JP4724126B2 - 生化学検査装置および生化学検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、生化学反応を解析するための装置と方法に関する。

近年、ヒトを含む多くの生物やイネをはじめとする多くの植物の遺伝子解析が進められている。最近では、半導体などにＤＮＡを規則正しく配列したＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイを用いた検査方法が開発されている。この検査方法では、同時に複数の遺伝子を検査することができる。同検査方法は、例えば三次元アレイとそれを検出する先行技術例として、特開２００２−３５０４４６号公報に紹介されている。同文献では、通常のダイナミックレンジを有するエリアセンサーまたはラインセンサーを用いて、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する光強度を同時に検出し得る生化学的検査方法を開示している。

特開２００２−３５０４４６号公報は、通常のダイナミックレンジを有するエリアセンサーまたはラインセンサーを用いて、実用上大きなダイナミックレンジで各プローブアレイ要素に対応する光強度を同時に検出し得る生化学検査方法の一つとして、検査者がＮＤフィルターを切り替えて所望のＮＤフィルターを観察光路上に配置する方法を開示している。しかし、検査者がＮＤフィルターを切り替えてアレイ型検出器にすべてのプローブアレイ要素の蛍光画像を取り込ませるには多くのＮＤフィルターを繰り返し抜き差ししなくてはならない。このため、生化学検査用アレイの蛍光画像を得るのに多大な時間がかかり作業効率が著しく悪い。

さらに特開２００２−３５０４４６号公報は、別の生化学検査方法として、ＣＣＤカメラにおけるＣＣＤの蓄積時間を変えることにより蛍光の受光量を変化させる方法を開示している。例えば、蓄積時間を（ｔ０、２ｔ０、４ｔ０、…、２^ｎ−１ｔ０（ｎ＝１，２，…））と一定の比率で順次増加させ、生化学検査用アレイの蛍光画像を取り込み、ＣＣＤが飽和状態になる直前での各蛍光画像を対象画像として画像処理部に送る。しかし、これではプローブアレイの蛍光発光量が少なく、かつ、ＣＣＤの蓄積時間が少ない取り込み条件の場合には、真っ暗な何も写っていない画像を画像処理部に送り続けることになる。さらに、それだけ画像を記憶する領域を無駄に消費してしまう。また特開２００２−３５０４４６号公報は、ＣＣＤの最大蓄積時間の決定方法に関して、生化学検査用アレイにおけるアレイ要素の領域の最小発光強度に対応する受光量がアレイ型検出器の出力特性の線形領域内に存在するという条件によって蓄積時間の最大値を決める方法を開示している。しかし、この方法では、例えば、検査者が生化学的物質の溶液を作成ミスしたために生化学検査用アレイにおける各アレイ要素の発光強度が著しく小さくなってしまった場合、前述の条件を満たすまでに多大な蓄積時間（例えば３００秒）を要し、検査者が負担を強いられるだけでなく、３００秒待っても結局所望の蛍光画像が得られないという検査効率の低下を招くことになる。

本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、生化学検査用アレイの画像解析に最適な強度を持つ画像を効率良く取得する装置と方法を提供することである。

本発明は、ひとつの見地によると、生化学検査用アレイから発せられる蛍光を測定して生化学反応を解析するための生化学的検査装置に向けられている。本発明の生化学的検査装置は、生化学検査用アレイに励起光を照射するための照明手段と、生化学検査用アレイから発せられる光画像を撮影するための撮影手段と、撮影された光画像を保存するための記録手段とを備えており、撮影手段は、露光時間を第一パラメーターで規定された初期値から徐々に長くしながら光画像を繰り返し撮影し、撮影された光画像の全ピクセル中の最大強度が第二パラメーターで規定された強度以上になったら記録手段による光画像の記録が開始され、また、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなったら記録手段による光画像の記録が終了される。

本発明は、別のひとつの見地によると、生化学検査用アレイから発せられる蛍光を測定して生化学反応を解析するための生化学的検査方法に向けられている。本発明の生化学的検査方法は、生化学検査用アレイに励起光を照射し、励起光の照射に応じて生化学検査用アレイから発せられる光画像を、露光時間を第一パラメーターで規定された初期値から徐々に長くしながら繰り返し撮影し、繰り返し撮影の間、撮影された光画像の全ピクセル中の最大強度が第二パラメーターで規定された強度以上になったら光画像の記録を開始し、また、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなったら光画像の記録を終了する。

