JP5790113B2 - 生体関連物質の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体関連物質の検出方法に関する。
ヒト、マウス及びラットなど多種類生物におけるゲノムDNAやmRNA、タンパク質の解析が進められ、情報が蓄積された結果、医療分野においては、ゲノムDNAの塩基配列の同定や、mRNAの遺伝子発現量を測定することにより、感染症の診断、薬効の予測、癌の予後予測等が可能となっている。また食品分野では、ある食品を摂食させた後の生体におけるmRNAやタンパク質などの発現量を解析することで、当該食品の機能性探索等が行われるようになっている。
上記のような測定及び解析対象となる生体関連物質は、非常に微量であるためそのままでは解析が困難であり、検出するためには多くの場合生体関連物質の増幅が必要となる。増幅方法として一般によく用いられる方法としては、PCR（polymerase chain reaction）が挙げられる。本手法は、プライマーと呼ばれる短鎖のDNAとDNAポリメラーゼとを用いて検出対象となるDNA断片を検出可能な量まで増幅する方法である。
また、多種類の生体関連物質を効率的に検出するために、多種類の生体関連物質を同時に検出することができる、マイクロアレイなどのデバイスが開発されている。これはあらかじめ既知の配列の核酸を基板上に配置及び固定化したものであり、相補的な核酸同士が水素結合によりハイブリダイゼーションする特性を利用し、検出対象となる核酸を結合し、検出するものである。
また、多種類の微量な生体関連物質を効率的に検出できるように、PCRなどの増幅技術とDNAマイクロアレイなどのデバイスとを組み合わせた技術も開発されている。例えば、プライマー対を固定化してマイクロアレイを作製し、当該マイクロアレイ上で多種類の微量な生体関連物質を増幅し、検出する試みが挙げられる（特許文献１、２）。
また、個々に区別可能な粒子を利用することにより、プライマー対をアレイ化することなく当該粒子に固定化し、生体関連物質の増幅及び検出を効率的に実施するような試みも行われている。（特許文献３）。
しかしながら、マイクロアレイに用いられる基板やエマルジョンPCR等に用いられる粒子などにプライマーを固定化し、当該プライマーを用いてPCRを行う場合、当該プライマーと接触する反応液の移動が非常に制限されるため、PCRの反応効率やハイブリダイゼーションの効率は著しく低いものであった。
上記のような測定及び解析対象となる生体関連物質は、非常に微量であるためそのままでは解析が困難であり、検出するためには多くの場合生体関連物質の増幅が必要となる。増幅方法として一般によく用いられる方法としては、PCR（polymerase chain reaction）が挙げられる。本手法は、プライマーと呼ばれる短鎖のDNAとDNAポリメラーゼとを用いて検出対象となるDNA断片を検出可能な量まで増幅する方法である。
また、多種類の生体関連物質を効率的に検出するために、多種類の生体関連物質を同時に検出することができる、マイクロアレイなどのデバイスが開発されている。これはあらかじめ既知の配列の核酸を基板上に配置及び固定化したものであり、相補的な核酸同士が水素結合によりハイブリダイゼーションする特性を利用し、検出対象となる核酸を結合し、検出するものである。
また、多種類の微量な生体関連物質を効率的に検出できるように、PCRなどの増幅技術とDNAマイクロアレイなどのデバイスとを組み合わせた技術も開発されている。例えば、プライマー対を固定化してマイクロアレイを作製し、当該マイクロアレイ上で多種類の微量な生体関連物質を増幅し、検出する試みが挙げられる（特許文献１、２）。
また、個々に区別可能な粒子を利用することにより、プライマー対をアレイ化することなく当該粒子に固定化し、生体関連物質の増幅及び検出を効率的に実施するような試みも行われている。（特許文献３）。
しかしながら、マイクロアレイに用いられる基板やエマルジョンPCR等に用いられる粒子などにプライマーを固定化し、当該プライマーを用いてPCRを行う場合、当該プライマーと接触する反応液の移動が非常に制限されるため、PCRの反応効率やハイブリダイゼーションの効率は著しく低いものであった。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降する粒子を用いて、生体関連物質を検出する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、気泡を含み、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降する粒子を作製することに成功した。そして、当該粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことにより、検出対象となる生体関連物質の検出効率を有意に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生体関連物質の検出用分子が固定された高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化した粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とする生体関連物質の検出方法であって、
前記粒子は、気泡を含み、温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するように選別されたものである前記方法。
（２）粒子が以下の式１及び２をともに満たすものである上記（１）に記載の方法。
式１： ρ(lLow)＜{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}
式２： ρ(lHigh)＞{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}
［式１中、ρ(lLow)、ρ(sLow)、V(sLow)、ρ(gLow)、V(gLow)はそれぞれ、反応液の温度が55℃以下のときの、反応液の密度、粒子の密度、粒子の体積、粒子内部の気泡の密度、粒子内部の気泡の体積を表し、
式２中、ρ(lHigh)、ρ(sHigh)、V(sHigh)、ρ(gHigh)、V(gHigh)はそれぞれ、反応液の温度が94℃以上のときの、反応液の密度、粒子の密度、粒子の体積、粒子内部の気泡の密度、粒子内部の気泡の体積を表す。］
（３）粒子は、反応液が55℃以下のときは下降し、94℃以上のときは浮上するものである上記（１）に記載の方法。
（４）生体関連物質の検出用分子が核酸又はタンパク質である上記（１）に記載の方法。
（５）生体関連物質の検出用粒子の製造方法であって、以下の工程：
(a) 発泡性高分子材料又は発泡剤を添加した高分子材料に生体関連物質の検出用分子を固定し、
(b) 工程(a)で得られた高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化し、
(c) 工程(b)で得られた粒子から、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するものを選別する工程を含む前記方法。
（６）工程(c)が、反応液が55℃以下のときは下降し、94℃以上のときは浮上する粒子を選抜する工程である、上記（５）に記載の方法。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生体関連物質の検出用分子が固定された高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化した粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とする生体関連物質の検出方法であって、
