KR101794396B1

KR101794396B1 - 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 또는 프로브 세트 및 핵산 마이크로 어레이

Info

Publication number: KR101794396B1
Application number: KR1020147015443A
Authority: KR
Inventors: 겐지로 이꾸따; 아이 하라; 다쯔노부 후꾸시마
Original assignee: 미쯔비시 케미컬 주식회사
Priority date: 2012-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2017-11-06
Also published as: US10053732B2; KR20140091580A; EP2845910A4; EP2845910A1; JP6094481B2; WO2013165018A1; JPWO2013165018A1; JP2016192978A; US20150133328A1

Abstract

피부 또는 피부 세포가 어떤 상태이고, 그 피부 또는 피부 세포에 대한 외부 자극(특히 자외선)이, 당김(탄력)이나 주름 등의 피부 상태에 어떤 영향을 미치는가를 평가할 수 있는 프로브 또는 프로브 세트 및 그것을 탑재한 핵산 마이크로 어레이를 제공한다. 본 발명은 하기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 또는 그의 일부를 포함하는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 또는 프로브 세트에 관한 발명이다. (a) GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산; (b) 상기 (a)의 핵산에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 핵산에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있는 핵산.

Description

피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 또는 프로브 세트 및 핵산 마이크로 어레이{PROBE OR PROBE SET FOR EVALUATING INFLUENCE OF ULTRAVIOLET RAY ON SKIN, AND NUCLEIC ACID MICROARRAY}

본 발명은 주름이나 당김 등의 피부의 상태를 평가하는, 구체적으로는 피부에 대한 자외선의 영향을 평가할 수 있는 프로브 또는 프로브 세트 및 핵산 마이크로 어레이, 및 이들을 사용한 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하는 방법 등에 관한 것이다.

피부는, 인간을 포함한 동물의 신체의 최대이며 가장 눈에 띄는 기관이고, 주로 상피 및 진피로 구성되고, 한선, 지선 및 모낭과 같은 몇 가지의 부속 구조를 갖는다.

또한, 피부는 체내의 조직 중에서, 환경 스트레스, 위험 및 병원체에 가장 빈번히 노출되는 기관이다. 그 때문에 많은 기능을 갖고 있고, 예를 들면 외부 침습(예를 들면, 열, 화학 약품, 세균)에 대한 보호 장벽 기능, 열 조절 기능, 탈수 방지 기능, 또한 감각 기능을 갖는다. 따라서, 피부의 건강 유지 및 확립은, 동물의 건강에 있어서 중요하다.

지금까지, 피부의 상태를 평가하거나 또는 피부의 상태를 개선하는 성분을 평가하는 방법의 하나로서, 유전자 발현 레벨을 측정하여 피부의 노화 상태나 염증 상태를 평가하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1 및 2). 특히, 주름이나 노화의 상태에 대해서는, 피부에 자외선을 조사하고, 특정한 단백질 및 유전자의 발현 등을 평가하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 3 및 4).

일본 특허 공개 제2010-115131호 공보 일본 특허 공개 제2010-172240호 공보 일본 특허 공개 제2011-178747호 공보 일본 특허 공표 제2005-520483호 공보

그러나, 이들 평가 방법은, 각각이 단일의 증상 또는 상태를 계측할 수 있는 것에 지나지 않는 것이고, 특히 자외선에 의한 피부에의 영향을 유전자 발현 레벨에서 객관적으로 평가할 수 있는 방법은 아니었다.

따라서, 본 발명의 주목적은 피부 또는 피부 세포가 어떤 상태이고, 그 피부 또는 피부 세포에 대한 외부 자극(특히 자외선)이, 당김(탄력)이나 주름 등의 피부 상태에 어떠한 영향을 미칠지를 평가할 수 있는, 프로브 또는 프로브 세트 및 그것을 탑재한 핵산 마이크로 어레이를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, 피부의 구성에 관련하는 유전자를 중심으로 특정한 유전자를 선택하고, 당해 유전자를 구성하는 핵산(또는 그의 일부)을 프로브로서 사용함으로써, 상기 목적을 달성할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 하기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 또는 그의 일부를 포함하는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 또는 프로브 세트.

(a) GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(b) 상기 (a)의 핵산에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 핵산에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있는 핵산

상기 (1)의 프로브 세트에 있어서, (a)의 핵산으로서는, 예를 들면 하기 (i) 및 (ii)의 핵산을 포함하는 것을 들 수 있다.

(i) GBA, GLB1, CAT, OLFM1 및 ASAH1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(ii) MMP14, MMP17 및 COL18A1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산

또한 마찬가지로, (a)의 핵산으로서는, 예를 들면 GBA, GLB1, CAT, OLFM1 및 ASAH1의 각 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산; MMP14, MMP17 및 COL18A1의 각 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산; 및 MMP14, MMP17, COL18A1, GBA, GLB1, CAT, OLFM1 및 ASAH1의 각 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.

(2) 하기 (α), (β) 또는 (γ)의 핵산을 포함하는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 또는 프로브 세트.

(α) 서열 번호 27, 30, 58, 63, 70, 84, 85 및 112에 나타나는 염기 서열 중 적어도 1종의 염기 서열을 포함하는 핵산

(β) 상기 (α)의 핵산에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산

(γ) 상기 (α) 또는 (β)의 핵산의 염기 서열에 대하여 70％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 또한 피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있는 핵산

(δ) 상기 (α), (β) 또는 (γ)의 핵산의 염기 서열에 있어서 1 내지 수개의 염기가 부가, 결실 또는 치환된 염기 서열을 포함하고, 또한 피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있는 핵산

상기 (2)의 프로브 세트에 있어서, (α)의 핵산으로서는, 예를 들면 서열 번호 27, 30, 58, 63, 70, 84, 85 및 112에 나타나는 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.

(3) 하기 (i) 및/또는 (ii)의 핵산을 포함하는, 자외선의 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 세트.

(i) 서열 번호 1 내지 130에 나타나는 염기 서열을 포함하는 핵산

(ii) 서열 번호 131 내지 257에 나타나는 염기 서열을 포함하는 핵산

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 핵산 마이크로 어레이.

(5) 검사 대상에 자외선을 조사 후, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 프로브 또는 프로브 세트를 사용하여 유전자 발현량을 측정하는 공정을 포함하는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하는 방법.

(6) 검사 대상에 자외선을 조사 후, 상기 (4)의 핵산 마이크로 어레이를 사용하여 유전자 발현량을 측정하는 공정을 포함하는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하는 방법.

(7) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 프로브 또는 프로브 세트를 사용하여, 피부 질환 치료약 또는 화장품에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법.

(8) 상기 (4)의 핵산 마이크로 어레이를 사용하여, 피부 질환 치료약 또는 화장품에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법.

본 발명에 따르면, 외부 자극, 특히 자외선에 의한 피부에의 영향을, 유전자 발현 레벨에서 객관적으로 평가할 수 있는 프로브 또는 프로브 세트, 및 이것을 탑재한 핵산 마이크로 어레이를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 당해 프로브 또는 프로브 세트 및 핵산 마이크로 어레이를 사용한, 피검 대상의 피부에 대한 자외선의 영향의 평가 방법 및 피부 질환 치료약(경피 흡수제 등)이나 화장품의 유효 성분으로서 유용한 물질(화합물 등)의 효율적인 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 중공 섬유 다발(중공 섬유 배열체) 제조용의 배열 고정 지그를 나타내는 개략도이다.
도 2는(도 2a 내지 h)는 케라티노사이트에의 UVB(자외선 B파) 조사에 수반하는 유전자 발현량의 변화를 나타내는 도면이다. 도 2 중의 모든 그래프에 있어서, 종축은 형광 강도(Intensity), 횡축은 시간(h)을 나타내고, 또한 ◆(UV-)는 UVB 조사 없음, ■(UV+)는 UVB 조사 있음을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이 설명에 구속되는 일은 없고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 손상시키지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원 제2012-105085호 명세서(2012년 5월 2일 출원)의 전체를 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들면 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허 문헌은, 참조로서 본 명세서에 도입된다.