図１は、本発明の実施形態による生化学検査装置の構成を示している。 図２は、図１に示された生化学検査装置で検査される生化学検査用アレイの平面図である。 図３は、図２に示された生化学検査用アレイのアレイ要素の断面図である。 図４は、図１に示されたコンピューター上で動作する制御プラグラムに読み込まれるイニシャルデータファイルの一部を示している。 図５Ａは、撮影開始直後に撮影された画像を示している。 図５Ｂは、画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になった直後の画像を示している。 図５Ｃは、図５Ｂに示された画像の撮影後に露光時間を長くして撮影された画像を示している。 図５Ｄは、図５Ｃに示された画像の撮影後に露光時間を長くして撮影された画像を示している。 図５Ｅは、図５Ｄに示された画像の撮影後に露光時間を長くして撮影された画像を示している。 図５Ｆは、ＴｒａｎｓＥｎｄと比較される最小強度値が調べられる蛍光画像の全体領域より小さい領域を示している。 図６は、中心部から外周部に向かって照明の強度むらが発生している様子を示している。 図７は、図１に示された生化学検査装置の動作のフローチャートを示している。 図８Ａは、４００ｍｓの露光時間で撮影された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を示している。 図８Ｂは、８００ｍｓの露光時間で撮影された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を示している。 図８Ｃは、１６００ｍｓの露光時間で撮影された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を示している。 図８Ｄは、図８Ａと図８Ｂと図８Ｃの画像に基づいて形成されたハイブリッド画像を示している。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

図１は、本発明の実施形態による生化学検査装置の構成を示している。図１において、励起光源２０４は水銀光源などの種々のランプやＬＥＤなどであり、電源ユニット２０６に接続されている。励起光源２０４から射出される励起光の光路上には、シャッター板２０８ａを内蔵しているシャッターユニット２０８、レンズ２１０、二枚の励起フィルター２１２ａを内蔵しているフィルターユニット２１２、ダイクロイックミラー２１４が配置されている。ダイクロイックミラー２１４の反射光路上には、対物レンズ２１６と生化学検査用アレイ１００が載せられるステージ２０２が配置されている。また、ダイクロイックミラー２１４の透過光路上には、結像レンズ２１８と撮像素子であるＣＣＤカメラ２２０が配置されている。ＣＣＤカメラ２２０は、少なくとも一枚分の撮影画像を一時的に記憶できる不図示のバッファメモリーと、バッファメモリー上の画像に対して信号強度検出などの画像演算が行なえる不図示のシグナルプロセッサとを内蔵している。シャッターユニット２０８とフィルターユニット２１２はユニバーサルコントロールボックス２２２を介してコンピューター２２４によって制御可能となっている。ステージ２０２はＸＹ方向に電動で位置決め可能であり、ステージコントローラー２３２を介してコンピューター２２４により制御可能となっている。コンピューター２２４にはキーボード２２６とモニター２２８とマウス２３０が接続されている。

言い方を変えれば、生化学検査装置２００は、生化学検査用アレイ１００が載せられるステージ２０２と、励起光を発する励起光源２０４と、励起光を生化学検査用アレイ１００に向けて反射するとともに生化学検査用アレイ１００から生じる蛍光を透過するダイクロイックミラー２１４と、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を撮るためのＣＣＤカメラ２２０とを備えている。ここで蛍光画像は光画像の一種である。光画像とは、蛍光、燐光、化学発光、生物発光、散乱光、反射光などの種々の光を信号とした画像のことである。

さらに生化学検査装置２００は、励起光を適宜遮断するためのシャッターユニット２０８と、レンズ２１０と、励起光の波長を選択するためのフィルターユニット２１２とを備えている。シャッターユニット２０８とレンズ２１０とフィルターユニット２１２は、励起光源２０４からダイクロイックミラー２１４までの光路上に順に配置されている。

また生化学検査装置２００は、ダイクロイックミラー２１４とステージ２０２の間に位置する対物レンズ２１６と、ダイクロイックミラー２１４とＣＣＤカメラ２２０の間に位置する結像レンズ２１８とを備えている。

このように構成される光学系において、励起光源２０４とシャッターユニット２０８とレンズ２１０とフィルターユニット２１２とダイクロイックミラー２１４と対物レンズ２１６は、生化学検査用アレイ１００に励起光を照射するための照明手段を構成している。また、対物レンズ２１６と結像レンズ２１８とＣＣＤカメラ２２０は、生化学検査用アレイ１００から発せられる光画像を撮影するための撮影手段を構成している。

