WO2006083040A1 - 核酸マイクロアレイを用いた核酸検出方法 - Google Patents

核酸マイクロアレイを用いた核酸検出方法 Download PDF

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WO2006083040A1
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Hiroyuki Ooshima
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid detection method using a high hybridization technology using a nucleic acid microarray.
  • Nucleic acid microarrays are obtained by immobilizing many nucleic acid probes on a carrier independently of each other.
  • a carrier As the nucleic acid probe, cDNA or synthetic oligonucleic acid is often used.
  • microarrays in which nucleic acid probes are immobilized on a surface-treated glass or silicon carrier have been used. Recently, however, the carrier has been modified by other methods such as a gel carrier. It has been broken.
  • the nucleic acid detection method using the hybridization technology is a sequence-specific hybridization method in which a nucleic acid sample to be tested is hybridized in a sequence-specific manner to a nucleic acid probe immobilized on a nucleic acid microarray.
  • This is a method in which a hybrid is detected with a fluorescent substance or the like, and a molecule containing a nucleobase sequence in a sample corresponding to a plurality of nucleic acid probes is quantitatively or qualitatively examined.
  • This method is used to analyze the expression level of a plurality of nucleobase sequences or the sequence of a specific nucleobase sequence itself.
  • nucleic acid probes are often designed to be complementary or identical to a desired nucleobase sequence to be detected in sequence analysis, functional analysis, and the like.
  • a relatively long chain nucleic acid such as cDNA or a short synthetic oligonucleic acid is used.
  • each nucleic acid probe must have the same Tm (nucleic acid double-strand dissociation temperature) so that it matches the hybridization and washing conditions with the nucleic acid sample.
  • Tm nucleic acid double-strand dissociation temperature
  • the nucleobase sequence of an organism may contain multiple similar sequences. Nucleic acid probes for detecting such regions with low sequence specificity or regions with a biased GC content may be provided. It was difficult to calculate, and even if nucleic acid probes were designed, it was difficult to obtain accurate data using a nucleic acid microarray on which the nucleic acid probes were mounted.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid detection method that is not limited by the design of the base sequence of a nucleic acid probe.
  • the present invention is a nucleic acid detection method including the following steps.
  • the change in the cleaning conditions can include a change in the salt concentration of the cleaning liquid, a change in the temperature of the cleaning liquid, or a combination of these changes.
  • FIG. 1 is a diagram of an array fixture for producing a fiber array.
  • Figure 2 shows the design of the nucleic acid microarray.
  • Figure 3 shows the signal intensity of nucleic acid detection after washing the nucleic acid micro-array in 1 XSSC for 20 minutes at 75 ° C.
  • FIG. 4 shows the signal intensity of nucleic acid detection after further washing the nucleic acid microarray in 0.7 XSSC at 75 ° C. for 20 minutes.
  • a nucleic acid microarray in which a plurality of nucleic acid probes are independently immobilized is brought into contact with a solution containing a nucleic acid sample, and the probe includes a base sequence complementary to the probe in the nucleic acid sample.
  • the first step of hybridization reaction with nucleic acid and the nucleic acid hybrid formed on the nucleic acid microarray are washed several times while changing the washing conditions from weak to strong washing conditions.
  • a nucleic acid detection method comprising a second step of detecting a nucleic acid hybrid.
  • a solution containing a nucleic acid sample is brought into contact with a nucleic acid microarray in which a plurality of nucleic acid probes are independently immobilized, and the probe and a nucleic acid in the nucleic acid sample (for example, the probe) And a nucleic acid containing a complementary base sequence).
  • Nucleic acid probe refers to a nucleic acid containing a base sequence complementary to the gene sequence to be detected.
  • the nucleic acid probe can be designed using, for example, commercially available probe design software.
  • the designed nucleic acid probe may be of any type and manufacturing method, but it is preferable to use a synthetic oligonucleic acid in view of the sequence specificity, detection accuracy, and stability of the hybridization.
  • Each prepared nucleic acid probe is independently arranged on a suitable carrier. “Independently” means a state in which each probe is physically separated. For example, when the carrier is a flat substrate, it means that the probes are arranged on the flat substrate with a certain interval. Further, when the carrier is a strip-like converging object, it means a state in which one type of probe is arranged on one strip.
  • the carrier examples include flat substrates such as glass, silicon, and resin.
  • the nucleic acid probe can be fixed by, for example, a photolithography method or a spotting method.
  • a through-hole substrate can also be used as the carrier.
  • the nucleic acid probe can be fixed to the inner wall of the through hole. It is also possible to hold the gel in the through hole and hold the nucleic acid probe in the gel.
  • a hollow fiber is used as a material for forming a through hole, and a gel is formed in the hollow portion.
  • the nucleic acid microarray in which the nucleic acid probe is held in the gel will be described in detail.
  • This nucleic acid microarray can be prepared, for example, through the following steps a) to d).
  • a step of producing an array by arranging a plurality of hollow fibers in three dimensions so that the longitudinal directions of the hollow fibers are the same.
  • hollow fiber materials include nylon hollow fibers such as nylon 6, nylon 66, and aromatic polyamide, polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polylactic acid, polydalicolic acid, and polystrength polyester.
  • Hollow fibers acrylic hollow fibers such as polyacrylonitrile, polyolefin hollow fibers such as polyethylene and polypropylene, polymethacrylate hollow fibers such as methyl methacrylate, polyvinyl alcohol hollow fibers, polyvinylidene chloride hollow Fiber, polyvinyl chloride hollow fiber, polyurethane hollow fiber, phenol hollow fiber, fluorine hollow fiber made of polyvinylidene fluoride polytetrafluoroethylene, polyalkylene paraoxybenzoate hollow fiber, etc. Mentioned It is.
  • the hollow fibers are arranged three-dimensionally so that their longitudinal directions are the same.
  • an arrangement method for example, a method in which a plurality of hollow fibers are arranged in parallel at a predetermined interval on a sheet-like material such as an adhesive sheet to form a sheet, and then the sheet is wound spirally (special Kaihei 1 1-1 0 8 9 2 8).
  • two perforated plates each having a plurality of holes provided at a predetermined interval are overlapped so that the holes coincide with each other, and the hollow fibers are passed through these holes so that the two perforated plates are formed. Open the space between two perforated plates, and fill the periphery of the hollow fiber with a curable resin material to cure Method (see Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 1-1 3 3 4 5 3).
  • the array is then embedded so that the array is not disturbed.
  • Examples of the embedding method include a method of pouring a polyurethane resin, an epoxy resin or the like into a gap between fibers, a method of adhering fibers to each other by heat fusion, and the like.
  • a gel precursor polymerizable solution containing a nucleic acid probe is introduced into the hollow part of each hollow fiber of the embedded array, and a polymerization reaction is performed in the hollow part. As a result, the gel is held in the hollow portion, and the nucleic acid probe is fixed to the gel.
  • the gel precursor solution examples include acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-acryloylaminoethoxyethanol, N-acryloylaminopropanol, and N-methylaluminum.
  • One or more monomers such as rilamide, N-vinyl pyrrolidone, hydroxyethyl methacrylate, (meth) acrylic acid, allyl dextrin, and methylene bis (meth) acrylamide, polyethylene glycol di (meth) as a crosslinkable monomer Includes acrylate and the like.
  • the nucleic acid probe is chemically bonded to the gel structure by copolymerizing with the gel precursor via the end of the nucleic acid probe (JP-A-2010). 0 4-1 6 3 2
  • the block body is cut into thin pieces by cutting in a direction crossing the longitudinal direction of the hollow fibers.
  • the thin piece produced here can be used as a nucleic acid microarray in the present invention.
  • the thickness of the nucleic acid microarray is about 0.1 min to lrrim.
  • the cutting can be performed by, for example, a microtome, a laser, or the like.
  • the nucleic acid microarray prepared as described above is brought into contact with a solution containing a nucleic acid sample, and a nucleic acid probe and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the probe in the nucleic acid sample are subjected to a hybridization reaction.
  • nucleic acid sample examples include a nucleic acid containing a complementary sequence with a nucleic acid probe, a nucleic acid not containing a complementary sequence with a nucleic acid probe, or a mixture thereof.
  • the nucleic acid sample can be prepared using PCR, reverse transcription reaction, transcription reaction, etc. regardless of the type or origin of DNA or RNA, but the preparation method is limited to these. Is not something When preparing a nucleic acid sample by a generally known method, for example, it can be performed by a preparation method described in a commercially available textbook “Molecular Cloning (CSHL PRESS)”.
  • These nucleic acid samples can be labeled with an appropriate label for detection. Examples of the label include a fluorescent substance, a radioisotope, and an enzyme.
  • the labeling method for example, the method described in “Nucleic acid microarray and latest PCR method (Shyujunsha)” can be used.
  • the hybridization reaction is carried out by preparing a hybridization solution containing a nucleic acid sample and bringing it into contact with a nucleic acid microarray on which nucleic acid probes are immobilized. For example, it can be carried out using the technique described in the commercial textbook “Nucleic acid microarray and the latest PCR method (Shyujunsha)”.
