DE102004045131B4

DE102004045131B4 - Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung in einem Biochip-Leser und Biochip-Leser

Info

Publication number: DE102004045131B4
Application number: DE102004045131A
Authority: DE
Inventors: Yumiko Musashino Sugiyama; Takeo Musano Tanaami
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2024-09-18
Also published as: US7666663B2; US7910357B2; DE102004045131A1; CN1637408A; US20050142579A1; CN1637408B; US20070141623A1; JP2005181244A

Abstract

Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung in einem Biochip-Leser, der zum Lesen eines Messprobenbildes durch Lichtstrahlbeleuchten verwendet wird, die Schritte umfassend:
Teilen der Werte jedes Pixels (a_i) eines Bildes, das durch Messen der gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte, die eine gleichmäßige Fluoreszenzverteilung darstellt, erhalten wird, durch jeweils den mittleren Wert des Gesamtbildes (a_Ave), um ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild aus korrigierten Pixels (a_i') zu erhalten; und
Teilen der Lichtmengenwerte jedes Pixels (b_i) in dem gemessenen Bild, das durch das Messen einer Messprobe erhalten wird, durch einen Lichtmengenwert eines entsprechenden Pixels (a_i') des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds, in dem sämtliche Positionen der Pixel (b_i) in dem gemessenen Bild denen der entsprechenden Pixel (a_i') des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds entsprechen, wodurch eine Ungleichmäßigkeit der Lichtmenge in der Lichtstrahlbeleuchtung korrigiert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biochip-Leser und auch ein Verfahren zum Korrigieren des Einflusses der Intensitätsverteilung (Abblenden bzw. Schattenbildung) einer Lichtquelle (Erregungslicht). Insbesondere ist der Einfluss dieses Abblendens groß bei einem Biochip-Leser vom abtastlosen Typ, in dem ein weiter Biochip-Bereich gleichzeitig mit einer Vielzahl von Lichtstrahlen gemessen wird.

Diese Art von Biochip-Lesern vom abtastlosen Typ ist aus der Vergangenheit bestens bekannt.

In der US 5 243 401 wird ein Densitometer offenbart, das ein optisches System zum Abtasten und Bestrahlen einer Messplatte, ein Fluoreszenzdetektionssystem, eine Platte, die gleichmäßig mit einem Fluoreszenzmittel versehen ist, eine Korrekturtabelle, die Daten über die gleichmäßig mit einem Fluoreszenzmittel versehene Platte enthält, und eine Recheneinheit, die detektierte Fluoreszenzdaten einer Probe durch die gespeicherten Referenzdaten der genannten Platte umfasst.

Die WO 98/49537 A1 beschreibt ein Verfahren zur Kalibration in der optischen Mikroskopie unter Verwendung einer leuchtenden Kalibrationsschicht.

Die Kalibration und somit die nachfolgende Messung von Proben erfolgt auf der Grundlage von charakteristischen Photobleichkurven der Kalibrationsschicht.

In der US 2003/0105195 A1 wird ein Kalibrationselement zur Kalibration eines optischen Scanners beschrieben, das eine Polymerschicht mit einem Fluoreszenzmittel umfasst.

In der WO 2004/023117 A1 wird ein Bildverarbeitungsverfahren beschrieben, gemäß dem eine Aufnahme einer Probe mithilfe einer Referenzaufnahme korrigiert wird.

1 ist eine Konfigurationszeichnung, die den wesentlichen Teil eines Beispiels des Biochip-Lesers vom abtastlosen Typ angibt, der in der JP 2003-028799 A beschrieben ist.

Gemäß 1 wird aus Laserlicht (Erregungslicht), das von einer Lichtquelle emittiert wird, paralleles Licht und trifft auf ein Mikrolinsenfeld 1 auf. Das Mikrolinsenfeld 1 ist eine Anordnung aus einer Vielzahl von Mikrolinsen (ML) und Erregungslicht, das durch jede Mikrolinse (ML) gebündelt wird, bestrahlt eine Messprobe 3, nachdem es einen dichroitischen bzw. zweifarbigen Spiegel 2 durchwandert hat. Die Messprobe 3 ist derart aufgebaut, dass eine Vielzahl von Zellen (Orten) in einer zweidimensionalen Art angeordnet ist und eine Probe in jeder Zelle (Ort) eingefüllt ist.