前記粒子は、気泡を含み、温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するように選別されたものである前記方法。
（２）粒子が以下の式１及び２をともに満たすものである上記（１）に記載の方法。
式１： ρ(lLow)＜{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}
式２： ρ(lHigh)＞{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}
［式１中、ρ(lLow)、ρ(sLow)、V(sLow)、ρ(gLow)、V(gLow)はそれぞれ、反応液の温度が55℃以下のときの、反応液の密度、粒子の密度、粒子の体積、粒子内部の気泡の密度、粒子内部の気泡の体積を表し、
式２中、ρ(lHigh)、ρ(sHigh)、V(sHigh)、ρ(gHigh)、V(gHigh)はそれぞれ、反応液の温度が94℃以上のときの、反応液の密度、粒子の密度、粒子の体積、粒子内部の気泡の密度、粒子内部の気泡の体積を表す。］
（３）粒子は、反応液が55℃以下のときは下降し、94℃以上のときは浮上するものである上記（１）に記載の方法。
（４）生体関連物質の検出用分子が核酸又はタンパク質である上記（１）に記載の方法。
（５）生体関連物質の検出用粒子の製造方法であって、以下の工程：
(a) 発泡性高分子材料又は発泡剤を添加した高分子材料に生体関連物質の検出用分子を固定し、
(b) 工程(a)で得られた高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化し、
(c) 工程(b)で得られた粒子から、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するものを選別する工程を含む前記方法。
（６）工程(c)が、反応液が55℃以下のときは下降し、94℃以上のときは浮上する粒子を選抜する工程である、上記（５）に記載の方法。
本発明の方法を用いることにより、検出対象となる生体関連物質の増幅効率又は検出効率を有意に向上させることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
１．概要
本発明は、生体関連物質の検出方法に関する。生体関連物質の検出用粒子を用いてPCRやハイブリダイゼーション反応を行なう方法は、従来より知られているが、従来の方法においては、反応液中における粒子の移動が極めて少ないため、粒子と反応液との接触効率が低く、生体関連物質の検出効率も極めて低いものであった（図１）。
これに対し、本発明者は、PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件の変化に応じて反応液中を浮上又は下降することが可能な粒子を用いることにより、粒子と反応液との接触効率が向上し、これに伴い生体関連物質の検出効率も向上することを見出した。
すなわち、本発明の方法は、PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降することができる粒子を用いて、PCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とするものである。
ここで、浮上とは、水面に向かって移動することをいい、水面に浮いた状態にあることも含む。また、下降とは、水面から遠ざかって移動することをいい、容器の底面に沈降した状態にあることも含む。
PCRは、DNAの熱変性（94℃）、アニーリング（30〜65℃）、伸長反応（65〜75℃）という温度サイクルを繰り返すことにより、DNA断片を増幅させる方法である。またハイブリダイゼーション反応は、核酸分子を熱変性後、冷却することにより、相補鎖同士をアニーリング（ハイブリダイズ）する反応である。
本発明は、このような密閉環境下におけるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度条件又は圧力条件の変化に着目し、この変化に応じて反応液中を浮上又は下降することができる粒子を用いるものである。この粒子は、例えば室温で下降（沈降）していた場合、PCRにおいて、核酸の熱変性条件（94℃）において粒子が反応液中で膨張して浮上し、アニーリング条件（例えば55℃）で下降し、熱変性条件（94℃）において再度浮上するというサイクルを繰り返すことができる（図２）。
また、温度条件の変化に伴い密閉環境下での圧力が変化する場合において、温度の上昇に伴って圧力が高まることにより粒子の密度が反応液の密度よりも大きくなるときは、室温で浮上していた粒子は、核酸の熱変性条件（94℃）において反応液中で圧縮されて下降し、アニーリング条件（例えば55℃）で浮上し、熱変性条件（94℃）において再度下降するというサイクルを繰り返すことができる（図３）。なお、このような圧力条件は、温度条件の変化を介することなく直接的に変化させることもできる。
本発明の方法は、このような機能を有する粒子を用いるため、従来の方法と比較して、検出対象となる生体関連物質の増幅効率又は検出効率を有意に向上させることができる。
本発明は、生体関連物質の検出方法に関する。生体関連物質の検出用粒子を用いてPCRやハイブリダイゼーション反応を行なう方法は、従来より知られているが、従来の方法においては、反応液中における粒子の移動が極めて少ないため、粒子と反応液との接触効率が低く、生体関連物質の検出効率も極めて低いものであった（図１）。
これに対し、本発明者は、PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件の変化に応じて反応液中を浮上又は下降することが可能な粒子を用いることにより、粒子と反応液との接触効率が向上し、これに伴い生体関連物質の検出効率も向上することを見出した。
すなわち、本発明の方法は、PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降することができる粒子を用いて、PCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とするものである。
ここで、浮上とは、水面に向かって移動することをいい、水面に浮いた状態にあることも含む。また、下降とは、水面から遠ざかって移動することをいい、容器の底面に沈降した状態にあることも含む。
PCRは、DNAの熱変性（94℃）、アニーリング（30〜65℃）、伸長反応（65〜75℃）という温度サイクルを繰り返すことにより、DNA断片を増幅させる方法である。またハイブリダイゼーション反応は、核酸分子を熱変性後、冷却することにより、相補鎖同士をアニーリング（ハイブリダイズ）する反応である。
本発明は、このような密閉環境下におけるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度条件又は圧力条件の変化に着目し、この変化に応じて反応液中を浮上又は下降することができる粒子を用いるものである。この粒子は、例えば室温で下降（沈降）していた場合、PCRにおいて、核酸の熱変性条件（94℃）において粒子が反応液中で膨張して浮上し、アニーリング条件（例えば55℃）で下降し、熱変性条件（94℃）において再度浮上するというサイクルを繰り返すことができる（図２）。
また、温度条件の変化に伴い密閉環境下での圧力が変化する場合において、温度の上昇に伴って圧力が高まることにより粒子の密度が反応液の密度よりも大きくなるときは、室温で浮上していた粒子は、核酸の熱変性条件（94℃）において反応液中で圧縮されて下降し、アニーリング条件（例えば55℃）で浮上し、熱変性条件（94℃）において再度下降するというサイクルを繰り返すことができる（図３）。なお、このような圧力条件は、温度条件の変化を介することなく直接的に変化させることもできる。
