DE60128721T2

DE60128721T2 - Verfahren und vorrichtung zur fluoreszenzlumineszenzmessung

Info

Publication number: DE60128721T2
Application number: DE60128721T
Authority: DE
Inventors: Takami Shibazaki; Kaneyasu Tsukuimachi Tsukui-gun OKAWA
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2021-11-17
Also published as: US7224826B2; DE60128721D1; WO2002057756A1; EP1347285A1; JP3576523B2; EP1347285B1; EP1347285A4; CN1243231C; US20040001196A1; JP2002257730A; CN1483142A

Description

Gebiet der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, welche für eine Vielzahl an winzigen Punkten, die auf einer Ebene angeordnet sind, die Intensität eines jeden winzigen Punkts misst, und insbesondere ein Fluoreszenzintensitätsmessverfahren, und eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung, die für ein System geeignet sind, das bei einem Biochip, in dem DNA oder Proteine, die durch eine fluoreszierende Substanz markiert sind, auf einer Ebene als winzige Punkte mit einer hohen Dichte angeordnet sind, eine Fluoreszenzanalyse durchführt.
Hintergrund des Stands der Technik
Es offenbart zum Beispiel die japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 2000-121559 eine Vorrichtung, die eine Fluoreszenzintensität eines jeden winzigen Punkts misst.
17 ist ein schematisches Blockdiagramm, das eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung aufzeigt, die in der japanische Patentanmeldung KOKAI Nr. 2000-121559 offenbart ist. Die in dieser Veröffentlichung offenbarten Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung besteht aus einem Chipantriebsabschnitt 503, der in einer Y-Richtung der Zeichnung einen Biochip 520 scannt, in welchem Proben, die einer Fluoreszenzmarkierung unterzogen wurden, auf einer Substratoberfläche als winzige Punkte ausgebildet sind, einem Laser 506 als eine Anregungslichtquelle, einem dichroitischen Spiegel 508, der einen Laserstrahl von dem Laser 506 reflektiert und die Fluoreszenz von dem Messobjekt durchlässt, einer Kondensorlinse 509, einen Kopfantriebsabschnitt 502, der in einer X-Richtung in der Zeichnung scannt, einem Lesekopf 507, der die Kondensorlinse 509 und den dichroitischen Spiegel einschließt, einem dichroitischen Spiegel 511, der die Fluoreszenz der winzigen Punkte entsprechend einer jeden Wellenlänge trennt, Filtern 515 und 519, welche den Laserstrahl und die Fluoreszenz trennen, Aperturlinsen 514 und 518, Pin-Hole-Platten 513 und 517 und Photomultiplier 512 und 516.
Die Effekte der Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung mit einem derartigen Aufbaus sind folgendermaßen. So wird der von dem Laser 506 erzeugte Laserstrahl von dem dichroitischen Spiegel 508 reflektiert und auf die Kondensorlinse 509 gerichtet. Er wird dann auf den Biochip 520 verdichtet, wodurch ein Laserstrahl ausgebildet wird. Wenn zu diesem Zeitpunkt eine fluoreszierende Substanz in einem mit den Laserstrahlpunkt bestrahlten Bereich vorhanden ist, wird die fluoreszierende Substanz durch den Laserstrahl angeregt und die Fluoreszenz erzeugt. Die erzeugte Fluoreszenz wird durch die Kondensorlinse 509 verdichtet, dann durch den dichroitischen Spiegel 508 geleitet, durch den farbtrennenden dichroitischen Spiegel 511 entsprechend einer jeden Wellenlänge aufgetrennt, durch die Aperturlinsen 514 und 518 entsprechend einer jeden Wellenlänge konzentriert, durch die Pin-Hole-Platten 513 und 517 geleitet und trifft auf die Photomultiplier 512 und 516. Die Photomultiplier 512 und 516 sind Sensoren, welche Photonen erfassen und diese in Impulse auf einem TTL-Niveau umwandelt und somit das in die Photomultiplier 512 und 516 eintretende Licht zu einem Impulssignal wird, und die Fluoreszenzintensität des winzigen Punkts durch Messen der Impulszahl gemessen werden kann. Wenn die oben beschriebene Betriebsweise durchgeführt wird, während mittels eines Chipantriebsabschnitts 503 und eines Kopfantriebsabschnitts 502 mit dem Laserstrahlpunkt mechanisch gescannt wird, wird die Fluoreszenzintensität der winzigen Punkte auf dem gesamten Biochip 520 gemessen.
Wenn jedoch auf der Oberfläche des Biochips 520 Fremdmaterial vorhanden ist, welches das Anregungslicht reflektiert oder die Fluoreszenz erzeugt, wird ebenso wir die Fluoreszenz von dem Punkt 521 auf dem Biochip 520 das Licht, welches die Störung von dem Fremdmaterial beinhaltet, erfasst und wird es somit unmöglich, das Auftreten eines Fehlers bei der gemessenen Intensität zu bewältigen.
Das Dokument WO 98/07022 offenbart ein System zur Bilderkennung mittels Fluoreszenz bei welchem die Fluoreszenz aufgrund von Nicht-Probenelementen, wie dem Probensubstrat, entfernt wird. Dieses System verwendet zwei Anregungswellenlängen: eine spezifische für die Probe, während die andere die Nicht-Probenelemente anregt.
Das Dokument WO 00/05571 offenbart ein Bilderkennungssystem für Agglutinations Assays, bei dem die Pixel, welche Staub und Schmutz auf dem Scanner entsprechen, automatisch durch eine Bildverarbeitung entfernt werden.
Da die Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung nach dem Stand der Technik nicht entscheiden können ob Fremdmaterial vorhanden oder abwesend ist, kann im Hinblick auf die Verlässlichkeit eines Intensitätswerts der winzigen Punkte keine quantitative Beurteilung durchgeführt werden.
Im Hinblick auf die oben beschriebenen Probleme ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Fluoreszenzintensitätsmessverfahren und eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung zur Verfügung zu stellen, welche Messfehler verringern können, auch wenn Fremdmaterial in der nähe der Oberfläche eines Biochips vorkommt, und welche das Vorkommen von Fremdmaterial erkennen und eine quantitative Beurteilung der Verlässlichkeit eines Intensitätsmesswertes durchführen können.
Offenbarung der Erfindung
Um dieses Ziel zu erreichen wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenzintensitätsmessverfahren gemäß Anspruch 1 zur Verfügung gestellt.
Darüber hinaus wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß Anspruch 6 zur Verfügung gestellt.
Das heißt, beim Betrieb des Fluoreszenzintensitätsmessverfahrens und der Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird Licht mit einer Wellenlänge, mit welcher die fluoreszierende Substanz angeregt werden kann, emittiert und wird eine Abbildung des winzigen Punktes, der die fluoreszierende Substanz enthält, als eine erste Abbildung erhalten, wird eine Maske erzeugt auf Basis der Abbildung einer Fremdmaterialfläche, welche extrahiert wird, aus einer Abbildung des Fremdmaterials, das an dem zu messenden Objekt anhaftet, die erhalten wird durch Licht mit einer Wellelänge, welche die fluoreszierenden Substanzen nicht anregt, und wird ein logisches Produkt der Maske und der ersten Abbildung erhalten, wodurch die Fremdmaterialfläche aus der ersten Abbildung eliminiert wird. Daher kann das störende Licht von dem Fremdmaterial, das an dem Biochip anhaftet, entfernt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Blockdiagramm, das eine Skizze einer Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
2A ist eine Ansicht, die ein Beispiel einer spektralen Charakteristik einer relativen Intensität einer Absorptionswellenlänge und einer Fluoreszenzwellenlänge einer fluoreszierenden Substanz für die Verwendung in einem Biochip aufzeigt;
2B ist eine Ansicht, die eine Charakteristik eines spektralen Transmissionsgrads einer Fluoreszenzmessfiltereinheit aufzeigt;
2C ist eine Ansicht, die eine Charakteristik eines spektralen Transmissionsgrads einer Filtereinheit zur Aufnahme einer Fremdmaterialabbildung aufzeigt;
3 ist eine schematische Ansicht, die ein Format des Biochips zeigt;
4 ist eine schematische Ansicht, die ein Datenverarbeitungsverfahren beim Messen der Intensität von winzigen Punkten in der ersten Ausführungsform aufzeigt;
5A ist eine Ansicht, die ein Intensitätssignal S relativ zu einer Pixelposition in einer Richtung x bei einer Position, bei der ein Fremdmaterial vorkommt, in einer Richtung y aufzeigt;
5B ist eine Ansicht, die ein Binarisierungsergebnis unter der Maßgabe, dass ½ der maximalen Intensität S_max ein Grenzwert ist, aufzeigt;
6 ist eine Ansicht, die eine Intensitätsverteilungscharakteristik einer Referenzabbildung aufzeigt;
7A ist eine Ansicht, die ein Intensitätssignal S' relativ zu einer Pixelposition in der Richtung x bei einer Position, bei der das Fremdmaterial vorhanden ist, in der Richtung y aufzeigt, unter der Maßgabe, dass ein Wert, der erhalten wird durch Multiplizieren des Intensitätssignals in 5A mit einem Verhältnis S_Rmax/S_R des maximalen Intensitätssignals S_Rmax relativ zu dem Referenzintensitätssignal S_R, ein Intensitätssignal S' ist;
7B ist eine Ansicht, die ein Binarisierungsergebnis unter der Maßgabe, dass ½ eines Maximalwerts S'_max ein Grenzwert ist aufzeigt;
8 ist eine Ansicht, die ein Differenzialsignal S'' relativ zu einer Pixelposition in der Richtung x bei einer Position, wo das Fremdmaterial vorkommt, in der Richtung y aufzeigt, wenn ein Differenzialoperation erster Ordnung verwendet wird;
9 ist eine Ansicht, die ein Differenzialsignal S'' relativ zu einer Pixelposition in der Richtung x bei einer Position, wo das Fremdmaterial vorkommt, in der Richtung y aufzeigt, wenn ein Differenzialoperator zweiter Ordnung verwendet wird;
10 ist eine Ansicht, die ein Differenzialsignal S'' relativ zu einer Pixelposition in der Richtung x bei einer Position, wo das Fremdmaterial vorkommt, in der Richtung y in Fällen aufzeigt, in denen der Differenzialoperator erster Ordnung verwendet wird, wenn das Differenzialsignal durch eine andere Technik erhalten wird;
11 ist eine Ansicht, die ein Differenzialsignal S'' relativ zu einer Pixelposition in der Richtung x bei einer Position, wo das Fremdmaterial vorkommt, in der Richtung y in Fällen aufzeigt, in denen der Differenzialoperator zweiter Ordnung verwendet wird, wenn gleichermaßen das Differenzialsignal durch eine andere Technik erhalten wird;
12 ist eine Ansicht einer Frequenzverteilung zur Erläuterung eines Verfahrens zur Festlegung eines geeigneten Grenzwertes, wenn zwei Arten an Fremdmaterialien vorkommen, bei der eine Horizontalachse einen repräsentativen Wert des gleichmäßig verteilten Differenzialsignals S'' darstellt und eine Vertikalachse eine Gesamtsumme an Pixel entsprechend diesem Differenzialsignal S'' darstellt;
13A ist eine Ansicht, die eine unterteilte Abbildung relativ zu einem winzigen Punkt aufzeigt;
13B ist eine Ansicht, die ein Ausgangssignal eines CCD auf einem in 13A dargestellten Linienabschnitt AB aufzeigt;
14 ist ein Blockdiagramm, das eine Skizze einer Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform aufzeigt, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist;
15 ist eine schematische Ansicht, die einen Referenzchip zeigt;
16 ist ein Flussdiagramm, das ein Messverfahren gemäß der zweiten Ausführungsform aufzeigt; und
17 ist ein schematisches Blockdiagramm, das eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung des Stands der Technik aufzeigt.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Es werden nun bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben.
