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Die vorliegende Erfindung betrifft eine optische Anordnung zur Erfassung der Lumineszenz von Proben. Ferner betrifft die Erfindung ein Lumineszenzmessgerät mit einer derartigen Optik sowie einen wechselbaren Filterwürfel.
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Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine optische Anordnung bereitzustellen, die eine kompakte Bauweise für ein hiermit ausgerüstetes Lumineszenzmessgerät und dessen preiswerte Herstellung ermöglicht.
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Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß gelöst durch eine optische Anordnung mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen.
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Die Verwendung eines absorbierenden Farbfilters, der keine reflektierenden Schichten, und insbesondere keine dichroitischen Schichten aufweist, ermöglicht eine kompakte Bauweise und preiswerte Herstellung einer entsprechenden optischen Anordnung und eines entsprechenden hiermit ausgestatteten Lumineszenzmessgerätes oder Mikroskops.
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Mit Lumineszenz ist vorliegend insbesondere Photolumineszenz, also die Lumineszenzanregung durch Photonen einschließlich Phosphoreszenz und Fluoreszenz, gemeint.
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Um die Lumineszenz einer Probe zu vermessen, ist die Anregung der Probe mit einer Anregungsstrahlung notwendig. Die in der Probe angeregte Lumineszenz weist aufgrund der Stokes-Verschiebung in der Regel eine größere Wellenlänge auf als die Anregungsstrahlung. Dadurch können Anregungs- und Lumineszenzstrahlung spektral separiert werden. Die effiziente Separierung ist dabei von entscheidender Bedeutung für ein gutes Signal/Untergrund-Verhältnis, da die Lumineszenzstrahlung viele Größenordnungen schwächer ist als die Anregungsstrahlung. Um die Anregungsstrahlung von der Kamera fernzuhalten, sieht der Stand der Technik interferenzbasierte Emissionsfilter vor. Diese sind jedoch teuer und haben den weiteren Nachteil einer hohen Empfindlichkeit bezüglich des Einfallswinkels der zu filternden Strahlung. Zwar weisen Interferenzfilter eine sehr scharfe Filterkante auf. Jedoch kann leicht ein Durchbruch auftreten, wenn Licht einer nicht akzeptablen Wellenlänge nicht wie vorgesehen senkrecht auf den Filter einfällt. Hierdurch entsteht ein unerwünschter Streulichtuntergrund im Kamerabild. Die Winkelabhängigkeit resultiert aus dem Funktionsprinzip des Interferenzfilters, das darauf basiert, eine Vielzahl von dünnen Schichten mit unterschiedlichen Brechungsindizes auf einem transparenten Substrat aufzubringen. Aufgrund der Winkelempfindlichkeit müssen Interferenzfilter daher in den kollimierten Strahlengang angeordnet werden. Um eine kompakte Bauweise zu erhalten, ist man jedoch darauf angewiesen, Optiken mit kurzen Brennweiten zu verwenden. Dies führt – bei Beibehaltung der Bildfeldgrößen – in der Regel zu größeren Feldwinkeln und damit zu einem größeren Winkelspektrum an den Filtern. Dieses vergrößerte Winkelspektrum führt bei einem Interferenz-Emissionsfilter zu einer erhöhten (ungewollten) Durchlässigkeit für die Anregungsstrahlung.
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Im Gegensatz zu interferenzbasierten Filtern, die unterwünschte Strahlung reflektieren, absorbiert ein absorbierender Farbfilter weitgehend unabhängig vom Einfallswinkel die unerwünschten Spektralanteile. Bei der erfindungsgemäßen optischen Anordnung stellt ein vergrößertes Winkelspektrum, da kein interferenzbasierter Emissionsfilter vorgesehen ist, jedoch kein Problem dar.