本発明の方法は、このような機能を有する粒子を用いるため、従来の方法と比較して、検出対象となる生体関連物質の増幅効率又は検出効率を有意に向上させることができる。
２．粒子
本発明の方法に用いられる粒子は、生体関連物質の検出用分子が固定された高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化することにより作製されるものである。
本発明において、「生体関連物質の検出用分子」とは、検出対象となる生体関連物質と特異的に結合する分子であり、このような分子としては、例えば、核酸（DNA又はRNA）、タンパク質、ペプチド、アプタマー、糖鎖、並びに検出対象となる生体関連物質と何らかの反応をおこすような酵素及び基質、高分子、金属などが挙げられる。また、「検出対象となる生体関連物質」としては、核酸（DNA又はRNA）、タンパク質、ペプチドなどが挙げられる。
本発明の方法に用いられる粒子は、生体関連物質の検出用分子が固定された高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化することにより作製されるものである。
本発明において、「生体関連物質の検出用分子」とは、検出対象となる生体関連物質と特異的に結合する分子であり、このような分子としては、例えば、核酸（DNA又はRNA）、タンパク質、ペプチド、アプタマー、糖鎖、並びに検出対象となる生体関連物質と何らかの反応をおこすような酵素及び基質、高分子、金属などが挙げられる。また、「検出対象となる生体関連物質」としては、核酸（DNA又はRNA）、タンパク質、ペプチドなどが挙げられる。
また、本発明において、「固定された」とは、前記の生体関連物質の検出用分子が高分子材料に安定的に結合していることを意味する。結合の様式は、安定的に結合している限り特に限定されるものではないが、共有結合や配位結合などの強固な結合が好ましい。また、生体関連物質の検出用分子の固定においては、検出の反応性を向上させるために、検出用分子がより高密度に固定されていることが好ましい。生体関連物質の検出用分子を高分子材料に固定化する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、生体関連物質の検出用分子をビニル化修飾しておき、ジメチルアクリルアミドモノマーと共重合する方法が挙げられる。この方法は、ジメチルアクリルアミドゲルに対して生体関連物質の検出用分子を高密度に固定化することが可能となるため有用である。
本発明において「高分子材料」とは、原子の数が1000個程度以上、あるいは分子量（Ｍｗ）が10,000程度以上の分子を意味し、有機高分子材料及び無機高分子材料のいずれであってもよい。本発明における高分子材料としては、例えば、ゲル、樹脂、金属、ガラス、シリコンなどが挙げられるが、好ましくはゲル又は樹脂である。高分子材料は単一種類の物質であっても、複数種類の物質の混合物であってもよい。
本発明において、粒子の形状としては、例えば、球状、多面体形状、円柱状、円錐状等が挙げられるが、限定されるものではなく、その表面に凹凸を有していてもよい。粒子の形状が球状である場合は、検出する際に粒子の向きが制限されず、また球状以外の形状の粒子と比較して粒子同士が付着しにくいため好ましい。粒子の大きさは、反応効率向上のために表面積を大きくする観点からより小さいほうが有利であるが、検出及び操作の容易性を考慮した場合、あまりに小さすぎても取り扱いが困難であるため、体積約10-6 mm3〜10 mm3（約１plから10μl）の大きさが好ましい。
また、本発明の方法に用いられる粒子は、気泡を含むものである。粒子が気泡を含むことにより、熱や圧力に応じて粒子の体積が変化しやすく、粒子の密度の変化も迅速なものとなる。粒子内部に気泡を生じさせる方法は限定されるものではないが、高分子材料がゲル又は樹脂の場合は、例えば、ゲル化時に加熱する方法、ゲルの前駆体であるモノマー溶液中に界面活性剤を入れ、窒素雰囲気下にて攪拌し、泡立てた後に重合する方法、疎水性の液体と界面活性剤とをモノマー溶液に混合し、懸濁した後に重合、ゲル化する方法、水溶性の微細な結晶の飽和溶液を用いてゲルを作製し、後から過剰な水を添加することにより結晶を溶解し、更に一旦乾燥させた後に水につけてゲルを膨潤させる方法などが挙げられる。
また、本発明の方法に用いられる粒子は、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するように選別されるものである。反応液の温度に応じて反応液中を浮上又は下降するように選別されるものである場合は、密閉環境下でなくてもよい。
本発明の方法に用いられる粒子は、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度条件及び／又は圧力条件が変化することにより、その密度が変化し、反応液中で浮上又は下降するものである。
まず、温度条件の変化による粒子の浮上又は下降について説明する。本発明においては、PCR又はハイブリダイゼーションの反応液の温度条件の変化を介して粒子自体の温度を変化させることにより、粒子を膨張若しくは収縮させ、粒子の密度を変化させることができる。温度条件の変化により、粒子が収縮し、粒子の密度が反応液に比較して大きくなった場合、粒子は反応液中で下降（沈降）する。他方、粒子が膨張し、粒子の密度が反応液よりも小さくなった場合、粒子は反応液中で浮上する。
本発明において、反応液中において粒子を下降させる温度としては、例えば、60℃以下、59℃以下、58℃以下、57℃以下、56℃以下、55℃以下、54℃以下、53℃以下、52℃以下、51℃以下、50℃以下の温度が挙げられるが、好ましくは55℃以下である。なお、通常PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度は、0℃以上であり、より好ましくは4℃以上である。
反応液中において粒子を浮上させる温度としては、例えば、90℃以上、91℃以上、92℃以上、93℃以上、94℃以上、95℃以上、96℃以上が挙げられるが、好ましくは94℃以上である。
本発明におけるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度条件は、例えば、市販のサーマルサイクラー等を用いて簡便に設定することができる。
反応液の種類は限定されず、実際にＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応で使用する反応溶液であっても良いし、水であっても良いし、緩衝液（バッファー）であっても良い。すなわち、水や緩衝液を用いて粒子を選別し、当該選別された粒子をＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応に用いることもできるし、ＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応で実際に使用する反応溶液で粒子を選別し、当該選別された粒子をＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応に用いることもできる。
本発明の方法に用いられる粒子は、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度条件及び／又は圧力条件が変化することにより、その密度が変化し、反応液中で浮上又は下降するものである。
まず、温度条件の変化による粒子の浮上又は下降について説明する。本発明においては、PCR又はハイブリダイゼーションの反応液の温度条件の変化を介して粒子自体の温度を変化させることにより、粒子を膨張若しくは収縮させ、粒子の密度を変化させることができる。温度条件の変化により、粒子が収縮し、粒子の密度が反応液に比較して大きくなった場合、粒子は反応液中で下降（沈降）する。他方、粒子が膨張し、粒子の密度が反応液よりも小さくなった場合、粒子は反応液中で浮上する。