1. 본 발명의 개요

본 발명에 있어서, 외부 자극, 특히 자외선의 피부에의 영향을 평가하는 것이란, 피부의 당김(탄력)이나 주름 등의 피부 상태를, 유전자의 발현 유무 또는 발현량의 변화에 따라 판단 및 평가하는 것을 말한다. 여기서, 유전자의 발현이란, mRNA의 발현이다.

본 발명에서는, 피부의 당김이나 주름 등의 피부의 상태를 평가하기 위해서, 세라마이드, 콜라겐, 세레크틴, 엘라스틴 등을 코딩하는 유전자, 그것들의 합성 효소를 코드하는 유전자, 그것들의 분해 효소를 코딩하는 유전자, 염증에 관련하는 유전자를 선택하여, 프로브로서 사용할 수 있다. 본 명세서 등에서는, 이 유전자를 피부 구성 관련 유전자라고 한다. 특히, 자외선(UV)에 의한 주름, 노화, 당김 등의 피부 상태에의 영향을 평가하는 경우에는, 뒤에 상세하게 설명하는 피부 구성 관련 유전자 중, GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 선택하여, 당해 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산 등을 프로브로서 사용할 수 있다.

여기서, 피부 구성 관련 유전자로서는, 예를 들면 이하의 것을 들 수 있다.

<피부 구성 관련 유전자>

.

이 각 유전자의 염기 서열 정보 등은, NCBI(National Center for Biotechnology Information Search term Search database)로부터 취득할 수 있다. 각 유전자명의 표기로서는, NCBI의 오피셜 심볼을 대문자로 표기하고 있지만, 이에 의해 생물 종이 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 인간 이외에, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이 등의 포유류의 유전자를 사용할 수 있다.

2. 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브

프로브란, 일반적으로, 검체(피검 시료) 중의 표적으로 하는 유전자의 핵산(mRNA)을 혼성화에 의해 포착하고, 당해 표적 핵산을 검출하기 위해 사용되는 것을 말한다. 당해 프로브는, 통상 핵산 프로브인데, 본 발명에 있어서 프로브를 구성하는 「핵산」으로서는, 일반적으로 DNA, RNA, PNA 등을 사용할 수 있고, 특별히 제한은 되지 않지만, DNA가 바람직하다.

본 발명에 있어서, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브(또는 프로브 세트)로서는, 예를 들면 이하의 (a), (b) 및 (c)의 핵산을 포함하는 것을 들 수 있다.

(a) GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종(바람직하게는 복수종)의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산

상기 (a)의 핵산은, 전술한 각종 피부 구성 관련 유전자 중에서 선택된, 피부에 대한 자외선의 영향 평가에 유용한 유전자(GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1)로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자의 염기 서열을 포함하는 핵산이지만, 예를 들면 이하의 형태로 사용하는 것도 바람직하다.

예를 들면, 상기 (a)의 핵산이

[1] 하기 (i) 및 (ii)의 핵산을 포함하는(하기 (i) 및 (ii)의 핵산의 조합을 포함하는) 것:

(i) GBA, GLB1, CAT, OLFM1 및 ASAH1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산; 및

(ii) MMP14, MMP17 및 COL18A1로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산;

[2] GBA, GLB1, CAT, OLFM1 및 ASAH1의 각 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산인 것;

[3] MMP14, MMP17 및 COL18A1의 각 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산인 것;

[4] MMP14, MMP17, COL18A1, GBA, GLB1, CAT, OLFM1 및 ASAH1의 각 유전자를 구성하는 염기 서열을 포함하는 핵산인 것

등을 바람직하게 들 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 컨트롤이 되는 유전자의 염기 서열을 포함하는 핵산(또는 그의 일부)도, 상기 (a)의 핵산과 함께 사용할 수 있고, 마찬가지로, 후술하는 (b) 및 (c)의 핵산과 함께 사용할 수도 있다. 예를 들면, 포지티브 컨트롤이 되는 유전자로서는 ACTB, GAPDH, RPLP0 등의 유전자를 들 수 있다.

또한, 상기 (b)의 핵산도, 상기 (a)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어서의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 등에 사용할 수 있다. 상기 (b)의 핵산에 대해서는, 상기 (a)의 핵산의 상보쇄 염기 서열을 포함하는 것 이외에는, 상술한 (a)의 핵산에 관한 설명을 동일하게 적용할 수 있다.

또한, 상기 (c)의 핵산도, 상기 (a) 및 (b)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어서의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 등에 사용할 수 있다.

여기서, 상기 (c)의 핵산이 있어서, 「엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산」이란, 예를 들면 상기 (a) 또는 (b)의 핵산의 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의, 전부 또는 일부를 프로브로서, 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법 또는 서던 혼성화법 등을 사용함으로써 얻어지는 핵산을 말한다. 혼성화의 방법으로서는, 예를 들면 "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

또한, 「엄격한 조건」이란, 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 및 높은 엄격한 조건 중 어느 것일 수도 있다. 「낮은 엄격한 조건」은, 예를 들면 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 32℃의 조건을 들 수 있다. 또한, 「중간 엄격한 조건」은, 예를 들면 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 42℃의 조건을 들 수 있다. 「높은 엄격한 조건」은, 예를 들면 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 50℃의 조건을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 구체적으로는 「엄격한 조건」은, 염기 쇄 길이가 65 염기의 경우, 버퍼의 1가 양이온 농도가 97.5 내지 3200mM, 온도가 37 내지 80℃의 조건이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1가 양이온 농도가 97.5 내지 800mM, 온도가 50 내지 70℃의 조건이고, 더욱 바람직하게는, 버퍼의 1가 양이온 농도가 195mM, 온도가 65℃ 등의 조건이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이러한 「엄격한 조건」에 있어서는, 온도를 올릴수록, 높은 상동성을 갖는 핵산을 효율적으로 얻을 수 있다. 단, 혼성화의 엄격성에 영향을 미치는 요소로서는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간, 이온 강도, 염 농도 등 복수의 요소가 생각되고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 엄격성을 실현하는 것이 가능하다.

또한, 혼성화에 있어서, 시판되고 있는 킷을 사용하는 경우에는, 예를 들면 알크포스 다이렉트 라벨링 시약(Alkphos Direct Labelling Reagents)(아마샴 파머시아사 제조)를 사용할 수 있다. 이 경우에는, 킷에 첨부된 프로토콜에 따라, 표식한 프로브와의 인큐베이션을 밤새 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건하에서 0.1％(w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정 후, 혼성화한 핵산을 검출할 수 있다.

상기 이외에 혼성화 가능한 핵산으로서는, FASTA 및 BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트의 파라미터를 이용하여 계산했을 때에, 상기 (a)의 핵산의 염기 서열과, 70％ 이상, 71％ 이상, 72％ 이상, 73％ 이상, 74％ 이상, 75％ 이상, 76％ 이상, 77％ 이상, 78％ 이상, 79％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 99.1％ 이상, 99.2％ 이상, 99.3％ 이상, 99.4％ 이상, 99.5％ 이상, 99.6％ 이상, 99.7％ 이상, 99.8％ 이상 또는 99.9％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.