  • Factors that give rise to conditions during the hybridization reaction include temperature during the reaction, salt concentration and pH of the hybridization solution, and the like.
  • the hybridization temperature and salt concentration should be at least specific in a sample solution containing a specific nucleic acid containing a base sequence complementary to the nucleic acid probe and a non-specific nucleic acid not containing the base sequence. It is preferable to select conditions sufficient for the target nucleic acid to form a nucleic acid probe and a nucleic acid hybrid. The selection of conditions can be determined, for example, by calculating Tm from the corresponding nucleic acid probe sequence information using the salt concentration of the solution in which the nucleic acid sample is dissolved as an index.
  • an appropriate temperature condition can be calculated together with the salt concentration in the hybridization reaction solution by the formula (Methods Enzymol. 168: 761-777) proposed by Baldino FJ et al.
  • the hybridization reaction is preferably performed under conditions such that the reaction temperature is Tm or less.
  • the nucleic acid hybrid formed on the nucleic acid microarray is washed a plurality of times while changing the washing conditions from a weak condition to a strong condition.
  • nonspecific hybrids that are non-specifically bound to nucleic acid probes are mixed into the sample.
  • Contaminations such as enzymes are present To do.
  • a washing operation to remove them is required.
  • an SSC solution or SDS solution prepared from sodium chloride, sodium quenate or the like and a mixture thereof can be used as the cleaning solution. Methods for preparing these cleaning solutions are described in, for example, “Bio-Experiment Illustrated (Shujijunsha)”.
  • the washing operation is a method of immersing a nucleic acid microarray in a solution that does not contain a nucleic acid sample, which is optimized at a certain salt concentration, temperature, and pH, as a washing solution, and the nucleic acid microarray surface or nucleic acid probe binding site.
  • a method of passing and retaining the cleaning solution is used.
  • the cleaning solution used at that time needs to have an appropriate salt concentration, temperature, and pH, and these are preferably determined using the Tm calculation formula as an index.
  • the washing solution is injected into a container larger than the nucleic acid microarray, and the temperature of the washing solution is kept constant using a thermostat or temperature controller, and then the nucleic acid microarray is placed in the container into which the washing solution is injected. It is carried out by dipping. Ideally, this washing operation should leave only the specific nucleic acid hybrid, and wash away all non-specific hybrids.
  • the degree of cleaning effect is gradually changed from a weak condition to a strong condition (stepwise cleaning).
  • the washing effect means the action of dissociating the nucleic acid hybrid between the nucleic acid sample and the nucleic acid probe.
  • “Strong cleaning effect” means, for example, a cleaning effect obtained under conditions where the salt concentration of the cleaning liquid is relatively low, the temperature of the cleaning liquid is relatively high, or a combination of these conditions. It is.
  • “Washing effect is weak” is obtained, for example, under conditions where the salt concentration of the cleaning solution is relatively high, the temperature of the cleaning solution is relatively low, or a combination of these conditions. It is a cleaning effect.
  • the microarray is first mounted.
  • the nucleic acid probe with the lowest Tm is adjusted to the washing condition, and washed and detected.
  • washing and detection are performed step by step up to the washing conditions of the nucleic acid probe having the highest Tm.
  • the steps up to the washing condition with the highest Tm can be achieved. It is not necessary to perform cleaning and detection automatically, and the operation can be completed at an intermediate stage. By performing such washing and detection a plurality of times, for example, it becomes possible to divide and detect nucleic acid hybrids in which the washing conditions and the hybrid dissociation conditions are close to each other.
  • the cleaning effect depends on the salt concentration of the cleaning liquid, the temperature of the cleaning liquid, the amount of the cleaning liquid, the cleaning time, and the like.
  • the influence of salt concentration and temperature on the cleaning effect is determined by the relationship with the base composition of the nucleic acid probe.
  • the salt concentration is kept constant and the temperature of the cleaning solution is changed stepwise.
  • the salt concentration is arbitrarily selected (however, a value within the applicable range of the Tm calculation formula is selected).
  • the probe having the minimum Tm is calculated from the Tm calculation formula.
  • the temperature of the cleaning solution at the minimum Tm value preferably at least 1 ° C below the minimum value, is selected as the first stage cleaning condition. Then, perform one or more cleaning operations under conditions where the temperature of the cleaning solution is increased stepwise.
  • the temperature of the cleaning liquid after the second stage only needs to be higher than the temperature of the cleaning liquid before the first stage, and the degree of temperature rise is not particularly limited.
  • the temperature of the cleaning solution can be increased, for example, to a temperature equal to or higher than the maximum Tm value, preferably 1 ° C higher than the maximum value, of probes mounted on the array.
  • the temperature of the cleaning liquid is kept constant and the salt concentration in the cleaning liquid is changed stepwise.
  • the cleaning temperature is arbitrarily selected first (however, a value that can be obtained from the salt concentration within the applicable range of the Tm calculation formula is selected).
  • the probe with the smallest Tm is calculated from the Tm calculation formula, and the minimum Tm value is the same as the specified cleaning solution temperature.
  • the salt concentration of the cleaning solution which is preferably calculated to be 1 or higher, is selected as the first stage cleaning condition, and then one or more cleaning operations are performed under the condition that the salt concentration of the cleaning liquid is gradually reduced by fc. .
  • the salt concentration of the cleaning solution after the second step should be lower than the salt concentration of the previous step, and the degree of salt concentration reduction is not particularly limited.
  • the salt concentration of the cleaning solution is, for example, also on the microarray.
  • On-board pro The maximum Tm value of the probe can be reduced to a calculated salt concentration that is preferably 1 ° C lower than the specified cleaning solution temperature.
  • a method of changing the temperature of the cleaning solution and the salt concentration of the cleaning solution as described above may be used as a method of changing the temperature of the cleaning solution and the salt concentration of the cleaning solution as described above. In this case, only one or both of the temperature and salt concentration of the cleaning solution may be changed in one step of the cleaning operation as long as the cleaning effect changes stepwise. .
  • Example 1 A specific example of the method for changing the salt concentration in the cleaning solution stepwise is shown in Example 1, and a specific example of the method for changing the cleaning solution temperature stepwise is shown in Example 2.
  • the Tm of each probe when the salt concentration is fixed and the salt concentration when ⁇ of each probe is fixed are calculated by a known calculation formula based on the GC content of each probe and the base sequence length. I can do it. However, this calculation formula is not limited to a specific calculation formula.
  • addition of a surfactant or a denaturing agent can be used to change the degree of cleaning.
  • the nucleic acid hybrid is detected for each washing operation.
  • various detection methods can be used.
  • fluorescent labeling detection methods, chemiluminescence methods, radioisotopes, and the like can be used.
  • the fluorescence-labeled detection method includes a method of detecting a fluorescent signal of a nucleic acid sample labeled in advance or a nucleic acid labeled with a hybrid after the hybridization.
  • detection means include a cooled CCD camera, a filter that allows only excitation light to pass through, a filter that allows only fluorescence to pass, an excitation light source, an appropriate optical system, and other fluorescence microscopes equipped with devices suitable for detecting fluorescence in a microarray.
  • detection means include a cooled CCD camera, a filter that allows only excitation light to pass through, a filter that allows only fluorescence to pass, an excitation light source, an appropriate optical system, and other fluorescence microscopes equipped with devices suitable for detecting fluorescence in a microarray.
  • Laser scanners can be used as other detection devices.
  • nucleic acid microarrays Subsequent detection of nucleic acid microarrays by immersing them in a solution-filled case and detecting them in the liquid phase, or by enclosing the detection target in a sealed vessel in a saturated water vapor atmosphere without water evaporation And the like.
  • the detection method described above can be used, for example, for analysis of the expression level of a transcription product, analysis of the base sequence of a gene, analysis of nucleic acid modification, and the like.
  • Transcript expression level analysis is a technique for analyzing the amount of RNA present in or outside a cell, whether it is living or dead.
  • this method single or multiple nucleic acid samples are independently labeled with a labeling substance and hybridized in a single or mixed state to determine the relative amount ratio of RNA between multiple nucleic acid samples. The At that time, by using the detection method of the present invention, the accuracy of the relative quantity ratio in each nucleic acid probe can be improved.
  • Gene base sequence analysis is a method for identifying polymorphisms and mutations in a nucleic acid base sequence or determining the base sequence itself. At that time, by using the detection method of the present invention, the identification performance or determination performance of each nucleic acid probe can be improved.
  • Examples of analysis of nucleic acid modification include a method of investigating the presence or absence of methylation in CpG islands. At that time, by using the detection method of the present invention, the presence or absence of methylation of the site to be studied can be more accurately determined in each nucleic acid probe.
  • the detection method of the present invention is useful for analyzing short nucleic acids such as microRNA (miRNA) using a microarray. Since the nucleic acid length of miRNA is about 20 mer, it is difficult to align the Tm values of the nucleic acid probes of the miRNA microarray. In addition, there is a method to introduce a linker into the probe in order to make the Tm value uniform, but the introduction of a linker is expensive. Therefore, the detection method of the present invention, in which the washing intensity is changed stepwise and the nucleic acid hybrid is detected for each washing condition, is miRNA It is useful for analysis of short nucleic acids.