本発明において、反応液中において粒子を下降させる温度としては、例えば、60℃以下、59℃以下、58℃以下、57℃以下、56℃以下、55℃以下、54℃以下、53℃以下、52℃以下、51℃以下、50℃以下の温度が挙げられるが、好ましくは55℃以下である。なお、通常PCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度は、0℃以上であり、より好ましくは4℃以上である。
反応液中において粒子を浮上させる温度としては、例えば、90℃以上、91℃以上、92℃以上、93℃以上、94℃以上、95℃以上、96℃以上が挙げられるが、好ましくは94℃以上である。
本発明におけるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度条件は、例えば、市販のサーマルサイクラー等を用いて簡便に設定することができる。
反応液の種類は限定されず、実際にＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応で使用する反応溶液であっても良いし、水であっても良いし、緩衝液（バッファー）であっても良い。すなわち、水や緩衝液を用いて粒子を選別し、当該選別された粒子をＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応に用いることもできるし、ＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応で実際に使用する反応溶液で粒子を選別し、当該選別された粒子をＰＣＲ反応やハイブリダイゼーション反応に用いることもできる。
次に、圧力条件の変化による粒子の浮上又は下降について説明する。本発明においては、密閉環境下で行われるPCR又はハイブリダイゼーションの反応時の圧力条件を変化させることにより、粒子の密度を迅速に変化させることができる。圧力条件の変化により、粒子の密度が反応液に比較して大きくなった場合、粒子は反応液中で下降し、粒子の密度が反応液よりも小さくなった場合、粒子は反応液中で浮上する。
圧力条件は、密閉環境下において温度条件を変化させることによって間接的に変化させることもできる。また、温度条件及び／又は圧力条件の変化に伴う粒子の密度の変化は、可能な限り大きく、可逆的であることが好ましい。粒子の密度の変化が大きければ、反応液中における浮上速度又は下降速度は大きいものとなり、また、粒子の密度の変化が可逆的であれば、反応液中における浮上及び下降を繰り返すことが可能となる。
また、別の態様において、温度条件及び圧力条件以外の他の条件、例えば反応液のｐＨ、粘性、光の当たり具合などの条件を変化させることも可能である。粒子の選別方法については、後述する。
圧力条件は、密閉環境下において温度条件を変化させることによって間接的に変化させることもできる。また、温度条件及び／又は圧力条件の変化に伴う粒子の密度の変化は、可能な限り大きく、可逆的であることが好ましい。粒子の密度の変化が大きければ、反応液中における浮上速度又は下降速度は大きいものとなり、また、粒子の密度の変化が可逆的であれば、反応液中における浮上及び下降を繰り返すことが可能となる。
また、別の態様において、温度条件及び圧力条件以外の他の条件、例えば反応液のｐＨ、粘性、光の当たり具合などの条件を変化させることも可能である。粒子の選別方法については、後述する。
上記のような粒子としては、例えば、以下の式１及び２をともに満たすものが挙げられる。
式１： ρ(lLow)＜{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}
式２： ρ(lHigh)＞{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}
上記式１及び２において、ρは密度、Vは体積を表し、lは反応液（liquid）、sは粒子（solid）、gは粒子内部の気泡（gas）を表す。Lowは反応液が低温（例えば55℃以下）であることを表し、Highは反応液が高温（例えば94℃以上）であることを表す。
すなわち、上記式１において、
ρ(lLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの反応液の密度を表し、
ρ(sLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子の密度（粒子内部の気泡の密度を除く）を表し、
V(sLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子の体積（粒子内部の気泡の体積を除く）を表し、
ρ(gLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子内部の気泡の密度を表し、
V(gLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子内部の気泡の体積を表す。
また、上記式２において、
ρ(lHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの反応液の密度を表し、
ρ(sHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子の密度（粒子内部の気泡の密度を除く）を表し、
V(sHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子の体積（粒子内部の気泡の体積を除く）を表し、
ρ(gHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子内部の気泡の密度を表し、
V(gHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子内部の気泡の体積を表す。
式１： ρ(lLow)＜{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}
式２： ρ(lHigh)＞{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}
上記式１及び２において、ρは密度、Vは体積を表し、lは反応液（liquid）、sは粒子（solid）、gは粒子内部の気泡（gas）を表す。Lowは反応液が低温（例えば55℃以下）であることを表し、Highは反応液が高温（例えば94℃以上）であることを表す。
すなわち、上記式１において、
ρ(lLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの反応液の密度を表し、
ρ(sLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子の密度（粒子内部の気泡の密度を除く）を表し、
V(sLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子の体積（粒子内部の気泡の体積を除く）を表し、
ρ(gLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子内部の気泡の密度を表し、
V(gLow)は反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの粒子内部の気泡の体積を表す。
また、上記式２において、
ρ(lHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの反応液の密度を表し、
ρ(sHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子の密度（粒子内部の気泡の密度を除く）を表し、