또한, 염기 서열의 상동성은 카린 및 아서에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, p.2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p.5873, 1993)을 사용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., vol. 215, p.403, 1990). BLASTN을 사용하여 염기 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예를 들면 score=100, word length=12로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 또한, 상기 (c)의 핵산에 있어서, 「피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있다」란, 상기 (a)에 있어서 열거한 피부 구성 관련 유전자(GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1)의 염기 서열이나 그의 상보쇄의 염기 서열 중 어느 하나를 혼성화에 의해 포착할 수 있는 것을 의미한다.

상기 (a), (b) 및 (c)의 핵산은, 당해 핵산의 전체 길이에 한정되지 않고, 그의 일부를 프로브로서 사용할 수도 있다. 당해 핵산의 일부란, 예를 들면 30 내지 5000 염기를 포함하는 핵산, 40 내지 1000 염기를 포함하는 핵산, 50 내지 500 염기를 포함하는 핵산, 나아가 60 염기 내지 200 염기를 포함하는 핵산 등을 들 수 있지만, 염기 길이에 대해서는 특별히 제한은 되지 않다.

또한, 본 발명에 있어서는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브(또는 프로브 세트)로서는, 예를 들면 이하의 (α), (β), (γ) 및 (δ)의 핵산을 포함하는 것도 들 수 있다.

상기 (α)의 핵산은, 서열 번호 27, 30, 58, 63, 70, 84, 85 및 112에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산이고, 당해 서열 번호에 나타나는 염기 서열은 전술한 (a)의 핵산에 있어서의 피부 구성 관련 유전자(GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1)의 염기 서열의 일부에 상당하는 염기 서열이다. 따라서, 상기 (α)의 핵산도, 본 발명에 있어서의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 등을 위한 프로브(또는 프로브 세트)로서 유효하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 (α)의 핵산으로서는, 예를 들면 서열 번호 27, 30, 58, 63, 70, 84, 85 및 112에 나타나는 각 염기 서열을 포함하는 핵산을 모두 포함하는 형태도 바람직하게 들 수 있다.

또한, 서열 표 및 하기 표 1 내지 4에 열거한, 서열 번호 1 내지 273에 나타나는 염기 서열 중, 서열 번호 1 내지 257에 나타나는 염기 서열은, 피부 구성 관련 유전자(인간 또는 마우스 유래)의 염기 서열의 일부에 상당하는 것이고, 서열 번호 258 내지 273에 나타나는 염기 서열은, 본 발명에 있어서의 평가 등을 위한 컨트롤로서 사용할 수 있는 유전자(인간 또는 마우스 유래)의 염기 서열의 일부에 상당하는 것이다. 또한, 서열 번호 258 내지 271에 나타나는 염기 서열은, 포지티브 컨트롤이 되는 것이고, 서열 번호 272 및 273에 나타나는 염기 서열은, 네거티브 컨트롤이 되는 것이다. 여기서, 상기 (α)의 핵산에 있어서의, 서열 번호 27, 30, 58, 63, 70, 84, 85 및 112에 나타나는 염기 서열은 각각 순서대로, MMP14, MMP17, COL18A1, CAT, GLB1, ASAH1, GBA 및 OLFM1의 유전자 염기 서열 일부에 상당하는 것이다.

본 발명에 있어서는, 상기 컨트롤로서의 염기 서열을 포함하는 핵산도, 상기 (α)의 핵산과 함께 사용할 수 있고, 마찬가지로 후술하는 (β), (γ) 및 (δ)의 핵산과 함께 사용할 수도 있다.

또한, 상기 (β)의 핵산도, 상기 (α)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어서의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 등에 사용할 수 있다. 상기 (β)의 핵산에 대해서는, 상기 (α)의 핵산의 상보쇄 염기 서열을 포함하는 것 이외에는, 상술한 (α)의 핵산에 관한 설명을 동일하게 적용할 수 있다.

또한, 상기 (γ)의 핵산도, 상기 (α) 및 (β)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어서의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 등에 사용할 수 있다.

상기 (γ)의 핵산은 상기 (α) 또는 (β)의 핵산의 염기 서열에 대하여, 70％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산이지만, 추가로 71％ 이상, 72％ 이상, 73％ 이상, 74％ 이상, 75％ 이상, 76％ 이상, 77％ 이상, 78％ 이상, 79％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 99.1％ 이상, 99.2％ 이상, 99.3％ 이상, 99.4％ 이상, 99.5％ 이상, 99.6％ 이상, 99.7％ 이상, 99.8％ 이상 또는 99.9％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산인 것이 바람직하다. 또한, 염기 서열의 상동성에 관한 설명에 대해서는, 전술한 (b)의 핵산에 있어서의 설명을 동일하게 적용할 수 있다.

또한, 상기 (γ)의 핵산에 있어서, 「피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있다」란, 전술한 (a)에 있어서 열거한 피부 구성 관련 유전자(GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1)의 염기 서열이나 그의 상보쇄의 염기 서열 중 어느 하나를 혼성화에 의해 포착할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 상기 (δ)의 핵산도, 상기 (α), (β) 및 (γ)의 핵산과 마찬가지로, 본 발명에 있어서의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 등에 사용할 수 있다.

상기 (δ)의 핵산은, 상기 (α), (β) 및 (γ)의 핵산의 염기 서열에 있어서 1 내지 수개(예를 들면, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개, 또는 1 내지 2개)의 염기가 부가, 결실 또는 치환된 염기 서열이다. 예를 들면, 상기 (α), (β) 및 (γ)의 핵산의 염기 서열 말단에, 링커가 되는 염기(폴리T 등)를 수식한 것이나, 당해 염기 서열의 일부에 다른 염기를 삽입하거나, 당해 염기 서열의 일부 염기를 결실시키거나, 당해 염기 서열의 일부 염기를 다른 염기로 치환한 것 등을 들 수 있다.

이와 같이, 원하는 염기를 부가, 결실 또는 치환한 변이 서열, 특히 변이 치환형의 핵산에 대해서는, 예를 들면 상기 「Moleculer cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.」나 「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)」등에 기재된 부위 특이적 변위 유발법에 준하여 제조할 수 있다. 구체적으로는, 쿤켈(Kunkel)법이나 갭드 듀플렉스(Gapped duplex)법 등의 공지 방법에 의해, 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트를 사용하여 제조할 수 있고, 당해 킷으로서는, 예를 들면 퀵체인지(QuickChange)^TM 부위 지정 돌연변이유발 키트(Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라타진사 제조), 진테일러(GeneTailor)^TM 부위 지정 돌연변이유발 시스템(Site-Directed Mutagenesis System)(인비트로젠사 제조), 다카라 부위 지정 돌연변이유발 시스템(TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System)(프라임 스타(Prime STAR)(등록 상표) 돌연변이유발 기초 키트(Mutagenesis Basal kit), 뮤탄(Mutan)(등록 상표)-수퍼 익스프레스(Super Express) Km 등: 다카라 바이오사 제조) 등을 바람직하게 들 수 있다.

또한, 상기 (δ)의 핵산에 있어서, 「피부 구성 관련 유전자를 검출할 수 있다」란, 상기 (γ)의 핵산에 관한 설명을 동일하게 적용할 수 있다.

상기 (α), (β), (γ) 및 (δ)의 핵산은, 전술한 (a), (b) 및 (c)의 핵산과 마찬가지로, 당해 핵산의 전체 길이에 한정되지 않고, 그의 일부를 프로브로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 피부에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 세트로서는, 예를 들면 하기 (i) 및/또는 (ii)의 핵산을 포함하는 것도 사용할 수 있다.