さらに生化学検査装置２００は、励起光源２０４を駆動するための電源ユニット２０６と、ステージ２０２を駆動するためのステージコントローラー２３２と、シャッターユニット２０８とフィルターユニット２１２を駆動するためのユニバーサルコントロールボックス２２２とを備えている。

また生化学検査装置２００は、ＣＣＤカメラ２２０とステージコントローラー２３２とユニバーサルコントロールボックス２２２とを制御するコンピューター２２４を備えている。コンピューター２２４にはユーザーインターフェイスとしてキーボード２２６とモニター２２８とマウス２３０が接続されている。コンピューター２２４はハードディスクを内蔵しており、撮影された光画像を保存するための記録手段を構成している。

図２と図３は、図１に示された生化学検査装置によって検査される生化学検査用アレイを示している。生化学検査用アレイ１００は三次元アレイであり、図２に示されるように、多孔質の三次元基材１０２と、三次元基材１０２に形成された多数のプローブアレイ要素（プローブスポット）１０６とを有している。プローブアレイ要素１０６は三次元基材１０２上に二次元的に配列されており、プローブアレイ要素１０６の配列領域の四隅には位置検出用アレイ要素（位置検出用スポット）１０４が形成されている。三次元基材１０２は多数の貫通孔を有しており、図３に示されるように、プローブアレイ要素１０６内に位置する貫通孔１０８の内壁には特定の物質と反応するプローブ１１０が固相化されている。プローブアレイ要素（プローブスポット）１０６は例えばプローブを含む溶液を三次元基材１０２上に必要量を分注することにより形成される。

三次元基材１０２上の複数のプローブアレイ要素１０６は複数の種類を含んでいる。各プローブアレイ要素１０６は同じ種類のプローブ１１０を含んでおり、そのプローブ１１０が特定の物質と反応すると、特定の励起光の照射に対して特定の蛍光を発光するようになる。

生化学検査装置２００は、コンピューター２２４上で動作する制御プログラムによって制御される。言い換えれば、コンピューター２２４は、生化学検査装置２００全体を制御するための制御プログラムを含んでいる。この制御プログラムは、図４に示されるようなイニシャルデータファイルから制御プログラム自身の動作や各ユニットの動作パラメーターを読み出して生化学検査装置２００全体を制御する。

図４は、イニシャルデータファイルの一部を抜き出して示している。検査者または装置の管理者はこのイニシャルデータファイルを一般的なエディターなどにより簡単に修正変更することができる。つまり、検査者や装置管理者は、モニター２２８を見ながら、キーボード２２６を操作して、必要であればマウス２３０も操作して、イニシャルデータファイルを容易に修正変更できる。イニシャルデータファイルは種々のパラメーターを含んでおり、モニター２２８とキーボード２２６、さらにマウス２３０は、イニシャルデータファイル中のパラメーターを任意に設定することを可能にするための入力手段を構成している。

図４に示されているパラメーターは、ＣＣＤカメラ２２０によって生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を撮影する際の撮影パラメーターである。

ＥｘｐＳｔａｒｔは、ＣＣＤカメラ２２０が生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を撮影する際の露光時間（ＣＣＤの電荷蓄積時間）の初期値である。検査者が生化学検査用アレイ１００の蛍光画像の撮影開始を指示すると、ＣＣＤカメラ２２０は、ここに示されている初期値から徐々に長くなるように露光時間を変化させながら、生化学検査用アレイ１００を繰り返し撮影する。露光時間は、これに限らないが、例えば１０×２^ｎ−１（ｎ＝１，２，…）［ｍｓ］の割合で変化される。

ＴｒａｎｓＳｔａｒｔは、ＣＣＤカメラ２２０が蛍光画像の記録（保存）開始を判断するためのピクセル強度値の基準値である。すなわち、ＣＣＤカメラ２２０は、撮影された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像の全ピクセル中で最も明るいピクセルの強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔの値以上になったらコンピューター２２４に画像データを転送するのを開始し、これに応じて記憶装置（コンピューター２２４内のハードディスク）は画像データの記録（保存）を開始する。