Fluoreszierendes Licht von einer Probe wird durch den dichroitischen Spiegel 2 reflektiert und fällt auf eine Linse 5 über ein Sperrfilter 4. Das Sperrfilter 4 hat den Betriebseffekt, dass es fluoreszierendes Licht von einer gemessenen Probe 3 durchlässt, aber Erregungslicht dämpft, das von der Messprobe 3 reflektiert wird, und wird dazu verwendet, das Hintergrundlicht des Probenbildes zu eliminieren. Ein Probenbild, das durch eine Linse 5 fokussiert und ausgebildet wird, wird von der Kamera 6 eingefangen.

Gemäß einem solchen Aufbau kann eine Vielzahl von Zellen (Orten) auf einem Biochip zur gleichen Zeit wie ein abtastloses Verfahren gemessen werden, indem das Erregungslicht nicht gerastert wird.

Bei diesen herkömmlichen Biochip-Lesern wird aus der Verteilung der Erregungslichtintensität die Verteilung der Erregungslichtintensität auf einer Messebene eines Biochips ohne Änderung und die Erregungslichtintensität ist an jedem Ort unterschiedlich, sogar auf dem gleichen Chip. Herkömmliche Biochip-Leser haben deshalb i.a. die nachfolgenden Probleme:

(1) Es gibt Abschnitte auf einem Biochip, wo das Erregungslicht stark ist, und Abschnitte auf einem Biochip, wo das Erregungslicht schwach ist. Dies beeinträchtigt die Menge der Emission des Fluoreszenzlichtes. Insbesondere sind Unterschiede zwischen diesen starken und schwachen Lichtintensitäten extrem groß für Leser vom abtastlosen bzw. rasterlosen Typ.
(2) Wenn die Mengen des Lichtes einfach unter Verwendung eines bestimmten Faktors korrigiert werden, werden sie in dem Fall unbekannt, in dem das Kalibrierungssystem für die absolute Lichtmenge verwendet wird, das ein Leistungsmeter verwendet, welches an die nationalen Standards angepasst werden kann.
(3) Wenn die Lichtmengen einfach unter Verwendung eines bestimmten Faktors korrigiert werden, können Pixel leicht gesättigt werden oder die Bildtöne über die gesamten Bildpixel können über den Messbereich abgesenkt werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung bereitzustellen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung in einem Biochip-Leser, der zum Lesen eines Messprobenbildes durch Lichtstrahlbeleuchten verwendet wird, die Schritte umfassend: Teilen der Werte jedes Pixels eines Bildes, das durch Messen der gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte, die eine gleichmäßige Fluoreszenzverteilung darstellt, erhalten wird, durch jeweils den mittleren Wert des Gesamtbildes, um ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild aus korrigierten Pixels zu erhalten; und

Teilen der Lichtmengenwerte jedes Pixels in dem gemessenen Bild, das durch das Messen einer Messprobe erhalten wird, durch einen Lichtmengenwert eines entsprechenden Pixels des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds, in dem sämtliche Positionen der Pixel in dem gemessenen Bild denen der entsprechenden Pixel des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds entsprechen, wodurch eine Ungleichmäßigkeit der Lichtmenge in der Lichtstrahlbeleuchtung korrigiert wird.

Zudem wird ein Biochip-Leser bereitgestellt, der das zuvor beschriebene Verfahren verwendet.

Das Verfahren und der Biochip-Leser werden in der Folge mit Hilfe der Zeichnungen näher beschrieben.
1 ist eine Konfigurationszeichnung, die den wesentlichen Teil eines herkömmlichen Biochip-Lesers vom rasterlosen Typ zeigt (Stand der Technik);
2 erläutert das Korrekturverfah- ren für die Lichtmengenverteilung, gemaß vorliegender Erfindung;
3 erläutert die Lichtintensitätsverteilung und die Verteilung der Lichtmenge für einen Biochip-Leser vom rasterlosen Typ; und
4 ist eine Konfigurationszeichnung, die den wesentlichen Teil einer Ausführungsform eines Biochip-Lesers zeigt, der das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail unter Verwendung der Zeichnungen beschrieben. Die Prozedur des Korrekturverfahrens der Lichtmengenverteilung wird nachfolgend erläutert. Ein Biochip-Leser kann entweder vom abtastlosen bzw. rasterlosen Typ oder vom Abtasttyp bzw. Rastertyp sein.