여기서, 상기 (i)의 핵산은, 인간 유래의 피부 구성 관련 유전자의 염기 서열을 포함하는 핵산의 일부에 상당하는 것이고, 상기 (ii)의 핵산은 마우스 유래의 피부 구성 관련 유전자의 염기 서열을 포함하는 핵산의 일부에 상당하는 것이다.

본 명세서에 있어서 기재한 각종 핵산의 구입 방법은, 특별히 한정은 되지 않고, 공지된 유전자 공학적 방법 또는 공지된 합성 방법에 의해 취득하는 것이 가능하고, 예를 들면 시판되는 DNA 합성기를 사용하는 등 하여 얻을 수 있다.

또한, 프로브로서 사용할 수 있는 각종 핵산은 적절하게 수식된 것일 수도 있고, 예를 들면 말단 비닐화(아크릴로일화, 메타크릴로일화) 또는 말단 아미노화가 이루어진 것이나, 링커가 되는 염기(폴리T 등)로 수식된 것 등을 들 수 있다. 또한, 각종 핵산의 염기 서열 일부에 다른 염기를 삽입하거나, 당해 염기 서열의 일부 염기를 결실시키거나, 또는 별도의 염기로 치환하거나, 또는 염기 이외의 물질로 치환하여 사용할 수도 있다. 여기서, 염기 이외의 물질로서는, 예를 들면 색소(형광 색소, 인터칼레이터), 소광기, 염기 가교제를 들 수 있다.

3. 핵산 마이크로 어레이

핵산 마이크로 어레이란, 담체 상에 다수의 핵산 프로브를 고밀도로 각각 독립적으로 고정화한 것이다. 핵산 마이크로 어레이는, 복수의 핵산 염기 서열에 관한 발현량이나, 특정한 핵산 염기 서열의 서열 자체를 해석하기 위하여 이용되는 시스템이다.

본 발명의 핵산 마이크로 어레이는, 상술한 본 발명의 프로브가 탑재된 것이다. 본 발명의 핵산 마이크로 어레이는 지지체 상에, 본 발명의 프로브가 고정된 것이라면, 한정은 되지 않는다. 예를 들면, 전술한 피부 구성 관련 유전자에서 유래되는 각각의 mRNA와 혼성화할 수 있는 프로브를 각각 지지체에 고정해 둠으로써, 복수의 피부 구성 관련 유전자의 발현 검출이나 정량을 동시에 행할 수 있다.

핵산 마이크로 어레이에 대해서, 그의 지지체의 형태는 특별히 한정되지 않고, 평판, 막대 형상, 비즈 등의 어느 형태도 사용할 수 있다. 지지체로서, 평판을 사용하는 경우에는, 그 평판 상에 소정의 간격을 갖고, 소정의 프로브를 종류마다 고정할 수 있다(스포팅법 등; Science 270, 467-470(1995) 등 참조). 또한, 평판 상의 특정한 위치에서, 소정의 프로브를 종류마다 차차 합성해 갈 수도 있다(포토리소그래피법 등; Science 251, 767-773(1991) 등 참조).

그 밖의 바람직한 지지체의 형태로서는, 중공 섬유를 사용하는 것을 들 수 있다. 지지체로서 중공 섬유를 사용하는 경우에는, 프로브를 종류마다 각 중공 섬유에 고정하고, 모든 중공 섬유를 집속시켜 고정한 후, 섬유의 길이 방향으로 절단을 반복함으로써 얻어지는 핵산 마이크로 어레이를 바람직하게 예시할 수 있다. 이 핵산 마이크로 어레이는, 관통 구멍 기판에 프로브를 고정화한 타입의 것으로 설명할 수 있고, 소위 「관통 구멍형 마이크로 어레이」라고도 말해진다(특허 제3510882호 공보 등, 본원 도 1을 참조).

지지체에의 프로브의 고정화 방법은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 결합 양식일 수도 있다. 또한, 지지체에 직접 고정화하는 것으로 한정은 되지 않고, 예를 들면 미리 지지체를 폴리리진 등의 중합체로 코팅 처리하고, 처리 후의 지지체에 프로브를 고정할 수도 있다. 또한, 지지체로서 중공 섬유 등의 관상체를 사용하는 경우에는, 관상체에 겔상물을 유지시켜, 그 겔상물에 프로브를 고정화할 수도 있다.

이하, 중공 섬유에 의한 관통 구멍형 핵산 마이크로 어레이에 대해서, 상세하게 설명한다. 이 마이크로 어레이는, 예를 들면 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 거쳐서 제작할 수 있다.

(i) 복수개의 중공 섬유를, 중공 섬유의 길이 방향이 동일 방향이 되도록 3차원으로 배열하여 배열체를 제조하는 공정

(ii) 상기 배열체를 포매하고, 블록체를 제조하는 공정

(iii) 프로브를 포함하는 겔 전구체 중합성 용액을 상기 블록체의 각 중공 섬유의 중공부에 도입하여 중합 반응을 행하고, 프로브를 포함하는 겔상물을 중공부에 유지시키는 공정

(iv) 중공 섬유의 길이 방향과 교차하는 방향으로 절단하여, 블록체를 박편화하는 공정 중공 섬유에 사용되는 재료로서는, 한정은 되지 않지만, 예를 들면 일본 특허 공개 제2004-163211호 공보 등에 기재된 재료를 바람직하게 들 수 있다.

중공 섬유는 그의 길이 방향의 길이가 동일해지도록 3차원으로 배열된다(공정 (i)). 배열 방법으로서는, 예를 들면 점착 시트 등의 시트 형상물에 복수개의 중공 섬유를 소정의 간격을 갖고 평행하게 배치하고, 시트 형상으로 한 후, 이 시트를 나선 형상으로 권취하는 방법(일본 특허 공개 평 11-108928호 공보를 참조)이나, 복수의 구멍이 소정의 간격을 갖고 설치된 다공판 2매를 구멍부가 일치하도록 중첩시켜, 그들의 구멍부에 중공 섬유를 통과시키고, 그 후 2매의 다공판의 간격을 개방하여 임시 고정하고, 2매의 다공판 사이에 있어서의 중공 섬유의 주변에 경화성 수지 원료를 충만시켜 경화시키는 방법(일본 특허 공개 제2001-133453호 공보를 참조) 등을 들 수 있다.

제조된 배열체는 그의 배열이 흐트러지지 않도록 포매된다(공정 (ii)). 포매의 방법으로서는, 폴리우레탄 수지 및 에폭시 수지 등을 섬유 사이의 간극에 유입하는 방법 이외에, 섬유끼리를 열 융착에 의해 접착하는 방법 등을 바람직하게 들 수 있다.

포매된 배열체에는, 각 중공 섬유의 중공부에, 프로브를 포함하는 겔 전구체 중합성 용액(겔 형성 용액)을 충전하고, 중공부 내에서 중합 반응을 행한다(공정 (iii)). 이에 의해, 각 중공 섬유의 중공부에, 프로브가 고정된 겔 상태물을 유지시킬 수 있다.

