CN113832244A - 莲dna品种分子鉴定的mnp核心引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了莲DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其应用。本发明基于莲重测序数据，结合高通量测序技术筛选得到了用于检测莲多态性MNP标记位点的525对MNP核心引物组合，其核苷酸序列为SEQ ID No.1‑SEQ ID No.1050所示。本发明提供的525对MNP位点检测引物可兼容二代测序平台，具备高效、准确、高重现性等特点，满足莲标准指纹数据构建的要求；对莲待测样本和对照品种鉴定，能够准确鉴定所述待测莲样本的真实性，能够应用于包括构建莲DNA指纹数据库、检测莲品种真实性、莲种质资源遗传多样性分析或莲分子育种等方面，为莲分子育种及种子资源分析提供了技术支撑，加快了莲新品种选育周期。
Description
技术领域
本发明涉及用于植物品种分子鉴定的引物组合，尤其涉及莲DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其在莲DNA品种分子鉴定中的应用，属于莲DNA品种分子鉴定领域。
背景技术
莲(Nelumbo nucifera L.)为睡莲科莲属蔬菜作物，中国最具特色的一种水生园艺植物，其根状茎，即藕或藕带作蔬菜食用，鲜莲子(果实)作水果食用，花(荷花)是中国十大名花之一，莲也是加工产品最多的园艺植物之一。中国藕莲栽培面积约40万hm2，子莲栽培面积约10万hm2，主要分布在长江流域、珠江流域和黄河流域，其中以长江中下游地区种植面积最大；中国台湾地区也有一定面积的莲藕种植。
中国莲栽培历史悠久，种质资源丰富，中国科学院武汉植物研究所收集了莲种质资源125份，武汉市农业科学院蔬菜研究所1980年开始收集莲藕等水生蔬菜资源，并在1990年建立了“国家种质武汉水生蔬菜资源圃”，截止目前资源圃保存国内20多个省200多个市县及美国、日本、印度、泰国等国家的莲种质资源741份。
作物种质资源是种质创新和新品种选育的物质基础，中国莲品种省级品种审(认)定工作始于20世纪90年代初期，湖北、江西、福建、浙江、湖南、江苏等单位先后审(认)定藕莲品种 14个，子莲品种12个。花莲资源收集和育种开始于20世纪60年代，中国科学院武汉植物研究所、武汉市园林科学研究所最早开始花莲育种工作，在花色、花型、花姿、花数、株型等方面选育出大量多样化的品种。随着育种单位的增加，花莲品种数量急速增长，据不完全统计，目前有花莲品种800～1000个。较大规模的莲品种数量，增加了品种管理的难度，近几年随着莲品种商业化地发展，在原品种的基础上仅少数性状的派生新品种增多，品种间的遗传差异逐渐缩小，有效地管理和鉴定庞大的莲品种成为品种管理的难题。
传统的田间种植观察鉴定、蛋白质电泳等方法，由于区分能力有限，已不能满足大样本、精确、快速鉴定的需要。DNA指纹鉴定技术由于不受环境和人为因素影响，且具有快速和准确的特性，已成为目前莲鉴定的重要手段。DNA指纹是指不同品种间遗传物质DNA碱基的排列、组分和长度不同所呈现的各自特有的DNA序列，具有特异性。早期传统的DNA指纹鉴定技术有 RFLP、RAPD、ISSR、SRAP标记法技术，这些标记具有分型不稳定、基因型过多无法分辨和非共显性等缺陷，基本上没有被纳入品种鉴定中。经过近几十年的发展，最终只有SSR和SNP标记鉴定技术被保留并应用品种鉴定中。SSR标记法的有主要优点是多态性高和共显性，可在普通实验室进行电泳检测。目前大部分的植物指纹图谱和品种鉴定标准都是基于SSR开发，但SSR 标记法主要依据片段大小进行检测，为了进行品种比较，往往需要将待测样本与对照样本在同一电泳胶上进行平行检测。当涉及到大规模样本检测时，无法做到同时检测成百上千的已知品种，并且涉及到近似品种筛选、品种权认定和实质派生品种判断时，不具有现实的可行性。
基于SSR标记法存在的问题，SNP标记法在近年来被逐步应用于植物品种鉴定中。SNP标记法主要是获得单个核苷酸酸碱基序列，因此不需要对照平行实验。然而SNP也有一些自身固有的缺陷，如SNP标记是二态性标记，单个标记区分能力有限，所以需要检测大量的SNP位点才能实现精确分型，因而涉及到高通量芯片技术。基因芯片技术的生产工艺较为复杂，生产成本较高，不太适合普通实验和小作物等中使用，推广力度有限。
MNP多态性是指在基因组水平上有多个核苷酸引起的多态性。MNP标记法技术主要是基于高通量测序技术开发的检测特定基因组上一段区域内的由多个核苷酸多肽性的标记法技术。与 SSR标记和SNP标记法相比，MNP标记法在构建植物指纹图谱和品种鉴定方面具有以下优势： (1)等位基因丰富，单个MNP位点上有2n种等位基因，高于SSR和SNP；(2)MNP获得的是碱基序列，不需要平行对照实验；(3)MNP标记的等位基因型丰富，品种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现品种鉴定，减少了检测错误率；(4)可定量检测，基于MNP位点利用二代高通量测序重复抽样可对特定等位基因进行定量分析；(5)效率高，利用二代高通量测序仪可实现成百上千份样本的数百个MNP位点分型；(6)可进行实质性派生品种检测。
鉴于以上优点和特性，MNP标记法已广泛应用于水稻、玉米、番茄、辣椒等作物中。
目前在莲中尚未有较为广泛应用的DNA指纹图谱以及品种鉴定标准，而MNP标记法的开发、筛选和应用在植物中具有较好的应用基础。
MNP标记主要基于参考基因组序列开发，根据已报道的莲重测数据和测得的差异性样本材料的重测序数据可以挖掘大规模的多态性MNP位点，再根据多态性MNP位点遗传多样性差异可筛选多态性最大、覆盖程度的最广的一套MNP位点，通过MNP位点两侧的保守序列可以设计MNP检测引物。根据研究目的不同MNP标记可筛选500至1000个左右即可完成大规模植物 DNA指纹图图谱构建、真实性鉴定、遗传多样性分析、分子育种等工作。
发明内容
本发明的目的之一是提供莲DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合；
本发明的目的之二是将所述的MNP核心引物组合应用于莲DNA品种分子鉴定；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明一方面提供了莲DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合，所述的引物组合为位点编号AMPL3700001～AMPL3700525对应的525对引物，所述的525对MNP核心引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1-SEQ ID No.1050所示。
本发明另一方面提供了将所述的MNP核心引物组合应用于莲DNA品种分子鉴定等方面，包括用于构建莲DNA指纹数据库、检测莲品种真实性、莲种质资源遗传多样性分析或莲分子育种。
作为一种优选的具体实施方案，本发明提供了将所述的MNP核心引物组合应用于构建莲 DNA指纹数据库，包括利用本发明的525对MNP核心引物组合对待测莲品种的基因组DNA进行第一轮混合PCR扩增；采用525对MNP引物构成的组合加上二代测序接头引物和标签序列后对第一轮混合PCR扩增的回收产物进行第二轮混合PCR扩增，对第二轮扩增产物回收和纯化后进行上机测序，测序结果比对所述的莲参考基因组，获取待测莲品种在所述525个MNP位点上的基因组数据，即构成莲的DNA指纹数据库。