ＴｒａｎｓＥｎｄは、ＣＣＤカメラ２２０が蛍光画像の記録（保存）終了を判断するためのピクセル強度値の基準値である。すなわち、ＣＣＤカメラ２２０は、撮影された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像の全体領域より小さい中心付近の領域内のピクセル中で最も暗いピクセルの強度値がＴｒａｎｓＥｎｄの値より大きくなったらコンピューター２２４に画像データを転送するのを終了し、これに応じて記憶装置（コンピューター２２４内のハードディスク）は画像データの記録（保存）を終了する。

ＴｔａｎｓＰｉｃｔｓは、ＣＣＤカメラ２２０が蛍光画像の記録（保存）終了を判断するための記録（保存）枚数の基準値である。すなわち、ＣＣＤカメラ２２０は、コンピューター２２４に転送した生化学検査用アレイの蛍光画像の枚数がＴｔａｎｓＰｉｃｔｓの値よりも大きくなったらコンピューター２２４に画像データを転送するのを終了し、これに応じて記憶装置（コンピューター２２４内のハードディスク）は画像データの記録（保存）を終了する。

ＭａｘＥｘｐＴｉｍｅは、ＣＣＤカメラ２２０が蛍光画像の記録（保存）終了を判断するための露光時間の基準値である。すなわち、ＣＣＤカメラ２２０は、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を撮影する露光時間がＭａｘＥｘｐＴｉｍｅ値よりも大きくなったらコンピューター２２４に画像データを転送するのを終了し、これに応じて記憶装置（コンピューター２２４内のハードディスク）は画像データの記録（保存）を終了する。

次に、生化学検査装置２００の動作について述べる。

検査者は、生化学検査の準備として例えば二色の蛍光分子（または化学発光分子）で標識された二種の生化学的物質を含有した溶液を作成する。この場合、検査者は、比較したい二種の生化学的物質の溶液を同一濃度で作成し、一方をＦＩＴＣで、他方をローダミンで標識する。これらの標識物質は、蛍光波長の異なる物質の組み合わせであれば他の物質でも構わない。その後、作成した二種の生化学的物質の溶液を体積比で１：１の割合で混合して撹拌し、生化学的物質の混合溶液とする。混合比率については、二種の生化学的物質の溶液および標識物質の特性に応じて変更してもよい。

検査者は、生化学検査用アレイ１００に生化学的物質の混合溶液を供給してプローブと特異的に反応させる。この場合、検査者は、図１に示した生化学検査装置２００による観察下で、ステージ２０２上に生化学検査用アレイ１００を配置し、その表面に一様に生化学的物質の混合溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１００上のプローブアレイ要素１０６内のプローブと混合溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素１０６内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子（または化学発光分子）が間接的にプローブに結合することになる。

検査者は、生化学検査用アレイ１００から未反応の生化学的物質を除去する。この場合、検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１００の各プローブアレイ要素１０６から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去してもよい。ただし、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。

検査者は、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を標識物質ごとにＣＣＤカメラ２２０で撮り込むために、モニター２２８を通してコンピューター２２４を操作する。検査者がモニター２２８上に表示されている「撮影」ボタンをマウス２３０によりクリックすると、コンピューター２２４はユニバーサルコントロールボックス２２２にコマンドを送信し、フィルターユニット２１２に内蔵されている二枚の励起フィルター２１２ａを切り替えて所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルターを照明光路上に配置する。そして、同じくコンピューター２２４はユニバーサルコントロールボックス２２２にシャッターユニット２０８に内蔵されているシャッター板２０８ａを開くコマンドを送信する。これにより励起光源２０４からの励起光は、レンズ２１０と励起フィルター２１２ａを通過し、ダイクロイックミラー２１４によって反射され、対物レンズ２１６を介して生化学検査用アレイ１００の上面全体に照射される。その結果、各プローブアレイ要素１０６内の蛍光分子が発生する蛍光は対物レンズ２１６とダイクロイックミラー２１４と結像レンズ２１８を通過してＣＣＤカメラ２２０に導かれる。

ＣＣＤカメラ２２０は、露光時間（蓄積時間）をイニシャルデータファイルに書かれたＥｘｐＳｔａｒｔで示される初期値から徐々に長くしながら繰り返し撮影する。本実施形態では、ＥｘｐＳｔａｒｔは１０ｍｓであり、露光時間（蓄積時間）は１０×２^ｎ−１（ｎ＝１，２…）ｍｓの割合で増加される。撮影が終了するたびに、撮影された蛍光画像の全ピクセルの強度の最大値がイニシャルデータファイルに書かれたＴｒａｎｓＳｔａｒｔで示されるピクセル強度以上になっているかがスキャンして判断される。