Erste Ausführungsform
Es werden zuerst ein Fluoreszenzintensitätsmessverfahren und eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf die 1 bis 13B beschrieben.
Wie in 1 aufgezeigt, besitzt in einer Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß dieser Ausführungsform eine Beleuchtungseinheit 1, eine Lichtquelle 2 wie eine Quecksilberlampe, und wird ein von dieser Lichtquelle 2 abgestrahlter Lichtstrom durch eine Sammellinse 3 konzentriert, durch eine Aperturblende 4 und eine Gesichtsfeldblende 5 ausgeblendet und tritt dann durch eine Linse 6 in ein Filterset 7 ein.
In dieser Ausführungsform wird ferner eine fluoreszierende Substanz als ein markierendes Material verwendet, die eine solche wie in 2A aufgezeigte Charakteristik aufweist. Das heißt in dieser Zeichnung, sie besitzt ein derartiges Absorptionsspektrum wie es durch die Referenzziffer 26 angegeben ist, und ein Lichtemissionsspektrum 27 mit einer längeren Wellenlänge als die des Absorptionsspektrums.
Das Fluoreszenzmessfilterset 7 besteht, wie in 2B gezeigt, aus einem Wellelängenselektionsfilter 8 (welcher nachfolgend als ein Anregungsfilter bezeichnet wird), der eine spektrale Transmissionscharakteristik aufweist, die selektiv eine Wellenlänge des Lichts durchlässt, mit der die fluoreszierende Substanz, die als die markierende Substanz verwendet wird und die in 2A aufgezeigte Charakteristik aufweist, angeregt wird, einem dichroitischen Spiegel 9 mit einer spektralen Charakteristik 29, welcher das Licht mit der von dem Anregungsfilter 8 durchgelassenen Wellenlänge reflektiert und lediglich eine Wellenlänge der von der fluoreszierenden Markierungssubstanz der winzigen Punkte auf dem Biochip erzeugten Fluoreszenz mit einem festen Wellelängenband durchlässt, und einem Wellenlängenselektionsfilter 10 (der nachfolgend als ein Absorptionsfilter bezeichnet wird) mit einer spektralen Transmissionscharakteristik 30, die selektiv lediglich die Wellenlänge der von der fluoreszierenden Markierungssubstanz der winzigen Punkte auf dem Biochip erzeugten Fluoreszenz durchlässt und unnötige Wellenlängenkomponenten absorbiert.
Darüber hinaus besteht ein wie in 2C aufgezeigtes Filterset 11 zur Aufnahme einer Fremdmaterialabbildung aus einem Wellenlängenselektionsfilter 12 mit einer spektralen Transmissionscharakteristik 31, die nicht die als die Markierungssubstanz verwendete fluoreszierende Substanz anregt und selektiv das Licht mit der Wellenlänge durchlässt, die von einem Fremdmaterial auf dem Biochip reflektiert wird oder bei der das Fremdmaterial die Fluoreszenz erzeugt, einem dichroitischen Spiegel 13 mit einer spektralen Charakteristik 32, der das von dem Wellenlängenselektionsfilter 12 durchgelassene Licht reflektiert und die von dem Fremdmaterial auf dem Biochip erzeugte Fluoreszenz oder das von dem Material reflektierte Licht durchlässt, und einem Filter 14 mit einer spektralen Charakteristik 33, der selektiv lediglich die von dem Fremdmaterial erzeugte Fluoreszenz oder die Wellenlänge des von dem Fremdmaterial reflektierten Lichts durchlässt.
Die Filtersets 7 und 11 sind an einem Filtersetbefestigungsbauteil 15 befestigt. Eines der Filtersets ist auf eine solche Weise angeordnet, dass ein Schnittpunkt einer optischen Beleuchtungsachse und einer optischen Beobachtungsachse mit den dichroitischen Spiegeln 9 und 13 zusammenfällt, und diese Filtersets sind so konfiguriert, dass sie mittels eines Filtersetumschaltmechanismus 16 basierend auf einem Umschaltsignal von einer später beschriebenen Filtersetsteuereinrichtung 20 umgeschaltet werden können.
Wie in 3 aufgezeigt, wird der Biochip 24 aus beispielsweise einer Glasplatte mit einer rechteckigen Form mit 10 mm × 20 mm und aus Objekten, wie einer DNA oder einem Protein, die durch eine fluoreszierende Substanz, z. B. FITC (Fluoresceinisothiocyanat) oder Rhodamin, markiert sind, die in der Gitterform mit Intervallen von beispielsweise 100 µm als winzige Punkte 25 mit einem Durchmesser von beispielsweise 50 µm und einer geringen im wesentlichen kreisförmigen Form angeordnet sind, gebildet. Darüber hinaus sind zum Zweck des Erkennens einer Fläche, in der die winzigen Punkte ausgebildet sind, vier Sets der zur Markierung verwendeten fluoreszierenden Substanz an Eckabschnitten als winzige Punkte 35 zur Positions erfassung ausgebildet. Zusätzlich ist dieser Biochip 24 auf einer nicht dargestellten Bühne mit zwei Achsen (XY) bereitgestellt, kann in einer horizontalen Ebene bewegt werden und kann innerhalb eines Gesichtsfelds einer Objektlinse 34 positioniert werden.
Die Objektlinse 34 ist oberhalb des Biochips 24 in einem Arbeitsabstand angeordnet, und es ist ein Beobachtungslichtweg derart ausgebildet, dass die durch Anregung und Beleuchtung des Biochips 24 erzeugte Fluoreszenz durch die Objektlinse 34 verdichtet wird und durch eine Bilderzeugungslinse 17 eine Abbildung des Biochips 24 auf einem CCD-Element 18 als einem photoelektrischen Umwandlungselement ausgebildet wird. Als ein Beispiel einer derartigen Vorrichtung kann ein allgemeines Auflichtfluoreszenzmikroskop verwendet werden. Es wird darauf hingewiesen, dass in dieser Ausführungsform eine koaxiale Auflichtbeleuchtung als ein Beleuchtungsverfahren angewendet wird, jedoch durch Verwenden des Beleuchtungslichts außerhalb des Beobachtungslichtwegs eine Schrägwinkelauflichtbeleuchtung und eine Dunkelfeldauflichtbeleuchtung ebenfalls als einer nahezu kreisförmigen Zone verwendet werden können.