  • the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present examples clarify the consistency of the present invention as a model, and the present invention is not limited to the following examples. Absent.
  • oligonucleotide nucleic acid sample solutions containing these in equal amounts were prepared. Each solution had a composition containing 10 fmol / l of each Cy5-labeled oligonucleotide, 2xSSC (33.3 mM sodium chloride, 33.3 ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ 7.0) and 0.2% SDS (sodium dodecyl sulfate). The above oligonucleotides were used as model nucleic acid samples.
  • Synthesizing 10 types of nucleic acid probes (SEQ ID NOs: 1 to 20) that have the same chain length and complete complement as the above 10 Cy 5 labeled oligonucleotides (SEQ ID NOs: 1 to 10) did.
  • This nucleic acid probe is a sequence in which a guanine base is replaced with an adenine base in the base sequences of SEQ ID NOS: 11 to 20.
  • a non-complementary base pair is formed with the oligonucleotide of the model nucleic acid sample only at the substitution site.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1-30 for example, the complete complementary sequence of SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 11, and the guanine salt in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • the base sequence in which the group is substituted with an adenine base is SEQ ID NO: 21.
  • the relationship between the sequences corresponding to SEQ ID NOs: 2 to 10 and SEQ ID NOs: 12 to 20 and SEQ ID NOs: 2 to 30 is the same.
  • a hollow fiber (3 1) bundle was manufactured using the array fixture shown in FIG.
  • x, y, and z are orthogonal three-dimensional axes, and the X axis coincides with the longitudinal direction of the fiber.
  • a hole with a diameter of 3 2 mm is provided with a total thickness of 144 mm in 1 2 rows in each length and width, with the distance between the centers of the holes (1 1) being 0.4 2 mm.
  • Two perforated plates (2 1) were prepared. These perforated plates were overlapped, and all of the pores were passed through each of the poly force-ponate hollow fibers (31) (added 1% by mass of Capon Black manufactured by Mitsubishi Engineering Plastics).
  • the position of the two perforated plates is moved so that the position of 20 mm and 100 mm from one end of the hollow fiber Fixed at two locations. That is, the interval between the two perforated plates was 80 mm.
  • the resin raw material was poured into the container from the upper part of the container.
  • the resin used was 2.5% by mass of carbon black added to the total weight of the polyurethane resin adhesive (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd. Nipponporan 4276, Coronate 4403).
  • the resin was cured by allowing to stand at 25 ° C for 1 week.
  • the porous plate and the plate-like material were removed to obtain a hollow fiber bundle. ⁇ .
  • Nucleic acid probe (SEQ ID NO: 11 to 30) 5 mol / 1
  • a gel precursor polymerizable solution containing each nucleic acid probe was placed in a desiccant overnight. After the inside of the desiccant was depressurized, one end of the hollow fiber bundle where the fiber bundle was not fixed was immersed in this solution. Nissen gas was sealed in the desiccant, and a gel precursor polymerizable solution containing a capillary probe was introduced into the hollow part of the hollow fiber. Next, the inside of the container was brought to 70 ° C., and a polymerization reaction was carried out over 3 hours. In this way, a hollow fiber bundle in which the nucleic acid probe was held in the hollow portion of the hollow fiber via a gel-like material was obtained.
  • the obtained hollow fiber bundle was sliced in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the fiber using a microtome to obtain 50 thin sheet sheets (DNA microarray) having a thickness of 0.5 mm.
  • the concentration of the nucleic acid probe present in each hollow portion is 50 fmol / spot.
  • the resulting nucleic acid microarray design is shown in Figure 2.
  • the numbers in Fig. 2 indicate the sequence number of the nucleic acid probe, and B indicates a plank gel (gel that does not include the nucleic acid probe).
  • Each labeled oligonucleotide solution prepared in 1 above was brought into contact with the nucleic acid microarray prepared in 3 above, and hybridization was performed at 75 ° C. for 3 hours in a thermostatic bath.
  • the nucleic acids of SEQ ID NOs: 1 to 10 contained in the nucleic acid sample are all complementary to the nucleic acid probes of SEQ ID NOs: 11 to 20 and the nucleic acid probes of SEQ ID NOs: 21 to 30 Partially complementary. Therefore, it is predicted that the fluorescence signal of the section where the nucleic acid probes of SEQ ID NOS: 11 to 20 are immobilized is stronger than that of the section where the nucleic acid probes of SEQ ID NOs: 21 to 30 are immobilized.
  • a fluorescent signal is detected in the section where the nucleic acid probes of SEQ ID NOs: 1 to 20 are fixed, and a fluorescent signal is detected in the section where the nucleic acid probes of SEQ ID NOs: 21 to 30 are fixed.
  • the fluorescence signal intensity of the section to which the nucleic acid probe of SEQ ID NO: 21 to 30 is fixed is greater than the fluorescence signal intensity of the section to which the nucleic acid probe of SEQ ID NO: 11 to 20 is fixed. Is also expected to be very small.
  • the fluorescence signal intensity of the compartment in which the nucleic acid probes of SEQ ID NOs: 21 to 30 were immobilized was slightly strong after washing at 75 ° C for 20 minutes in 1 XSSC (Fig.
  • Oligonucleotides having the sequences shown in SEQ ID NOs: 31 to 36 below were synthesized. Each oligonucleotide is labeled and purified by PlatinumBright TM: Nucleic Acid Labeling Kit (manufactured by KREATECH) according to the protocol attached to the kit.
  • SEQ ID NOs: 31 to 3 6 Six kinds of the above-mentioned labeled oligonucleotides (SEQ ID NOs: 31 to 3 6) and 6 kinds of nucleic acid probes (SEQ ID NOs: 37 to 4 2) which are completely complementary sequences were synthesized.
  • SEQ ID NO: 3 7 is a completely complementary sequence to SEQ ID NO: 31.
  • the relationship between the sequences corresponding to SEQ ID NOs: 3 8 to 4 2 and SEQ ID NOs: 3 2 to 3 6 is also the same.
  • the Tm value was calculated according to the following formula 1 under the condition of 2 X SSC salt concentration.
  • Each nucleic acid probe is composed of a very short sequence and has high complementarity, so that it may easily cross-hybridize the same nucleic acid sample.
  • a nucleic acid microarray was produced in the same manner as in Example 1 except that the nucleic acid probe described in Table 1 of Example 1 was changed to a nucleic acid probe having the sequence of SEQ ID NOs: 37 to 42. ..
  • Each labeled oligonucleotide solution prepared in 1 above was brought into contact with the nucleic acid microarray prepared in 3 above, and hybridization was carried out.
  • the conditions for high pre-dialysis were performed at 50 ° C. After reaching 50 ° C, it was kept warm for 16 hours, and then a washing operation was performed. Washing was performed by immersing in 2 XS SC, 0.2% SDS solution at 50 ° C for 20 minutes, and this was repeated twice, followed by 2 XSSC, 50 ° C. Soaked for 10 minutes.
  • the microarray was immersed in 2 XSSC and covered with a cover glass, and then the fluorescence signal intensity of the labeled nucleic acid sample molecule was measured using a cooled CCD camera type nucleic acid microarray automatic detection device.
  • the measurement results are shown in Table 2.
  • the value of fluorescence detection intensity from a completely complementary hybrid was set as 100, and the other values were shown as relative values. The value below the detection limit is indicated as ND.
  • the target sequence is very short and targets having high homology with each other are included, it is difficult to exhibit the specificity of the probe (for example, It can be especially used for microRNA detection. Potential for industrial use
  • the present invention when there are significant differences in the sequence length and GC content of genes that can be mounted on the same microarray, and variations in Tm values estimated based on the differences among the nucleic acid probes.
  • by performing only the washing operation in the nucleic acid detection process step by step it is possible to easily perform sequence-specificity without using multiple types of Tm-specific microarrays or performing multiple experiments with different hybridization conditions. It is possible to detect signals derived from typical hybridization.
  • the method of the present invention improves the stringency of sequence-specific hybridization in a stepwise manner by repeating washing and detection in multiple steps, and restricts the nucleic acid probe design, particularly Tm (nucleic acid duplex). (Dissociation temperature) and nucleic acid probe sequence length can be relaxed.