ＣＣＤカメラ２２０は、画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔより小さい間はコンピューター２２４に画像データを転送しない。図５Ａは、撮影開始直後に撮影された画像を示している。すなわち、１０ｍｓの露光時間で撮影された画像を示している。図５Ａの画像では、全ピクセルの強度値の最大値はＴｒａｎｓＳｔａｒｔより小さい。このためＣＣＤカメラ２２０は、図５Ａの画像データはコンピューター２２４に転送しない。ＣＣＤカメラ２２０は、画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になるまで同じ動作を繰り返す。

ＣＣＤカメラ２２０は、画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になったら、コンピューター２２４への画像データの転送を開始する。図５Ｂは、画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になった直後の画像を示している。図５Ｂの画像では、画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になっており、二つのプローブアレイ要素が現われている。このためＣＣＤカメラ２２０は、図５Ｂの画像データをコンピューター２２４に転送する。転送された画像データは、コンピューター２２４内のハードディスクに記録（保存）される。

ＣＣＤカメラ２２０は、蛍光画像の全体領域より小さい中心付近の領域内の最小強度値がＴｒａｎｓＥｎｄ以下である間はコンピューター２２４に画像データの転送を続ける。露光時間が長くなるにつれて、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像には、順に、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅに示されるように、だんだん多くのプローブアレイ要素が現われてくる。

ＣＣＤカメラ２２０は、蛍光画像の全体領域より小さい領域内の最小強度値がＴｒａｎｓＥｎｄより大きくなったら、コンピューター２２４への画像データの転送を終了する。これにより、コンピューター２２４内のハードディスクへの画像データの記録（保存）が終了される。

このとき、画像データをいったんコンピューターに送り、保存するか否かを判断するようにしてもよい。この場合は、ＣＣＤカメラに画像演算用のシグナルプロセッサが不要になる。

より好ましくは、画像データをコンピューター２２４に転送している間、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像の撮影をする際に、それぞれの露光時間に対して照明光を当てない状態、つまりシャッターユニット２０８を閉じた状態でも撮影し、その画像データをコンピューター２２４へ転送する。そして、同じ露光時間において照明光が当たった状態での生化学検査用アレイ１００の蛍光画像からシャッターユニット２０８を閉じた状態で撮影した画像をコンピューター２２４により引き算演算を行ない、ＣＣＤカメラ２２０自体によって発生する暗ノイズを除去する処理をする。また、このノイズ除去処理はＣＣＤカメラ２２０内で行ない、処理後の画像をコンピューター２２４に転送してもよい。そのようにすれば、転送処理が一度で済むのでさらに処理速度の向上が図れる。

通常、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を露光時間を長くしながら撮影してゆくと、照明光学系の収差や観察光学系（本実施形態ではＣＣＤカメラの撮影光学系）の収差の影響により、図５Ｄから図５Ｅへの変化から分かるように、また図６に示されるように、中心部から外周部に向かって強度むらが発生する。これにより、中心部と周辺部では発光蛍光量が同じプローブアレイ要素でもＣＣＤカメラ２２０で撮影されたときに異なる強度値で撮影されてしまうことになり、正しい正確な生化学検査を行なうことができない。このため、コンピューター２２４は、生化学検査用アレイ１００の照明強度むら分布から補正係数を算出し、既に記録（保存）されている画像に対して、露光時間ごとにすべてのプローブアレイ要素の蛍光発光強度を算出した補正係数により補正する。言い換えれば、コンピューター２２４は、保存されている画像に対して露光時間ごとにすべてのプローブアレイ要素の蛍光発光強度を照明強度むら分布から算出した補正係数により補正する補正手段を構成している。

本実施形態では、この補正係数を算出するための画像として、蛍光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル強度の最小値がＴｒａｎｓＥｎｄより大きくなる直前にコンピューター２２４に転送された画像を用いる。これは、ＣＣＤカメラ２２０のダイナミックレンジを有効に利用して、より正確な補正係数を算出するためである。このとき得られる生化学検査用アレイ１００の蛍光画像は例えば図５Ｅで示されるような画像であるが、このままではプローブアレイ要素が蛍光発光しているので、画像にフィルター処理を施して画素補間によりプローブアレイ要素を消去して図６で示されるような補正係数計算用画像をつくり出す。この補正係数計算用画像から補正係数が算出される。