作为一种优选的具体实施方案，本发明提供了将所述的MNP核心引物组合应用于检测莲品种真实性，包括：利用所述的525对MNP引物对待测莲样本和对照莲样本的基因组DNA进行扩增和测序，从而获取待测莲样本和对照莲样本各自在525个MNP位点的基因型数据并进行品种间的数据比较，获得差异位点百分比；差异位点百分比p＝(差异基因型位点数n/比较基因型位点数目N)×100％(其中N最大值为525)；
如果所述待测莲品种与所述对照莲品种在所述525个MNP位点上的基因型数据中的差异位点百分比大于等于5％，则说明两个莲样本不属于同一品种；如果所述待测莲品种与所述对照莲品种在所述525个MNP位点上的基因型数据中的差异位点百分比小于5％，则为同一品种或者候选同一品种。
作为一种优选的具体实施方案，本发明提供了将所述的MNP核心引物组合应用于莲种质资源遗传多样性分析，包括：分别提取待测种质资源群类划分的所有莲品种的基因组DNA；利用所述的525对MNP核心引物组合对所述莲品种的基因组DNA分别进行扩增和MNP位点查询，从而获得所有所述莲品种在所述的525个MNP位点上的基因型数据；建立聚类树状图。
本发明基于莲重测序数据，结合高通量测序技术开发了一套用于检测莲多态性MNP标记位点的引物，并用于构建莲DNA指纹图谱，相关MNP标记法引物适用于莲真实性鉴定、遗传多样性分析、分子育种等领域。
本发明提供的525对MNP位点检测引物可兼容二代测序平台，具备高效、准确、高重现性等特点，满足莲标准指纹数据构建的要求；对莲待测样本和对照品种鉴定，能够准确鉴定所述待测莲样本的真实性。因此本发明所提供的525对MNP核心引物组合可应用于莲品种DNA指纹图谱构建、品种真实性鉴定、种质资源类群划分以及其他相关研究中。本发明提供的525对MNP 标记引物组合在莲中的应用将加快莲品种标准MNP指纹数据库的构建进程，推动MNP标记数据在品种真实性及实质派生性鉴定中的应用，为中国莲品种权管理、种苗市场监测和品种维权等方面提供有力的科技支撑，确保蔬菜生产安全；同时，也为莲分子育种及种子资源分析提供了技术支撑，加快了莲新品种选育周期。
附图说明
图1为525个MNP标记在莲染色体上的分布。
图2为525个MNP标记位点分别在56份莲资源中检出的数目；横坐标代表莲资源编号，纵坐标代表MNP标记位点数目。
图3为莲藕样品间差异分布。
图4为56份莲资源基于MNP位点的基因型数据建立的群类聚类分析图；分支上数字代表进行1000次重复时支持的自展值百分比，分支末端为莲资源编号。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1莲DNA品种分子鉴定的MNP核心标记引物组合的筛选和验证 (一)莲MNP引物标记组合筛选
以莲藕基因组版本GCA_003033685.1为参考基因组，序列下载地址： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_003033685.1，序列总长817,267,751bp，含8条染色体和多个未定位的contig，；利用武汉市农科院提供的296份种质资源(链接 https://db.cngb.org/search/project/CNP0001227/)的基因组重测序数据，根据测序数据进行比较分析，筛选到525个MNP标记位点，设计引物(引物详细信息见表1)。
表1 525对MNP标记扩增引物序列信息表
(二)莲MNP引物标记组合正确性分析
为了检验莲MNP标记法的准确性，从武汉市农业科学院蔬菜研究所提供的56份莲自交系中随机选择8个样品，进行了重现性实验，每份品种的同一份DNA分别构建了2次文库，编号 -11、-12；2个文库不同时间测序两次。不同批次文库第一次和第二次测序比较，比较差异位点数目都为0，统计结果见表2：
表2莲MNP标记法准确性分析结果
| 重复1 | 重复2 | 共同位点数 | 差异 | 可重复基因型对数 | 准确性 |
| test_LO0406-11 | test_LO0406-12 | 451 | 0 | 451 | 100％ |
| test_LO0407-11 | test_LO0407-12 | 479 | 0 | 479 | 100％ |
| test_LO0408-11 | test_LO0408-12 | 459 | 0 | 459 | 100％ |
| test_LO0409-11 | test_LO0409-12 | 463 | 0 | 463 | 100％ |
| test_LO0410-11 | test_LO0410-12 | 450 | 0 | 450 | 100％ |
| test_LO0411-11 | test_LO0411-12 | 470 | 0 | 470 | 100％ |
| test_LO0412-11 | test_LO0412-12 | 458 | 0 | 458 | 100％ |
| test_LO0413-11 | test_LO0413-12 | 431 | 0 | 431 | 100％ |
同一样品的不同文库间检出相同的MNP标记基因型是可重现的，按照重现性计算公式r＝n/N， n:可重复的基因型对数，N：比较的基因型总对数。依据2次实验间可重现的基因型认为是准确的原则，准确率＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r。根据表2的莲MNP标记法准确性分析结果可见，本重现性试验中每个样品不同文库间MNP标记基因型差异对数为0，r＝1,准确性为100％。
实施例2莲DNA品种分子鉴定的MNP核心标记引物组合应用于构建莲标准DNA指纹
1、DNA提取与质量评估
利用常规CTAB法提取用于构建莲指纹数据库的所有莲品种的基因组DNA，RNA酶处理后用琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测DNA的质量。若DNA条带单一，无明显降解，紫外分光光度计检测A260/280介于1.8-2.0，且A260/230介于1.8-2.0，270nm出无明显光吸收，DNA浓度大于50ng/ul，则说明基因组DNA达到相关的质量要求，可进行后续实验。
2、MNP标记检测
利用实施例1筛选的525对莲MNP标记引物组合对武汉市农业科学院蔬菜研究所提供的56 份莲种质进行了多重扩增、二代高通量测序与数据分析。
本次试验结果实现了一次实验达到56×525＝29400个标记的检测，每个样品的测序平均覆盖倍数达490倍，显示了MNP-seq的高效性。基于56份莲种质的MNP数据进行分析，每个品种平均可以检出501个(95.36％)MNP标记(图1)，检出标记数量远超现有SSR标记数量，且检出率高。
3、基因型指纹数据
将比对后的基因型位点数据导入Excel2016软件，记录每个样品525个位点的基因型作为最终的MNP指纹图谱数据。
实施例3莲DNA品种分子鉴定的MNP核心标记引物组合应用于检测莲品种真实性1、莲MNP引物标记品种区分度及莲品种真实性检测结果判定标准的确定
