CN103952408A

CN103952408A - 玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法

Info

Publication number: CN103952408A
Application number: CN201410147180.6A
Authority: CN
Inventors: 宋任涛; 邢莹莹; 王明民; 张举善; 马东东; 王珊珊; 祁巍巍; 梅冰; 唐远平
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明涉及玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法。该启动子序列为下列之一：i）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；ii）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。本发明从克隆玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子入手，通过对14kD zein启动子的功能分析，从实验水平验证了该启动子适用于启动目标基因在玉米胚乳中特异性表达，而在其他组织中低表达或不表达。为植物基因工程表达载体构建提供了合适的调控元件，为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。

Description

玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法

技术领域

本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法。

技术背景

玉米（Zea mays L.），又名玉蜀黍，是重要的粮食作物、优良的饲料和工业原料。因此，大量研究致力于将外源基因转入玉米以培育出满足人们需求的新品种。现今的转基因技术通常采用组成型强启动子使驱动外源基因高效表达。其缺点在于组成型启动子使外源基因在植株中全方位表达，造成不必要的能源浪费。其次，组成型启动子常引起基因多效性，以及引起食品安全性问题。

将外源基因在转基因植株中定位表达不仅可以降低植株负担、减轻对作物农艺性状的影响, 还可以提高外源基因在特定部位的表达量，同时尽可能地避免食品安全性问题。组织特异性启动子在植物发育过程中能够在时间和空间上有效地调控目的基因的特异性表达，使目的基因表达产物在特定的空间区域积累，进而按照人们的意愿改进代谢途径、提高组织中营养物质含量、调控转基因植物继代繁殖、利用种子便利地获得工业新产品和医药新化合物等。因此，良好的组织特异性启动子已成为转基因研究中最具有发展前景的外源基因启动元件。

当前的植物基因工程中还常使用一些来自于病毒、细菌等的调控元件，也有引起生物安全性问题的隐患。因此，克隆来源于植物自身的具有组织特异性的启动子不仅为研究植物生长发育的调控机理提供了材料，为植物基因工程研究提供了更多调控元件的选择，同时还在某种程度上避免了生物安全性问题。本试验中研究的启动子都是来自植物自身的具有组织特异性的启动子。

玉米胚乳中的蛋白质成分根据能否溶解于70%乙醇溶液可分为两种类型，醇溶蛋白和非醇溶蛋白。19kD、22kD zein 是由zein1基因家族编码的，而14kD zein 是由zein2基因家族中的Zc1基因编码的。1990年Manuel Reina等人从玉米W64A基因组中克隆到β-zein 中的14kD zein基因，序列比对发现与NCBI中的序列有98%的相似度。14kD zein基因编码醇溶蛋白，在胚乳中特异表达。

目前对于组织特异性启动子的应用主要有以下方面：①改良农作物品质, 提高作物的抗冻、抗旱、抗盐能力, 防止水果腐烂；②改良花卉品质、控制观赏花卉的颜色；③提高植物的抗病性、抗虫性和抗除草剂能力；④开发生物反应器用于生物制药；⑤创建雄性不育系和恢复系；⑥用于植物的分化发育研究等。

谷类、油类作物的种子是植物基因工程改良的重要材料。因此，种子特异性启动子的研究对植物基因工程的发展和人们生产生活水平的提高具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供玉米胚乳中特异表达启动子14kD zein的启动子序列。

本发明的目的之二在于提供该启动子序列的克隆方法。

为了实现本发明目的，本发明的采用如下技术方案：

一种玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列，其特征在于该启动子序列为下列之一：

i） SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

ii）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由 i）衍生的核苷酸序列。

一种载体，其特征在于该载体含有上述的启玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列。

一种转基因细胞系，其特征在于该转基因细胞系含有上述的启动子序列。

一种克隆上述的玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得2031bp目的片段后通过TA克隆连接载体；所述的引物序列为：

正向引物从5′端至3′端为：CCCTCAGAACCATACCTT；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC。