겔 전구체 중합성 용액이란, 겔 형성 중합성 단량체 등의 반응성 물질을 함유하는 용액이며, 해당 단량체 등을 중합, 가교시킴으로써 해당 용액이 겔상물이 되는 것이 가능한 용액을 말한다. 그러한 단량체로서는, 예를 들면 아크릴아미드, 디메틸아크릴아미드, 비닐피롤리돈, 메틸렌비스아크릴아미드 등을 들 수 있다. 이 경우 용액에는 중합 개시제 등이 포함되어 있을 수도 있다. 중공 섬유 내에 프로브를 고정한 후, 중공 섬유의 길이 방향과 교차하는 방향(바람직하게는 직교하는 방향)으로, 블록체를 절단하여 박편화한다(공정(iv)). 이와 같이 하여 얻어진 박편은, 핵산 마이크로 어레이로서 사용할 수 있다. 당해 어레이의 두께는 0.01mm 내지 1mm 정도인 것이 바람직하다. 블록체의 절단은, 예를 들면 마이크로톰 및 레이저 등에 의해 행할 수 있다. 당해 관통 구멍형 마이크로 어레이로서는, 예를 들면 미쯔비시 레이온사 제조의 핵산 마이크로 어레이(게노팔(Genopal)^TM) 등을 바람직하게 들 수 있다.

4. 피부의 상태 평가

본 발명에 따르면, 전술한 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트 또는 핵산 마이크로 어레이를 사용하여 피부 구성 관련 유전자의 발현량을 측정함으로써, 검사 대상(피검 대상)의 피부에 대한 외부 자극, 특히 자외선에 의한 당김이나 주름 등의 피부의 상태에의 영향을 포괄적으로 평가할 수 있다.

피부 구성 관련 유전자의 발현량의 측정은, 예를 들면 외부 자극을, 검사 대상으로서의 동물의 피부 또는 그의 배양 세포에 첨가한 후(특히, 자외선을 동물의 피부 또는 그의 배양 세포에 조사한 후), 당해 피부 또는 배양 세포로부터 mRNA를 추출함으로써 행할 수 있다. 당해 mRNA는 검사 대상 중에 포함되어 있는 것을 그대로 사용할 수도 있고, 또한 당해 mRNA로부터 역전사(또는 역전사 및 증폭)하여 얻은 cDNA나, 당해 cDNA를 전사 증폭하여 얻은 aRNA(amplified RNA)를 사용할 수도 있다. 또한, 당해 증폭 산물에는, 비오틴(biotin)을 시작으로 하는 형광 표식제, 인터컬레이터, 금속 입자, 발광 반응하는 효소 등에 의해 표식해 두는 것이 바람직하다.

피부 또는 그의 배양 세포의 유래 동물은 한정되지 않지만, 예를 들면 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이 등을 들 수 있다. 배양 세포의 종류는, 피부에 관련되는 세포라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 정상 표피 세포, 정상 멜라노사이트, 정상 케라티노사이트 세포, 상피 섬유아세포, 멜라노마 세포 등을 들 수 있다.

혼성화 반응은, 상술한 바와 같이 하여 얻어진 mRNA, cDNA, aRNA가 마이크로 어레이에 탑재된 프로브와 엄격한 조건하에서 혼성화 할 수 있도록, 반응 조건(완충액의 종류, pH, 온도 등)을 적절히 설정하여 행할 수 있다. 또한, 여기에서 말하는 「엄격한 조건」에 대해서는, 전술한 바와 같다.

세정 후에는 프로브에 결합한 mRNA, cDNA, aRNA의 표식을 검출할 수 있는 장치에 의해, 프로브마다 검출 강도를 측정한다. 표식제 등으로부터 얻어진 검출 결과(시그널 강도)에 기초하여, 공지된 처리 방법에 의해, 타깃이 되는 각종 유전자의 발현량의 유의성을 평가할 수 있다.

5. 스크리닝 방법

본 발명에 있어서는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트 또는 핵산 마이크로 어레이를 사용하여, 피부 질환 치료약 또는 화장품에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

당해 스크리닝은, 구체적으로는 예를 들면 UVB와 같은 외부 자극을 동물의 피부 또는 그의 배양 세포에 가한 후, 후보 물질을 동물 또는 배양 세포에 접촉시켜, 피부 구성 관련 유전자의 발현량을 측정하고, 대조(후보 물질을 접촉시키지 않는 경우 등)의 유전자 발현량과 비교 해석함으로써 스크리닝을 할 수 있다. 또는, 경우에 따라서는, 외부 자극 전에 후보 물질을 접촉시키는 경우도 있다. 여기에서 말하는 접촉이란, 동물이라면, 후보 물질을 경피 투여(피부에 도포, 부착 등), 경구 투여, 복강 투여, 피하 투여, 정맥 투여하는 것 등을 가리키고, 배양 세포라면, 배양액 중에 후보 물질을 첨가하는 것을 가리킨다.

대조로서는, 후보 물질을 접촉시키지 않고 외부 자극을 가한 경우, 외부 자극을 가하지 않고 후보 물질을 접촉시킨 경우, 또는 외부 자극을 가하지 않고 후보 물질의 접촉도 시키지 않은 경우 등을 들 수 있다.

또한, 사용할 수 있는 후보 물질로서는, 임의의 각종 화합물을 들 수 있고, 천연 유래의 것이거나 인공적으로 제작한 것일 수도 있고, 한정은 되지 않는다.

대조가 되는 유전자의 발현량 데이터는, 동일한 피검 대상으로부터 취득한 것이거나 복수의 다른 동일 종의 피검 대상으로부터 취득한 것일 수도 있고, 또한 데이터 베이스에 미리 축적된 것일 수도 있다. 또한, 측정된 피검 대상 유래의 발현량 데이터를 모집단(피검 대상)의 값에 도입하여 발현량 레벨을 다시 데이터 처리하고(평균값화 등), 모집단의 예수를 증가시킬 수도 있다. 예수를 증가시킴으로써, 발현량의 임계치의 정밀도를 높이고, 경우에 따라 임계치를 적절히 수정함으로써, 스크리닝의 정밀도를 높일 수 있다.

유전자 발현량의 비교 해석으로서는, 후보 물질의 접촉에 의해, 유전자 발현량이 외부 자극을 부여하지 않는 경우의 유전자 발현량에 가까워지는지 여부로 평가할 수 있다. 그의 평가의 방법으로서는, 유전자 발현량의 경시 변화나 조건에 의한 변화를 패턴으로서 평가할 수 있고, 구체적으로는, 다변량 해석을 사용하여 행할 수 있다. 다변량 해석으로서는, 예를 들면 주성분 분석, 인자 분석, 판별 분석, 수량화 이론(I류, II류, III류, IV류), 클러스터 분석, 다차원 척도 구성법(MDS), 중회귀 분석, 컨조인트 분석, 마하라노비스·다구치 시스템(MT법)을 사용한 패턴의 비교 및 효과의 예측 등을 들 수 있다.

동물이나 배양 세포에 접촉시키는 후보 물질의 농도나 양은, 후보 물질이나 피검 대상의 종류 등에 따라서 적절히 설정 및 선택할 수 있지만, 핵산 추출에 장해가 되는 영향을 미치지 않도록, 후보 물질에 의한 독성이 피검 대상에 발생하지 않는 농도나 양으로 행하는 것이 바람직하다. 독성이 발생하지 않는다란, 동물의 경우에는, 적어도 사망하지 않는, 또는 부분적인 괴사가 관측되지 않는 것, 배양 세포에서는, 적어도 세포 생존율이 90％ 이상인 것을 들 수 있다.