Das CCD-Element 18 scannt elektrisch eine Fluoreszenzabbildung des Biochips 24 und gibt ein analoges Bildsignal aus. Die Steuereinrichtung 23 besitzt einen A/D-Wandler 19, der dieses analoge Signal in digitale Daten umwandelt, und einen Bildspeicher 21 und besteht aus einer Bildverarbeitungseinrichtung 22 mit einer Binarisierungsfunktion für Abbildungen, einer Funktion zur Durchführung logischer Multiplikationen zwischen einer Vielzahl an Abbildungen, einer Funktion zur Messung einer Fläche einer willkürlichen Fläche und einer Funktion zur Integration eines Intensitätswertes in einer willkürlichen Fläche, einer Berechnungseinrichtung 42 zur Durchführung von vier arithmetischen Operationen und einer Filtersetsteuereinrichtung 20.
Die Effekte dieser Ausführungsform werden nun unter Bezug auf die 1 bis 13B beschrieben.
Zuerst wird der Biochip 24 mittels einer nicht dargestellten zweiachsigen Bühne auf eine solche Weise positioniert, dass eine Messbereich, der durch vier winzige Positionierungspunkte 35 auf den Biochip 24 spezifiziert ist, mit einem Sichffeldbereicht übereinstimmt, der bestimmt wird durch eine Abbildungsvergrößerung eines optischen Beobachtungssystems und einer Größe einer Lichtaufnahmefläche auf dem CCD-Element 18. Dann wird das Fluoreszenzmessfilterset 7 mittels des Filtersetumschalt mechanismus 16 so auf einer Aufnahmeposition positioniert, dass eine Fluoreszenzabbildung der winzigen Punkte 25 auf dem Biochip 24 aufgenommen werden kann.
Andererseits wird der von der Lichtquelle 2 ausgestrahlte Lichtstrom durch die Sammellinse 3 verdichtet, durch die Aperturblende 4 und die Gesichtsfeldblende 5 ausgeblendet und dann durch die Linse 6 dem Fluoreszenzmessfilterset 7 zugeführt. Das dem Fluoreszenzmessfilterset 7 zugeführte Licht wird durch den Anregungsfilter 8 mit der spektralen Transmissionscharakteristik 28, welche mit dem Absorptionswellenlängenband 26 der fluoreszierenden Markierungssubstanz übereinstimmt, zu dem Lichtstrom mit einer Wellenlänge mit einer spezifischen Halbbandbreite (welcher nachfolgend als das Anregungslicht bezeichnet wird). Da der dichroitische Spiegel 9 eine Spektralcharakteristik 29 aufweist, wird dieser Lichtstrom durch den dichroitischen Spiegel 9 reflektiert und durch die Objektlinse 34 auf den Biochip 24 eingestrahlt. Zu diesem Zeitpunkt erzeugt die auf dem Biochip 24 als die winzigen Punkte 25 angeordnete fluoreszierende Substanz eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge, die länger ist als die des Anregungslichts, welche bestimmt wird durch ihre physikalischen Eigenschaften und die Umgebung. Da die von jedem winzigen Punkt 25 erzeugte Fluoreszenz durch die Objektlinse 34 verdichtet wird und die hier erzeugte Fluoreszenz ein Transmissionswellenlängenband des dichroitischen Spiegels 9 besitzt, durchläuft sie den dichroitischen Spiegel 9 des Fluoreszenzmessfiltersets 7 und durchläuft ferner den Absorptionsfilter 10, wodurch eine Abbildung der winzigen Punkte 25 auf dem CCD-Element 18 ausgebildet wird.
Danach wird die Abbildung der winzigen Punkte 25 auf dem CCD-Element 18 durch das CCD-Element 18 elektrisch gescannt und zu einem analogen elektrischen Signal umgewandelt. Dieses analoge Signal wird durch den A/D-Wandler 19 in ein digitales Signal umgewandelt und in einem Bildspeicher 21 als eine Fluoreszenzabbildung 101 der in 4 gezeigten winzigen Punkts gespeichert.
Das Fluoreszenzmessfilterset 7 wird dann mittels des Filtersetumschaltmechanismus 16 auf das Filterset zur Aufnahme einer Fremdmaterialabbildung umgeschaltet, das Beleuchtungslicht mit einer Lichtwellenlänge, bei der die fluoreszierende Substanz nicht angerecht wird, wird dem Biochip 24 zugeführt und durch den dem oben beschriebenen Schritt entsprechenden Arbeitsschritt wird eine in 4 gezeigte Fremdmaterialabbildung 102 in dem Bildspeicher 21 gespeichert. Da die fluoreszierende Markierungssubstanz des winzigen Punkts 25 nicht angeregt wird, ist zu diesem Zeit- Punkt die Abbildung des winzigen Punkts 25 nicht in der Fremdmaterialabbildung 102 enthalten.
Anschließend wird zur Extraktion der Fremdmaterialfläche aus der Fremdmaterialabbildung 102 die Binarisierungsverarbeitung in Bezug auf die Fremdmaterialabbildung 102 durch eine Bildverarbeitungseinrichtung 22 durchgeführt. Wenn eine Abbildung eines Objekts mit einer gleichförmigen Intensität auf dem Lichtaufnahmeelement mit einem y-Wert "1" durch eine aplanatische Linse abgebildet wird, kann im Allgemeinen zu diesem Zeitpunkt eine Grenze der Abbildung, die erhalten wird durch Binarisierung unter Festlegen von ½ der maximalen Intensitat der Abbildung als einen Grenzwert, als ein Schnittpunkt eines Hauptlichtstrahls und einer optimalen Bildoberfläche angesehen werden, und kann die erhaltene binarisierte Fläche als eine äußere Gestalt des Fremdmaterials verwendet werden.
Wenn jedoch räumliche Unregelmäßigkeiten in dem Anregungslicht auftreten, mit dem der Biochip 24 bestrahlt wird, existieren ebenfalls räumliche Unregelmäßigkeiten in der Intensität der durch das Fremdmaterial erzeugten Fluoreszenz. Unter der Maßgabe, dass ½ der maximalen Intensität ein Grenzwert ohne Variation ist, kann ferner, sogar wenn eine Vielzahl desselben Fremdmaterials vorhanden ist, das Fremdmaterial aufgrund der räumlichen Unregelmäßigkeiten im Anregungslicht nicht als das Fremdmaterial erkannt werden.
Dieses Phänomen wird nun unter Bezug auf die 5A und 5B ausführlich beschrieben. 5A ist eine Ansicht, die ein Intensitätssignal S relativ zu einer Pixelposition in einer Richtung x bei einer Position, bei der das Fremdmaterial in einer Richtung y vorhanden ist, zeigt. Wie in der Zeichnung aufgezeigt, kann in Fällen, in denen räumliche Unregelmäßigkeiten in dem Anregungslicht auftreten, wenn eine Vielzahl an Fremdmaterialien (in der Zeichnung kommen drei Fremdmaterialien A, B und C vor) mit derselben Charakteristik vorkommen, nicht dasselbe Intensitätssignal erhalten werden. Unter der Annahme, dass S_max ein Intensitätssignal des Fremdmaterials A ist, welches das größte ist, S₁ und S₂ jeweils Intensitätssignale des Fremdmaterials B und des Fremdmaterials C sind und S_max/2 < S1 < S_max und S₂ < S_max/2 erhalten werden, wenn festgelegt wird, dass ½ der maximalen Intensität ein Grenzwert ohne Variation ist, stimmt lediglich die Grenze des Fremdmaterials A, die durch Einarisierung erhalten wird, mit einem Schnittpunkt des Hauptlichtstrahls und der optimalen Bildoberfläche überein, wie in 5B gezeigt, und wird eine exakte Fläche gezeigt. Im Fall des Fremdmaterials B ist die aufgezeigte Fläche jedoch geringer als die exakte Fläche. Darüber hinaus wird im Fall des Fremdmaterials C die Fläche überhaupt nicht erkannt.
Es wird nun ein Verfahren zur Beseitigung dieses Nachteils beschrieben.
Ein erstes Verfahren, das nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, misst Unregelmäßigkeiten im Anregungslicht und führt basierend auf dieser Messung Korrekturen durch. Zur Durchführung dieses Verfahrens wird eine Abbildung (Referenzabbildung) einer Platte mit flacher Oberfläche mit einem gleichförmigen Reflexionsvermögen oder Lichtemissionsverhältnis abgebildet als eine Intensitätsverteilungscharakteristik, wie sie zum Beispiel in 6 aufgezeigt wird (tatsächlich ist es eine zweidimensionale Intensitätsverteilung, jedoch wird sie in diesem Beispiel der Einfachheit halber als eine eindimensionale Verteilung dargestellt). Es sei angemerkt, dass die vertikale Achse ein Referenzintensitätssignal S_R darstellt und deren Maximalwert ein maximales Intensitätssignal S_Rmax in 6 ist. Wenn dann ein Wert, der durch Multiplizieren des wie in 5A erhaltenen Intensitätssignals S mit S_Rmax/S_R als ein Intensitätssignal S' bestimmt wird, werden die Intensitätssignale S' der drei Fremdmaterialien wie in 7A gezeigt, gleich zueinander. Unter der Maßgabe, dass ½ des Maximalwerts S'_max des Intensitätssignals S' ein Grenzwert ist, anstelle der Verwendung des Intensitätssignals S, stimmen daher die durch Einarisierung erhaltenen Grenzen von jedem der drei Fremdmaterialien mit dem Schnittpunkt des Hauptlichtstrahls und der optimalen Bildoberfläche überein, wie in 7 aufgezeigt, und wird die Korrekturfläche aufgezeigt. Obwohl die Beschreibung gemacht wurde unter Bestimmung der Intensität von anderen Teilen als den Fremdmaterialien als 0, kann aufgrund von Streulicht oder dem Dunkelstrom des Lichtempfangselements in einigen Fällen ein Rauschen zugemischt sein, und ist es somit wünschenswerter, den Grenzwert als (S'_min + S'_max)/2 festzulegen. Hier ist S'_min ein Minimalwert des Intensitätssignals S'.