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Die erfindungsgemäße optische Anordnung kann überall dort zum Einsatz kommen, wo die Lumineszenz von Proben erfasst werden soll. Es ist beispielsweise denkbar, Lumineszenzmessgeräte, insbesondere sogenannte Biochip-Reader, Fluoreszenzreader, real time PCR-Geräte und ähnliche, damit auszustatten. Die auszulesenden lumineszierenden Proben können dabei einzeln, parallel oder hochparallel angeordnet vorliegen und im Prinzip jegliche physikalischen, chemischen, biochemischen oder biologischen auf Lumineszenz basierende Tests oder Analysen umfassen. Die Tests oder Analysen können sich auf lebendes oder totes Material, einzelne Moleküle oder Molekülfragmente, Bestandteile von Zellen, ganze Zellen, Gewebe, Gewebeverbände, Organismen, Lösungen, Suspensionen, in vivo oder in vitro-Fragestellungen sowie im Prinzip alle Arten von lumineszierenden Materialien oder Materialoberflächen beziehen. Beispielsweise können mit der erfindungsgemäßen optischen Anordnung ausgestattete Lumineszenzmessgeräte dazu dienen, Ziel-DNA oder -RNA mittels fluoreszierender Sonden zu detektieren. Weiterhin ist es möglich und denkbar, die erfindungsgemäße optische Anordnung in Lumineszenzmessgeräte zu integrieren, welche, beispielsweise mit Hilfe interkalierender fluoreszierender Farbstoffe wie Ethidiumbromid oder SYBR® Green I oder mittels Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET)-Sonden, die Verfolgung der Amplifikation von Ziel-DNA oder -RNA quantitativ und in Echtzeit ermöglichen (quantitative Echtzeit-PCR). Es ist darüber hinaus auch möglich, die erfindungsgemäße optische Anordnung in Lumineszenzmessgeräte zu integrieren, welche parallele oder hochparallele Anordnungen von fluoreszierenden Sonden wie beispielsweise mit einem Fluorophor gekoppelte Antikörper, markierte Proben wie Moleküle oder Molekülfragmente, insbesondere DNA, RNA, Peptide oder Proteine, auslesen. Die Moleküle oder Molekülfragmente können entweder immobilisiert, beispielsweise auf sogenannten Biochips, oder in Lösung vorliegen, beispielsweise in sogenannten Mikrotestplatten, die vorteilhafterweise eine Vielzahl kleiner Reaktionskammern oder Näpfe (beispielsweise 96, 384, 1536 solcher Näpfe) aufweisen. In solchen Probenarrays können die Proben entweder einzeln nacheinander oder parallel ausgelesen werden. Vorteilhaft kann die erfindungsgemäße Optik beispielsweise auch in Durchflussanordnungen wie Fluorescent activated cell sorter (FACS)-Geräten oder Mikrofluidik-Anwendungen, wie beispielsweise sogenannten Lab-on-a-Chip Systemen, Verwendung finden. Die erfindungsgemäße optische Anordnung ist weiterhin geeignet zum Einsatz in insbesondere preiswerten, nicht-scannenden weitfeldbeleuchteten Fluoreszenzmikroskopen.
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Neben der erwähnten deutlichen Verbesserung hinsichtlich einer kompakten Bauweise bringt die vollständige Einsparung des teuren interferenzbasierten Emissionsfilters den weiteren Vorteil, dass die erfindungsgemäße optische Anordnung erheblich preiswerter gefertigt werden kann. Besonders für Geräte im sogenannten point-of-care-Bereich ergibt sich so ein signifikantes Einsparpotential beim Geräteendpreis.
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Aufgrund der fokussierenden Abbildungsoptik nimmt der Querschnitt des Abbildungsstrahlenganges in Richtung Kamera ab. Zwischen Abbildungsoptik und Kamera kann deshalb ein kleinerer Filter angeordnet werden als im kollimierten Strahlengang, was weitere Kostenvorteile mit sich bringt. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Emissionsfilter innerhalb der erfindungsgemäßen optischen Anordnung deshalb zwischen Abbildungsoptik und Kamera, nahe der Kamera, platziert. Mit einem interferenzbasierten Filter wäre eine solche Anordnung aufgrund dessen Winkelempfindlichkeit nicht möglich.
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Die Filterwirkung, das heißt die Absorption der unerwünschten Spektralanteile, nimmt bei absorbierenden Farbfiltern mit der Filterdicke monoton zu. Bei höheren Filterdicken, beispielsweise über 6 mm, leidet jedoch die Abbildungsqualität bereits merklich. Um die Filterwirkung bei akzeptablen Gesamtfilterdicken zu optimieren, und um eine bessere Gesamtfilterwirkung zu erzielen, kann in der erfindungsgemäßen optischen Anordnung deshalb ein Filterset aus wenigstens zwei in Abbildungsrichtung hintereinander stehenden absorbierenden Farbfiltern aus unterschiedlichen Materialien vorgesehen sein.
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Um eine optimale Filterwirkung zu erzielen, können die in dem Filterset verwendeten Filter unterschiedliche Dicken aufweisen.
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Die in dem Filterset verwendeten Filter können mit einem optischen Kitt verkittet sein, um Reflexionsverluste zu vermindern.
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Es kann auch vorgesehen sein, dass zumindest einer der absorbierenden Farbfilter des Filtersets als Strahlteiler eingerichtet ist. Der Filter bildet in diesem Fall das Substrat für den erfindungsgemäß in der optischen Anordnung vorgesehenen, insbesondere interferenzbasierten, Strahlteiler.