핵산의 추출 방법, 추출한 핵산의 처리 방법은 한정되지 않고, 공지의 방법으로 행할 수 있지만, 사용하는 마이크로 어레이의 종류에 적합한 방법으로 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 전체(Total) RNA를 단리하는 경우에는 시판품의 시약 키트인 알엔이지 미니 키트(RNeasy mini kit)(퀴아젠(QIAGEN)) 등을 사용할 수 있고, 부속의 프로토콜에 따라서 추출을 행할 수 있다. 또한, 경우에 따라 RNA를 증폭하는 경우에는, 시판품에서의 키트인 메시지(Message) AmpII-비오틴 인핸스드(Biotin Enhanced) 키트(어플라이드 바이오 시스템즈사 제조)을 사용하여, 부속의 프로토콜을 따라서 증폭한 aRNA를 제조하여, 측정할 수 있다.

측정 결과에서 평가에 사용하는 데이터는, 판정값 이상의 값만을 사용한다. 판정값은 네거티브 컨트롤의 평균값 X를 사용할 수 있고, 나아가 X에 표준 편차 σ를 더한 값, 또한 X+2σ, 또한 X+3σ가 바람직하다. 또한, 네거티브 컨트롤이란, 피검 대상으로부터 검출되는 것이 없는 유전자이고, 예를 들면 피검 대상과 다른 타종 생물의 유전자 등이다.

얻어진 데이터의 각 샘플간의 오차를 하우스키핑 유전자(gapdh, actin, arbp 등)의 값으로 보정하고, 보정한 데이터를 사용하여 mRNA량의 변동을 판정한다(mRNA량의 변동은 검정에 의해 통계적으로 판정한다. 각 피검 대상으로부터 샘플 수(n)를 3 이상 취득하고, t 검정을 행한다. P값이 0.05 이하인 경우에, 또한 0.01 이하인 경우에 유의하게 변동했다고 판정함). 당해 판정의 결과, 유의하게 변동하였다고 판정되지 않은 경우에 사용한 후보 물질이, 전술한 바와 같이, 유전자 발현량이 외부 자극을 부여하지 않은 경우의 유전자 발현량에 접근할 수 있었던 후보 물질로 판단할 수 있고, 피부 질환 치료약 또는 화장품에 유용한 화합물로서 스크리닝된 것으로 판단할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 어떠한 한정이 되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) 중공 섬유 다발의 제조

도 1에 나타내는 배열 고정 기구를 이용하여 중공 섬유 다발을 제조하였다. 또한, 도면 중의 x, y, z는 직교의 3차원 축이고, x축은 섬유의 길이 방향과 일치한다.

먼저, 직경 0.32mm의 구멍이, 구멍의 중심 사이 거리를 0.12mm로서, 종횡 각 16열로 합계 256개 설치된 두께 0.1mm의 다공판 2장을 준비하였다. 이 다공판을 중첩하여, 그의 모든 구멍에, 외경 280㎛, 내경 180㎛, 길이 150mm의 폴리카르보네이트 중공 섬유를 1개씩 통과시켰다.

X축 방향으로 각 섬유에 0.1N의 장력을 가한 상태에서 2매의 다공판의 위치를 이동시켜, 중공 섬유의 한쪽의 단부로부터 20mm의 위치와 100mm의 위치에 2군데에 고정하였다. 즉, 2매의 다공판의 간격을 80mm로 하였다. 계속해서, 다공판 사이의 공간의 주위 3면을 판상물로 둘러쌌다. 이와 같이 하여 상부만이 개구 상태에 있는 용기를 얻었다.

이어서, 이 용기의 상부부터 용기 내에 수지 원료를 유입하였다. 수지로서는, 폴리우레탄 수지 접착제(닛본 폴리우레탄 고교(주) 닛포란 4276, 코로네이트 4403)의 총 질량에 대하여 2.5질량％의 카본 블랙을 첨가한 것을 사용하였다. 25℃에서 1주일 정치하여 수지를 경화시켰다. 계속하여 다공판과 판상물을 제거하여, 중공 섬유 다발을 얻었다. 얻어진 중공 섬유 다발을 데시케이터 중에 넣어 내부를 질소 치환한 후, 16시간 정치하였다.

(2) 중공사 내에의 프로브의 고정화와 슬라이스

서열 표로부터 선택한 유전자의 프로브(BEX사로부터 비닐화 핵산을 구입)를 포함하는 조성의 겔 중합 전구체 용액(표 5: 단위는 mL)을 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 36μL 분주하였다. 해당 웰 플레이트를 데시게이터 내에 설치하고, 단부로부터 각 웰에 분주한 겔 전구체 용액을 흡인하고, 중공 섬유의 중공부에 도입하였다.

계속해서, 상기한 중공 섬유 다발을 상기 데시케이터 내에 설치하고, 데시케이터 내를 질소 분위기하에서, 55℃까지 승온하여, 55℃에서 3시간, 중합 반응을 실시하였다.

중합 반응 종료 후, 마이크로톰을 사용하여, 중공 섬유 다발을 중공 섬유의 길이 방향으로 직각 방향으로 두께 250㎛로 박편화하였다. 이와 같이 하여, 228개의 캡처 프로브를 포함하는 겔 스폿을 탑재한 두께 250㎛의 핵산 마이크로 어레이를 300장 제작하였다.

(3) 제작한 핵산 마이크로 어레이를 사용한 샘플 측정

피브로사이트(RIKEN BRC CELL BANK)을 96웰 플레이트에 2.0×10⁴세포/웰이 되도록 파종하고, 10％ FBS 함유 DMEM 배지(시그마 알드리치)에서 24시간 배양하였다. UVB(자외선 B파) 조사 전을 0시간으로 하고, 한쪽에는 배지를 제거하고 PBS를 첨가하여 UVB(30mJ/㎠)를 조사하였다. UVB 조사 후, PBS를 제거하고, 다시 배지를 첨가하여 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72시간 배양하였다.

각 배양 시간의 세포를 PBS(-)로 세정하고, 핵산 마이크로 어레이에 의한 유전자 발현 해석을 행하였다. 핵산 마이크로 어레이에 의한 유전자 발현 해석을 위한 샘플 제조는 알엔이지 미니 키트(퀴아젠사 제조)의 프로토콜 대로 행하였다.

세포를 PBS(-)에서 세정 후, 트립신 처리로 회수하고, 1000rpm으로 침전시켜, 상청을 제거 후에 PBS(-) 175μL를 첨가하였다. 세포 샘플 용액 175μL에 키트에 부속의 RLT 용액 175μL를 첨가하고, 1mL 시린지로 5회 출납하여, 세포를 파쇄하였다. 파쇠액에 70％ 에탄올을 첨가하고, 피펫팅 5회 행한 후, 그 용액을 첨부의 칼럼에 첨가하여 원심하고(13000rpm 1분), 계속하여 부속의 RW 1700μL, RPE 500μL로 세정하고(각 13000rpm, 1분), 알엔아제 무함유수(RNase free Water) 30μL로 용출하여 RNA의 정제를 행하였다.

이어서, 메시지 Amp II-비오틴 인핸스드 키트(어플라이드 바이오 시스템즈사 제조)을 사용하여, 첨부의 프로토콜을 따라서 전체 RNA 1mg로부터 aRNA의 제조를 행하였다. aRNA 5μg을 플라스틱 튜브에 넣고, 메시지 AmpII-비오틴 인핸스드 키트(어플라이드 바이오 시스템즈사 제조) 부속의 5x 어레이 단편화 버퍼(Array Fragmentation Buffe)를 4μL 첨가하고, 20μL로 희석하여 잘 혼합한 후, 94℃에서 7.5분간 가열하여 aRNA의 단편화를 행하였다. 단편화 후의 용액 20μL에, 18μL의 1M 트리스(Tris)-HCl 용액(인비트로젠사 제조), 18μL의 1M NaCl 용액(나카라이테스크사 제조) 및 15μL의 0.5％ 트윈(Tween) 20 용액을 각각 혼합하고, 뉴클레아제 무함유수(Nuclease-free water)로 150μL로 희석하여, 검체액을 제조하였다.