Es wird nun ein zweites Verfahren zum Beseitigen dieses Nachteils beschrieben, welches Teil der vorliegenden Erfindung ist. Dieses Verfahren unterscheidet sich von dem oben beschriebenen ersten Verfahren und benötigt keine Referenzabbildung.
Das heißt, es wird angenommen, dass das Intensitätssignal S ausgedrückt wird als f(i, j) und ein Differentiationssignal S'' berechnet wird unter Verwendung des folgenden Ausdrucks.
Hier kann die Nähe von (i, j) in einer Richtung i und einer Richtung j (welche nicht auf benachbarte Pixel beschränkt ist) dargestellt werden durch [–m₁, m₂] beziehungsweise [-n₁, n₂]. Darüber hinaus ist C_0,m,n ein Mittelungsoperator. Üblicherweise kann der folgende Ausdruck angegeben werden.
Darüber hinaus, stellt g(i, j) eine Differentiationsabbildung dar und kann durch den folgenden Ausdruck dargestellt werden.
Hier sind C_1,m,n und C_2,m,n Differenzialoperatoren. Als ein Differenzialoperator erste Ordnung kann zum Beispiel oft der folgende Ausdruck verwendet werden.
Als ein Differenzialoperator zweiter Ordnung wird oft ein Laplace-Filter verwendet.
Das auf diese Weise erhaltene Differentiationssignal S'' ist ein Differentiationssignal, welches in Bezug auf die drei Fremdmaterialien das selbe ist, wie in 8 aufgezeigt, wenn der Differenzialoperator erste Ordnung verwendet wird, und eine Umfangslinie eines jeden Fremdmaterials ist eine Linie mit einer festen Breite mit dem maximalen Differentiationssignal S''_max _. Die Linie, welche das Zentrum dieser Breite verbindet wird zu einer tatsächlichen Fremdmaterialumfangslinie. Im Fall der Verwendung des Differenzialoperators zweiter Ordnung, wie in 9 aufgezeigt, besitzen die drei Fremdmaterialien darüber hinaus das selbe Differenzialsignal und wird die Linie, welche Punkte verbindet, bei denen das positive und negative des Differenzialsignals S'' invertiert sind, zu der Fremdmaterialumfangslinie.
Es sei angemerkt, dass die Beschreibung der Einfachheit halber für die jeweiligen Fälle gegeben wurde, bei denen die Neigung der Nachbarschaft der Grenze des Intensitätssignals S konstant ist, tatsächlich ist diese Neigung jedoch nicht konstant. Daher ist das Muster des Differenzialsignals S'' in den 8 und 9 nicht eine rechteckige Verteilung sondern kommt einer Normalverteilung nahe und es ist somit wünschenswert, die Fremdmaterialfläche unter Verwendung eines Signals zu bestimmen, das mit dem Grenzwert verarbeitet wurde, oder die Fremdmaterialfläche unter Verwendung eines Peakpunkts des Differenzialsignals S'' zu bestimmen. In ersterem Fall muss jedoch der Grenzwert prinzipiell nicht % des maximalen Differenzialsignals S''_max sein. In letzterem Fall kann ferner anstelle der Verwendung des oben beschriebenen Ausdrucks, der das Differenzialsignal S'' erhält, der folgende Ausdruck ausreichend sein. S'' = g (i, j)
Das heißt, es ist wie in den 10 und 11 aufgezeigt. In 10 wird als die Fremdmaterialfläche eine Fläche bestimmt, die gebildet wird durch Punkte entsprechend dem Maximalwert von S''. In 11 wird als die Fremdmaterialfläche eine Fläche bestimmt, die gebildet wird durch jeden Zentralpunkt zwischen einem Punkt, der dem Maximalwert von S'' entspricht, und einem Punkt, der dem Minimalwert davon entspricht.
Es wird nun ein Verfahren zum Festlegen eines weiteren geeigneten Grenzwertes in ersterem Fall beschrieben.
Mit Obigen wurde der gleiche eine Typ an Fremdmaterial beschrieben, wobei tatsächlich jedoch eine Vielzahl an Arten von Fremdmaterialien vorkommen. Es wird nun ein Verfahren beschrieben zum Festlegen eines geeigneten Grenzwerts, wenn ein Fremdmaterial 1 und ein Fremdmaterial 2 vorkommen. 12 ist eine Frequenztabelle, in der eine horizontale Achse einen repräsentativen Wert des gleichmäßig verteilten Differenzialsignals S'' darstellt und eine vertikale Achse eine Gesamtsumme an Pixel entsprechend dem Differenzialsignal S'' (welche nachfolgend als Frequenz bezeichnet wird) darstellt. Wie in der Zeichnung dargestellt, tritt ein Rauschen intensiv in einer Zone auf, in der das Differenzialsignal S'' klein ist, und das Fremdmaterial 1 und das Fremdmaterial 2 treten sporadisch in einer entsprechend ihrer Eigenschaften inhärenten Zone auf. Der Grenzwert kann daher unter Verwendung dieser Frequenztabelle festgelegt werden. Das heißt wenn der in der Zeichnung aufgezeigte Grenzwert 1 angewendet wird, können die Umfangslinien des Fremdmaterials 1 und des Fremdmaterials 2 erhalten werden. Wenn der Grenzwert 2 angewendet wird, kann die Umfangslinie des Fremdmaterials 2 erhalten werden. Wenn darüber hinaus der Grenzwert 1 und der Grenzwert 2 angewendet werden, kann die Umfangslinie von lediglich dem Fremdmaterial 1 erhalten werden.
Schließlich wird die Umfangslinie des Fremdmaterials und dessen Inneres festgelegt als z. B. 0 oder –1 und jeglicher anderer Bereich wird festgelegt als 1, und werden durch die Bildverarbeitungseinrichtung 22 als eine Abbildung 103 der Fremdmaterialfläche in dem Bildspeicher gespeichert.
Darüber hinaus wird für die Fluoreszenzabbildung 101 des winzigen Punkts 25 die Abbildung 103 der Fremdmaterialfläche als eine Maske verwendet, wird durch die Bildverarbeitungseinrichtung 22 ein Produkt der beiden Abbildungen gebildet und wird eine Fluoreszenzabbildung 104 von dem winzigen Punkt 25 erhalten, von welcher die Fremdmaterialfläche entfernt wurde. Das heißt, es ist möglich, die Fluoreszenzabbildung 104 so zu erhalten, dass die Fläche mit dem Wert von 0 oder –1 als die Fremdmaterialfläche erkannt werden kann.
Darüber hinaus wird in diesem Beispiel die durch die Binarisierungsverarbeitung erhaltene Fläche direkt als die Fremdmaterialfläche verwendet und wird von der Fluoreszenzabbildung 101 des winzigen Punkts 25 entfernt. In Bezug auf die durch Einarisierung erhaltene Fremdmaterialfläche kann jedoch durch den folgenden Ausdruck (1)) als eine Summe eines Abstands von dem Zentrum einer Diffraktionsabbildung und einem Tal des Diffraktionpeaks zweiter Ordnung und dem Diffraktionspeak dritter Ord nung (eine aufgrund der Diffraktion erzeugte Unschärfemenge, der erste Term auf der rechten Seite des folgenden Ausdrucks (1)) und einer maximalen Unschärfemenge, die erhalten wird, wenn ein Fokussierfehler berücksichtigt wird (der zweite Term auf der rechten Seite des Ausdrucks (1)) eine optische Unschärfemenge angegeben werden und kann die Fremdmaterialfläche durch diese Menge erweitert und aus der Fluoreszenzabbildung des winzigen Punkts entfernt werden. β ist eine Bildvergrößerung des optischen Systems, λ ist eine Wellenlänge des eine Abbildung des Fremdmaterials bildenden Lichts, α ist die numerische Apertur der Objektlinse 34 auf der Seite des Biochips und Δ ist ein Defokussierbetrag. δ = β·(1.619 λ2 + α|Δ|) (1)
Dann werden die auf den Biochip 24 ausgebildeten winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung erfasst, die Positionen der Gravitationszentren der vier winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung oder die Schwerpunkte der binarisierten Abbildungen der winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung erhalten und basierend auf diesen Koordinaten- und Anordnungsinformationen auf dem Biochip 24 die Fluoreszenzabbildung 104 der winzigen Punkte zu jeder Einheit eines winzigen Punkts, wie durch die Bezugsziffer 105 angezeigt, unterteilt.
Es wird dann ein Messbereich relativ zu jedem winzigen Punkt 25 mittels des folgenden Arbeitsschritts festgelegt.