本发明首次提出一个新的能够在玉米胚乳中特异表达的14kD zein启动子，该启动子适用于启动目标基因（如GUS基因或GFP基因）在玉米胚乳中的特异性表达。该启动子的特异性很强，因此为植物基因工程表达载体的构建提供了合适的调控元件，也为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。

附图说明

图1 PCR获得玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游2031bp片段电泳图

图2 PCR获得1043bp、588bp、443bp、302bp、202bp、104bp的序列片段

图3 pBI121载体图谱

图4 pUC18载体图谱

图5 B73玉米授粉后14天的籽粒基因枪轰击GUS染色结果

A：35S（正对照） B：B73负对照 C：14kDzein-2031bp片段 D：14kDzein-1043bp片段

E：14kDzein-588bp片段 F：14kDzein-443bp片段 G：14kDzein-302bp片段

图中的标尺长度代表1mm

图6 PBPA玉米幼胚转化流程图

A：取胚侵染 B：共培养 C：恢复培养 D：一轮筛选 E：三轮筛选 F：抗性愈伤

G：暗再生 H：光再生 I：阳性苗入土

图7 PCR检测结果电泳图

A:(bar)14-1-1,2,3,4,5;14-2-2,3;14-4-1,2;14-5-2;14-6-5,6,7,8;14-8-1,2,3,4,5;14-A-12;14-B-27,28;14-C-1,2

B:(GUS)14-1-1,2,3,4,5;14-2-2,3;14-4-1,2;14-5-2;14-6-5,6,7,8;14-8-1,2,3,4,5;14-A-12;14-B-27,28;14-C-1,2

图8 部分事件bar探针Southern杂交检测图

1-5：14kD 5个转基因事件 6：PBPA负对照

图9 植株的叶、根、种皮、胚、胚乳组织的GUS染色结果图

35S-GUS的

A：叶 B：根 C：种皮 D：胚 E：胚乳

14kD-GUS的

A1：叶 B1：根 C1：种皮 D1：胚 E1：胚乳

图中的标尺长度代表1mm。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编， Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：获得启动子片段

在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的碱基序列，具体序列详见SEQ ID NO.1，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得片段，参见图1。扩增片段的引物序列：

正向引物从5′端至3′端为：CCCTCAGAACCATACCTT；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

结果：获得2031bp目的片段后通过TA克隆连接载体，测序比对，与数据库中提供的序列一致。

实施例二：启动子截短片段的获得

根据预测启动子元件的网站（http://www.softberry.com）的预测结果，分别截取1043bp、588bp、443bp、302bp、202bp、104bp大小的碱基序列，PCR获得片段，见图2。扩增片段的引物序列：

1043bp：

正向引物从5′端至3′端为：TCGAGAAATGACGTGGCA；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

588bp：

正向引物从5′端至3′端为：ATTCACGGGTAATCTCAG；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

443bp：

正向引物从5′端至3′端为：TTAATTGGGTGAGAAACA；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

302bp：

正向引物从5′端至3′端为：TAGTTTCGTGAAAAGCAA；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

202bp：

正向引物从5′端至3′端为：CCAAAAGTGAATGAGATG；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

104bp：

正向引物从5′端至3′端为：AAAGCTATAAATAACCGTC；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC；

结果：分别回收不同大小的目的片段后通过TA克隆连接载体，测序比对，与提供的序列一致。

实施例三：截短片段与GUS基因连接，打基因枪，验证启动子核心元件

用SmaⅠ+EcoRⅠ酶点将gusA-NOS片段从pBI121载体（图谱见图3）上酶切连接到pUC18载体（图谱见图4）中，构建pUC18-Gus-nos载体。将克隆到的不同长度的片段回收连接测序验证正确后，用XbaI+SmaI酶切，连入pUC18-Gus-nos，构建pUC18-14kD zein-GUS载体。将构好的载体转入大肠杆菌TOP10中，抽提质粒后打基因枪。

选取B73玉米授粉后14天的籽粒为受体材料，用70%酒精消毒剥去种皮，放到渗透培养基上培养6小时后进行基因枪的瞬时转化。基因枪的轰击参数：压力650，距离3cm，两枪。轰击之后25℃暗培养48小时，GUS染色（图5）。