제조한 검체액에, 핵산 마이크로 어레이(미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 제조 핵산 마이크로 어레이(게노팔^TM))를 침지하고, 65℃에서 16시간 혼성화 반응을 행하였다. 당해 어레이로부터 혼성화에 사용한 검체액을 제거한 후, 당해 어레이를 65℃의 0.12M TNT 용액(0.12M 트리스-HCl, 0.12M NaCl, 0.5％, 트윈 20 용액) 중에 침지하고(20분간×2회), 계속해서, 65℃로 따뜻하게 한 0.12M TN 용액(0.12M 트리스-HCl, 0.12M NaCl)에 10분간 침지하여 세정하였다. 그 후, 핵산 마이크로 어레이의 시그널을 검출하였다.

핵산 마이크로 어레이에 있어서의 시그널의 검출은, 핵산 마이크로 어레이 검출 장치(요꼬가와 덴끼 제조: MB-M3A, 레이저 파장: 633nm)를 사용하여, Cy5의 형광 강도를 측정하였다(노광 시간: 0.1초, 1초, 4초, 40초). 또한, 결과는 백그라운드를 감산 후, β-액틴(Actin), Arbp, Gapdh의 값을 사용하여 보정하고, 그의 시그널 값의 경시 반가를 나타냈다.

그 결과를 도 2(도 2a 내지 h)에 나타내었다. 도 2의 결과로부터, 네거티브 컨트롤과 비교하여, 38시간 후 이후에서 UVB 조사의 조건 차이로 발현 차가 유의하게 변동하고 있는 유전자로서, GBA, GLB1, CAT, OLFM1, ASAH1, MMP14, MMP17 및 COL18A1(각각 순서대로, 도 2f: No.85, 도 2e: No.70, 도 2d: No.63, 도 2g: No.112, 도 2e: No.84, 도 2b: No.27, 도 2b: No.30 및 도 2d: No.58의 각 그래프를 참조)을 들 수 있다. 이 유전자는 UVB 조사의 영향을 반영하고 있다고 시사되고, 이 유전자를 사용하여 피부에의 영향을 평가할 수 있다.

이 결과로부터, 당김, 주름, 감촉과 같은 피부 구성에 영향을 주는 조건을 정량적으로 평가할 수 있는 것으로 나타났다.

<산업상 이용가능성>

본 발명에 따르면, 외부 자극, 특히 자외선에 의한 피부에의 영향을, 유전자 발현 레벨에서 객관적으로 평가할 수 있는 프로브 또는 프로브 세트, 및 이것을 탑재한 핵산 마이크로 어레이를 제공할 수 있다. 당해 프로브 또는 프로브 세트 및 핵산 마이크로 어레이는, 피검 대상의 피부에 대한 자외선의 영향 평가 방법 및 피부 질환 치료약(경피 흡수제 등)이나 화장품의 유효 성분으로서 유용한 물질(화합물 등)의 효율적인 스크리닝 방법에 사용할 수 있는 점에서, 극히 유용한 것이다.