V(sHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子の体積（粒子内部の気泡の体積を除く）を表し、
ρ(gHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子内部の気泡の密度を表し、
V(gHigh)は反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの粒子内部の気泡の体積を表す。
また、一般に物質の質量は、（密度）×（体積）という式により表される。
上記式１の場合、ρ(sLow)・V(sLow)は、粒子の質量（粒子内部の気泡の質量を除く）を表し、ρ(gLow)・V(gLow)は粒子内部の気泡の質量を表す。従って、{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}は、粒子の質量と粒子内部の気泡の質量との和、すなわち内部に気泡を含む粒子全体の質量を表す。また、上記式１において、{V(sLow)+ V(gLow)}は、粒子の体積と粒子内部の気泡の体積との和、すなわち内部に気泡を含む粒子全体の体積を表す。
上記式１の場合、ρ(sLow)・V(sLow)は、粒子の質量（粒子内部の気泡の質量を除く）を表し、ρ(gLow)・V(gLow)は粒子内部の気泡の質量を表す。従って、{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}は、粒子の質量と粒子内部の気泡の質量との和、すなわち内部に気泡を含む粒子全体の質量を表す。また、上記式１において、{V(sLow)+ V(gLow)}は、粒子の体積と粒子内部の気泡の体積との和、すなわち内部に気泡を含む粒子全体の体積を表す。
他方、物質の密度は、（質量）÷（体積）という式により求められる。
上記式１の場合、{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}÷{V(sLow)+ V(gLow)}という式により、内部に気泡を含む粒子全体の密度が求められる。従って、上記式１において、{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}は、反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの、内部に気泡を含む粒子全体の密度を表す。同様に、上記式２の場合、{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}は、反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの、内部に気泡を含む粒子全体の密度を表す。
すなわち、上記式１及び２を単純化すると以下の式で表される。
式１：（反応液の低温時の密度）＜（内部に気泡を含む粒子全体の低温時の密度）
式２：（反応液の高温時の密度）＞（内部に気泡を含む粒子全体の高温時の密度）
上記式１は、反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときは反応液の密度よりも粒子全体の密度の方が大きいことを示し、式２は、反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときは反応液の密度よりも粒子全体の密度の方が小さいことを示す。
従って、上記式１及び２をともに満たす粒子は、反応液が低温（例えば55℃以下）のときに反応液中で下降し、高温（例えば94℃以上）のときに浮上するものである。
上記式１の場合、{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}÷{V(sLow)+ V(gLow)}という式により、内部に気泡を含む粒子全体の密度が求められる。従って、上記式１において、{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}は、反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときの、内部に気泡を含む粒子全体の密度を表す。同様に、上記式２の場合、{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}は、反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときの、内部に気泡を含む粒子全体の密度を表す。
すなわち、上記式１及び２を単純化すると以下の式で表される。
式１：（反応液の低温時の密度）＜（内部に気泡を含む粒子全体の低温時の密度）
式２：（反応液の高温時の密度）＞（内部に気泡を含む粒子全体の高温時の密度）
上記式１は、反応液の温度が低温（例えば55℃以下）のときは反応液の密度よりも粒子全体の密度の方が大きいことを示し、式２は、反応液の温度が高温（例えば94℃以上）のときは反応液の密度よりも粒子全体の密度の方が小さいことを示す。
従って、上記式１及び２をともに満たす粒子は、反応液が低温（例えば55℃以下）のときに反応液中で下降し、高温（例えば94℃以上）のときに浮上するものである。
３．生体関連物質の検出用粒子の製造方法
本発明の生体関連物質の検出用粒子は、以下の工程を含む方法により製造することができる。(a) 発泡性高分子材料又は発泡剤を添加した高分子材料に生体関連物質の検出用分子を固定し、(b) 工程(a)で得られた高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化し、(c) 工程(b)で得られた粒子から、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するものを選別する工程。
本発明の生体関連物質の検出用粒子は、以下の工程を含む方法により製造することができる。(a) 発泡性高分子材料又は発泡剤を添加した高分子材料に生体関連物質の検出用分子を固定し、(b) 工程(a)で得られた高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化し、(c) 工程(b)で得られた粒子から、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降するものを選別する工程。
本発明において、「発泡性高分子材料」は、発泡する性質を有する高分子材料であり、例えば、発泡剤を含む重合性前駆体が挙げられる。重合性前駆体としては、例えば、ジメチルアクリルアミドやメチレンビスアクリルアミド等のモノマーと、2-ヒドロキシ-2-メチルプロピオフェノンなどの光重合開始剤等との混合物が挙げられる。本発明において、「発泡剤」は、高分子材料に直接的又は間接的に気泡を生じさせるための薬剤であり、例えば、界面活性剤、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸アンモニウム、ジアゾアミノベンゼン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、アゾジカルボンジアミド、ジニトロソペンタメチレンテトラミン、フレオンなどが挙げられるが、好ましくは界面活性剤である。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）が挙げられる。
発泡性高分子材料及び発泡剤を添加した高分子材料を発泡させて内部に気泡を生じさせる方法、並びに高分子材料に生体関連物質の検出用分子を固定する方法については、上記の通りである。
本発明において、高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、作製した高分子材料をスライドグラス上に展開し、剃刀を用いて細分化する方法が挙げられる。