Das heißt, es wird unter Bezug auf die unterteilten Abbildung 106 und 107 für jeden winzigen Punkt, von dem die Fremdmaterialfläche entfernt wurde ½ der maximalen Intensität in der unterteilten Abbildung oder ein Mittelwert der maximalen Intensität und der minimalen Intensität als ein Grenzwert bestimmt und eine Binarisierungsverarbeitung ausgeführt. Dann werden eine maximale X-Koordinate, eine minimale X-Koordinate, eine maximale Y-Koordinate und eine minimale Y-Koordinate der binarisierten Fläche erhalten und werden diese bestimmt als x_max, x_min, y_max und y_min. Basierend auf diesen Koordinaten werden durch die folgenden Ausdrücke zwei Koordinaten, welche rechteckige Flächen angeben, die zur Bestimmung einer Messfläche und einer Fläche zum Abtasten des Rauschens verwendet werden, wie in 13A aufgezeigt als (x'_min, y'_min) und (x'_max, y'_max) angegeben. x'min = xmin – δ (2) y'min = ymin – δ (3) x'max = xmax + δ (4) y'max = ymax + δ (5)
Es sei angemerkt, dass obwohl in diesem Beispiel lediglich eine rechteckige Fläche als die Messfläche angedacht ist, es auch möglich ist, eine Fläche anzuwenden, die um einen Betrag ausgedehnt ist, der bestimmt wird durch den obigen Ausdruck (1) in Bezug auf die binarisierte Fläche, während die Gestalt der Fläche beibehalten wird.
Dann wird eine tatsächliche Fläche des winzigen Punkts als ein physikalisches Objekt, das der binarisierten Fläche entspricht, aus der Anzahl an Pixeln und der Vergrößerung des optischen Systems berechnet und diese als D bestimmt. Es wird hier basierend auf einer Standartfläche D₀ des winzigen Punkts, die festgelegt wird, bei Erzeugung des Biochips 24, und der gemessenen Fläche D des winzigen Punkts der folgende Ausdruck (6) berechnet. σ = D0/D(6)
Wenn der winzige Punkt 25 nicht mit dem Fremdmaterial abgedeckt ist, wie bei dem Teilbild 106 angezeigt, wird zu diesem Zeitpunkt σ ≈ 1 erhalten. Wenn jedoch der winzige Punkt mit dem Fremdmaterial abgedeckt ist, wie bei dem Teilbild 107 angezeigt, wird σ >> 1 erhalten. Die Intensitätsmessung wird unter Verwendung dieses σ lediglich dann ausgeführt, wenn z. B. σ < 10. Im Falle keiner Übereinstimmung wird bestimmt, dass es das Fremdmaterial oder ein Fehler des winzigen Punktes selbst ist und die dem winzigen Punkt entsprechenden Daten keine Verlässlichkeit aufweisen.
Unter Bezug auf die unterteilte Abbildung 106 wird die folgende Verarbeitung ausgeführt.
Das heißt, wie in 13B gezeigt, enthält das von dem CCD-Element 18 erhaltene Bildsignal üblicherweise das Rauschen. Obwohl diese Rauschkomponente abhängig ist von dem Aufbau der Vorrichtung oder einer Messumgebung ist das Anregungslichtrauschen (Rauschen, das durch das Anregungslicht erzeugt wird) basierend auf dem reflektierten Licht des Anregungslichts an dem Substrat (Biochip 24) oder einer Selbstlichtemission des Substrats unter Verwendung des Anwendungslichts dominant und kann in einigen Fällen das Streulichtrauschen (Rauschen, das aufgrund einer Lichtquelle verursacht wird, die von dem Anregungslicht verschieden ist) nicht ignoriert werden. Es sei angemerkt, dass die 13A und 13B zum besseren Verständnis modellhafte Elemente aufzeigen, das zu erfassende Signal und das Rauschsignal tatsächlich jedoch nicht flach sind und in Abhängigkeit von der jeweiligen Position Unregelmäßigkeiten auftreten. Im Speziellen spiegelt das oben beschriebene Anregungs rauschen die Beleuchtungsunregelmäßigkeiten wieder und kann somit dieses Rauschen der größte Faktor der unregelmäßigkeiten in der Rauschkomponente sein.
Daher wird in dieser Ausführungsform eine Fläche, die innerhalb der unterteilten Bildfläche liegt und außerhalb des Messbereichs liegt als ein Bereich zur Rauschabtastung bestimmt und wird von den Signalen relativ zu Pixel in den Messbereich ein gemitteltes Rauschsignal subtrahiert, das erhalten werden kann durch Teilen einer Gesamtsumme der Signale in der Rauschabtastungsfläche durch eine Fläche der Rauschabtastungsfläche.
Es wird dann eine Gesamtsumme der Erfassungssignale, die erhalten wird durch Subtraktion in der Messfläche, als eine Signalintensität P₀ des winzigen Punkts bestimmt. Die Signalintensität P₀ des winzigen Punkts wird ferner durch eine tatsächliche Fläche des winzigen Punkts (Normalisationsverarbeitung) korrigiert und wird das Ergebnis als ein Intensitätsmesswert P des winzigen Punkts bestimmt und wird dieser P durch den folgenden Ausdruck (7) berechnet. Es sei angemerkt, dass D₀ eine Standardfläche des winzigen Punkts ist und D eine tatsächliche Fläche ist, die erhalten wird aus der binarisierten Abbildung eines jeglichen winzigen Punkts, die vorher in diesem Beispiel errechnet wurde. P = (D0/D) P0 (7)
Diese Korrektur, d.h. die Normalisationsverarbeitung, kann das Rauschen eliminieren, das verursacht wird aufgrund eines Bildungsfehlers des winzigen Punkts oder eines Fehlers, wenn ein Teil des winzigen Punkts 25 durch das Fremdmaterial verdeckt wird.
Es sei angemerkt, dass die Abbildung des Biochips 24 gemeinschaftlich durch elektrisches Scannen unter Verwendung des CCD-Elements 18, wie einem in dieser Ausführung verwendeten, aufgenommen wird und in dem Bildspeicher gespeichert wird, die vorliegende Erfindung jedoch nicht darauf beschränkt ist und die Abbildung des Biochips 24 natürlich unterteilt sein kann und durch Durchführen eines wie im Stand der Technik bekannten mechanischen Scannens natürlich unterteilt und aufgenommen werden kann, wodurch eine Gesamtabbildung des Biochips 24 im Bildspeicher erhalten wird. Eine Kombination der beiden Verfahren ermöglicht darüber hinaus die Verwendung eines großen Biochips, der nicht auf einmal vollständig von dem CCD-Element 18 abgebildet werden kann.
Darüber hinaus besitzt diese Ausführungsform die folgenden ihr eigenen Vorteile dieser Erfindung.
Das heißt, da das CCD-Element 18 verwendet wird, kann die Abbildung des Biochips 24 gemeinschaftlich verarbeitet werden, wodurch die Messzeit verkürzt wird. Da andererseits darüber hinaus eine Belichtungszeit verlängert werden kann, ist diese Ausführungsform vorteilhaft im Hinblick auf die Messempfindlichkeit der Intensität. Es sei angemerkt, dass jeder Aufbau in dieser Ausführungsform natürlich auf viele Arten und Weisen modifiziert und verändert werden kann. Zum Beispiel kann als die Bildverarbeitungsvorrichtung ein Personalcomputer verwendet werden. Auch ist es möglich als das CCD-Element 18 eine gekühlte CCD zu verwenden, die von einem Typ ist, der mittels eines Peltier–Elements oder dergleichen gekühlt wird.
Darüber hinaus kann durch Ausdehnen der Fremdmaterialfläche und deren Eliminieren aus der Fluoreszenzabbildung des winzigen Punktes ein Fehler betreffend das Fokussieren des optischen Systems absorbiert werden, wodurch der Einfluss des Rauschlichts des Fremdmaterials der Fluoreszenzabbildung des winzigen Punktes weiter verringert wird. Darüber hinaus kann in dieser Ausführungsform, sogar wenn der binarisierte Bereich keine kreisförmige Gestalt aufweist, wie in der Zeichnung aufgezeigt, aufgrund von Unregelmäßigkeiten in dem zu erfassenden Signal, oder sogar wenn eine Vielzahl der binarisierten Flächen in einer unterteilten Abbildung auftritt, eine Bestimmung einer rechteckigen Fläche, die definiert wird durch (x'_min, y'_min) und (x'_max, y'_max) als dem Messbereich garantieren, dass alle zu erfassenden Signale in diesem Messbereich enthalten sind.
Da die Rauschabtastungsfläche in der Nähe des winzigen Punktes gesetzt wird und die Signalintensität des winzigen Punktes korrigiert wird, kann die Erfassungsgenauigkeit des zu erfassenden Signals verbessert werden. Da darüber hinaus die Messfläche wie oben beschrieben unter Berücksichtung einer Defokussierung festgelegt wird, ist es offensichtlich, dass kein Fokussierungsrauschen erzeugt wird.
Zweite Ausführungsform
Es wird nun unter Bezug auf die 14 und 16 ein Fluoreszenzintensitätsmessverfahren und eine Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform beschrieben, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist.
Es sei angemerkt, dass 14 ein Blockdiagramm ist, das einen Abriss der Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform aufzeigt, und 15 eine schematische Ansicht ist, die einen Referenzchip zeigt. Ferner ist 16 ein Flussdiagramm, das ein Messverfahren gemäß dieser Ausführungsform zeigt.