  • the present invention provides a use in which it is difficult for the nucleic acid sample to be designed to easily align the Tm values in the design of the nucleic acid probe sequence, for example, a focus door that narrows down several hundred to several tens of genes to be analyzed. It can be used for expression analysis in lei and diagnosis of diseases based on it, analysis of short nucleic acids such as miRNA, detection of nucleic acid methylation, polymorphism analysis of disease-related genes and genetic diagnosis based on them, and pathogenic bacteria and virus duplication, Furthermore, the data reliability in these applied methods can be improved. ' Sequence listing free text ⁇ ⁇ ⁇

Abstract

本発明は、核酸プローブの塩基配列の設計に制限を受けない、核酸検出方法を提供する。　多段階での洗浄及び検出を繰り返すことにより、段階的に配列特異的ハイブリダイゼーションの厳密性を向上させ、核酸プローブ設計における制約条件、特にＴｍ（核酸二本鎖の解離温度）や核酸プローブ配列長での制約条件の緩和を可能とする。

Description

明 細 書 核酸マイクロアレイを用いた核酸検出方法 技術分野
本発明は核酸マイクロアレイによるハイプリダイゼ一ション技術を利用した 核酸検出方法に関する。 背景技術
核酸マイクロアレイとは、 担体上に多数の核酸プローブをそれぞれ独立に固 定化したものである。 核酸プローブとしては cDNAや合成オリゴ核酸が用いら れることが多い。従来は、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体上に、 核酸プ口一ブを固定化したマイクロアレイが利用されているが、 近年ではゲル 担体など、 他の手法による担体の改質も行われている。
ハイブリダィゼ一シヨン技術を利用した核酸検出方法とは、 核酸マイクロア レイに固定されている核酸プロ一ブに対して、 検査対象となる核酸試料を配列 特異的にハイブリダィズさせ、 配列特異的に形成したハイプリッドを蛍光物質 等により検出し、 複数の核酸プローブに対応する試料中の核酸塩基配列を含む 分子を、 定量的又は定性的に調べる方法である。 この方法は、 複数の核酸塩基 配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体等を解析するのに利用 されている。
核酸を検出する際、 従来は予め設定した適切な条件下でハイブリダィゼ一シ ヨン反応を実施し、 次いで洗浄工程により、 アレイ表面に残存した核酸試料又 はその他不要物の除去を行い、 ··核酸プローブと特異的な八イブリッドを形成し ている核酸試料を検出する。 核酸プローブは、 配列解析、 機能解析等、 検出対 象となる所望の核酸塩基配列と相補又は同一に設計されることが多い。 核酸プ 口一プとしては、 cDNA等の比較的長鎖の核酸又は短鎖の合成オリゴ核酸等が 使用される。 合成オリゴ核酸を核酸プローブとして使用する場合、 ヒトゃマウ スなど、 遺伝子情報の知見が蓄積している生物については、 それらの塩基配列 情報を用い、 各配列の相同性や機能などに着目した上で、 合成オリゴ核酸の配 列を設計し、 核酸プローブを作製することが可能である。 - 発明の開示
同一マイクロアレイに搭載する核酸プローブについては、 それぞれの核酸プ ローブが、 核酸試料とのハイブリダィゼーシヨン及び洗浄条件に適合するよう Tm (核酸二本鎖の解離温度） を揃える必要がある。 しかし、 生物の持つ核酸 塩基配列には、 複数の類似配列が含まれている場合があり、 そのような配列特 異性が低い領域や GC含量の偏った領域内を検出するための核酸プローブの設 計は困難であり、 仮に核酸プローブを設計したとしても、 それら核酸プローブ が搭載された核酸マイクロアレイを使用して正確なデータを得ることは困難で あった。
一方、 上記問題点を克服するために、 最適なハイブリダィゼ一シヨン条件及 び洗浄条件等で検出操作を行うことも検討されている （特開 2 0 0 3— 0 0 0 3 0 0号公報） 。 その検出操作は、 同一塩基配列をもつ核酸プローブを複数種 類、 核酸マイクロアレイに搭載し、 マイクロアレイ自体に温度のグラデーショ ンをかけて、 同一塩基配列をもつ複数の核酸プローブのシグナル強度を比較す るものである。 しかし、 この方法では、 ハイブリダィゼーシヨン条件を決定す る因子として、 温度のみをパラメータ一として扱っていること、 また、 特殊な 装置を用いる必要があり、 簡便とは言えない。
本発明は、 核酸プローブの塩基配列の設計に制限を受けない、 核酸検出方法 を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を克服するために、 鋭意検討を行った結果、 多段階 での洗浄'及び検出を繰り返すことにより、 段階的に配列特異的ハイブリダィゼ —シヨンの厳密性を向上させ、 核酸プローブ設計における制約条件、 特に Tm や核酸プローブ配列長での制約条件の緩和を可能に出来ることを見出し、 本発 明を完成するに至った。 即ち、 本発明は、 以下の工程を含む核酸検出方法である。
( 1 ) 複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレイに、 核酸試料を含む溶液を接触させ、 前記プローブと、 前記核酸試料中の核酸 とをハイプリダイゼ一ション反応させる工程、 及び
(2) 核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイブリッドを、 洗浄効果の弱 い条件から強い条件まで洗浄条件を変えながら複数回洗浄し、洗浄操作毎 に核酸ハイプリッドを検出する工程。
ここで、 洗浄条件の変化として、 洗浄液の塩濃度の変化、 洗浄液の温度の変 化またはこれらの変化の組み合わせを挙げることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 繊維配列体を製造する配列固定器具の図である。
図 2は、 核酸マイクロアレイのデザインを示す図である。
図 3は、 核酸マイクロ-アレイを 1 XS S C中、 7 5 °Cで 20分間洗浄した 後の核酸検出のシグナル強度を示した図である。
図 4は、 核酸マイクロアレイをさらに 0. 7 XS S C中、 75°Cで 20分 間洗浄した後の核酸検出のシグナル強度を示した図である。 符号の説明
1 1 · · 孔
21 · ' 多孔板
31 · · 中空繊維
41 · ' 板状物 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明するが、 本実施の形態は、 本 発明を説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態のみ 限定させる ものではない。 なお、 本明細書において引用した文献、 及び公開公報、 特許公 報その他の特許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 本発明は、複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレ ィに、 核酸試料を含む溶液を接触させ、 前記プローブと、 前記核酸試料中におい て当該プローブに相補的な塩基配列を含む核酸とをハイブリダィゼーシヨン反 応させる第 1の工程と、核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイプリッドを、 洗浄効果の弱い条件から強い条件まで洗浄条件を変えながら複数回洗浄し、洗浄 操作毎に核酸ハイプリッドを検出する第 2の工程を含む核酸検出方法である。 第 1の工程では、複数の核酸プロ一'ブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイク ロアレイに、 核酸試料を含む溶液を接触させ、 前記プローブと、 前記核酸試料中 の核酸 （例えば、 当該プローブに相補的な塩基配列を含む核酸） とをハイブリダ ィゼ一ション反応させる。
「核酸プロ一ブ」 とは、検出すべき遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む核酸 を示す。 核酸プローブは、 例えば、 市販のプローブ設計ソフト等を使用し設計す ることができる。 設計した核酸プローブは、 その種類や製造方法を問わないが、 ハイブリダィゼーシヨンの配列特異性、 検出正確性、 安定性を鑑みると、 合成ォ リゴ核酸を用いることが好ましい。
調製された各核酸プローブは、適当な担体にそれぞれ独立に配置される。 「独 立に」 とは、 各プローブが物理的に隔離されて配置されている状態をいう。 例 えば、 担体が平面基板の場合、 各プローブが平面基板上にある一定の間隔を以 つて配置されている状態をいう。 また、 担体がストリップ状物の集束物である 場合、 1本のストリップに 1種類のプローブが配置されている状態をいう。
担体としては、 例えばガラス、 シリコン、 樹脂等の平面基板が挙げられる。 平面基板を使用する場合には、 例えばフォトリソグラフィ一法、 スポッティン グ法により核酸プローブを固定することができる。
また、 担体として、 平面基板の他に、 貫通孔基板も使用することができる。 その場合、 核酸プローブは、 貫通孔の内壁に固定することができる。 また、 貫 通孔にゲルを保持し、 ゲル内に核酸プローブを保持することも可能である。
ここで、 貫通孔'を形成する材料として中空繊維を使用し、 その中空部にゲル が保持され、 そのゲル内に核酸プローブを保持されている核酸マイクロアレイ について詳しく説明する。 この核酸マイクロアレイは、 例えば、 下記の a ) 〜 d ) の工程を経て作製することができる。
a )複数本の中空繊維を、 中空繊維の長手方向が同一方向となるように 3次元に 配列し配列体を製造する工程。
b ) 前記配列体を包埋し、 ブロック体を製造する工程。