発泡性高分子材料及び発泡剤を添加した高分子材料を発泡させて内部に気泡を生じさせる方法、並びに高分子材料に生体関連物質の検出用分子を固定する方法については、上記の通りである。
本発明において、高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、作製した高分子材料をスライドグラス上に展開し、剃刀を用いて細分化する方法が挙げられる。
また、本発明において、密閉環境下で行なわれるPCR又はハイブリダイゼーション反応時の温度及び／又は圧力条件に応じて反応液中を浮上又は下降する粒子の選別、例えば、PCRの温度条件に応じて反応液中を浮上又は下降する粒子の選別は、以下のようにして行うことができる。
まず、上記の細分化して得られた粒子を、PCRの反応液に添加し、室温の状態で浮上しているものと下降（沈降）しているものとを分画する。室温で浮上している粒子を含む溶液を分画１とし、下降している粒子を含む溶液を分画２とする。
次に、分画１をヒートブロックで94℃に加熱し、浮上する粒子と下降する粒子とを分画する。分画１のうち、94℃で浮上している粒子を含む溶液を分画１−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画１−２とする。分画２についても、同様の操作を行い、分画２のうち、94℃で浮上している粒子を含む溶液を分画２−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画２−２とする。
さらに、分画１−２をヒートブロックで55℃に加熱し、浮上する粒子と下降する粒子とを分画する。分画１−２のうち、55℃で浮上している粒子を含む溶液を分画１−２−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画１−２−２とする。分画２−１についても、同様の操作を行い、分画２−１のうち、55℃で浮上している粒子を含む溶液を分画２−１−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画２−１−２とする。
このようにして、室温で浮上し、94℃で下降し、かつ55℃で浮上する粒子（分画１−２−１）、あるいは、室温で下降し、94℃で浮上し、かつ55℃で下降する粒子（分画２−１−２）を選別（選抜）することができる。
まず、上記の細分化して得られた粒子を、PCRの反応液に添加し、室温の状態で浮上しているものと下降（沈降）しているものとを分画する。室温で浮上している粒子を含む溶液を分画１とし、下降している粒子を含む溶液を分画２とする。
次に、分画１をヒートブロックで94℃に加熱し、浮上する粒子と下降する粒子とを分画する。分画１のうち、94℃で浮上している粒子を含む溶液を分画１−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画１−２とする。分画２についても、同様の操作を行い、分画２のうち、94℃で浮上している粒子を含む溶液を分画２−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画２−２とする。
さらに、分画１−２をヒートブロックで55℃に加熱し、浮上する粒子と下降する粒子とを分画する。分画１−２のうち、55℃で浮上している粒子を含む溶液を分画１−２−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画１−２−２とする。分画２−１についても、同様の操作を行い、分画２−１のうち、55℃で浮上している粒子を含む溶液を分画２−１−１とし、下降している粒子を含む溶液を分画２−１−２とする。
このようにして、室温で浮上し、94℃で下降し、かつ55℃で浮上する粒子（分画１−２−１）、あるいは、室温で下降し、94℃で浮上し、かつ55℃で下降する粒子（分画２−１−２）を選別（選抜）することができる。
４．生体関連物質の検出方法
本発明は、上記の粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とする生体関連物質の検出方法である。従来技術を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行った場合、固相と液相の境界面で行われる反応はその反応効率が著しく低下する。これに対し、上記の粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行うことにより、反応液中に存在する検出対象の生体関連物質と粒子表面に存在する生体関連物質の検出用分子との接触効率が向上し、粒子を用いた生体関連物質の検出反応を効率的に行うことが可能である。
本発明の方法において、PCR及びハイブリダイゼーションの種類は限定されるものではなく、通常のPCRのほか、リアルタイムRT-PCR、マイクロアレイ上におけるPCR等を行うことができる。PCR及びハイブリダイゼーション反応においては、検出用プローブを使用することができ、その作製方法は当業者に公知である。また、反応液中の粒子の含有量は、反応液内での粒子の移動の自由度を阻害しない量であることが好ましい。なお、本発明の方法に用いられる粒子は、PCR及びハイブリダイゼーション反応以外に、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ反応、抗原抗体反応、ライゲーション反応、制限酵素処理、リン酸化反応、メチル化反応等に対して用いることも可能である。
本発明は、上記の粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とする生体関連物質の検出方法である。従来技術を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行った場合、固相と液相の境界面で行われる反応はその反応効率が著しく低下する。これに対し、上記の粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行うことにより、反応液中に存在する検出対象の生体関連物質と粒子表面に存在する生体関連物質の検出用分子との接触効率が向上し、粒子を用いた生体関連物質の検出反応を効率的に行うことが可能である。
本発明の方法において、PCR及びハイブリダイゼーションの種類は限定されるものではなく、通常のPCRのほか、リアルタイムRT-PCR、マイクロアレイ上におけるPCR等を行うことができる。PCR及びハイブリダイゼーション反応においては、検出用プローブを使用することができ、その作製方法は当業者に公知である。また、反応液中の粒子の含有量は、反応液内での粒子の移動の自由度を阻害しない量であることが好ましい。なお、本発明の方法に用いられる粒子は、PCR及びハイブリダイゼーション反応以外に、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ反応、抗原抗体反応、ライゲーション反応、制限酵素処理、リン酸化反応、メチル化反応等に対して用いることも可能である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
オリゴＤＮＡの合成
配列番号１から４で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡ（表１）を合成した。
プライマー１（配列番号２）及びプライマー２（配列番号３）については、合成の最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を前記オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基を導入し、５’−Ｏ−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、５’−Ｏ−オリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これらをプライマーとして用いた。