结果：14kDzein-2031bp、1043bp片段、588bp片段、443bp片段、302bp片段均有GUS表达，说明截短到302bp片段时启动子仍有功能。

实施例四：根据截短片段的功能验证结果，选取1043bp片段构建表达载体，农杆菌转化玉米幼胚

选取pTF102载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。先用PstⅠ酶切pTF102载体去除35S-GUS片段，载体自连。将pUC18-14kD zein-GUS载体中的1043bp启动子片段连接GUS的区段用XbaI+EcoRⅠ酶切后，连入自连后的pTF102载体，构建pTF102-14kDzein-GUS载体，电击转化EHA101菌株。

选取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程（图6）：农杆菌侵染10min-共培养20℃ 3天-恢复培养28℃ 7天-筛选培养（双丙氨磷 1.5mg/l）28℃ 14天-筛选培养（双丙氨磷 3mg/l）28℃ 14天 3-5轮-获得抗性愈伤组织-暗再生培养28℃ 14-21天-光再生培养28℃ 14-21天-获得阳性苗-移入盆中-PCR检测（图7）-Southern检测（图8）-授粉获得后代。

结果：选取约2000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得10个抗性愈伤，经过再生后获得转基因植株，并收获后代。同时选取部分事件的叶子抽提基因组，通过PCR检测及Southern杂交验证转基因结果。

实施例五：GUS染色

选取35S-GUS作为正对照，对转基因植株的叶、根、种皮、胚、胚乳分别进行GUS染色，验证启动子的特异性（图9）。

结果：35S-GUS在玉米植株的叶、根、胚、胚乳均有GUS基因表达，而14kD-GUS在玉米植株的叶、根、种皮组织均没有GUS基因表达，胚组织有少量的表达，只有胚乳组织中GUS基因高效表达，证明14kD启动子的特异性很好。