c ) 核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の 中空部に導入し、 重合反応を行い、 核酸プローブを含むゲル状物を中空部に保 持する工程。
d ) 中空繊維の長手方向と交叉する方向で、 切断してブロック体を薄片化する 工程。
中空繊維材料としては、 例えば、 ナイロン 6、 ナイロン 6 6、 芳香族ポリア ミド等のポリアミド系中空繊維、 ポリエチレンテレフ夕レート、 ポリプチレン テレフ夕レート、 ポリ乳酸、 ポリダリコール酸、 ポリ力一ポネート等のポリェ ステル系中空繊維、 ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、 ポリェチ レンやポリプロピレン等のポリオレフイン系中空繊維、 ポリメ夕クリル酸メチ ル等のポリメタクリレート系中空繊維、 ポリビニルアルコール系中空繊維、 ポ リ塩化ビニリデン系中空繊維、 ポリ塩化ビニル系中空繊維、 ポリウレタン系中 空繊維、 フエノール系中空繊維、 ポリフッ化ビニリデンゃポリテトラフルォロ ェチレン等からなるフッ素系中空繊維、 ポリアルキレンパラォキシベンゾエー ト系中空繊維等が挙げられる。
上記中空繊維は、 その長手方向が同一となるように 3次元に配列される。 配 列方法としては、 例えば、 粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所 定の間隔をもって平行に配置し、 シート状とした後、 このシートを螺旋状に巻 き取る方法 （特開平 1 1— 1 0 8 9 2 8号公報参照） が挙げられる。 また、 複 数の孔が所定の間隔をもつて設けられた多孔板 2枚を孔部が一致するように重 ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、 2枚の多孔板の間隔を開き、 2枚の多孔板間の'、 中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方 法 （特開 2 0 0 1 - 1 3 3 4 5 3号公報参照） が挙げられる。
次に配列体はその配列が乱れないように包埋される。 包埋の方法としては、 ポリウレタン樹脂、 エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、 繊維同士 を熱融着により接着する方法等が挙げられる。
次に包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、 核酸プローブを含むゲル前 駆体重合性溶液を導入し、 中空部内で重合反応を行う。 これにより中空部にゲ ルが保持され、 ゲルには核酸プローブが固定される。
ゲル前駆体溶液としては、 例えば、' アクリルアミド、 N , N—ジメチルァク リルアミド、 N—イソプロピルアクリルアミド、 N—ァクリロイルァミノエト キシエタノール、 N—ァクリロイルァミノプロパノール、 N—メチ口一ルァク リルアミド、 N—ビニルピロリ ドン、ヒドロキシェチルメタクリレート、（メタ） アクリル酸、 ァリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、 架橋性モノマ一 としてメチレンビス （メタ） アクリルアミド、 ポリエチレングリコールジ （メ 夕） ァクリレート等を含むものである。 予め核酸プローブの末端を不飽和官能 基で修飾しておけば、 核酸プローブの末端を介してゲル前駆体と共重合するこ とにより、 ゲルの構成に核酸プローブが化学結合する （特開 2 0 0 4 - 1 6 3 2
1 1号公報参照）。
次に、 中空繊維の長手方向と交叉する方向で、 切断してブロック体を薄片化 する。 ここで作製された薄片は、 本発明において核酸マイクロアレイとして使 用できる。 核酸マイクロアレイの厚みは、 0.1min〜lrrim程度である。 切断は、 例えばミクロト一ム、 レーザ一等により行うことができる。
次に、 上記のごとく調製した核酸マイクロアレイを、 核酸試料を含む溶液に 接触させ、 核酸プローブと、 前記核酸試料中において当該プローブと相補的な 塩基配列を含む核酸とをハイプリダイゼーシヨン反応させる。
核酸試料としては、 核酸プローブとの相補配列を含む核酸、 核酸プローブと の相補配列を含まない核酸、 もしくはその混合物を挙げることができる。 その 核酸試料は、 DNAや RNAなどの種類やその由来を問わず、 PCRや逆転写反応、 転写反応などを利用して調製することが出来るが、 調製方法はこれらに限定さ れるものではない。 一般に公知の手法で核酸試料を調製する場合、 例えば、 市 販の教本 「Molecular Cloning(CSHL PRESS)」 記載の調製方法で行うことが 出来る。 これら核酸試料は、 検出のための適当な標識を施すことができる。 標 識としては、 例えば、 蛍光物質、 ラジオアイソトープ、 酵素等が挙げられる。 標識方法は、 例えば、 「核酸マイクロアレイと最新 PCR法 （秀潤社)」 記載の手 法を用いることが出来る。
接触とは、マイクロアレイに配置されているプローブの全部又は一部を、核酸 試料を含むハィブリダイゼ一ション溶液に浸漬している状態にすることをいう。 ハイブリダイゼーション反応は、核酸試料を含むハイブリダイゼ一ション溶液を 調製し、これを核酸プローブの固定化された核酸マイクロアレイに接触させるこ とにより行う。例えば、市販教本「核酸マイクロアレイと最新 PCR法（秀潤社)」 記載の手法を用いて行うことが出来る。
ハイブリダィゼ一シヨン反応時の条件を泱める要素としては、該反応時の温度、 ハイブリダィゼーション溶液の塩濃度及び pHなどが挙げられる。 ハイブリダィ ゼ一シヨン温度及び塩濃度は、核酸プローブに対して相補的な塩基配列を含む特 異的核酸及び当該塩基配列を含まない非特異的核酸が含まれる試料溶液中で、少 なくとも、特異的核酸が核酸プローブと核酸ハイプリッドを形成するに十分な条 件を選択することが好ましい。条件の選択は、 例えば、核酸試料が溶解している 溶液の塩濃度を指標にして、 対応する核酸プローブ配列情報から Tmを計算し決 定することができる。 具体的には、 Baldino F.Jらによって提唱された計算式 (Methods Enzymol. 168：761-777) によって、 適当な温度条件をハイブリダィ ゼ一ション反応液中の塩濃度とともに計算することができる。ハイブリダイゼ一 シヨン反応は、 反応温度が Tm以下になるような条件で行うことが好ましい。 第 2の工程では、核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイプリッドを、洗 浄効果の弱い条件から強い条件まで洗浄条件を変えな.がら複数回の洗浄を行う。 通常、ハイブリダィゼーシヨンの後の核酸マイクロアレイ上には、特異的核酸 と核酸プローブとの核酸ハイプリッドの他に、核酸プローブと非特異結合をして いる非特異的ハイプリッドゃ試料中に混入している酵素類などの共雑物が存在 する。特異的核酸ハイプリッドのみを検出するには、 これらを除去する洗浄操作 が必要になる。 洗浄液としては、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウム等から調 製された S S C溶液や S D S溶液及びその混合物を用いることができる。これら の洗浄液の調製方法は、 例えば 「バイオ実験イラストレイテッド （秀潤社）」 に 記載されている。
洗浄操作は、 一定の塩濃度、 温度、 pHで最適化された、 核酸試料を含まない 溶液を洗浄液として用い、核酸マイクロアレイをその溶液中に浸漬する方法、核 酸マイクロアレイの表面もしくは核酸プローブ結合部位に洗浄液を通過、滞留さ せる方法等が用いられる。 また、 その際に使用される洗浄液については、 適切な 塩濃度、 温度、 pHである必要があるが、 これらは前述の Tmの計算式を指標にし て決定されることが好ましい。
好ましい洗浄形態としては、核酸マイクロアレイよりも大きな容器中に洗浄液 を注入し、 恒温槽ゃ温度制御装置を用い、 洗浄液温度を一定に保持した上で、 洗 浄液の注入された容器中に核酸マイクロアレイを浸漬することにより実施する。 この洗浄操作は、 理想的には、 特異的核酸ハイプリッドのみを残し、 非特異的ハ イブリッドゃ共雑物をすベて洗い流すことが望ましい。
洗浄操作の際、洗浄効果の度合いを洗浄条件の弱い条件から強い条件へと段階 的に変えていく （段階的洗浄）。 ここで、 洗浄効果は、 核酸試料と核酸プローブ との核酸ハイブリッドを解離させる作用を意味する。 「洗浄効果が強い」 とは、 対照の洗浄条件よりも、 例えば、 洗浄液の塩濃度が相対的に低い条件、 洗浄液の 温度が相対的に高い条件、またはこれらを組み合わせた条件で得られる洗浄効果 である。 「洗浄効果が弱い」 とは、 対照の洗浄条件よりも、 例えば、 洗浄液の塩 濃度が相対的に高い条件、洗浄液の温度が相対的に低い条件、 またはこれらを組 み合わせた条件で得られる洗浄効果である。
具体的には、 まず、 マイクロアレイに搭載している.核酸プローブの中で、 Tm が最も低いものに洗浄条件を合わせ、 洗浄及び検出を行う。 次に、 核酸プローブ の中で Tmが最も高いものの洗浄条件まで、 段階的に洗浄及び検出を行う。 ただ し、 目的の核酸の検出が確認できれば、 Tmが最も高いものの洗浄条件まで段階 的に洗浄および検出を行う必要はなく、途中の段階で操作を終了することができ る。 このような複数回の洗浄及び検出を行うことにより、 例えば、 洗浄条件とハ イブリッドの解離条件とが近接している核酸ハイプリットを分割して検出する ことが可能となる。
洗浄効果は、 洗浄液の塩濃度、 洗浄液温度、 洗浄液量、 洗浄時間などに依存す る。 特に、 洗浄効果に対する塩濃度及び温度の影響は、 核酸プローブの塩基構成 との関係によって定まる。
洗浄条件を段階的に変更する方法としては、 例えば、 塩濃度を一定にして、 洗 浄液の温度を段階的に変えていく方法がある。具体的には、 はじめに塩濃度を任 意に選ぶ （ただし、 Tm計算式の適用範囲内の値を選ぶ） 。 次いで核酸マイクロ アレイ上に搭載されている全ての核酸プローブの内、 Tmが最小となるプローブ を Tm計算式から算出する。 その最小の Tm値、 好ましくは、 最小値よりも 1 °C 以上低い洗浄液の温度を第一段階の洗浄条件として選ぶ。その後、洗浄液温度を 段階的に高くした条件で、 1回以上の洗浄操作を行う。 この場合、 第二段階以降 の洗浄液温度は、一段階前の洗浄液温度よりも高ければよく、温度上昇の程度は 特に限定されない。 洗浄液温度は、 例えば、 同じくアレイ上に搭載されているプ ローブの内の最大 Tm値以上、 好ましくは最大値よりも 1 °C以上高い温度まで高 くすることができる。