(1) Zuerst wird eine gleichmäßige, fluoreszierende Platte vorbereitet bzw. hergestellt, die eine gleichmäßige Verteilung des fluoreszierenden Lichtes in einem Bereich bereitstellt, der ein Gebiet hat, das äquivalent bzw. gleich zu einem Messgebiet für eine Messprobe ist. Dann wird ein fluoreszierendes Bild dieser gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte, das heißt, das Referenzmengenlichtverteilungsbild "a", gemessen, indem Erregungslicht unter Verwendung eines Biochip-Lesers aufgestrahlt wird. Der Wert (die Lichtintensität) jedes Pixels ist in diesem Fall gegeben als "a_i" ("i" zeigt die Anzahl der Pixel und nimmt einen Wert 1 bis n an).
(2) Der Durchschnittsfarbton "a_Ave" des vorstehend erhaltenen Referenzmengenlichtverteilungsbilds "a" wird bestimmt und dann wird das Lichtquellenintensitätskorrekturbild "a'" bestimmt, indem die Werte jedes Pixels durch diesen Durchschnittsfarbton bzw. Durchschnittston "a_Ave" geteilt werden [die Werte jedes Pixels werden durch "a'_i" (i = 1 bis n) wiedergegeben].

Dies ermöglicht, dass ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild erhalten wird, in dem der Ton bzw. Farbton oder die Tönung des Referenzmengenlichtverteilungsbildes "a" auf 1 normalisiert ist und der Gesamtenergiewert unverändert bleibt, wie in 2A gezeigt ist. Zudem zeigt 2 Bilder, die mit einem Biochip-Leser vom Abtasttyp gemessen werden.

(3) Eine Messprobe wird unter Verwendung einer Lichtquelle der gleichen Intensitätsverteilung in dem gleichen Biochip-Leser, wie vorstehend erwähnt wurde, gemessen, um ein Messprobenbild "b" zu erhalten [Werte jedes Pixels sind "b_i" (i = 1 bis n)], wie in 2B gezeigt ist.
(4) Als Nächstes, wie in der Gleichung (1) gezeigt ist, wird ein Korrekturprobenbild "c" [Werte jedes Pixels sind "c_i" (i = 1 bis n)] bestimmt, indem das Messprobenbild "b" durch das oben beschriebene Lichtquellenintensitätskorrekturbild "a'" geteilt wird. ci= bi – a'i (1)

Gemäß diesem Korrekturverfahren werden die nachfolgenden Effekte erhalten:

(1) Die Normalisierung des Farbtones bzw. der Tönung des Lichtquellenintensitätskorrekturbildes auf 1: ergibt keine Änderung der Totalenergie, das heißt, die Totalmenge der Lichtenergie wird bsibehalten, und verhindert, dass Werte der Pixel extrem große oder kleine Werte annehmen.
(2) Fluoreszierende Bilder der Orte, die nicht in 2B aufgrund des Fehlens der Gleichmäßigkeit der Lichtmengenverteilung der Lichtquelle gesehen werden können, werden sichtbar, indem die Korrektur durchgeführt wird, wie in dem Kreis unten links von 2C gezeigt ist. Anders ausgedrückt werden hochempfindliche Messungen ermöglicht.