In dieser Ausführungsform, wie in 14 aufgezeigt, werden zum Zweck des Einstellens einer Lichtmenge, die auf das CCD-Element 18 trifft, eine Vielzahl an ND-Filtern 39, von denen jeder einen bekannten Transmissionsgrad besitzt, selektiv in den Lichtpfad zwischen der Bilderzeugungslinse 17 und dem CCD-Element 18 eingefügt. Das heißt, es ist eine Vielzahl der ND-Filter 39 an der Filterhalteeinrichtung 40 befestigt, und der ND-Filter mit einem verschiedenen Transmissionsgrad wird zum Einsatz in den Lichtpfad basierend auf einem Kommando von der ND-Filtersteuereinrichtung 38 durch die ND-Filterumschalteinrichtung 41 umgeschaltet.
Darüber hinaus wird in dieser Ausführungsform zusätzlich zu dem in 3 dargestellten Biochip 24 auch ein Referenzchip 36 verwendet, wie er in 15 aufgezeigt ist. Hier wird an den selben Positionen der winzigen Punkte 25 des Biochips 24 auf dem Referenzchip 36 die als eine Fluoreszenzmarkierung auf einem Substrat wie einem Flachglas verwendete fluoreszierende Substanz als winzige Referenzpunkte 37, welche eine bekannte Anzahl an fluoreszierenden Molekülen aufweisen, übertragen und fixiert, und es werden die selben fluoreszierenden Moleküle wie die Markierung an vier Ecken der Gruppe von winzigen Punkten, wie dem Biochip 24, übertragen und als winzige Punkte 35 zur Positionserfassung fixiert.
Es sei angemerkt, dass das Verfahren zum Übertragen und Fixieren die Anzahl an zu verwendenden fluoreszierenden Molekülen anhand des Gewichts der zu verwendenden fluoreszierenden Moleküle und der Menge der Moleküle spezifiziert, eine Lösung der fluoreszierenden Moleküle mit dieser Anzahl an fluoreszierenden Molekülen erzeugt, um so eine spezifische Menge zu erhalten, und lediglich eine fest gelegte Menge dieser Lösung durch ein Tintenstrahlverfahren auf dem Substrat abgeschieden. Es ist darüber hinaus möglich, ein Verfahren zum In-Kontakt-Bringen der fluoreszierenden Substanz mit dem Substrat anzuwenden, bei dem bewirkt wird, dass die Lösung an einer Nadel anhaftet. Es sei angemerkt, dass die Anzahl an fluoreszierenden Molekülen pro winzigem Referenzpunkt aus verschiedenen Mengen (einer Menge der Lösung und der Anzahl an fluoreszierenden Molekülen in der Lösung) und einer eine Abscheidungsmenge der Lösung berechnet wird. Darüber hinaus ermöglicht die Ver wendung eines Festphasenreagenz als ein Verfahren zum Halten der fluoreszierenden Moleküle ein sicheres Halten der fluoreszierenden Moleküle, wobei dies jedoch nicht notwendigerweise erforderlich ist.
Dieser Referenzchip 36 wird auf einer nicht erläuterten zweiachsigen Bühne, wie sie in 14 aufgezeigt wird, auf die selbe flache Ebene wie der Biochip 24 gegeben und kann mittels der zweiachsigen Bühne in einem Gesichtsfeld des optischen Systems positioniert werden.
Da der sonstige Aufbau der selbe wie der in der oberen beschriebenen ersten Ausführungsform ist, wird auf deren Erläuterungen verzichtet.
Unter Bezug auf das Flussdiagramm aus 16 wird nun das Messverfahren beschrieben, welches die Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung mit einem derartigen Aufbau verwendet.
Als erstes wird der Referenzchip 36 so positioniert, dass er mit dem Gesichtsfeld der Objektlinse 34 übereinstimmt (Schritt S1)
Das heißt, der Referenzchip 36 wird durch die nicht näher beschriebene zweiachsige Bühne auf eine solche Weise positioniert, dass ein durch die vier winzigen Positionierungspunkte 35 auf dem Referenzchip 36 definierter Bereich in einem Gesichtsfeldbereich enthalten ist, der bestimmt wird durch die Abbildungsvergrößerung eines optischen Beobachtungssystems und die Größe der Lichtempfangsfläche des CCD-Elements 18.
Dann wird ein Fluoreszenzmessfilterset 7 an einer Aufnahmeposition positioniert (Schritt S2).
Das heißt, es wird ein Filtersetumschaltmechanismus 16 verwendet, um das Fluoreszenzmessfilterset 7 an der Aufnahmeposition so zu positionieren, dass die Fluoreszenzabbildung der winzigen Referenzpunkte 37 auf dem Referenzchip 36 aufgenommen werden kann.
Dann wird die Fluoreszenzabbildung des Referenzchips 36 von dem CCD-Element 18 aufgenommen, während die ND-Filter 39 umgeschaltet werden (Schritt S3).
Das heißt, der Referenzchip 36 wird einer Anregungsbeleuchtung unterzogen und wird während eines Umschaltens einer Vielzahl der ND-Filter 39 eine Abbildung der von den fluoreszierenden Molekülen in den winzigen Referenzpunkten 37 erzeugten Fluoreszenz aufgenommen. Es sei angemerkt, dass in dieser Ausführungsform das CCD-Element 18 als das Lichtaufnahmeelement verwendet wird, jedoch die vorliegende Erfindung nicht auf das CCD-Element beschränkt ist und ein beliebiger anderer Flächensensor angewendet werden kann. Daher kann das unten beschriebene "CCD-Element" durch einen Flächensensor ausgeführt sein.
Anschließend wird eine Hintergrundabbildung des Referenzchips 36 von dem CCD-Element 18 aufgenommen, währende die ND-Filter 39 umgeschaltet werden (Schritt S4).
Das heißt, die Anregungsbeleuchtung wird unmittelbar nach der Aufnahme der Fluoreszenzabbildung des Referenzchips 36 unterbrochen und die Hintergrundabbildung aufgenommen. Diese Hintergrundabbildung besteht aus einem Dunkelstrom und einem Streulichtstrahl, welche nicht für die Erfassungsintensität erforderlich sind.
Der Referenzchip 36 wird dann aus dem Gesichtsfeld bewegt und der Biochip 24 in dem Gesichtsfeld positioniert (Schritt S5).
Das heißt, der Biochip 24 wird durch die nicht veranschaulichte zweiachsige Bühne auf eine solche Weise positioniert dass die vier winzigen Positionierungspunkte 35 auf dem Biochip 24 im Wesentlichen mit den Positionen der winzigen Positionierungspunkte 35 auf dem Referenzchip 36 übereinstimmen.
Es wird dann die Fluoreszenzabbildung des Biochips 24 von dem CCD-Element 18 aufgenommen, während die ND-Filter 39 umgeschaltet werden (Schritt S6).
Das heißt, der Biochip 24 wird einer Anregungsbeleuchtung ausgesetzt und eine Abbildung der durch die Fluoreszenzmoleküle in jedem winzigen Punkt erzeugten Fluoreszenz durch das CCD-Element 18 aufgenommen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Fluoreszenzabbildung aufgenommen, während eine Vielzahl der ND-Filter 39 umgeschaltet werden.
Durch das CCD-Element 18 wird dann eine Hintergrundabbildung des Biochips 24 aufgenommen, während die ND-Filter 39 umgeschaltet werden (Schritt S7).
Das heißt, unmittelbar nach der Aufnahme der Fluoreszenzabbildung des Biochips 24 wird die Anregungsbeleuchtung unterbrochen und die Hintergrundbeleuchtung aufgenommen. Diese Hintergrundabbildung besteht aus einem Dunkelstrom und deinem Streulichtstrahl, welche wie bei der Hintergrundabbildung des Referenzchips 36 nicht für die Erfassungsintensität erforderlich sind.
Anschließend wird der Filter auf das Filterset 11 zur Aufnahme der Fremdmaterialabbildung umgeschaltet (Schritt S8).
Das heißt, es wird der Filtersetumschaltmechanismus 16 verwendet, um das Filterset 11 zur Aufnahme der Fremdmaterialabbildung an einer Aufnahmeposition zu positionieren, um so eine Abbildung des Fremdmaterials auf dem Biochip 24 aufzunehmen.
Danach wird eine Abbildung des Fremdmaterials auf dem Biochip aufgenommen (Schritt S9).
Das heißt, das Fremdmaterial auf dem Biochip 24 wird durch das Licht mit einer Wellenlänge, bei der die fluoreszierende Markierungssubstanz nicht angeregt wird, beleuchtet und es wird eine Abbildung von dem Fremdmaterial durch das CCD-Element 18 unter Verwendung der von dem Fremdmaterial erzeugten Fluoreszenz (Selbstlichtemission) oder dem reflektierten Licht aufgenommen.
Die Fremdmaterialabbildung wird dann binarisiert (Schritt S10).
Das heißt, die aufgenommene Fremdmaterialabbildung oder deren Differenzialabbildung wird unter Verwendung eines spezifischen Grenzwertes binarisiert, die Fremdmaterialfläche spezifiziert und diese Abbildung als eine binarisierte Fremdmaterialabbildung bestimmt.
Anschließend werden die entsprechenden Hintergrundabbildungen von den Fluoreszenzabbildungen des Referenzchips 26 und des Biochips 24 abgezogen, wodurch korrigierte Abbildungen erhalten werden (Schritt S11).