配列番号１から４で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡ（表１）を合成した。
プライマー１（配列番号２）及びプライマー２（配列番号３）については、合成の最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を前記オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基を導入し、５’−Ｏ−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、５’−Ｏ−オリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これらをプライマーとして用いた。
生体関連物質の検出反応に必要な物質が結合した粒子の作製
まず、表２に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をプローブ毎にそれぞれ調製し、２ｍＬ容量のふたつきの透明なエッペンチューブに入れた。生体関連物質検出反応に必要な物質としては、プライマー１及びプライマー２で示されるオリゴＤＮＡを用いた。
まず、表２に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をプローブ毎にそれぞれ調製し、２ｍＬ容量のふたつきの透明なエッペンチューブに入れた。生体関連物質検出反応に必要な物質としては、プライマー１及びプライマー２で示されるオリゴＤＮＡを用いた。
上記のエッペンチューブの蓋を閉じた後に、注射針の先で蓋の中央部分に微細孔を一箇所貫通した。
次に、ゲル前駆体重合性溶液を入れた上記のエッペンチューブをベルジャー中に入れ、真空ポンプで脱気した後に、窒素を入れることで、窒素置換した。
エッペンチューブをベルジャーから取り出し、即座に蓋に開いた穴にパラフィルムで封止をし、エッペンチューブを指ではじくことで、ゲル前駆体重合性溶液をよく泡立てた。
泡立てたゲル前駆体重合性溶液に対して、コスモバイオ製ＵＶトランスイルミネーターを用いて２４５ｎｍ波長の紫外線を出力１００％で１０分間照射し、ゲル前駆体重合性溶液を重合、ゲル化した。
作製したゲルをスライドグラス上に展開し、剃刀を用いて一辺が０．５ｍｍ以下になるように細切れにし、細かい気泡が含まれた多数の粒子（ゲル粒子）を作製した。
次に、ゲル前駆体重合性溶液を入れた上記のエッペンチューブをベルジャー中に入れ、真空ポンプで脱気した後に、窒素を入れることで、窒素置換した。
エッペンチューブをベルジャーから取り出し、即座に蓋に開いた穴にパラフィルムで封止をし、エッペンチューブを指ではじくことで、ゲル前駆体重合性溶液をよく泡立てた。
泡立てたゲル前駆体重合性溶液に対して、コスモバイオ製ＵＶトランスイルミネーターを用いて２４５ｎｍ波長の紫外線を出力１００％で１０分間照射し、ゲル前駆体重合性溶液を重合、ゲル化した。
作製したゲルをスライドグラス上に展開し、剃刀を用いて一辺が０．５ｍｍ以下になるように細切れにし、細かい気泡が含まれた多数の粒子（ゲル粒子）を作製した。
粒子（ゲル粒子）の選別
上記のようにして作製したゲル粒子を、エッペンチューブに入った２ｍｌの蒸留水中に入れ、室温の状態で浮上しているゲル粒子と沈降しているゲル粒子を取り分けた。
ここで浮上している粒子については、ピペットにて蒸留水ごと吸い上げ、別のエッペンチューブに入った蒸留水中に分け、分画Ａとした。
また、沈降している粒子については、蒸留水に入れたままエッペンチューブの蓋を閉めヒートブロックで９４℃に加熱し、浮上したものと、沈降しているものに取り分けた。
ここで、沈降しているゲル粒子については、分画Ｂとした。
さらに、ここで浮いてきたゲル粒子について、ピペットにて吸い上げ、別のエッペンチューブに入った蒸留水に取り分けた。このエッペンチューブについて、蒸留水に入れたままヒートブロックで５５℃に加熱し、浮上するものについてはピペットにて吸い上げ、別のエッペンチューブに取り分け、分画Ｃとした。
沈降したゲル粒子については、分画Ｄとした。
ここで、分画Ｄについては、５５℃の時点では、粒子が液相中で沈降し、９４℃の時点で浮上する粒子の集まりである。即ちこれらの粒子は５５℃の時点では粒子内部の気泡体積の縮小により、粒子全体の密度が液相の密度に比べて大きくなることを示しており、本明細書中の式１の条件を満たしている。また、９４℃の時点では粒子内部の気泡体積の拡大により、粒子全体の密度が液相の密度に比べて小さくなったため、式２の条件を満たしている。
なお、分画Ａについては、５５℃よりも低い室温時に浮上しているため、式１の条件を満たさない。また、分画Ｂについては、９４℃の高温時に沈降しているため、式２の条件を満たさない。さらに、分画Ｃは、５５℃の低温時に浮上しているため、式１の条件を満たさない。
上記のようにして作製したゲル粒子を、エッペンチューブに入った２ｍｌの蒸留水中に入れ、室温の状態で浮上しているゲル粒子と沈降しているゲル粒子を取り分けた。
ここで浮上している粒子については、ピペットにて蒸留水ごと吸い上げ、別のエッペンチューブに入った蒸留水中に分け、分画Ａとした。
また、沈降している粒子については、蒸留水に入れたままエッペンチューブの蓋を閉めヒートブロックで９４℃に加熱し、浮上したものと、沈降しているものに取り分けた。
ここで、沈降しているゲル粒子については、分画Ｂとした。
さらに、ここで浮いてきたゲル粒子について、ピペットにて吸い上げ、別のエッペンチューブに入った蒸留水に取り分けた。このエッペンチューブについて、蒸留水に入れたままヒートブロックで５５℃に加熱し、浮上するものについてはピペットにて吸い上げ、別のエッペンチューブに取り分け、分画Ｃとした。
沈降したゲル粒子については、分画Ｄとした。
ここで、分画Ｄについては、５５℃の時点では、粒子が液相中で沈降し、９４℃の時点で浮上する粒子の集まりである。即ちこれらの粒子は５５℃の時点では粒子内部の気泡体積の縮小により、粒子全体の密度が液相の密度に比べて大きくなることを示しており、本明細書中の式１の条件を満たしている。また、９４℃の時点では粒子内部の気泡体積の拡大により、粒子全体の密度が液相の密度に比べて小さくなったため、式２の条件を満たしている。
なお、分画Ａについては、５５℃よりも低い室温時に浮上しているため、式１の条件を満たさない。また、分画Ｂについては、９４℃の高温時に沈降しているため、式２の条件を満たさない。さらに、分画Ｃは、５５℃の低温時に浮上しているため、式１の条件を満たさない。
ＰＣＲ
分画Ｄのゲル粒子を、以下の表３の組成のＰＣＲ液に添加した。ここでＰＣＲ液にはプライマーは添加されておらず、分画Ｄのゲル粒子にのみプライマーが固定化されている。
分画Ｄのゲル粒子を添加したＰＣＲ液を、サーマルサイクラーにセットし、９４℃で５分間加熱した後、９４℃を４５秒、５５℃を１５０秒、７２℃を１８０秒の温度変化を３０回繰り返し、さらに７２℃で１８０秒維持した後に、４℃で反応を終了した。反応終了後のゲルは、２００μｌの蒸留水による置換を室温で５回繰り返すことで洗浄した。最後に蒸留水を除去し、ゲル粒子のみとした。
分画Ｄのゲル粒子を、以下の表３の組成のＰＣＲ液に添加した。ここでＰＣＲ液にはプライマーは添加されておらず、分画Ｄのゲル粒子にのみプライマーが固定化されている。
ハイブリダイゼーション