また、洗浄液の温度を一定にして、洗浄液中の塩濃度を段階的に変える方法を 用いることも出来る。 具体的には、 はじめに洗浄温度を任意に選ぶ（ただし、 T m計算式の適用範囲内の塩濃度から求められうる値を選ぶ）。次いで核酸マイク ロアレイ上に搭載されている全ての核酸プローブの内、 Tmが最小となるプロ一 ブを Tm計算式から算出し、その最小 Tm値が、規定された洗浄液温度に比べて、 同じかもしくは、 好ましくは 1 以上高くなるように計算される洗浄液の塩濃度 を第一段階の洗浄条件として選び、その後、洗浄液の塩濃度を段階的 fc低くした 条件で、 1回以上の洗浄操作を行う。 この場合、 第二段階以降の洗浄液の塩濃度 は、一段階前の塩濃度よりも低ければよく、塩濃度低下の程度は特に限定されな レ^洗浄液の塩濃度は、 例えば、 同じくマイクロアレイ上に搭載されているプロ ーブの内の最大 Tm値が、 規定された洗浄液温度に比べて好ましくは 1°C以上低 くなるように計算される塩濃度まで低くすることができる。
また、洗浄条件を洗浄効果の強い条件に段階的に変更する方法としては、前述 の洗浄液の温度と洗浄液の塩濃度とを組み合わせて変化させる方法を用いるこ ともできる。 この場合、洗浄液の温度と塩濃度は、 洗浄効果が段階的に変化する 限り、 洗浄操作の一段階において、 いずれか一方のみを変化させてもよいし、 ま たは両方とも変化させてもよい。
洗浄液中の塩濃度の制御は、洗浄液温度の制御よりも容易であるため、 この点 から言えば、洗浄液中の塩濃度を段階的に変える方法が好ましい。洗浄液中の塩 濃度を段階的に変える方法の具体例を実施例 1に示し、洗浄液温度を段階的に変 える方法の具体例を実施例 2に示した。
尚、 塩濃度を固定した際の各プローブの Tm、 及び各プローブの Τηιを固定し た際の塩濃度は、 各プローブの GC含量、 塩基配列長を基に、 公知の計算式で算 出することが出来る。しかしながらこの計算式は特定の計算式に限定されるもの ではない。
また別途、界面活性剤や変性剤等の添加も洗浄度合いの変更に使用が可能であ る。
第 2の工程では、 上記の洗浄操作毎に核酸ハイブリッドを検出する。 洗浄後 の検出方法としては、 種々の検出方法を用いることが出来る。 例えば、 蛍光ラ ベル化検出法、 化学発光法、 ラジオアイソトープ等の手法が利用出来る。 蛍光 ラベル化検出法では、 予めラベル化した核酸試料、 あるいは、 ハイブリダィゼ —シヨンの後にィン夕一カレー夕一で標識した核酸の蛍光シグナルを検出する 方法がある。
検出手段としては、 例えば冷却 CCDカメラ、 励起光のみを通過させるフィル ター、 蛍光のみを通過させるフィルター、 励起光源、 適切な光学系、 その他の マイクロアレイにおける蛍光の検出に適した機器を供えた蛍光顕微鏡により、 蛍光を検出する方法が挙げられる。 それ以外の検出装置としては、 レーザース キヤナーなどが利用できる。 また、 検出の際には、 核酸マイクロアレイ表面又はマイクロアレイ全体の乾 燥を防ぐため、 少なくとも、 水分蒸発の少ない環境下で検出することが望まし レ 乾燥を防ぐ方法としては、 例えば、 検出対象の洗浄後の核酸マイクロアレ ィ自体を、 溶液の入ったケースに浸漬させて、 液相中で検出する方法、 又は水 分の蒸発のない飽和水蒸気雰囲気にした密閉容器中に検出対象を封入して検出 する方法等が挙げられる。
上述した検出方法は、 例えば、 転写産物の発現量の解析、 遺伝子の塩基配列の 解析、 核酸修飾の解析等に使用することができる。
転写産物の発現量解析とは、 生体の生死を問わず、 細胞中、 もしくは細胞外に 存在する RNAの量を解析する手法である。 単一又は複数の核酸試料を、 それぞ れ独立に標識物質によって標識し、単独又は混合状態でハイブリダィゼーシヨン することにより、 RNAの複数の核酸試料間における相対量比を調べる方法であ る。 その際に、 本発明の検出方法を使用することにより、 各核酸プロ一ブにおけ る上記の相対量比の正確性を向上することができる。
遺伝子の塩基配列解析とは、核酸塩基配列における多型や変異などの同定もし くは塩基配列自体の決定を行う方法である。その際に、本発明の検出方法を使用 することにより、各核酸プローブにおける上記の同定性能、又は決定性能を向上 することができる。
核酸修飾の解析とは、 たとえば、 CpGアイランドにおけるメチル化の有無を調 ベる方法が挙げられる。 その際に、 本発明の検出方法を使用することにより、 調 查対象となる部位のメチル化の有無等を各核酸プローブにおいてより正確に決 定することができる。
また、 本発明の検出方法は、 マイクロ RNA (miRNA) などの短い核酸をマイ クロアレイを用いて解析するのに有用である。 miRNAの核酸長は約 20merであ るため、 miRNA用マイクロアレイの核酸プローブの Tm値を揃えるのは困難であ る。また、 Tm値を揃えるために、プローブにリンカ一を導入する方法があるが、 リンカーの導入はコスト高となってしまう。 したがって、洗浄強度を段階的に変 化させ、洗浄条件毎に核酸ハイプリッドを検出する本発明の検出方法は、 miRNA などの短い核酸の解析に有用である。 以下、 実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、 本実施例はモデルとし て本発明の整合性を明確にしたものであり、 本発明は以下の実施例に限定され るものではない。
<実施例 1 > .
1 . 核酸試料の調製
下記の配列番号 1〜 1 0に示す配歹 iJの C y 5標識オリゴヌクレオチドを合成 後、これらを等量に含むオリゴヌクレオチド核酸試料溶液をそれぞれ作製した。 各溶液は、 各 C y 5標識オリゴヌクレオチドを 10 fmol/ l、 2xSSC (塩化ナト リウム 33.3 mM、 クェン酸ナトリウム 33.3 πιΜ、 ρΗ 7.0)及び 0.2 % SDS (ド デシル硫酸ナトリウム) を含む組成とした。 以上のオリゴヌクレオチドをモデ ル核酸試料として使用した。
配列番号 1 ：
cggattaggg cgttttttat tttcgtcggg agttcgtcga ttggttgggt gtgggcgtac gtgatc 配列番号 2 ：
cgtttttggt gagcgtcgtc gttagttaat cgcggggcgt agaggttttt ggtttcgttt cgc 配列番号 3 ：
cggcgtgggt gtggggcgag tgggtgtgtg cggggtgtgc gcggtagagc gcgttagc
配列番号 4 ：
cggggggcgg tgtttcgggg tttatttggt tgtagttacg tatttttttt tagtggcgtc
配列番号 5 ：
cgcgcgttcg tcgttcgtta tatatcgttc gtagtattcg tgtttagttt cgtagtggcg tttgacgtcg eg cgc
配列番号 6 ：
cggatcgagt gcgttcggcg gttgcggaga ggggtagagt aggtagcggg cggc
配列番号 7 ：
cgcgtggtgt tttgcggtcg tcgtcgttgt ggtcgttcgg ggtggggtgt gaggagggga c 配列番号 8 ：
cggttggggt ttcgcgttta tacggttttt ggcgggggtt cgcgcgtttc gggagtttcg c 配列番号 9 ：
cggagcgacg cgtcgtatag ttaatcggcg gagtttttat cgcgggtatt tcggtggcgt tcgc 配列番号 1 0 ：
cgcgggcggc gtcgtcgaac gttagcgtta gggggcgggg tgggggaggg agcgaggttt ttc 2 . 核酸プローブの調製
上述の C y 5標識オリゴヌクレオ ド 1 0種 （配列番号 1〜 1 0 ) と同一鎖 長、 且つ完全相補配列である核酸プロ一ブ 1 0種 （配列番号 1 1〜2 0 ) を合 成した。
配列番号 1 1 ：
gatcacgtac gcccacaccc aaccaatcga cgaactcccg acgaaaataa aaaacgccct aatccg 配列番号 1 2 :
gcgaaacgaa accaaaaacc tctacgcccc gcgattaact aacgacgacg ctcaccaaaa acg 配列番号 1 3 : '
gctaacgcgc tctaccgcgc acaccccgca cacacccact cgccccacac ccacgccg " 配列番号 1 4 :
gacgccacta aaaaaaaata cgtaactaca accaaataaa ccccgaaaca ccgccccccg 配列番号 1 5 ：
gcgaacgcga cgtcaaacgc cactacgaaa ctaaacacga atactacgaa cgatatataa cgaacgacga acgcgcg
配列番号 1 6 ：
gccgcccgct acctactcta cccctctccg caaccgccga acgcactcga tccg
配列番号 1 7 : '
gtc'ccctcct cacaccccac cccgaacgac cacaacgacg acgaccgcaa aacaccacgc g 配列番号 1 8 ：
gcgaaactcc cgaaacgcgc gaacccccgc caaaaaccgt ataaacgcga aaccccaacc g 配列番号 1 9 : ' gcgaacgcca ccgaaatacc cgcgataaaa actccgccga ttaactatac gacgcgtcgc tccg 配列番号 2 0 ：
gaaaaacctc gctccctccc ccaccccgcc ccctaacgct aacgttcgac gacgccgccc gcg また、 上述の C y 5標識オリゴヌクレオチド 1 0種 （配列番号 1〜 1 0 ) と 同一鎖長、且つ部分相補配列である核酸プローブ 1 0種（配列番号 2 1〜3 0 ) をそれぞれ合成した。
この核酸プローブは、 配列番号 1 1〜 2 0の塩基配列の内、 グァニン塩基が アデニン塩基に置換された配列であ ¾。 同置換部位においてのみモデル核酸試 料のオリゴヌクレオチドと非相補塩基対を形成するものである。
配列番号 2 1 ：
aatcacatac acccacaccc aaccaatcaa caaactccca acaaaaataa aaaacaccct aatcca 配列番号 2 2 :
acaaaacaaa accaaaaacc tctacacccc acaattaact aacaacaaca ctcaccaaaa aca 配列番号 2 3 ： '
