物重新悬浮在10mL 1xTE缓冲液中并在80℃加热1h；在离心(以15,000rpm离心50min)并除去上清液之后，如上所述用10mL 1xTE洗涤共轭的水凝胶，随后离心50min并除去上清液。将所得沉淀物重新悬浮在14mL去离子水中并用5μm注射器过滤器过滤以备随后使用
实施例51
如实施例50，但使用来自实施例49的羧酸NHS酯水凝胶沉淀物。
用OCP143库模板化、芯片加载和测序
实施例52
有关更多信息，请参见thermofisher.com上的用户指南，以下是简要说明。通过乳液PCR将共轭颗粒用100-120个碱基对的DNA库模板化。使用530v1标准Ion ChefTM试剂和消耗品在自动Ion ChefTM仪器上进行模板化。将颗粒手动加载至芯片上，并在Ion ProtonTM测序仪上进行测序。来自实施例50的共轭颗粒的测序的关键指标：1.4M总读数，98.6％原始读取准确度和75碱基AQ20平均值(错误碱基读数的概率为1％)。来自实施例51的共轭颗粒的测序的关键指标：3.0M总读数，98.7％原始读取准确度和83个碱基AQ20平均值。
Claims (54)
1.具有100nm至1500nm的Z-平均直径的单分散种子颗粒，其中每个种子颗粒包含多个聚N,N-二甲基丙烯酰胺的非交联低聚物。
2.权利要求1的种子颗粒，其中所述低聚物的重均分子量(Mw)为2,000Da至100,000Da。
3.权利要求1或2的种子颗粒，其中所述低聚物的Mw为5,000Da至70,000Da；任选地为6,000Da至40,000Da；进一步任选地为7,000Da至50,000Da或为8,000Da至40,000Da。
4.权利要求1至3中任一项的种子颗粒，其中所述颗粒具有在有机溶剂中在稳定剂和链转移剂的存在下通过N,N-二甲基丙烯酰胺的自由基引发聚合形成的种子颗粒的特征。
5.权利要求1至4中任一项的种子颗粒用于形成单分散交联水凝胶聚合物颗粒的用途，任选地其中所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒是交联聚丙烯酰胺颗粒。
6.权利要求5的用途，其中所述单分散交联水凝胶聚合物颗粒包含由以下形成的聚合物：
(a)log Poct/wat(log P)小于约1的亲水乙烯基单体；
以及
(b)包含至少两个乙烯基的交联剂。
7.权利要求6的用途，其中所述亲水乙烯基单体的log P小于约0.6，任选地其中log P小于约0.3，进一步任选地其中log P小于约0。
8.权利要求6或权利要求7的用途，其中所述亲水乙烯基单体的log P为0.5至-2，任选地其中log P为0至-2。
9.权利要求6至8中任一项的用途，其中所述亲水乙烯基单体为丙烯酰胺单体和/或丙烯酸酯单体。
10.权利要求6至9中任一项的用途，其中所述亲水乙烯基单体包括式(I)的至少一种化合物：
其中：
R1为-H、-CH3或-CH2CH3；
R2为-OR3或-N(R4)R5；
R3为-H、-C1-C6烷基或-C1-C6醇；以及
R4和R5彼此独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6卤代烷基、-C1-C6醇，
其中，在化学上可能的情况下，R3和/或R4和/或R5任选地各自独立地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H和C1-C4烷基。
11.权利要求10的用途，其中R1为-H或-CH3，任选地其中R1为-H。
12.权利要求10或权利要求11的用途，其中R2为-OR3。
13.权利要求10至12中任一项的用途，其中R3为-H。
14.权利要求10至13中任一项的用途，其中R4为-H或-C1-C6烷基，任选地其中R4为-H。
15.权利要求10至14中任一项的用途，其中R5可为-H或-C1-C6烷基，任选地其中R5为-H。
16.权利要求6至15中任一项的用途，其中所述亲水乙烯基单体选自或包括至少一种丙烯酰胺单体、丙烯酸单体、甲基丙烯酰胺单体或甲基丙烯酸单体。