<120> 玉米胚乳特异表达启动子14kD zein启动子及其克隆方法

<160> 1

<210> 1

<211> 2031

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

CCCTC AGAAC CATAC CTTCC TGTAA CGCAC GCAGA AGCAT GCCTG TAGGC TGTAT CCGAT 60

TGACG AAGAG ACAAG GCAGG CATTG CTGTC CCATA CCAAC CATAA TAAGG CACGT CGCCA 120

TACAC ATGTC GTCTT GGATG ACGTC ACGAC ACGAT GGTGG ATGAC AGAGA AGCCC TTGAA 180

AAAGG GATGG GGCAT CGCCG CGCAT GACTC CCAAC ACCTT CTAGT TATGA CACGC GGGTC 240

CTGTC ATGTG TCACT ACAAG GGAGT TTAGC GCCGG AGTCG CTACA CTAAT CTGCG TACCG 300

GGTAG ACGGA ACGCT CCGCC ATACC GATCA CATGA CCGTC AGAAG ACAAC ATTAG AAGGG 360

ATTGC CGGGG ATCCC ATGGA AAGTC GCTGA GCACT CCCTA AAAAT CCAGT CGACG ACCAG 420

GTCGA TTGTT CAACG TCTCT TCTGT TTTGA CGAGG AGAAG CGCAA GGCCA TAGGC GAGGA 480

GGTCA CCAAG CTTTT AGCGG TAGGG TTTGC AAGAG AAATT CACCA CCCAG TGTGG ATCGC 540

AAATC CAATA ATCGT TAAGA AGAAG AATGG GAGCT GGAGT ATGTG TGTCG ATTAC ATGGG 600

CCATA ACAAG GCATG TCCAA AAGAT CCACT ACAAT GCACA TTCGA GCCTA GCAAC CAGGA 660

TTCAA ATGGA CACCG AGATG ATGGA CACAT CGATG TATAC ACAAA TCCAA CTTAG TTTGG 720

TTGAG CATGT GTGGG GACGT AATCA TCATT AGATT TAAGT AATTT TCTAT TAATT ATTAT 780

GTAAT TTTCT AATTG TAATG TACTT TTCTT TTAAT TGTTA TGCAC TTTGT AATTT TTAAT 840

TTAAT AAAAA ATTAT TACAT ATGTT GTGTA AGCGT TAAAA CAAAT TTGAG AGATT ATTTA 900

ATTCT GAAAT AGAAA AACCG ATGTG GCTAA GCCGA CGCTA TAGCC TGCGG TAGGC TGTAC 960

ACTGG AGCAT TAGAG ACGAG ATTGG AGTCG AGAAA TGACG TGGCA GGGGC GAGAA GGGGA 1020

CGGTG CACTG GCATC AGCCT TGGAG CCTCA TGGCA CCGCC TGTTT GGTTC AACTT TTTTC 1080

TGACC AGCTT TTCCG AGAAT CTAGC TGTGG GGAGA ATCTG GCTGT ATAGA GAATC TGAGT 1140

ATCAT TAGGA TTACG TGCGG AGGAA GATAA AGTTG TCCAT GAGCT CAGGA TCTAT AAAGT 1200

GACGG ATTAC TATAA TTGCG ACGAC TCAAC CGATT ATATG TTTAT GTTGA TTTTG AATGG 1260

TTTTT ATCCA AACGA ATTTT ATAGA AGCTG GCTGA AAAGC TGAGT GTTTG ATAAT CCGTA 1320

ACAGC TTTTG GTAGC CAGAA GCTGC GAAAG CCGAA ACAAA CAGGG GCACA GTAAA GGCGG 1380

ATTGT GAAAC AAACG TCTTC TTGCC GTGTC TCACG GAATT GCAAC ATTCT TGTCG GAAGA 1440

CGCCA CTGTA TTCAC GGGTA ATCTC AGCAC GTTAT AAAGT GGTGA GGAAC GCGGC CGGAA 1500

CAACC ATTGG CATGT AGAGC TCCAT ATATG AGTTG GTGTT ATCCA CCACA ACTCG CAGAA 1560

CATCA CAAAA TGTAC ATCAA GCAGC GATTA ATTGG GTGAG AAACA AATCG GGCGT CTCTC 1620

CGTGT ACAAT GAAAT ATAAT GGTGA GTCAC GAGTC ACGCT GATCT GATGT ATATA TGCTA 1680

ATAGC TCGCA CGACA TTGCA AACAA CTCAT ACCAC TACAT TACAG AGTTA GTTTC GTGAA 1740

AAGCA AGAGT AGGAC GGAGA GGAAA ATAAT CCTTG ACGAC GTGCA CATGA GCCAC ACGCA 1800

AGAGT ACTGA ATAAA TCCAG ATGAA CCCTC CAAAA GTGAA TGAGA TGAGT CATGT ATACA 1860

TTTGG CAAGA AACCG TAGAA GCTAC CGCCA TCGAT TTCAT CATAG AAGAA GAAAT TGTGG 1920

TAATC GGAAA GCTAT AAATA ACCGT CGTAT GCCTA TGCAC TTCTC CACCA CCACC ACTGG 1980

ACGTC AGCCT AGCAA TTAGC TCATC GACTC CAGAT TGGAG AACTC GACAC C 2031

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCCTC AGAAC CATAC CTT 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TCGAG AAATG ACGTG GCA 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ATTCA CGGGT AATCT CAG 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTAAT TGGGT GAGAA ACA 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TAGTT TCGTG AAAAG CAA 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCAAA AGTGA ATGAG ATG 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AAAGC TATAA ATAAC CGTC 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTGT CGAGT TCTCC AATC 19

Claims

1.一种玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列，其特征在于该启动子序列为下列之一：

i） SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的启玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列。

3.一种转基因细胞系，其特征在于该转基因细胞系含有根据权利要求1所述的启动子序列。

4.一种克隆根据权利要求1所述的玉米胚乳特异表达启动子14kD zein的启动子序列的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：在NCBI数据库中找到玉米胚乳特异表达基因14kD zein的ATG上游序列，截取2031bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增技术获得2031bp目的片段后通过TA克隆连接载体；所述的引物序列为：

正向引物从5′端至3′端为：CCCTCAGAACCATACCTT；

反向引物从5′端至3′端为：GGTGTCGAGTTCTCCAATC。