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Ebenfalls zum Zweck der Verringerung von Reflexionsverlusten kann weiterhin vorgesehen sein, dass einige oder alle der zugänglichen Flächen des oder der absorbierenden Farbfilter(s) mit einer Anti-Reflexbeschichtung für die zu transmittierenden Wellenlängen versehen sind.
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Die Strahlungsquelle wird vorteilhafterweise durch eine Leuchtdiode (LED) oder ein Array aus wenigstens zwei LEDs gebildet. Die Auswahl der LED erfolgt jeweils spektral abgestimmt auf das für die jeweilige Messaufgabe verwendete Fluorophor, so dass das Fluorophor effizient angeregt werden kann. Die Auswahl der Filter erfolgt ebenfalls abgestimmt auf das jeweils zu detektierende Fluorophor in einer Weise, dass die zur Anregung des Fluorophors notwendige Anregungsstrahlung möglichst effektiv von der Kamera ferngehalten wird und die vom angeregten Fluorophor ausgesendete Emissionsstrahlung möglichst effektiv zur Kamera gelangt. Die Abstimmung der Filter hat also so zu erfolgen, dass eine Überlappung der Spektralbereiche von Anregungsstrahlung und Emissionsstrahlung weitgehend, im Rahmen des Möglichen, vermieden wird.
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Wie bereits eingangs ausgeführt, bezieht sich die Erfindung auch auf mit der erfindungsgemäßen optischen Anordnung ausgestattete optische Geräte, insbesondere auch auf ein Lumineszenzmessgerät.
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Die erfindungsgemäße optische Anordnung oder ein damit ausgestattetes optisches Gerät können mit mechanischen oder elektronischen Steuer- und Auswerteeinheiten verbunden oder mit diesen integriert verbunden sein. Dazu gehören beispielsweise schalt- und dimmbare Stromquellen für die Strahlungsquelle, elektromechanische Verstellvorrichtungen zur Fokussierung oder zum Probentransport, elektromechanische Wechsler für Optiken oder Filter, sowie Computer und Monitore. Weiterhin kann die erfindungsgemäße optische Anordnung oder ein damit ausgestattetes optisches Gerät auch ein Gehäuse umfassen, das von außen kommende Störungen, wie Umgebungslicht, Feuchtigkeit oder elektromagnetische Felder abschirmt.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen:
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1 eine optische Anordnung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops nach dem Stand der Technik,
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2 eine typische Zusammenstellung von Transmissionsspektren nach dem Stand der Technik für rot fluoreszierende Fluorophore,
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3 eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen optischen Anordnung, sowie
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4 eine Zusammenstellung von Transmissionsspektren nach der erfindungsgemäßen optischen Anordnung der 3 für rot fluoreszierende Fluorophore.
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1 zeigt die optische Anordnung 1 eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops nach dem Stand der Technik. Die optische Anordnung enthält eine Strahlungsquelle 2, deren Strahlung mittels einer Beleuchtungsoptik 3 kollimiert wird. Die kollimierte Anregungsstrahlung 4 trifft auf einen interferenzbasierten Anregungsfilter 5 mit einer Bandpass-Charakteristik. Nach der spektralen Filterung durch den Anregungsfilter 5 wird die Anregungsstrahlung 4 mit einem dichroitischen Strahlteiler 6 durch das Objektiv 7 auf die Probe 8 gelenkt. Die von der angeregten Probe 8 ausgesendete Lumineszenzstrahlung 9 wird vom Strahlteiler 6 weitgehend transmittiert und über eine Abbildungsoptik 10 auf eine Kamera 11 gelenkt. Um die Anregungsstrahlung 4 weitestgehend von der Kamera 11 fernzuhalten, ist ein interferenzbasierter Emissionsfilter 12 vorgesehen.
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Alle Interferenzfilter sind empfindlich bezüglich des Einfallswinkels der zu filternden Strahlung. Die Winkelabhängigkeit resultiert aus dem Funktionsprinzip des Interferenzfilters, das darauf basiert, eine Vielzahl von dünnen Schichten mit unterschiedlichen Brechungsindizes auf einem transparenten Substrat aufzubringen. Trifft Anregungsstrahlung 4 nicht wie vorgesehen senkrecht auf den interferenzbasierten Emissionsfilter 12, so erfährt die Strahlung eine andere spektrale Filterung als bei senkrechtem Einfall, d. h. die Filterkanten verschieben sich. Durch diese Winkelempfindlichkeit kann es passieren, dass gestreute Anregungsstrahlung 4, die nicht senkrecht auf den interferenz-basierten Emissionsfilter 12 trifft, durch diesen hindurch gelassen wird, was in 1 schematisch anhand eines gestrichelt gezeichneten Streulichtstrahls 13 angedeutet ist. Um die Funktionsfähigkeit zu gewährleisten, müssen Interferenzfilter daher im (näherungsweise) kollimierten Strahlengang stehen. Prinzipiell können zwar Maßnahmen ergriffen werden, um Streulicht zu reduzieren, beispielsweise Strahlfallen oder lange Strahlengänge mit vielen Blenden. Dies erfordert jedoch zusätzlichen Aufwand und erhöht den Raumbedarf einer entsprechenden optischen Anordnung.