17.权利要求6至16中任一项的用途，其中所述亲水乙烯基单体选自或包括丙烯酰胺、羟甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酰胺、[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、3-丙烯酰胺基丙酸、甲基丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、或丙烯酸2-羟乙酯；任选地其中亲水乙烯基单体选自或包括丙烯酰胺(丙-2-烯酰胺)、羟甲基丙烯酰胺、羟乙基丙烯酰胺、三羟甲基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-羟乙酯和丙烯酸中的至少一种。
18.权利要求6至17中任一项的用途，其中所述亲水乙烯基单体包括伯酰胺基团(-C(O)NH2)。
19.权利要求6至18中任一项的用途，其中所述交联剂为双官能、三官能或四官能丙烯酰胺，任选地其中所述交联剂为双官能丙烯酰胺。
20.权利要求6至19中任一项的用途，其中所述交联剂包括式(IIa)或(IIb)的至少一种化合物：
其中R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6杂烷基、-C1-C6环烷基-、-C1-C6羟烷基-、-C1-C6醚-或包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚；
R7和R8各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚；
R9为-N(R11)C(O)CH＝CH2；
R10选自-H和-N(R12)C(O)CH＝CH2；以及
R11和R12各自独立地选自-H、-C1-C6烷基、-C1-C6杂烷基、-C3-C6环烷基、-C1-C6羟烷基或-C1-C6醚；
任选地其中，在化学上可能的情况下，R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12中的一个或多个独立地被1至5个在每种情况下各自独立地选自以下的取代基取代：氧代基、＝NRa、＝NORa、卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa；SRa、S(O)Ra、S(O)2ORa、S(O)2Ra、S(O)2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基、C1-C4卤代烷基；其中Ra在每种情况下独立地选自：H、C1-C4烷基和C1-C4烯基。
21.权利要求20的用途，其中R6选自-C1-C6烷基-、-C1-C6羟烷基-和包含2至100个C2-C3醚单元的聚醚，任选地其中R6选自-C1-C6烷基-和-C1-C6羟烷基-，进一步任选地其中R6为-C1-C6羟烷基-。
22.权利要求20或权利要求21的用途，其中R6选自-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-或-(CH2)4-，任选地其中R6为-(CH2)2-。
23.权利要求20至22中任一项的用途，其中R6选自-C(OH)H-、-(C(OH)H)2-、-(C(OH)H)3-或-(C(OH)H)4-，任选地其中R6为-(C(OH)H)2-。
24.权利要求20或权利要求21的用途，其中R6为(CH2)r(OCH2CH2)nO(CH2)s，其中r和s各自独立地为2或3，并且n为1至100的整数。
25.权利要求24的用途，其中r和s各自为2并且n为1至50的整数。
26.权利要求20至25中任一项的用途，其中R7和/或R8为H。
27.权利要求6至26中任一项的用途，其中所述交联剂的log P值小于约1，任选地log P值小于约0.5，进一步任选地log P值小于约0。
28.权利要求6至27中任一项的用途，其中所述交联剂是或包括N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、Ν,Ν'-亚乙基双(丙烯酰胺)、甘油1,3-二甘油化物二丙烯酸酯、哌嗪二丙烯酰胺、N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)、4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)和/或N,N-双(2-丙烯酰胺基乙基)丙烯酰胺。
29.权利要求6至28中任一项的用途，其中所述交联剂是或包括1,2-二羟基双丙烯酰胺。