Zudem, wenn ein Biochip-Leser vom abtastlosen Typ ist, der einen Lichtstrahl nicht abtastet bzw. nicht rastert, wird eine sehr viel ungleichmäßigere Lichtverteilung als jene in dem Bild, das in 2B gezeigt ist, erzeugt, wie in 3A gezeigt ist. Die Verteilung kann jedoch auch korrigiert werden, indem eine ähnliche Technik verwendet wird. Eine Intensitätsverteilung für korrigiertes Licht der Orte auf der A-A-Linie, die in 3A gezeigt ist, ist in 3B angegeben.
Wenn eine Kamera zum Einfangen bzw. Aufnehmen von Bildern oder Ähnlichem einen Versatz x hat, sollte der Wert des Versatzes von dem Wert für jedes Pixel im vorhinein subtrahiert werden, bevor die Division durchgeführt wird, wie in Gleichung (2) erläutert ist. ci = (bi – x)/{ai – x)/(aAve – x)} (2)
4 ist eine Konfigurationszeichnung, die den wesentlichen Teil einer Ausführungsform eines Biochip-Lesers für die praktische Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung angibt. Zudem ist in 4 ein Biochip-Leser vom rasterlosen Typ gezeigt und die gleichen Zeichen wie jene, die in 1 gezeigt sind, werden den Teilen gegeben, die identisch zu jenen in 1 sind.
In 4 speichert die Speichervorrichtung 10 Bilddaten, die mit der Kamera 6 gemessen werden, die in der Aufnahmeeinrichtung enthalten ist. Die Bildverarbeitungseinrichtung 20 führt eine Berechnung und eine Bildverarbeitung, die in dem vorstehend erwähnten Korrekturverfahren gezeigt ist, für die Lichtmengenverteilung auf der Basis von Bilddaten durch, die aus der Speichervorrichtung 10 gelesen werden. Das Korrekturprobenbild für die erhaltene Messprobe wird auf der Anzeige 30 angezeigt.
In einem solchen Aufbau wird zuerst am Anfang eine Fluoreszenzmessung ausgeführt, indem eine gleichmäßige, fluoreszierende bzw. gleichmäßig fluoreszierende Platte in der Position der Messprobe 3 angebracht wird, und Bilddaten des Lichtmengenverteilungsbildes "a", das mit der Aufnahmeeinrichtung erhalten wird, das heißt, der Kamera 6, werden in der Speichervorrichtung 10 gespeichert.
Als Nächstes wird die Messprobe 3 anstelle der gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte angebracht und das Messbild wird mit der Kamera 6 auf die gleiche Art und Weise gemessen und Bilddaten des Messprobenbildes "b" werden in der Speichervorrichtung 10 gespeichert.
In der Bildverarbeitungseinrichtung 20 wird der Durchschnittsfarbton "a_Ave" der Gesamtpixel des Referenzbildlichtmengenverteilungsbildes "a", das aus der Speichervorrichtung 10 gelesen wird, bestimmt und Werte jedes Pixels des ursprünglichen Referenzbildmengenverteilungsbildes "a" werden durch diesen Durchschnittsfarbton "a_Ave" jeweils geteilt. Das Ergebnis dieser Teilung wird als Lichtquellenintensitätskorrekturbild "a'" angegeben. Wie vorstehend beschrieben wurde, wird ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild nahe 1 erhalten. Nachfolgend wird das Messprobenbild "b" durch das vorstehende Lichtquellenintensitätskorrekturbild "a'" für jedes entsprechende Pixel geteilt.
Das korrigierte Probenbild "c", das wie vorstehend beschrieben bestimmt wird, wird auf der Anzeige 30 angezeigt.
Zudem ist die vorliegende Erfindung nicht auf die vorstehende Ausführungsform beschränkt, sondern kann in anderen speziellen Ausführungsformen, Änderungen und Versionen ausgeführt werden, ohne dass von dem Prinzip der Erfindung abgewichen wird.
Zum Beispiel kann die Speichervorrichtung 10 und die Bildverarbeitungseinrichtung 20 als integrierter Aufbau hergestellt werden, und nicht als separate Einheiten.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich wird, können die nachfolgenden Effekte gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden:

(1) Ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild, in dem der Durchschnittswert zu 1 gemacht ist, wird erhalten, indem der Durchschnittsfarbton bzw. Durchschnittston eines Bildes für eine gleichmäßig fluoreszierende Platte erhalten wird und indem die Intensitäten jedes Pixels durch den Durchschnittsfarbton geteilt werden. Ein gemessenes Bild, in dem die Ungleichmäßigkeit der Lichtmenge korrigiert ist, kann dementsprechend leicht erhalten werden, indem das gemessene Bild durch das vorstehende Lichtquellenintensitätskorrekturbild geteilt wird.
(2) Da das Lichtquellenintensitätskorrekturbild, in dem der Durchschnittswert zu 1 gemacht ist, wie vorstehend beschrieben wurde, erhalten wird, ist es möglich, ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild zu erhalten, dessen Gesamtenergie sich nicht ändert, das heißt, die Gesamtlichtmengenenergie wird beibehalten.

Zudem werden gemäß dieser Korrektur keine Pixelwerte extrem groß oder extrem klein.