Das heißt, eine Ausgabe des Lichtempfangselements umfasst im Allgemeinen ein Direktstromrauschen wie ein Dunkelstromrauschen oder ein Streulichtrauschen. Um dieses Direktstromrauschen zu eliminieren, werden die Hintergrundabbildungen von den entsprechenden Fluoreszenzabbildungen des Referenzchips 36 und des Biochips 24 abgezogen und werden die resultierenden Abbildungen als korrigierte Abbildungen bezeichnet, welche die Ziele der nachfolgenden Verarbeitung sein werden. Dies wird gemäß jedem großen ND-Filter durchgeführt.
Danach wird in jeder korrigierten Abbildung eine Position des Gravitationszentrums der Abbildung entsprechend den winzigen Punkten zur Positionserfassung erfasst (Schritt S12).
Das heißt, die winzigen Punkte 25 und die winzigen Referenzpunkte 37, die auf dem Referenzchip 36 und dem Biochip 24 angeordnet sind, sind wie in den 3 und 15 zweidimensional angeordnet, und es werden alle vier winzigen Punkte, die an den vier Ecken angeordnet sind, als die winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung verwendet. Da die winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung zur Ausgabe von Positionssignalen verwendet werden, ist jegliche Substanz in diesem Element ausreichend, solange sie eine lumineszierende Substanz oder eine reflektierende Substanz ist. Es ist jedoch bevorzugt, eine fluoreszierende Substanz mit einer Fluoreszenzwellenlänge zu verwenden, die von der Fluoreszenzwellenlänge der als eine Markierung verwendeten fluoreszierenden Substanz verschieden ist. Der Grund hierfür ist, dass damit die Möglichkeit ausgeräumt wird, dass die von den winzigen Punkten 35 zur Positionserfassung erzeugte Fluoreszenz als ein Rauschen wirkt. In diesem Fall wird die Beleuchtung durch die Anregungswellenlänge ausgeführt, die den winzigen Punkten 35 zur Positionserfassung eigen ist, und eine Positionserfassung bewirkt. Zur Positionserfassung wird ein Verfahren zur Bestimmung einer Gravitationszentrumskoordinate als eine Positionskoordinate von jedem der vier winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung angewendet, oder es werden ein Verfahren zur Einarisierung der korrigierten Abbildung durch Verwenden eines Niveaus von ½ der maximalen Intensität und Bestimmen der vier Schwerpunkte als Positionskoordinaten oder ein ähnliches Verfahren angewendet.
Zusätzlich wird jede korrigierte Abbildung gedreht und bewegt, wodurch für jeden ND-Filter eine Rotationsabbildung erhalten wird (Schritt S13).
Das heißt, die Positionskoordinaten werden derart korrigiert, dass ein Viereck, das durch die Positionskoordinaten der vier winzigen Punkte 35 zur Positionserfassung gebildet wird, bzw. relativ zu dem Referenzchip 36 und dem Biochip 24 erhalten wird, zu einem Rechteck mit einer minimalen Ablenkung wird und die korrigierten Abbildungen gedreht und bewegt werden, wobei der Mittelpunkt einer jeden Abbildung auf dem Mittelpunkt der Rotation liegt, so dass jede Seite dieses Rechtecks parallel mit der Koordinatenachse einer jeden Abbildung wird. Eine nach einer Bewegung erhaltene Abbildung wird als eine Rotationsabbildung bezeichnet. Zu diesem Zeitpunkt wird die binarisierte Fremdmaterialabbildung ebenfalls um denselben Betrag wie der Biochip 24 gedreht und bewegt.
Dann wird unter Verwendung der binarisierten Fremdmaterialabbildung als einer Maske in Bezug auf die Fluoreszenzabbildung des Biochips 24 die Intensitätsinformation der Fluoreszenzabbildung, die mit der Fremdmaterialfläche übereinstimmt, deaktiviert (Schritt S14).
Das heißt, es wird mittels der Bildverarbeitungseinrichtung 22 eine logische Multiplikation der als die binarisierte Fremdmaterialabbildung erhaltenen Abbildung mit einer Fluoreszenzabbildung des Biochips 24 durchgeführt und es werden die Intensitätsdaten der Pixel der Fluoreszenzabbildung des Biochips 24, die mit der binarisierten Fremdmaterialfläche übereinstimmen, auf "0" gesetzt.
Danach wird jede Rotationsabbildung in Abbildungen für jeden winzigen Referenzpunkt 37 und jeden winzigen Punkt 25 unterteilt und werden die resultierenden Abbildungen als die unterteilte Abbildung für jeden ND-Filter und jeden winzigen Punkt bestimmt (Schritt S15).
Das heißt, die Divisionsbedingungen werden basierend auf den Positionskoordinaten der vier winzigen Positionspunkte in Bezug auf jede Rotationsabbildung des Referenzchips 36 und des Biochips 24 und der Anordnungsbedingungen der winzigen Referenzpunkte 37 und der Referenzpunkte 25 bestimmt und es werden unter den Divisionsbedingungen alle Rotationsabbildungen zu Abbildungen für jeden winzigen Referenzpunkt 37 oder jeden winzigen Punkt 25 unterteilt, wodurch die unterteilen Abbildungen erhalten werden.
Dann wird jede unterteilte Abbildung entsprechend einem optimalen ND-Filter 39 als eine Messabbildung für jedes Element extrahiert (Schritt S16).
Das heißt, eine unterteilte Referenzabbildung, deren maximale Signalintensität innerhalb eines dynamischen Bereichs des CCD-Elements 18 fällt, und deren Intensi tätssignal maximal ist, wird aus der unterteilten Referenzabbildung, deren Zahl der Zahl der ND-Filter in Bezug auf die winzigen Referenzpunkte 37 bei den selben Positionen auf dem Referenzchip 36 entspricht, extrahiert und diese als eine Messreferenzabbildung bezeichnet. Gleichermaßen wird eine unterteilte Abbildung, deren maximale Signalintensität innerhalb eines dynamischen Bereichs des CCD-Elements 18 fällt und deren Signalintensität maximal ist, aus den unterteilten Abbildungen, deren Zahl der Zahl der ND-Filter relativ zu den winzigen Punkten 25 an denselben Positionen auf dem Biochip 24 entspricht, extrahiert und diese als eine Messprobenabbildung bezeichnet. Für die Messreferenzabbildung und die Messprobenabbildung wird die korrigierte Intensität R_k (= die maximale Intensität in der unterteilen Abbildung x Transmissionsgrad des ND-Filters 39, der zur Aufnahme verwendet wird) in der absteigenden Ordnung des Transmissionsgrads T_k eines jeden ND-Filters 39, der für die Aufnahme verwendet wird, erhalten. In diesem Beispiel ist k eine Zahl, die jedem ND-Filter in absteigenden Ordnung des Transmissionsgrads gegeben wird (k = 1 bis n). Wenn ein Änderungsverhältnis von Rk (=(P_k+1/T_k+1) – (P_k/T_k)) der negativen Bedingung genügt, wird eine Abbildung entsprechend der ND-Filterzahl k extrahiert.
Dann wird jede extrahierte Messabbildung binarisiert, wodurch eine binarisierte Abbildung für jedes Element erhalten wird (Schritt S17).
Das heißt, alle Messreferenzabbildungen und die Messprobenabbildungen werden mit einem Mittelwert aus dem Maximalsignal und dem Minimalsignal in jeder Abbildung, der als ein Grenzwert bestimmt wird, binarisiert und die resultierenden Abbildungen als binarisierte Referenzabbildungen und binarisierte Probenabbildungen bestimmt. Hier wird für die binarisierte Probenabbildung eine Fläche D der binarisierten Fläche berechnet.
Danach werden die Messflächen und die Rauschabtastfläche unter Verwendung einer jeden binarisierten Abbildung festgelegt (Schritt S18).
Das heißt, es werden in Bezug auf alle binarisierten Referenzabbildungen eine maximale X-Koordinate x_Rmax, eine minimale X-Koordinate x_Rmin, eine maximale Y-Koordinate Y_Rmax und eine minimale Y-Koordinate Y_Rmin einer jeden Abbildung erhalten. Gleichermaßen werden in Bezug auf alle binarisierten Probenabbildungen eine maximale X-Koordinate x_Smax, eine minimale X-Koordinate x_Smin, eine maximale Y-Koordinate Y_Smax und eine minimale Y-Koordinate Y_Smin einer jeden Abbildung erhalten und es werden dann x'_Rmax, x'_Rmin, y'_Rmax, y'_Rmin, x'_Smax, x'_Smin, y'_Smax und Y'_Smin, die zur Festlegung der Abtastfläche des Rauschens verwendet werden, unter Verwendung der folgenden Gleichungen berechnet. x'min = xmin – δ (8) y'min = ymin – δ (9) x'max = xmax + δ (10) y'max = ymax + δ (11)
In dem obigen Ausdruck ist δ eine Menge, die eine Unschärfemenge des optischen Systems angibt und wird angegeben durch den folgenden Ausdruck. δ = β·(1.619 λ2 + α|Δ|) (12)
Es sei angemerkt, dass β eine Abbildungsvergroßerung des optischen Systems ist, λ eine zur Ausbildung der Abbildungen der winzigen Punkte 25 und der winzigen Referenzpunkte 37 verwendete Wellenlänge ist, α eine numerische Apertur der Objektlinse 34 auf der Seite des Biochips ist und Δ eine Defokussierungsmenge ist.