对实施例2中的56份莲样品进行两两比较，分析其MNP标记位点的差异，共得到1540对比较结果，任意品种间MNP标记平均差异数量212.65个，1540对样品的遗传距离的差异位于 0％-89.5％之间，平均差异达44.15％，其中1对差异为0，占总样品对数的0.06％。利用所开发的标记检测方法，99.93％的莲品种可以被区分(图2)，说明本发明提供的莲MNP标记多态性高、品种区分力强。因此525个位点完全可以应用到莲品种真实性鉴定中。
另外，由于莲品种真实性鉴定标准并未有农业行标准，参考其他农业行业标准，水稻、玉米等SSR标记的技术规程规定在48个(水稻)或者40个(玉米)SSR中大于等于2个差异位点的品种认为是不同品种，按照位点比率计算均约为5％差异。根据以上莲MNP检测结果及其他作物参照，将差异百分比5％作为莲品种真实性判定的标准。
所以，利用本发明进行莲品种真实性检查具体判定标准如下：获得待测样品与对照样品(即标准样品)525个MNP位点的基因数据，并进行品种间的数据比较，获得差异位点百分比。
差异位点百分比p＝(差异基因型位点数n/比较基因型位点数目N)×100％(其中N最大值为 525)。
(1)如果待测样品与对照样品差异位点百分比p≥5％，结论为检测到明显差异；
(2)如果待测样品与对照样品差异位点百分比p<5％，结论为未检测到明显差异
2、鉴定待测莲样品是否为某已知对照莲品种
待测莲样品(代号A)和对照莲品种鄂莲6号(代号B)；待测莲样品(代号C)和对照莲品种鄂莲9号(代号D)；提取上述两组检测样品的基因组DNA，进行DNA质量检测、MNP 标记鉴定，获得基因型指纹数据，具体方法见实施例2。
将样品A和样本B的所获取的MNP位点基因型数据进行比对，并将样品C和样本D的所获取的MNP位点基因型数据进行比对。
结果如下：
(1)样本A(待测莲样本)和样本B(已知莲品种鄂莲6号)比较位点数为490，差异位点数为1，差异位点百分比为0.2％；
(2)样本C(待测莲样本)和样本D(已知莲品种鄂莲9号)比较位点数为499，差异位点数为 56，差异位点百分比为11.22％。
根据5％的判定标准，鉴定的待测样本A与莲品种鄂莲6号为同一品种或者近似品种；而待测样本C与鄂莲9号不是同一品种。鄂莲6号和鄂莲9号的植物新品种权证书号为第CNA20100505.4号和第CNA20130482.8号。
实施例4利用MNP核心标记引物组合构建的莲标准DNA指纹信息对莲资源进行类群划分
本发明提供的525个MNP引物可用于进行莲指纹图谱构建，用于莲种质资源分析，具体方法包括：应用实施例2采用MNP核心标记引物组合构建的莲标准DNA指纹信息，将实施例3 中的56个莲的525个位点基因型指纹数据利用Power-Marker v3.25软件，选用欧式遗传距离算法UPGMA进行聚类分析，并用MEGA7软件绘制聚类树状图，56份莲种质资源被划分到不同的群内，结果如图4所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉市农业科学院
<120> 莲DNA品种分子鉴定的MNP核心引物组合及其应用
<130> WH-2001-210513A
<160> 1048
<170> PatentIn version 3.5
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tgtttaccat ttcgcaaggc aaata 25
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taaatggctg agtagggata tggtg 25
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ggcacatcta ttaccttcac tgact 25
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gtcgccatct ccaatcaaga gg 22
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acttctaacc atgcttcaac caatg 25
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atatcgacgt gtacttacaa cccat 25
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cttctcaaat ctctctacta ccggg 25
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tgcagacgac atcattagtt tttgt 25
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ctactcttcc tcctggtaag catg 24
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ctcctctata aggtcaccat gaagg 25
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tatcagaagg catcatctca actcc 25
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gaaagcgtta tggggtggtg tatta 25
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acgtctccta tgacatgctt gatta 25
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agaagatact aacttgagct tcgga 25
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ttcttctttg ctttcttctt cccac 25
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agtagatgga tggtagtttt ggacc 25
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aagtccattc ctctgctttt cgatt 25
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ttcaagggaa gatcagttgg gtc 23
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attatgtact catcaatcgc tggtc 25
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gaaaacacaa accctacttc taggc 25
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gaacaactca ccagaaaatc taggc 25
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accgatgacc gatcctaatt tatgt 25