通常、上述した一連の動作によって、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像は問題なく撮影される。しかし、検査者が生化学物質の混合溶液を間違えていた場合や、プローブアレイ要素が正しく作成されていなかったなどの場合、生化学検査用アレイ１００内で正しい結合反応が行なわれず、その結果、プローブアレイ要素が蛍光を期待通り発しないこともある。その場合には、生化学検査用アレイ１００中の最大強度がＴｒａｎｓＳｔａｒｔで示されるピクセル強度より大きくなるまでに相当に長い時間が必要になる。その場合、実験そのものが失敗である上に露光時間が相当に長くなるまで無意味に待つことになるので検査に無駄な時間を費やすことになる。

このような事態を避けるため、本実施形態では、繰り返し撮影の間に、露光時間がＭａｘＥｘｐＴｉｍｅより大きくなったら、その時点で、所望の画像を撮影できなかった旨のメッセージをモニター２２８に表示し、撮影を終了する。

また、これまでの経験から、露光時間の増加の割合を考慮して、生化学検査用アレイ１００の蛍光画像の必要な枚数の見当がつくことも少なくない。その場合、蛍光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル強度の最小値がＴｒａｎｓＥｎｄより大きくなるまで待つことは、検査に無駄な時間を費やすことになる。

このため、本実施形態では、繰り返し撮影の間に、ＴｒａｎｓＰｉｃｔｓで示される枚数より大きくなったら、その時点で、ＴｒａｎｓＰｉｃｔｓで示される枚数に達した旨のメッセージをモニター２２８に表示し、撮影を終了する。

上述した一連の動作のフローチャートを図７に示す。図７から分かるように、上述した一連の動作を要約すると次のようになる。まずＥｘｐＳｔａｒｔの露光時間で生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を撮影する。蛍光画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔより小さければ露光時間を増加して生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を再び撮影する。以降、撮影された蛍光画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になるまで、露光時間の増加と生化学検査用アレイ１００の蛍光画像の撮影とを繰り返し行なう。撮影された蛍光画像の全ピクセルの最大強度値がＴｒａｎｓＳｔａｒｔ以上になったら、画像データをコンピューター２２４に転送してコンピューター２２４内のハードディスクに記録（保存）するとともに、記録枚数をカウントする。これ以降、露光時間の増加、撮影、画像データの転送と記録、記録枚数のカウントを繰り返し行なう。その間、蛍光画像の全体領域より小さい領域内の最小強度値がＴｒａｎｓＥｎｄより大きくなるか、記録枚数がＴｒａｎｓＰｉｃｔｓより大きくなるか、露光時間がＭａｘＥｘｐＴｉｍｅより大きくなるかしたら、撮影を終了する。

上述のようにして撮影・転送・画像処理によって取得された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像は、コンピューター２２４によってプローブアレイ要素ごとに分割され、分割画像として保存される。そのとき、各分割画像には、プローブアレイ要素領域の最大強度値と露光時間がデータとして加えられる。これをすべての露光時間に対して行ない、最終的にハイブリッド画像を作成する。ハイブリッド画像について、図８Ａないし図８Ｄを用いて説明する。

図８Ａと図８Ｂと図８Ｃは、それぞれ、４００ｍｓと８００ｍｓと１６００ｍｓの露光時間で撮影された生化学検査用アレイ１００の蛍光画像を示している。図８Ａの蛍光画像では、プローブアレイ要素Ａ１とＡ９の強度値は２００と低く、画面上では光が確認できない。また、本実施形態で使用されているＣＣＤカメラ２２０では、ＣＣＤおよびその周辺回路の関係上、強度値が４００〜３０００の範囲を最もリニアで信頼できる範囲としている。

コンピューター２２４は、プローブアレイ要素のそれぞれについて、記録（保存）された複数の画像の中から３０００以下で３０００に最も近い強度値とその露光時間を探し出す。具体的には、図８Ａと図８Ｂと図８Ｃの画像において、プローブアレイ要素のそれぞれについて強度値を検出し、同一のプローブの複数の強度値（例えばＡ１とＢ１とＣ１の強度値）の中から、３０００に最も近い強度値のデータとその露光時間のデータとを取り出す。すべてのプローブアレイ要素に対してこの作業が終了すると、すべてのプローブアレイ要素に対して強度値を例えば一秒の露光時間に換算して（規格化して）、換算後のすべてのプローブアレイ要素の画像を合成して図８Ｄに示されるハイブリッド画像を形成し、これを擬似グラフィック画像としてモニター２２８に表示する。