(3) Wie in dem Kreis in dem unteren linken Abschnitt des Bildes, das in 2C gezeigt ist, ersichtlich ist, werden Orte, die in dem Bild, das in 2B gezeigt ist, nicht zu sehen sind, leicht sichtbar.

Claims

Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung in einem Biochip-Leser, der zum Lesen eines Messprobenbildes durch Lichtstrahlbeleuchten verwendet wird, die Schritte umfassend: Teilen der Werte jedes Pixels (a_i) eines Bildes, das durch Messen der gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte, die eine gleichmäßige Fluoreszenzverteilung darstellt, erhalten wird, durch jeweils den mittleren Wert des Gesamtbildes (a_Ave), um ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild aus korrigierten Pixels (a_i') zu erhalten; und Teilen der Lichtmengenwerte jedes Pixels (b_i) in dem gemessenen Bild, das durch das Messen einer Messprobe erhalten wird, durch einen Lichtmengenwert eines entsprechenden Pixels (a_i') des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds, in dem sämtliche Positionen der Pixel (b_i) in dem gemessenen Bild denen der entsprechenden Pixel (a_i') des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds entsprechen, wodurch eine Ungleichmäßigkeit der Lichtmenge in der Lichtstrahlbeleuchtung korrigiert wird.
Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung nach Anspruch 1, worin ein Bild, das durch Messen der gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte erhalten wird, und das gemessene Bild unter Verwendung des rasterlosen Verfahrens gemessen werden, in dem vielzählige Lichtstrahlen in Obereinstimmung mit den Orten ausgestrahlt werden.
Korrekturverfahren für die Lichtmengenverteilung nach Anspruch 1 oder 2, worin, wenn eine Messkamera zum Messen eines Bildes, das durch Messen der gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte erhalten wird, und eines gemessenen Bildes oder ein optisches Messsystem einen Versatz haben, die Divisionsoperation nach dem Subtrahieren dieses Versatzes von den Werten für jedes Pixel ausgeführt wird.
Biochip-Leser, der zum Lesen eines Messprobenbildes durch Lichtstrahlbeleuchten verwendet wird und der ausgestattet ist mit: einer Aufnahmeeinrichtung, die mit einer Messkamera (6) zum Aufnehmen eines Bildes, das durch Messen einer gleichmäßigen, fluoreszierenden Platte erhalten wird, die eine gleichmäßige, fluoreszierende Lichtverteilung wiedergibt, und eines gemessenen Bildes versehen ist, das durch Messen einer Messprobe erhalten wird, einer Speichervorrichtung (10) zum Speichern von Bilddaten von der vorstehenden Aufnahmeeinrichtung, einer Bildverarbeitungseinrichtung (20), die den Wert jedes Pixels (a_i) der gleichmäßigen fluoreszierenden Platte jeweils durch einen mittleren Wert (a_Ave) des Gesamtbilds teilt, Um ein Lichtquellenintensitätskorrekturbild aus korrigierten Pixels (a_i') zu erhalten, und den Lichtmengenwert jedes Pixels (b_i) in dem gemessenen Bild durch einen Lichtmengenwert eines entsprechenden Pixels (a_i') des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds teilt, in dem sämtliche Positionen der Pixel (b_i) in dem gemessenen Bild denen der entsprechenden Pixel (a_i') des Lichtquellenintensitätskorrekturbilds entsprechen, so dass eine Ungleichmäßigkeit der Lichtmenge in der Lichtstrahlbeleuchtung korrigiert wird, und einer Anzeige (30), die das gemessene Bild angibt, in dem die Ungleichmäßigkeit der Lichtmenge in der Lichtstrahlbeleuchtung korrigiert ist und das durch die vorstehende Bildverarbeitungseinrichtung (20) bestimmt wird.
Biochip-Leser nach Anspruch 4, worin die Bildverarbeitungseinrichtung (20) derart aufgebaut ist, dass, wenn eine Messkamera der Aufnahmeeinrichtung einen Versatz hat, die Divisionsoperation nach dem Subtrahieren des Versatzes von den Werten für jedes Pixel für jedes Bild ausgeführt wird.
Biochip-Leser nach Anspruch 4 oder 5, worin die Bildverarbeitungseinrichtung (20) eine Funktion zum Bestimmen einer absoluten Größe der Lichtleistung hat.