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tgtttggcat atctttttgt gtgga 25
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tatttccaat acaaggtggg atggg 25
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aatgtttaag gtattgatga ggggc 25
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tagaaggtta ctacgtgtca cttcg 25
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tggggttttt attgttcagt tcacc 25
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ctttaggact gtggtaggct tatgt 25
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cactttatgt gtcagtggct tagtt 25
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tgaagaagtt cattcacgaa ttggg 25
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accagacata ctatggggat agact 25
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actgaaaatg gtaaattggt gacca 25
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gatcttggtg tgaatcaggt tgttc 25
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atgggccaac ctataattgc atttt 25
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taactgcttt ggcgttaaat ccttt 25
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cgatgaagaa gatgaaatgg gtgag 25
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gaaagagaaa ggccctccaa aaata 25
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aaaagtgtga actgtgaacc atacc 25
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cttcgaatca ccttccagaa tcaag 25
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tagaataaat ggcagcagcg taaag 25
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tagatttggt ccaatccaat ccagt 25
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agatgagtgt agagaaaaca ggtta 25
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cattgattct gatcttcacg acgag 25
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taataaaaca ggatgacagc cactg 25
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gacttgaaca aaagcttggg tcata 25
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gctgttacag acttgcagtg aaaaa 25
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atgcttcaca tgatggagtt tgatc 25
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cctaagatgg gtaattggtg ttagc 25
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<213> Artifical sequence
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tagagtttca ccacgtgtct tatga 25
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cttttaggct aggctgagga ttttg 25
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ccacttcttc atcttcatcc attgt 25
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ttcctctcca tcaaattcta ggcaa 25
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aggtgtattt tcggccttag agtag 25
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aggggagcat ggtaaattgg taata 25
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aaaaactcag agatgggtga ggag 24
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caccgaaaag gagatcttag caatt 25
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<211> 25
<212> DNA
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atatacaaca agagacagtc gaggg 25
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gtctggatcc ttattatacg ccctt 25