30.权利要求6至29中任一项的用途，其中所述交联剂是或包括N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酰胺(MW≤2000)和4臂PEG-丙烯酰胺(MW≤2000)，任选地其中所述交联剂是或包括N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))二丙烯酰胺。
31.权利要求6至30中任一项的用途，其中所述交联剂不包含伯胺、仲胺、羟基或羧酸。
32.权利要求6至31中任一项的用途，其中所述交联水平为1-60重量％的交联剂，任选地1-30重量％的交联剂；或其中所述交联水平为10-90重量％的交联剂，任选地25-60重量％的交联剂。
33.权利要求6至8中任一项的用途，其中所述亲水乙烯基单体为如权利要求19至31任一项中所定义的交联剂。
34.权利要求6至33中任一项的用途，其中所述聚合物颗粒是多孔的。
35.权利要求6至34中任一项的用途，其中所述聚合物颗粒的平均直径为0.5μm至10μm，任选地为0.5μm至5μm。
36.权利要求6至35中任一项的用途，其中变异系数(CV)小于20％，任选地其中CV小于15％。
37.权利要求6至36中任一项的用途，其中所述颗粒包含连接至所述颗粒的寡核苷酸。
38.权利要求6至37中任一项的用途，其中每个所述颗粒包含连接至所述颗粒的多个寡核苷酸，任选地其中所述多个寡核苷酸对于每个单个颗粒是相同的。
39.形成单分散种子颗粒的方法，其包括：
将N,N-二甲基丙烯酰胺、稳定剂、自由基引发剂和链转移剂溶解在有机溶剂中以形成反应混合物；以及
加热反应混合物使引发剂活化，
从而形成单分散种子颗粒。
40.权利要求39的方法，其中所述稳定剂是苯乙烯和聚烯烃的嵌段共聚物，任选地其中所述稳定剂是由聚(乙烯-共-丁烯)中间嵌段和聚苯乙烯外侧嵌段组成的三嵌段共聚物。
41.权利要求39或权利要求40的方法，其中所述稳定剂选自或包括Kraton A1535H、Kraton G1650M、Kraton G1652M或Kraton G1657M。
42.权利要求39至41中任一项的方法，其中所述自由基引发剂是过氧化物引发剂或偶氮引发剂。
43.权利要求39至42中任一项的方法，其中所述自由基引发剂选自2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)、2,2'-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)、过氧化二苯甲酰，任选地其中所述自由基引发剂是2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)。
44.权利要求39至43中任一项的方法，其中加热反应混合物使引发剂活化包括加热至至少40℃，任选地加热至至少50℃，进一步任选地加热至至少60℃。
45.权利要求39至44中任一项的方法，其中所述链转移剂是硫醇或卤代烷，任选地其中所述链转移剂是烷基硫醇。
46.权利要求39至45中任一项的方法，其中所述链转移剂选自1-辛硫醇、己硫醇、6-巯基-1-己醇、苄硫醇、四氯化碳和溴三氯甲烷。
47.权利要求39至46中任一项的方法，其中所述链转移剂是1-辛硫醇。
48.权利要求39至47中任一项的方法，其中所述有机溶剂包括烷烃组分和芳族组分的混合物。
49.权利要求48的方法，其中所述烷烃组分和芳族组分以约0.5:1至约20:1的烷烃组分:芳族组分的重量比存在，任选地其中烷烃组分:芳族组分的重量比为约1:1至约10:1。
50.权利要求48或权利要求49的方法，其中所述烷烃组分是庚烷并且所述芳族组分是甲苯。
51.权利要求39至50中任一项的方法，其中所述反应混合物包含：
约2重量％至约5重量％的量的N,N-二甲基丙烯酰胺；
约1重量％至约5重量％的量的稳定剂；
约0.01重量％至约4重量％的量的自由基引发剂；以及
约0.05重量％至约0.25重量％的量的链转移剂。
52.权利要求51的方法，其中所述N,N-二甲基丙烯酰胺的重量％大于所述稳定剂的重量％。
53.权利要求39至52中任一项的方法，其中在加热所述反应混合物之前，对所述反应混合物清除氧气。
54.权利要求53的方法，其中所述清除氧气包括用化学惰性气体喷射，任选地其中所述化学惰性气体选自氩气、氦气或氮气。
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