検査者は、この擬似グラフィック画像と強度値の換算データに基づいて各プローブアレイ要素の反応度合いを検査する。

これまでの説明から分かるように、本実施形態の生化学検査装置によれば、記録（保存）される生化学検査用アレイの蛍光画像は所望の強度範囲にあるものであるため、無駄な画像が記録（保存）されることが防止される。さらに、最大露光時間を規定することにより、また蛍光画像の取得枚数を規定することにより、無意味な時間の浪費が防止される。従って、画像解析に最適な強度を持つ生化学検査用アレイの画像が効率良く取得できる。

本実施形態では、生化学的物質の標識に蛍光色素を用い、生化学検査用アレイを光源により照明して蛍光を光画像として取得する場合について説明した。蛍光物質は種々の特性を有するものが数多くあり、用途により選択の範囲が広いので好ましい。しかし、これ以外にも、種々の検出方法や標識を本発明に適用することが可能である。化学発光や生物発光を用いる場合は、生化学検査用アレイを照明する光源は不要である。例えば、酵素を生化学的物質の標識に用い化学発光法により検出を行う場合は、酵素と基質の反応により発光するので、生化学検査用アレイを照明する光源は不要である。この場合は、図１において、ユニバーサルコントロールボックス２２２、フィルターユニット２１２、レンズ２１０、シャッターユニット２０８、励起光源２０４、電源ユニット２０６は必ずしも必要ではなくなる。

また蛍光で検出する場合も種々の蛍光物質を標識として用いることが可能である。蛍光色素のほかに、蛍光ガラス粒子、蛍光セラミックス、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質なども用いることができる。散乱光や反射光で検出を行う場合は、金属粒子や誘電体粒子を標識として用いる。例えば金微粒子、銀、白金、シリコンなどの微粒子やラテックス粒子を用いることができる。特に、金、銀、白金などの微粒子は、粒径が０．１〜１μｍのものが、同様に、運動状態にある粒子の速さが最適となるため特に好ましい。最適な粒径は、粒子の比重とブラウン運動の速さにより決定される。ここで、粒子の運動状態は、例えばブラウン運動や振動などがあげられる。

以上のように、生化学的物質を標識して検出する場合に、蛍光色素だけでなく他の標識を用いた場合にも本発明は適用が可能である。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

例えば、図７に示されたフローチャートにおいて、繰り返し撮影の間に露光時間がＭａｘＥｘｐＴｉｍｅより大きくなったら撮影を終了する処理は省略されてもよい。同様に、繰り返し撮影の間にＴｒａｎｓＰｉｃｔｓで示される枚数より大きくなったら撮影を終了する処理も省略されてもよい。

また実施形態では、露光時間を１０×２^ｎ−１［ｍｓ］に従って増加させているが、これは本発明者らが経験的に特に有効であることを確認したものでる。しかし、露光時間の増加の仕方はこれに限定されるものではない。例えば、露光時間は一定の比率により（等比数列的に）増加されてもよく、また一定の増分により（等差数列的に）増加されてもよい。さらには、連続する二つの露光時間の間に規則性のない所定の増加パターンに従って増加されてもよい。

露光時間を増加させる好適な割合は、カメラの特性（ダイナミックレンジ（入力に対して出力の直線性がよい範囲）、光電変換効率、１ピクセル当たりの飽和電荷量）と、取得したい信号の最小と最大の差とに依存する。つまり、使用するカメラと検出の対象物によって異なる。このため、何回か実験を繰り返し、その結果に基づいて決められるとよい。

露光時間の増加の割合は小さいほど、取得する情報量は多くなる反面、処理に要する時間は長くなる。従って、露光時間の増加の割合は、取得する情報量と処理に要する時間のトレードオフを考慮した上で決められるとよい。

また、似たようなサンプルと反応済みの多数の生化学検査用アレイを検査する場合、生化学検査用アレイの検査の都度、検査条件をフィードバックして、露光時間の増加の割合の最適化を図りながら検査してもよい。これは、処理に要する時間を短縮する上で有効である。

本発明によれば、生化学検査用アレイの画像解析に最適な強度を持つ画像を効率良く取得する装置と方法が提供される。

Claims (16)