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agaaggttgg ggattagata agaga 25
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agttttgaca tccatctgcc aaatt 25
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tgtaatcaac cttagagcaa tggga 25
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<211> 25
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<213> Artifical sequence
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attgttctgt tcttcatcgt agagc 25
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<212> DNA
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tacaactttt tggtagtcgc aactc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
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tcttctatag gtgcaattcg ctctt 25
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gggattatct accggacaat cagaa 25
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aatcgctcca ttattgatgc agttg 25
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tcatccgtat gagctaagtc ttttt 25
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<213> Artifical sequence
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ccactataag ctgggaaaaa tgcaa 25
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taaaggtatt tccccaccag tagtg 25
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tggaattgat tatgtgtcac ttcgg 25
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gcacttcttt ccactttctt agcat 25
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aagcttgttt tccacttcac gtatt 25
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gatgaagcca ttgtagagaa agcc 24
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cttcttgtcg ggatgatgta ccaag 25
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cattacagcc cgtattcttg ctaag 25
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attgatcaac gcaattccat aaggg 25
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cttgaaactt gattcccaaa gagct 25
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taagggtact catagtccag tttgg 25
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<211> 25
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taggtgtacg gtacaaggtt agttg 25
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gcatccatat ccacaatatc gcaat 25
<210> 1047
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ctccctccta agactaactg acttg 25
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<400> 1048
aaaagtgaga actaaatcgt gtggg 25
<210> 1049
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1049
ggaaggaaag aaggttacac aacag 25
<210> 1050
<211> 25
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<213> Artifical sequence
<400> 1050
ttgattctgg tgcttccata tgact 25
Claims (9)
1.莲MNP核心引物组合，其特征在于，由以下525对引物组成：
引物对1：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的反向引物组成；
引物对2：由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的反向引物组成；
引物对3：由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的反向引物组成；
引物对4：由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的反向引物组成；
引物对5：由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的反向引物组成；
引物对6：由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.12所示的反向引物组成；