actaacacac tcatccacac acaccccaca cacacccact caccccacac ccacacca
配列番号 2 4 :
aacaccacta aaaaaaaata cataactaca accaaataaa ccccaaaaca ccacccccca 配列番号 2 5 ：
acaaacacaa catcaaacac cactacaaaa ctaaacacaa atactacaaa caatatataa caaacaacaa acacaca
配列番号 2 6 ：
accacccact acctactcta cccctatcca caaccaccaa acacactcaa tcca
配列番号 2 7 :
atcccctcct cacaccccac cccaaacaac cacaacaaca acaaccacaa aacaccacac a 配列番号 2 8 :
acaaaactcc caaaacacac aaacccccac caaaaaccat ataaacacaa aaccccaacc a 配列番号 2 9 : '
acaaacacca ccaaaatacc cacaataaaa actccaccaa ttaactatac aacacatcac tcca 配列番号 3 0 ：
aaaaaacctc actccctccc ccaccccacc ccctaacact aacattcaac aacaccaccc aca 配列番号 1〜3 0で示される塩基配列において、 例えば、 配列番号 1の完全 な相補配列が配列番号 1 1であり、 配列番号 1 1の塩基配列の内、 グァニン塩 基をアデニン塩基に置換した塩基配列が配列番号 2 1である。 以下、 配列番号 2〜 1 0、 配列番号 1 2〜 2 0及び配列.番号 2 2〜 3 0に対応する配列の関係 も同様である。
3 . 核酸マイクロアレイの製造 '
図 1に示す配列固定器具を利用して中空繊維 （3 1 ) 束を製造した。 なお、 図中の x、 y、 zは直交の 3次元軸であり、 X軸は繊維の長手方向と一致する。 まず、 直径 3 2 mmの孔が、 孔 ( 1 1 ) の中心間距離を 0 . 4 2 mmと して、 縦横各 1 2列で合計 1 4 4個設けられた厚さ 0 . 1 mmの多孔板（2 1 ) 2枚を準備した。 これらの多孔板を重ね合わせて、 そのすベての孔に、 ポリ力 ーポネート中空繊維（3 1 ) (三菱エンジニアリングプラスチック社製 カ ポ ンブラック 1質量％添加） を 1本づつ、 通過させた。
X軸方向に各繊維に 0 . 1 Nの張力をかけた状態で 2枚の多孔板の位置を移 動させて、 中空繊維の一方の端部から 2 0 mmの位置と 1 0 0 mmの位置の 2 ケ所に固定した。 即ち、 2枚の多孔板の間隔を 8 0 mmとした。
次いで、 多孔板間の空間の周囲 3面を板状物 （4 1 ) で囲った。 このように して上部のみが開口状態にある容器を得た。
次に、 この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。 樹脂としては、 ポリウレタン樹脂接着剤 （日本ポリウレタン工業 （株） ニッポラン 4276、 コロ ネート 4403) の総重量に対し、 2.5質量％のカーボンブラックを添加したもの を使用した。 2 5 °Cで 1週間静置して樹脂を硬化させた。 次いで多孔板と板状 物を取り除き、 中空繊維束を得た。 · .
次に、 表 1に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合 性溶液を調製した。 表 1
組 成 質 量 比
(核酸プローブは濃度で示した。）
N , N-ジメチルァクリルアミ ド 3 . 4 2 %
N , N-メチレンビスァクリルアミド 0 . 3 8 %
2, 2， -ァゾ 'ビス [2- (2-イミダ Ύリン- 2-ィル) 0 . 1 %
フ。 Dハ。ン]シ、、ハイド口クロライド (VA-044)
水 - 9 6 . 1 %
核酸プローブ （配列番号 11〜30) 5 mol/ 1 次に、 各核酸プロ一ブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケ一夕一内に設置 した。 デシケ一夕一内を減圧状態にしたのち、 中空繊維束の繊維束が固定され ていない一方の端部をこの溶液中に浸 mした。 デシケ一夕一内に窒素ガスを封 入し、 中空繊維の中空部にキヤプチヤープローブを含むゲル前駆体重合性溶液 を導入した。 次いで、 容器内を 70°Cとし、 3時間かけて重合反応を行った。 このようにして核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持さ れた中空繊維束を得た。
次に得られた中空繊維束を、 ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交す る方向でスライスし、 厚さ 0 . 5 mmの薄片シート （DNAマイクロアレイ） を 5 0枚得た。なお、各中空部に存在している核酸プローブの濃度は、 50fmol/spot である。 得られた核酸マイクロアレイのデザインは、 図 2に示す。 図 2中の数 字は、 核酸プローブの配列番号を示し、 Bはプランクゲル （核酸プローブを含 まないゲル） を示す。
4 . ハイブリダィゼ一シヨン皮応、 洗浄及び検出操作
上記 3 . で作製した核酸マイクロアレイに、 上記 1 ·. で調製した各標識オリ ゴヌクレオチド溶液を接触させ、 恒温槽中で、 7 5 °Cで 3時間ハイブリダィゼ ーションを行つた。
ハイプリダイゼーシヨン後、 マイクロアレイを 1 X S S C中、 7 5 °Cで 2 0 分間洗浄を行い、 上記マイクロアレイを 1 x s S C中に浸潰し、 カバ一ガラス をかぶせた後に、 冷却 C C Dカメラ方式の核酸マイクロアレイ自動検出装置を 用いて、 標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。 測定結果を図 3に 示した。
さらに 0 . 7 X S S C中、 7 5 °Cで 2 0分間洗浄を行い、 上記マイクロアレ ィを 0 . 7 X S S C中に浸漬し、 カバ一ガラスをかぶせた後に、 冷却 C C D力 メラ方式の核酸マイクロアレイ自動検出装置で標識核酸試料分子の蛍光シグナ ル強度を測定した。 測定結果を図 4 示した。
本実施例においては、 核酸試料に含まれる配列番号 1〜 1 0の核酸は、 全て 配列番号 1 1〜2 0の核酸プローブと相補的であり、 配列番号 2 1〜3 0の核 酸プローブと部分相補的である。 よって、 配列番号 1 1〜2 0の核酸プローブ が固定されている区画の蛍光シグナルは、 配列番号 2 1〜3 0の核酸プローブ が固定されている区画のものよりも強いことが予測される。 より詳しくは、 配 列番号 1 1〜2 0の核酸プローブが固定されている区画で蛍光シグナルが検出 され、 配列番号 2 1〜3 0の核酸プローブが固定されている区画で蛍光シグナ ルが検出されないか、 あるいは、 配列番号 2 1〜3 0の核酸プローブが固定さ れている区画の蛍光シグナル強度が、 配列番号 1 1〜2 0の核酸プローブが固 定されている区画の蛍光シグナル強度よりも非常に小さいことが予測される。 実施例において、 1 X S S C中、 7 5 °Cで 2 0分間での洗浄では、 配列番号 2 1〜3 0の核酸プローブが固定されている区画の蛍光シグナル強度はやや強 かったが （図 3参照）、 さらに 0 . 7 X S S C中、 7 5 °Cで 2 0分間洗浄を行う ことにより、 配列番号 2 1〜3 0の核酸プローブが固定されている区画の蛍光 シグナル強度は大幅に低下した （図 4参照）。 また、 洗浄による配列番号 1 1〜 2 0の核酸プローブが固定されている区画の蛍光強度の変化は少なかった。 以上より、 繰り返し洗浄を行うことにより、 目的とする検出対象の蛍光強度 を低下させることなく、 クロスハイブリダィズした核酸の除去に有効であるこ とが実証された。 ぐ実施例 2 >
1 . 核酸試料の調製
下記の配列番号 3 1〜3 6に示す配列のオリゴヌクレオチドを合成した。 各 オリ ゴヌクレオチ ドは、 PlatinumBright™:Nucleic Acid Labeling Kit (KREATECH社製)により、 キットに付属プロトコ一ルに従い、 標識、 精製し、
2XSSC (塩化ナトリウム 33.3 mM、 クェン酸ナトリウム 33.3 mM、 pH 7.0) 及び 0.2 % SDS (ドデシル硫酸ナトリウム） を含む 10 fmol/ 1溶液となるよう に調製した。 '
配列番号 3 1 ：
tgaggtagta ggttgtgtgg tt
配列番号 3 2 ：
tgaggtagta ggttgtatgg tt
配列番号 3 3 ：
agaggtagta ggttgcatag t
配列番号 3 4 :
tgaggtagga ggttgtatag t
配列番号 3 5 ：
tgaggtagta gattgtatag t
配列番号 3 6 :
tgaggtagta gtttgtacag t
2 . 核酸プローブの調製
上述の標識オリゴヌクレオチド 6種 （配列番号 3 1〜3 6 ) と完全相補配列 である核酸プローブ 6種 （配列番号 3 7〜4 2 ) を合成した。 配列番号 3 7は 配列番号 3 1と完全に相補的な配列である。 配列番号 3 8〜4 2、 配列番号 3 2〜3 6に対応する配列の関係も同様である。 Tm値は以下の式 1に従い、 2 X SSCの塩濃度条件下における値を算出した。
[式 1 ] 81.5+16.6(log10[Na+])+0.4l(%[G+C])-600/n
なお、 各核酸プローブは、 非常に短い配列からなり、 且つ各々の相補性の高 いため、 同一の核酸試料に対して、 容易にクロスハイブリダィゼ一シヨンする 可能性がある。
配列番号 3 7 (Tm= 6 6°C) ：
aaccacacaa cctactacct ca
配列番号 3 8 (Tm= 64°C) ：
aaccatacaa cctactacct ca
配列番号 3 9 (Tm= 64°C) ：
actatgcaac ctactacctc t
配列番号 40 (Tm= 64°C) ：
actatacaac ctcctacctc a
配列番号 4 1 (Tm= 6 0°C) :
aactatacaa tctactacct ca
配列番号 42 (Tm= 6 2°C) :
actgtacaaa ctactacctc a '
3. 核酸マイクロアレイの製造
実施例 1の表 1に記載の核酸プローブを配列番号 3 7〜4 2の配列の核酸プ ローブに変更した以外は、実施例 1と同様の方法に従って、核酸マイクロアレイ を製造した。 . .