1. 生化学検査用アレイから発せられる光を測定して生化学反応を解析するための生化学的検査装置であり、
   生化学検査用アレイに励起光を照射するための照明手段と、
   生化学検査用アレイから発せられる光画像を撮影するための撮影手段と、
   撮影された光画像を保存するための記録手段とを備えており、
   撮影手段は、露光時間を第一パラメーターで規定された初期値から徐々に長くしながら光画像を繰り返し撮影し、
   撮影された光画像の全ピクセル中の最大強度が第二パラメーターで規定された強度以上になったら記録手段による光画像の記録が開始され、また、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなったら記録手段による光画像の記録が終了される、生化学検査装置。
2. 請求項１において、記録手段は、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなる前に、露光時間が第四パラメーターで規定された値より大きくなったら、その時点で光画像の記録を終了する、生化学検査装置。
3. 請求項１において、記録手段は、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなる前に、記録された光画像の枚数が第五パラメーターで規定された値より大きくなったら、その時点で光画像の記録を終了する、生化学検査装置。
4. 請求項１において、記録手段は、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなる前に、露光時間が第四パラメーターで規定された値より大きくなるか、記録された光画像の枚数が第五パラメーターで規定された値より大きくなるかしたら、その時点で光画像の記録を終了する、生化学検査装置。
5. 請求項１において、撮影手段は露光時間を規定の割合で長くする、生化学検査装置。
6. 請求項１ないし請求項４のいずれか一つにおいて、使用者が少なくとも第一パラメーターないし第五パラメーターのいずれか一つを任意に設定することを可能にするための入力手段をさらに備えている、生化学検査装置。
7. 請求項１ないし請求項４のいずれか一つにおいて、保存されている画像に対して露光時間ごとにすべてのプローブアレイ要素の発光強度を照明強度むら分布から算出した補正係数により補正する補正手段をさらに備えている、生化学検査装置。
8. 請求項１ないし請求項４のいずれか一つにおいて、記録手段に記録された複数の光画像から一枚のハイブリッド画像を形成するための画像形成手段をさらに備えており、画像形成手段は、記録手段に保存された複数の光画像をプローブアレイ要素ごとに分割し、プローブアレイ要素のそれぞれについて好適な強度値の分割画像を選択し、選択したすべての分割画像における強度値を同一の露光時間に換算し、換算後のすべてのプローブアレイ要素の分割画像を合成して一枚のハイブリッド画像を形成する、生化学検査装置。
9. 請求項１ないし請求項４のいずれか一つにおいて、撮影手段は撮像素子を有し、撮像素子はＣＣＤカメラである、生化学検査装置。
10. 生化学検査用アレイから発せられる光を測定して生化学反応を解析するための生化学的検査方法であり、
    生化学検査用アレイに励起光を照射し、
    励起光の照射に応じて生化学検査用アレイから発せられる光画像を、露光時間を第一パラメーターで規定された初期値から徐々に長くしながら繰り返し撮影し、
    繰り返し撮影の間、撮影された光画像の全ピクセル中の最大強度が第二パラメーターで規定された強度以上になったら光画像の記録を開始し、また、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなったら光画像の記録を終了する、生化学検査方法。
11. 請求項１０において、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなる前に、露光時間が第四パラメーターで規定された値より大きくなったら、その時点で光画像の記録を終了する、生化学検査方法。
12. 請求項１０において、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなる前に、記録された光画像の枚数が第五パラメーターで規定された値より大きくなったら、その時点で光画像の記録を終了する、生化学検査方法。
13. 請求項１０において、撮影された光画像の全体領域より小さい領域内のピクセル中の最小強度が第三パラメーターで規定された強度より大きくなる前に、露光時間が第四パラメーターで規定された値より大きくなるか、記録された光画像の枚数が第五パラメーターで規定された値より大きくなるかしたら、その時点で光画像の記録を終了する、生化学検査方法。
14. 請求項１０において、露光時間を規定の割合で長くする、生化学検査方法。
15. 請求項１０ないし請求項１３のいずれか一つにおいて、保存されている画像に対して露光時間ごとにすべてのプローブアレイ要素の発光強度を照明強度むら分布から算出した補正係数により補正する、生化学検査方法。
16. 請求項１０ないし請求項１３のいずれか一つにおいて、記録手段に保存された複数の光画像をプローブアレイ要素ごとに分割し、プローブアレイ要素のそれぞれについて好適な強度値の分割画像を選択し、選択したすべての分割画像における強度値を同一の露光時間に換算し、換算後のすべてのプローブアレイ要素の分割画像を合成して一枚のハイブリッド画像を形成する、生化学検査方法。

Images