ＰＣＲによる増幅対象核酸の増幅を確認するために、増幅対象核酸の塩基配列（配列番号１）のうち、プライマー１及び２の塩基配列を除いた部分と同一の配列からなるオリゴＤＮＡを蛍光標識し（検出用プローブ：配列番号４）、ＰＣＲ後のゲル粒子にハイブリダイゼーションを行った。蛍光標識は、ＵＬＹＳＩＳ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、キットに付属のプロトコールに従って実施した。標識後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社）を使用し、未反応の蛍光物質を取り除いた。
上記ゲル粒子が入ったエッペンチューブ中に、表４に示す組成のハイブリダイゼーションバッファー（検出用プローブを含む）１５０μｌを添加し、６５℃にて２時間のハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、エッペンチューブからバッファーを除去し、６５℃の洗浄液（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液）２００μｌにて２０分間の洗浄を２回行った。続いて、６５℃の保存液（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ ＮａＣｌ水溶液）２００μｌにて１０分間の洗浄を１回行った後、室温の保存液で液置換を５回行った。
ＰＣＲによる増幅対象核酸の増幅を確認するために、増幅対象核酸の塩基配列（配列番号１）のうち、プライマー１及び２の塩基配列を除いた部分と同一の配列からなるオリゴＤＮＡを蛍光標識し（検出用プローブ：配列番号４）、ＰＣＲ後のゲル粒子にハイブリダイゼーションを行った。蛍光標識は、ＵＬＹＳＩＳ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、キットに付属のプロトコールに従って実施した。標識後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社）を使用し、未反応の蛍光物質を取り除いた。
上記ゲル粒子が入ったエッペンチューブ中に、表４に示す組成のハイブリダイゼーションバッファー（検出用プローブを含む）１５０μｌを添加し、６５℃にて２時間のハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、エッペンチューブからバッファーを除去し、６５℃の洗浄液（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液）２００μｌにて２０分間の洗浄を２回行った。続いて、６５℃の保存液（０．１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１２Ｍ ＮａＣｌ水溶液）２００μｌにて１０分間の洗浄を１回行った後、室温の保存液で液置換を５回行った。
蛍光シグナルの検出・定量
ゲル粒子をスライドグラス上に展開し、保存液で包埋後、カバーガラスをかぶせた。
ＣＣＤカメラ、水銀ランプ光源、Ｃｙ３検出用蛍光フィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を用い、Ａｌｅｘａ５４６の蛍光を１秒の露光時間にてゲル粒子を検出した。
得られた検出画像は、画像処理ソフトＩｍａｇｅＰｒｏ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて粒子中央部分をラインプロファイルにより定量化し、当該ゲル部分のシグナル強度を数値化した。
ゲル粒子をスライドグラス上に展開し、保存液で包埋後、カバーガラスをかぶせた。
ＣＣＤカメラ、水銀ランプ光源、Ｃｙ３検出用蛍光フィルターセットを装備した蛍光顕微鏡を用い、Ａｌｅｘａ５４６の蛍光を１秒の露光時間にてゲル粒子を検出した。
得られた検出画像は、画像処理ソフトＩｍａｇｅＰｒｏ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて粒子中央部分をラインプロファイルにより定量化し、当該ゲル部分のシグナル強度を数値化した。
比較例
実施例中における分画Ａ、分画Ｂ、分画Ｃについて、上記実施例の粒子作製以後の操作と同様の操作を行い、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、蛍光シグナルの検出及び定量を行った。
実施例中における分画Ａ、分画Ｂ、分画Ｃについて、上記実施例の粒子作製以後の操作と同様の操作を行い、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、蛍光シグナルの検出及び定量を行った。
結果
図４に示すように、実施例（分画Ｄ）で得られた蛍光シグナル強度は、比較例（分画Ａ、分画Ｂ、分画Ｃ）のいずれの蛍光シグナル強度に比較しても強いものであった。
以上より、本発明の方法を用いることにより、検出対象となる生体関連物質の増幅効率や検出反応効率を有意に向上させることが可能であることが示された。
図４に示すように、実施例（分画Ｄ）で得られた蛍光シグナル強度は、比較例（分画Ａ、分画Ｂ、分画Ｃ）のいずれの蛍光シグナル強度に比較しても強いものであった。
以上より、本発明の方法を用いることにより、検出対象となる生体関連物質の増幅効率や検出反応効率を有意に向上させることが可能であることが示された。
本発明の方法を用いることにより、検出対象となる生体関連物質の増幅効率又は検出効率を有意に向上させることができる。
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
Claims (3)
- 生体関連物質の検出用核酸が固定された高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化した粒子を用いてPCR又はハイブリダイゼーション反応を行なうことを特徴とする生体関連物質の検出方法であって、
前記高分子材料は、ジメチルアクリルアミドの重合体、メチレンビスアクリルアミドの重合体、又はジメチルアクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドとの共重合体を含むものであり、
前記粒子は、気泡を含み、反応液が55℃以下のときは下降し、94℃以上のときは浮上するものである前記方法。 - 粒子が以下の式１及び２をともに満たすものである請求項１に記載の方法。
式１： ρ(lLow)＜{ρ(sLow)・V(sLow)+ ρ(gLow)・V(gLow)}/{V(sLow)+ V(gLow)}
式２： ρ(lHigh)＞{ρ(sHigh)・V(sHigh)+ ρ(gHigh)・V(gHigh)}/{V(sHigh)+ V(gHigh)}
［式１中、ρ(lLow)、ρ(sLow)、V(sLow)、ρ(gLow)、V(gLow)はそれぞれ、反応液の温度が55℃以下のときの、反応液の密度、粒子の密度、粒子の体積、粒子内部の気泡の密度、粒子内部の気泡の体積を表し、
式２中、ρ(lHigh)、ρ(sHigh)、V(sHigh)、ρ(gHigh)、V(gHigh)はそれぞれ、反応液の温度が94℃以上のときの、反応液の密度、粒子の密度、粒子の体積、粒子内部の気泡の密度、粒子内部の気泡の体積を表す。］ - 生体関連物質の検出用粒子の製造方法であって、以下の工程：
(a) ジメチルアクリルアミドの重合体、メチレンビスアクリルアミドの重合体、又はジメチルアクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドとの共重合体を含む高分子材料に生体関連物質の検出用核酸を固定し、
(b) 工程(a)で得られた高分子材料を任意の形状及び大きさに細分化して粒子化し、
(c) 工程(b)で得られた粒子から、反応液が55℃以下のときは下降し、94℃以上のときは浮上する粒子を選抜する工程、
を含む前記方法。
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