引物对7：由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.14所示的反向引物组成；
引物对8：由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.16所示的反向引物组成；
引物对9：由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.18所示的反向引物组成；
引物对10：由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.20所示的反向引物组成；
引物对11：由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.22所示的反向引物组成；
引物对12：由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.24所示的反向引物组成；
引物对13：由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.26所示的反向引物组成；
引物对14：由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.28所示的反向引物组成；
引物对15：由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.30所示的反向引物组成；
引物对16：由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.32所示的反向引物组成；
引物对17：由核苷酸序列为SEQ ID No.33所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.34所示的反向引物组成；
引物对18：由核苷酸序列为SEQ ID No.35所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.36所示的反向引物组成；
引物对19：由核苷酸序列为SEQ ID No.37所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.38所示的反向引物组成；
引物对20：由核苷酸序列为SEQ ID No.39所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.40所示的反向引物组成；
引物对21：由核苷酸序列为SEQ ID No.41所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.42所示的反向引物组成；
引物对22：由核苷酸序列为SEQ ID No.43所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.44所示的反向引物组成；
引物对23：由核苷酸序列为SEQ ID No.45所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.46所示的反向引物组成；
引物对24：由核苷酸序列为SEQ ID No.47所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.48所示的反向引物组成；
引物对25：由核苷酸序列为SEQ ID No.49所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.50所示的反向引物组成；
引物对26：由核苷酸序列为SEQ ID No.51所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.52所示的反向引物组成；
引物对27：由核苷酸序列为SEQ ID No.53所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.54所示的反向引物组成；
引物对28：由核苷酸序列为SEQ ID No.55所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.56所示的反向引物组成；
引物对29：由核苷酸序列为SEQ ID No.57所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.58所示的反向引物组成；
引物对30：由核苷酸序列为SEQ ID No.59所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.60所示的反向引物组成；
引物对31：由核苷酸序列为SEQ ID No.61所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.62所示的反向引物组成；
引物对32：由核苷酸序列为SEQ ID No.63所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.64所示的反向引物组成；
引物对33：由核苷酸序列为SEQ ID No.65所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.66所示的反向引物组成；
引物对34：由核苷酸序列为SEQ ID No.67所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.68所示的反向引物组成；
引物对35：由核苷酸序列为SEQ ID No.69所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.70所示的反向引物组成；
引物对36：由核苷酸序列为SEQ ID No.71所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.72所示的反向引物组成；
引物对37：由核苷酸序列为SEQ ID No.73所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.74所示的反向引物组成；
引物对38：由核苷酸序列为SEQ ID No.75所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.76所示的反向引物组成；
引物对39：由核苷酸序列为SEQ ID No.77所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.78所示的反向引物组成；
引物对40：由核苷酸序列为SEQ ID No.79所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.80所示的反向引物组成；
引物对41：由核苷酸序列为SEQ ID No.81所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.82所示的反向引物组成；
引物对42：由核苷酸序列为SEQ ID No.83所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.84所示的反向引物组成；