4. ハイブリダィゼーシヨン反応、 洗浄及び検出操作
上記 3. で作製した核酸マイクロアレイに、 上記 1. で調製した各標識オリ ゴヌクレオチド溶液を接触させ、 ハイブリダィゼ一シヨンを行った。 ハイプリ ダイゼ一シヨンの条件は、 5 0°Cで実施した。 5 0°Cに到達した後、 1 6時間、 保温し、 その後、 洗浄操作を行った。 洗浄は、 2 XS S C、 0. 2 %SD S溶 液中、 5 0°Cで 20分間浸漬し、 これを二回繰り返した後、 2 X S S C、 5 0 °C で 1 0分間浸漬した。 洗浄後、 上記マイクロアレイを 2 X S S C中に浸漬し、 カバーガラスをかぶせた後に、 冷却 C C Dカメラ方式の核酸マイクロアレイ自 動検出装置を用いて、 標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。 測定 結果を表 2に示した。 なお、 各核酸マイクロアレイにおいて、 完全に相補的な ハイプリッドからの蛍光検出強度の値を 1 0 0とし、 その他の値は相対値で示 した。 また、 検出限界以下は N Dとして示した。
[¾ 2 ]
Figure imgf000021_0001
次に 2 X S S Cの温度を 5 5 tに昇温し、 核酸マイクロアレイを 3 0分間浸 潰し、再度上述と同様にして蛍光シグナル強度を測定した。結果は表 3に示す。
3] 00
Figure imgf000022_0001
表 2と表 3を比較すると、 段階的洗浄を行うことで、 目的以外の区画でのハ イブリッド、 すなわちクロスハイブリダイズした核酸が除去されつつあること が分かる。
さらに、 温度を 6 0°C及び 6 5°Cとして操作を行った、 6 0°Cの結果は表 4 に、 6 5での結果は表 5に示した。
[¾4]
配列番号 配列番号 配列番号 配列番号 配列番号
32 33 34 35 36 配列番号
100 6 ND ND ND ND
37
配列番号
28 100 ND ND ND ND
38
配列番号
ND ND 100 ND ND ND
39
配列番号
ND ND ND 100 ND ND
40
配列番号
ND ND ND ND 100 ND
41
配列番号
ND ND ND ND ND 100 42 [¾5]
Figure imgf000023_0001
各プローブの Tm値を指標として洗浄条件を設定することにより、 互いに相 同性の高いプローブにおいても、 クロスハイブリダィゼーシヨンの影響をほぼ 除去して測定することができた。
本核酸マイクロアレイの場合、 配列番号 35番の標識オリゴヌクレオチドと 41番のプローブとのハイブリダィゼ一シヨン （Tm=60°C) の場合は、 5 5 °C洗浄において、 クロスハイブリダィズする他の核酸の影響がほとんど検出 されないことがわかる （表 3)。
また、 配列番号 33番の標識オリゴヌクレオチドと 39番のプローブ、 およ び 34番の標識オリゴヌクレオチドと 40番のプローブとのハイブリダィゼー シヨン （Tm== 64°Cおよび 64°C) の場合は、 60 °Cの洗浄条件に置いて、 他のクロスハイプリダイゼーショ の影響が検出されないことがわかる（表 4 )。
さらに、 配列番号 31番の標識オリゴヌクレオチドと 37.番のプローブとの ハイブリダィゼーシヨン （Τπι= 66°C). の場合は、 65°Cの洗浄条件におい て、他のクロスハ.ィブリダイゼーションの影響がなくなることがわかる（表 5 )。
つまり、 非常に高い相同性を持ったサンプルをそれぞれに検出する場合にお いても、 各プローブ -検体間の組み合わせの Tmに沿って段階的な洗浄を行う ことにより、 相同性の高い個々のプローブを、 クロスハイブリダィゼ一シヨン の影響をほとんど受けない状態で検出することが可能となった。
本発明の方法は、 核酸マイクロアレイのプローブ設計において、 ターゲット となる配列が非常に短く、 互いに相同性が高いターゲットが含まれるために、 プローブの特異性を発揮することが困難である場合 （例えば、 マイクロ RNA の検出） に、 特に活用することができる。 產業上の利用の可能性
本発明を利用することにより、 同一マイクロアレイ上に搭載できる遺伝子の 配列長や G C含量の著しい差異、 及びそれに基づいて推算される Tm値の各核 酸プロ一ブ間でのばらつきが認められる場合においても、 核酸プロ一ブの塩基 配列の設計に制限を受けることなく、 核酸を検出することが可能となった。 本 発明において、 核酸の検出過程における洗浄操作のみを段階的に行うことによ り、 Tm別の複数種マイクロアレイの使用や、 ハイブリダィゼ一シヨン条件の 異なる実験を複数回行うことなく、 簡便に配列特異的なハイブリダィゼーショ ン由来のシグナルを検出することが可能である。 すなわち、 本発明の方法は、 多段階での洗浄及び検出を繰り返すことにより、 段階的に配列特異的ハイプリ ダイゼーシヨンの厳密性を向上させ、 核酸プローブ設計における制約条件、 特 に Tm (核酸二本鎖の解離温度） や核酸プローブ配列長での制約条件の緩和を 可能とする。
また本発明は、 核酸プローブ配列設計において設計対象となる核酸試料が容 易に Tm値をそろえることが困難である用途、 例えば、 解析対象の遺伝子を数 百から数十種類まャ絞り込んだフォーカスドアレイにおける発現解析とそれに 基づく疾病等の診断及び miRNAなどの短い核酸の解析、 核酸のメチル化検出、 疾病関連遺伝子の多型解析とそれに基づく遺伝子診断、 病原菌やウィルスの夕 ィピング等に利用でき、 さらにこれらの応用手法におけるデータ信頼性の向上 が可能となる。 ' 配列表フリーテキス卜
配列番号 1〜 4 2 ：合成 D N A

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の工程を含む核酸検出方法；
( 1 ) 複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレイに、 核酸試料を含む溶液を接触させ、 前記プローブと、 前記核酸試料中の核酸 とをハイプリダイゼ一ション反応させる工程、 及び
( 2 ) 核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイブリッドを、 洗浄効果の弱 い条件から強い条件まで洗浄 件を変えながら複数回洗浄し、洗浄操作毎 に核酸ハイプリッドを検出する工程。
2 . 洗浄条件の変化が、 洗浄液の塩濃度の変化である、 請求項 1記載の方法。
3 . 洗浄条件の変化が、 洗浄液の温度の変化である、 請求項 1記載の方法。
4 .洗浄条件の変化が、洗浄液の塩濃度の変化および洗浄液の温度の変化である、 請求項 1記載の方法。
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