1 배열 고정 기구
11 구멍부
21 다공판
31 중공 섬유
41 판상물

SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., LTD. <120> A probe or a probe set, and a nucleic acid microarray for evaluating an influence of ultraviolet rays on a skin <130> PCT13-0024 <150> JP 2012-105085 <151> 2012-05-02 <160> 273 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgccgtctgg cgagccctta gccttgctgt agagacttcc gtcacccttg gtagagttta 60 ttttt 65 <210> 2 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgggggctct ctccaccctt ctcagagttc cagtttcaac cagagttcca accaatgggc 60 tccat 65 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aggagattcc acacaggggt ggagtttctg acgaaggtcc taagggagtg tttgtgtctg 60 actca 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ttctgccact tggacatcat ctgggtgaac actcctgaac agacagctcc ttacggcctg 60 ggaaa 65 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cccgtgcagc agaagcatgc gactttcata tccttgccta gaataggctg catggtgtat 60 gtcag 65 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caccatctga taccgtaagg 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ctttgggtat gggacattcc tctgatccta atgcagtgat gtatccaacc 60 tatgg 65 <210> 22 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 acgtcttcca gtaccgagag aaagcctatt tctgccagga ccgcttctac tggcgcgtga 60 gttcc 65 <210> 23 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cacacatatt aaagagtaac agctggttac attgctaggc gagatagggg gaagacagat 60 atggg 65 <210> 24 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgtctcagac tgggcaggga ggctttggca tgacttaaga ggaagggcag tcttgggccc 60 gctat 65 <210> 25 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 aggaggcaca aacttgttcc tcactgctgt tcacgagatt ggccattcct taggtcttgg 60 ccatt 65 <210> 26 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ggggagggtg cttggcactt attgaatata tgatcggcca tcaagggaag aactattgtg 60 ctcag 65 <210> 27 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gcacggggta ggggaaatgg ggtgaacggt gctggcagtt cggctagatt tctgtcttgt 60 ttgtt 65 <210> 28 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ggtggggctg cgggggttcc gtgtccaccc ccatacattt atttctgtaa ataatgtgca 60 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tacctctttt 60 gtgaa 65 <210> 44 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 cccatggaat gatgacttca tgttcttctc gtgggtttgt gccgtgctgc tttccaaata 60 ggtat 65 <210> 45 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cccacaaact gatttctcac ggcgtgtcac cccaccaggg cgcaagcctc actattactt 60 gaact 65 <210> 46 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cctagacccg tgacctgaga tgtgtgattt ttagtcatta aatggaagtg tctgccagct 60 gggcc 65 <210> 47 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gggagagatg agtgggttag ctacctgcta tgcgctagtt aggaagttac ctggatgcca 60 ttgta 65 <210> 48 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 aacctaagaa taagcaagtc ttctttccag gtcaccactt gcaagctaca tggaggttcc 60 ccctg 65 <210> 49 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ctcacctgta gcagccagtc ccgtttcatt tagtcatgtg accactctgt cttgtgtttc 60 cacag 65 <210> 50 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 gcatgctgga agccaggaag gcctatgtga acatgtcgct gtttgagaac ttcacttacg 60 cgggc 65 <210> 51 <211> 65 <212> DNA <213> Homo 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aggcaatggg agctgaggcc 60 acact 65 <210> 59 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gggggtcgtg gcagataatc agcctcttaa agctgcctgt agttaggaaa taaaaccttt 60 caaat 65 <210> 60 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 gcccaataaa cattcccttg gatgtagtct gaggcccctt aactcatctg ttatcctgct 60 agctg 65 <210> 61 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 ggcagctcat gcttgagacc caatctccat gatgacctac aagctagagt atttaaaggc 60 agtgg 65 <210> 62 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 actcagtagg tctgaaggcc tccatttgta ccgaaacacc ccgctcacgc tgacagcctc 60 ctagg 65 <210> 63 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 gccttctgcc ctggagcaca gcatccaata ttctggagaa gtgcggagat tcaacactgc 60 caatg 65 <210> 64 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 acgagggagg aacacctgat cttacagaaa ataccacctc gagatgggtg ctggtcctgt 60 tgatc 65 <210> 65 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gtgaagtgca tcaaacttgg gaaagatttg aggaggctgg gaacctcctg gaaaaccact 60 ccttg 65 <210> 66 <211> 65 <212> DNA 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ctccaggcat gaagaaaacc 60 aggta 65 <210> 243 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 243 gaacaagacg agcatgagta ctgaggccac tgatgctggt gcctgatgac cacttctcaa 60 taaat 65 <210> 244 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 244 ctcttccaca gtcttagcag tcagttctat gacaccccat ctgcaacctt agcaatagaa 60 actcc 65 <210> 245 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 245 tgaatgtacg gtatcatcgt gtgtgaacta ctgctgtaaa atgtgctgat cctcctgccc 60 caaac 65 <210> 246 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 246 cccctcatga taatgaaacc cacggagaaa gcagaagtac cgacaggggt tatcataggc 60 agcat 65 <210> 247 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 247 caagcactag aagtgggcta actcattcag tctttgcaat ggacatgcag ggaagctgag 60 ccttt 65 <210> 248 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 248 acctgccaat acctcaagaa ttacctaact cagctgctgg ttccctacat agtcaacgtg 60 tcctg 65 <210> 249 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 249 tgaggccttt tctctctggg aaccaacaag aaatacatta tctttgcccc cgttctgaca 60 agtgt 65 <210> 250 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 250 atttcaggac acgtggagaa ccgctcatgt agagcagtcc cacccctaat tttcatacca 60 ttcac 65 <210> 251 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 251 cctttttgag aagtatgtca ttgctcaaga ctgccagcac agtgtacagc aaaagctatg 60 aataa 65 <210> 252 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 252 atatatcatg gagggtgccg tatccaagtc tctgtctgtg ccaaaaccaa gccaaagcgc 60 ctcta 65 <210> 253 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 253 ttaaggtgga atcaagttta cagacaatca cctgaatgct gactcattcc ttgttcacaa 60 ccact 65 <210> 254 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 254 ctccccagag ctcactgtga cagtaacagt ttggaatgag ggtgaggaca gctatggaac 60 cttaa 65 <210> 255 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 255 tctgctagcc tgccttgtcc ctctgagaga atctttgaaa taaactcgga gaaactgcca 60 tctca 65 <210> 256 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 256 cttcctagct gttgggggtc tctccttagg gatattaaag ggtatatgtt tagaatctat 60 tccac 65 <210> 257 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 257 ctgccaagga tccaaaagcc tgctcggttt ctttccgcca ttatatcaag tctgccaggg 60 tttcc 65 <210> 258 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 258 agtcctctcc caagtccaca caggggaggt gatagcattg ctttcgtgta aattatgtaa 60 tgcaa 65 <210> 259 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 259 gagacaattg ccaagtgcat tgcggaccta aagctgctgg caaagaaggc tcaagcacag 60 ccagt 65 <210> 260 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 260 agttgccatg tagacccctt gaagagggga ggggcctagg gagccgcacc ttgtcatgta 60 ccatc 65 <210> 261 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 261 gagcctttca tgaggaaaaa caaaagacat ggtacgcatt ccagggctga atactattgc 60 ttggc 65 <210> 262 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 262 caacacagag tactgactct gcctggttcc tgagagaggc tcctaagtca cagacctcag 60 tcttt 65 <210> 263 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 263 aacaacggca agaagctcat gactgtgcgc atcgtcaagc atgccttcga gatcatacac 60 ctgct 65 <210> 264 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 264 tgcagcatgt catgctccca gaatttcagc ttcagcttaa ctgacagacg ttaaagcttt 60 ctggt 65 <210> 265 <211> 65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 265 tggaaaacag cccgtttact tgagcaagac tgataccacc tgcgtgtccc ttcctccccg 60 agtca 65 <210> 266 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 266 gtcggacgag gatatgggat ttggtctctt tgactaatca ccaaaaagca accaacttag 60 <210> 267 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 267 ccatcgtgca ccgcaagtgc ttctaggcgg actgttactg agctgcgttt tacacccttt 60 ctttg 65 <210> 268 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 268 gggctgccat ttgcagtggc aaagtggaga ttgttgccat caacgacccc ttcattgacc 60 tcaac 65 <210> 269 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 269 ggtcctccat ttcccaggtg atccaaatgc ccttttggcc cctgcgggta ccacatgtat 60 gtggt 65 <210> 270 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 270 ttctgcctga gaaaggaagt gagctgtaaa ggctgagctc tctctctgac gtatgtagcc 60 tctgg 65 <210> 271 <211> 65 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 271 atcagatgag gatatgggat tcggtctctt cgactaatcc cgccaaagca accaagtcag 60 cctgc 65 <210> 272 <211> 65 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 272 gcatgttgac tcgtcctctg aaccaaagca cggacaggat taagagtgat ccaactttca 60 agtcg 65 <210> 273 <211> 65 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 273 gtgtcggcat aagccgaaga tatcggtaga gttatattga gcagatcccc cggtgaagga 60 tttaa 65

Claims

하기 (a) 또는 (b)의 핵산을 포함하는, 피부의 탄력 및 주름 중 적어도 하나에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 세트.
(a) (i) 서열 번호 63, 70, 84, 85 및 112로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 염기 서열로 구성된 핵산, 및
(ii) 서열 번호 27, 30 및 58로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 염기 서열로 구성된 핵산; 또는
(b) 상기 (a)의 핵산에 대하여 상보적인 염기 서열로 구성된 핵산.
제1항에 있어서, 상기 (i)의 핵산이 서열 번호 63, 70, 84, 85 및 112의 각 염기 서열로 구성된 핵산인 프로브 세트.
제1항에 있어서, 상기 (ii)의 핵산이 서열 번호 27, 30 및 58의 각 염기 서열로 구성된 핵산인 프로브 세트.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 핵산이 서열 번호 27, 30, 58, 63, 70, 84, 85 및 112의 각 염기 서열로 구성된 핵산인 프로브 세트.
하기 (i)의 핵산, (ii)의 핵산, 또는 둘다를 포함하는, 피부의 탄력 및 주름 중 적어도 하나에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 프로브 세트.
(i) 서열 번호 1 내지 130에 나타나는 염기 서열로 구성된 핵산
(ii) 서열 번호 131 내지 257에 나타나는 염기 서열로 구성된 핵산
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트를 포함하는, 피부의 탄력 및 주름 중 적어도 하나에 대한 자외선의 영향을 평가하기 위한 핵산 마이크로 어레이.
검사 대상에 자외선을 조사 후, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트를 사용하여 유전자 발현량을 측정하는 공정을 포함하는, 피부의 탄력 및 주름 중 적어도 하나에 대한 자외선의 영향을 평가하는 방법.
검사 대상에 자외선을 조사 후, 제6항에 기재된 핵산 마이크로 어레이를 사용하여 유전자 발현량을 측정하는 공정을 포함하는, 피부의 탄력 및 주름 중 적어도 하나에 대한 자외선의 영향을 평가하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트를 사용하여, 피부 질환 치료약 또는 화장품에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법.
제6항에 기재된 핵산 마이크로 어레이를 사용하여, 피부 질환 치료약 또는 화장품에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 핵산이 하기 (i) 및 (ii)의 핵산을 포함하는 것인 프로브 세트.
(i) 서열 번호 63, 70, 84, 85 및 112로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 염기 서열로 구성된 핵산, 및
(ii) 서열 번호 27, 30 및 58로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 염기 서열로 구성된 핵산.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 핵산이 하기 (i) 및 (ii)의 핵산을 포함하는 것인 프로브 세트.
(i) 서열 번호 63 및 85의 각 염기 서열로 구성된 핵산, 및
(ii) 서열 번호 30 및 58의 각 염기 서열로 구성된 핵산.
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