引物对43：由核苷酸序列为SEQ ID No.85所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.86所示的反向引物组成；
引物对44：由核苷酸序列为SEQ ID No.87所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.88所示的反向引物组成；
引物对45：由核苷酸序列为SEQ ID No.89所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.90所示的反向引物组成；
引物对46：由核苷酸序列为SEQ ID No.91所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.92所示的反向引物组成；
引物对47：由核苷酸序列为SEQ ID No.93所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.94所示的反向引物组成；
引物对48：由核苷酸序列为SEQ ID No.95所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.96所示的反向引物组成；
引物对49：由核苷酸序列为SEQ ID No.97所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.98所示的反向引物组成；
引物对50：由核苷酸序列为SEQ ID No.99所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.100所示的反向引物组成；
引物对51：由核苷酸序列为SEQ ID No.101所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.102所示的反向引物组成；
引物对52：由核苷酸序列为SEQ ID No.103所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.104所示的反向引物组成；
引物对53：由核苷酸序列为SEQ ID No.105所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.106所示的反向引物组成；
引物对54：由核苷酸序列为SEQ ID No.107所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.108所示的反向引物组成；
引物对55：由核苷酸序列为SEQ ID No.109所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.110所示的反向引物组成；
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引物对486：由核苷酸序列为SEQ ID No.971所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.972所示的反向引物组成；
引物对487：由核苷酸序列为SEQ ID No.973所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.974所示的反向引物组成；
引物对488：由核苷酸序列为SEQ ID No.975所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.976所示的反向引物组成；
引物对489：由核苷酸序列为SEQ ID No.977所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.978所示的反向引物组成；
引物对490：由核苷酸序列为SEQ ID No.979所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.980所示的反向引物组成；
引物对491：由核苷酸序列为SEQ ID No.981所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.982所示的反向引物组成；
引物对492：由核苷酸序列为SEQ ID No.983所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.984所示的反向引物组成；
引物对493：由核苷酸序列为SEQ ID No.985所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.986所示的反向引物组成；
引物对494：由核苷酸序列为SEQ ID No.987所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.988所示的反向引物组成；
引物对495：由核苷酸序列为SEQ ID No.989所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.990所示的反向引物组成；
引物对496：由核苷酸序列为SEQ ID No.991所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.992所示的反向引物组成；
引物对497：由核苷酸序列为SEQ ID No.993所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.994所示的反向引物组成；
引物对498：由核苷酸序列为SEQ ID No.995所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.996所示的反向引物组成；
引物对499：由核苷酸序列为SEQ ID No.997所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.998所示的反向引物组成；
引物对500：由核苷酸序列为SEQ ID No.999所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1000所示的反向引物组成；
引物对501：由核苷酸序列为SEQ ID No.1001所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1002所示的反向引物组成；
引物对502：由核苷酸序列为SEQ ID No.1003所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1004所示的反向引物组成；
引物对503：由核苷酸序列为SEQ ID No.1005所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1006所示的反向引物组成；
引物对504：由核苷酸序列为SEQ ID No.1007所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1008所示的反向引物组成；
引物对505：由核苷酸序列为SEQ ID No.1009所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1010所示的反向引物组成；