Das Innere eines Rechtecks, das durch die hierin berechneten Punkte (x'_Rmin, y'_Rmin) und die Punkte (x'_Rmax, y'_Rmax) definiert ist, wird als die Messfläche der Messreferenzabbildung bestimmt, und der Bereich außerhalb des Rechtecks wird als die Rauschabtastfläche der Messreferenzabbildung bestimmt. Gleichermaßen wird das Innere des Rechtecks, das durch den Punkt (x'_Smin, y'_Smin) und den Punkt (x'_Smax, y'_Smax) definiert ist, als die Messfläche der Messprobenabbildung bestimmt, und der Bereich außerhalb des Rechtecks wird als die Rauschabtastfläche der Messprobe bestimmt.
Anschließend wird ein mittleres Rauschsignal von dem Signal der Messfläche auf der Messabbildung subtrahiert (Schritt S19).
Das heißt, das Rauschen pro Einheitsfläche wird erhalten aus dem Signal in der Rauschabtastfläche, das in der Messreferenzabbildung festgelegt ist, wobei dieses Signal von dem Signal der Messfläche in der Messreferenzabbildung subtrahiert wird, und es wird ein Ergebnis als ein Erfassungssignal der Messreferenzabbildung bestimmt. Gleichermaßen wird das Rauschen pro Einheitsfläche aus dem Signal der Rauschabtastfläche erhalten, die in der Messprobenabbildung festgelegt ist, wobei dieses Signal von dem Signal der Messfläche in der Messprobenabbildung subtrahiert wird, und es wird ein Ergebnis als ein Erfassungssignal der Messprobenabbildung bestimmt.
Dann wird eine Signalintensität pro Standardfläche des winzigen Punkts 25 berechnet (Schritt S20).
Das heißt, es wird eine Gesamtsumme der Erfassungssignale in den Messflächen der Messreferenzabbildung entsprechend eines jeden winzigen Referenzpunkts 36 berechnet und dies als P_R bestimmt. Darüber hinaus wird ein Maximalwert der Gesamtsumme P_R der Erfassungssignale entsprechend einer Vielzahl der winzigen Punkte 25 als P_Rmax bestimmt. Des Weiteren wird eine Gesamtsumme der Erfassungssignale in der Messfläche der Messprobenabbildung entsprechend eines jeden winzigen Punkts 25 berechnet und dies als P_D0 bestimmt. Es wird dann die Signalintensität P_D pro Standardfläche des winzigen Punkts 25 unter Verwendung des folgenden Ausdrucks (13) berechnet. Diese Signalintensitäten werden als Intensitäten mit einem Intensitätsfehler erhalten, der erzeugt wird aufgrund von Unregelmäßigkeiten des Anregungslichts, Rauschen des Anregungslichts und Bildungsfehlern der winzigen Punkte, die davon entfernt werden.
Da die Anregungslichtmenge unter Verwendung des Referenzchips 36 korrigiert wird, wenn die Intensität des Biochips 24 gemessen wird, können gemäß dieser oben beschriebenen Ausführungsform räumliche und zeitliche Fluktuationen des Anregungslichts ausgeräumt werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung basierend auf den Ausführungsformen beschrieben wurde, ist die vorliegende Erfindung nicht auf die vorherige Ausführungsform beschränkt und sind natürlich zahlreiche Modifikationen oder Anwendungen innerhalb des Umfangs der anhängenden Ansprüche möglich.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben ist die vorliegende Erfindung auf dem technischen Gebiet der chemischen und physikalischen Eigenschaftsanalyse eines biologischen Materials wie einer DNA oder eines Proteins wirksam.

Claims

Fluoreszenzintensitätsmessverfahren, das die Intensität winziger Punkte misst, die auf einem Substrat mit einer im Wesentlichen flachen Oberfläche angeordnet sind und eine fluoreszierende Substanz enthalten, umfassend: einen ersten Bilderzeugungsschritt, bei dem Licht mit einer Wellenlänge, mit der die fluoreszierende Substanz angeregt werden kann, emittiert wird und eine Abbildung eines jeden winzigen Punktes, der die fluoreszierende Substanz enthält, als eine erste Abbildung erhalten wird; einen zweiten Bilderzeugungsschritt, bei dem durch Licht mit einer Wellenlänge, die die fluoreszierende Substanz nicht anregt, eine Abbildung von an dem Substrat anhaftendem Fremdmaterial als eine zweite Abbildung erhalten wird; einen Extraktionsschritt, bei dem eine binarisierten Abbildung durch Extrahieren einer Fremdmaterialfläche aus der zweiten Abbildung erhalten wird; und einen Fremdmaterialeliminierungsschritt, bei dem man an einem Abschnitt, der mit der Fremdmaterialfläche überlappt, in der ersten Abbildung keine Abbildung zustande kommen lässt, wobei die binarisierte Abbildung als eine Maske verwendet wird; dadurch gekennzeichnet, dass der Extraktionsschritt die binarisierte Abbildung erhält durch Anwenden eines Differentialoperators auf die zweite Abbildung und Bestimmen eines Binarisierungsniveaus der binarisierten Abbildung durch Verwenden einer Frequenzverteilung des jedem Pixel entsprechenden Differenzsignals.
Fluoreszenzintensitätsmessverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen Ausdehnungsschritt umfasst, bei dem die Fremdmaterialfläche der binarisierten Abbildung um einen festgelegten Betrag ausgedehnt wird.
Fluoreszenzintensitätsmessverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen Normalisierungsschritt umfasst, bei dem die gemessenen Intensität des winzigen Punktes durch Verwenden einer Referenzfläche für den winzigen Punkt normalisiert wird.
Fluoreszenzintensitätsmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner einen Zuverlässigkeitsbeurteilungsschritt umfasst, bei dem nach dem Fremdmaterialeliminierungsschritt für jeden winzigen Punkt eine Fläche erhalten wird und die Zuverlässigkeit des Messwertes beurteilt wird unter Verwendung eines Verhältnisses der erhaltenen Fläche und der Referenzfläche für den winzigen Punkt.
Fluoreszenzintensitätsmessverfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Differenzsignal mit einer Intensität in einer winzigen Fläche, die dem Differenzsignal entspricht, standardisiert wird.
Fluoreszenzintensitätsmessvorrichtung, welche die Intensität einer Fluoreszenzabbildung misst, die erhalten wird durch Bestrahlen von winzigen Punkten, die auf einem Substrat mit einer im Wesentlichen flachen Oberfläche angeordnet sind und eine fluoreszierende Substanz enthalten, mit einem Anregungslicht, umfassend: eine Lichtquelle (2); ein erstes Wellenlängenauswahlmittel (8, 9, 12, 13) zur Wahl einer Wellenlänge des Anregungslichtes; Abbildungserzeugungsmittel (17) zum Erzeugen einer Abbildung der fluoreszierende Substanz; zweites Wellenlängenauswahlmittel (10, 14) zur Wahl lediglich einer Wellenlänge einer erzeugten Fluoreszenz; photoelektrisches Umwandlungsmittel (18) zum Erhalt einer Abbildung durch Abtasten einer Fluoreszenzabbildung; Speichermittel (21) zur Speicherung der Abbildung; und Bildverarbeitungsmittel (22), das ausgelegt ist für: eine Verarbeitung zum Emittieren von Licht mit einer Wellenlänge, die die fluoreszierende Substanz anregen kann, in dem Licht von der Lichtquelle durch Steuern des ersten Wellenlängeauswahlmittels, um mittels des photoelektrischen Umwandlungsmittels eine Abbildung des winzigen Punktes, der die fluoreszierende Substanz enthält, als eine erste Abbildung zu erhalten durch Steuern des zweiten Wellenlängeauswahlmittels, und zum Speichern der ersten Abbildung in dem Speichermittel; eine Verarbeitung zum Emittieren von Licht mit einer Wellenlänge, die die fluoreszierende Substanz nicht anregt, in dem Licht von der Lichtquelle durch Steuern des ersten Wellenlängeauswahlmittels, um mittels des photoelektrischen Umwandlungsmittels eine Abbildung des an dem Substrat anhaftenden Fremdmaterials zu erhalten durch Steuern des zweiten Wellenlängeauswahlmittels, und zum Speichern der zweiten Abbildung in dem Speichermittel; eine Verarbeitung zum Erhalt einer binarisierten Abbildung durch Extrahieren einer Fremdmaterialfläche aus der in dem Speichermittel gespeicherten zweiten Abbildung; und eine Verarbeitung bei der man an einem Abschnitt, der mit der Fremdmaterialfläche überlappt, in der in dem Speichermittel gespeicherten ersten Abbildung keine Abbildung zustande kommen lässt, wobei die binarisierte Abbildung als eine Maske verwendet wird; dadurch gekennzeichnet, dass das Bildverarbeitungsmittel eine binarisierte Abbildung erhält durch Anwenden einer Differentialoperators auf die zweite Abbildung und Bestimmen eines Binarisierungsniveaus der binarisierten Abbildung durch Verwenden einer Frequenzverteilung des jedem Pixel entsprechenden Differenzsignals.