引物对506：由核苷酸序列为SEQ ID No.1011所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1012所示的反向引物组成；
引物对507：由核苷酸序列为SEQ ID No.1013所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1014所示的反向引物组成；
引物对508：由核苷酸序列为SEQ ID No.1015所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1016所示的反向引物组成；
引物对509：由核苷酸序列为SEQ ID No.1017所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1018所示的反向引物组成；
引物对510：由核苷酸序列为SEQ ID No.1019所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1020所示的反向引物组成；
引物对511：由核苷酸序列为SEQ ID No.1021所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1022所示的反向引物组成；
引物对512：由核苷酸序列为SEQ ID No.1023所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1024所示的反向引物组成；
引物对513：由核苷酸序列为SEQ ID No.1025所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1026所示的反向引物组成；
引物对514：由核苷酸序列为SEQ ID No.1027所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1028所示的反向引物组成；
引物对515：由核苷酸序列为SEQ ID No.1029所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1030所示的反向引物组成；
引物对516：由核苷酸序列为SEQ ID No.1031所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1032所示的反向引物组成；
引物对517：由核苷酸序列为SEQ ID No.1033所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1034所示的反向引物组成；
引物对518：由核苷酸序列为SEQ ID No.1035所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1036所示的反向引物组成；
引物对519：由核苷酸序列为SEQ ID No.1037所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1038所示的反向引物组成；
引物对520：由核苷酸序列为SEQ ID No.1039所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1040所示的反向引物组成；
引物对521：由核苷酸序列为SEQ ID No.1041所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1042所示的反向引物组成；
引物对522：由核苷酸序列为SEQ ID No.1043所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1044所示的反向引物组成；
引物对523：由核苷酸序列为SEQ ID No.1045所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1046所示的反向引物组成；
引物对524：由核苷酸序列为SEQ ID No.1047所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1048所示的反向引物组成；
引物对525：由核苷酸序列为SEQ ID No.1049所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.1050所示的反向引物组成。
2.权利要求1所述的莲MNP核心引物组合在莲DNA品种分子鉴定中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的莲DNA品种分子鉴定包括构建莲DNA指纹数据库。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的构建莲DNA指纹数据库包括：利用权利要求1的525对莲MNP核心引物组合对待测莲品种的基因组DNA进行第一轮混合PCR扩增；采用权利要求1的525对莲MNP核心引物组合加上二代测序接头引物和标签序列后对第一轮混合PCR扩增的回收产物进行第二轮混合PCR扩增；对第二轮混合扩增产物回收和纯化后进行上机测序，测序结果比对莲参考基因组，获取待测莲品种在525个MNP位点上的基因组数据，即构成莲的DNA指纹数据库。
5.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的莲DNA品种分子鉴定包括检测莲品种真实性。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的检测莲品种真实性包括：利用权利要求1所述的525对MNP核心引物组合对待测莲样本和对照莲样本的基因组DNA进行扩增和测序，获取待测莲样本和对照莲样本各自在525个MNP位点的基因型数据并进行品种间的数据比较，获得差异位点百分比；
如果待测莲品种与对照莲品种在525个MNP位点上的基因型数据中的差异位点百分比大于等于5％，则说明两个莲样本不属于同一品种；如果待测莲品种与对照莲品种在525个MNP位点上的基因型数据中的差异位点百分比小于5％，则为同一品种或者候选同一品种。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，所述差异位点百分比按照以下计算公式进行计算：差异位点百分比p＝(差异基因型位点数n/比较基因型位点数目N)×100％，其中，N最大值为525。
8.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的莲DNA品种分子鉴定包括莲种质资源遗传多样性分析或莲分子育种。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述莲种质资源遗传多样性分析包括：分别提取待测种质资源群类划分的所有莲品种的基因组DNA；利用权利要求1所述的525对莲MNP核心引物组合对莲品种的基因组DNA分别进行扩增和MNP位点查询，获得所有莲品种在525个MNP位点上的基因型数据；建立聚类树状图。
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