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Üblich ist es, die drei interferenzbasierten Filter (Anregungsfilter, Strahlteiler und Emissionsfilter) in einem sogenannten Filterwürfel bzw. Fluoreszenzwürfel unterzubringen, der für bestimmte Fluorophore optimiert ist und komplett ausgetauscht werden kann. Ein derartiger Filterwürfel bzw. Fluoreszenzwürfel ist beispielsweise in der
DE 10317615 B4 und der
DE 10 2005 045 165 näher beschrieben.
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2 zeigt eine typische Zusammenstellung von Transmissionsspektren der Filter in einer optischen Anordnung 1 nach 1 für rot fluoreszierende Fluorophore wie beispielsweise Cy5 oder Alexa Fluor 647. Eine rote LED dient hier als Lichtquelle. Das Emissionsspektrum 14 der roten LED wird durch einen interferenzbasierten Anregungsfilter 5 mit dem Anregungsfilter-Transmissionsspektrum 15 beschnitten. Das Strahlteiler-Transmissionsspektrum 16 eines dichroitischen Strahlteilers 6 ist für einen Einfallswinkel von 45° angegeben. Wie in 2 zu erkennen, weist dieser Strahlteiler unterhalb von 500 nm eine eigentlich unerwünschte Transmission auf, die jedoch nicht relevant ist, da der Anregungsfilter 5 Licht dieser Wellenlänge nicht passieren lässt.
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Schließlich weist der nach der bekannten optischen Anordnung der 1 vorgesehene interferenzbasierte Emissionsfilter 12 bei senkrechtem Einfall der Strahlung das Emissionsfilter-Transmissionsspektrum 17 auf. Zwar ergibt sich bei optimaler Anordnung des Emissionsfilters 12 im optischen System 1 eine sehr gute Filterwirkung. Jedoch erfährt Strahlung, die nicht senkrecht einfällt, wegen der Verschiebung der Filterkanten unter Umständen eine deutlich abweichende spektrale Filterung. So kann es passieren, dass gestreute Anregungsstrahlung 4, die der Emissionsfilter 12 eigentlich speien soll, durch diesen hindurchtritt.
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Die 3a und 3b zeigen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen optischen Anordnung. Als Strahlungsquelle 2 dient eine Leuchtdiode (LED). Die Auswahl der LED erfolgt jeweils spektral abgestimmt auf das für die jeweilige Messaufgabe verwendete Fluorophor, so dass das Fluorophor effizient angeregt werden kann. Das Absorptionsmaximum des Fluoreszenzfarbstoffs Cy5 liegt beispielsweise bei etwa 647 nm. Cy5 ist also mit einer roten LED, die beispielsweise eine Peak-Wellenlänge von ca. 630 nm aufweist, effizient anregbar. Dagegen liegt das Absorptionsmaximum von Cy3 im grünen Spektralbereich bei 514 nm. Cy3 kann daher mit einer grünen LED, die beispielsweise eine Peak-Wellenlänge von ca. 530 nm aufweist, effizient angeregt werden.
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Um eine höhere Strahlungsleistung zu erzeugen und eine gleichmäßige Beleuchtung zu gewährleisten, ist die Strahlungsquelle 2 bevorzugt aus einem Array von wenigstens zwei LEDs, besonders bevorzugt aus einem Array von vier quadratisch angeordneten LEDs, geformt.
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Es ist auch möglich, anstelle der LED einen Laser, insbesondere einen Halbleiterlaser, als Strahlungsquelle zu verwenden. In diesem Fall kann sogar der Anregungsfilter entfallen. Es sind dann allerdings Maßnahmen zu ergreifen, um Speckle-Effekte, die durch Kohärenz des Lasers entstehen, zu unterdrücken. Hierzu kann beispielsweise eine periodisch bewegte bzw. rotierende Streuplatte verwendet werden. Eine weitere Beleuchtungsvariante besteht darin, einen Leuchtstoff mit einer LED oder einem Laser anzuregen und die vom Leuchtstoff ausgesendete Strahlung zur Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzanregung zu verwenden. Die Anregungswellenlängen der Strahlungsquelle können, abhängig vom anzuregenden Fluorophor bzw. Luminophor, im UV-, im VIS- oder im IR-Bereiche liegen.
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Die Strahlungsquelle 2 strahlt Anregungsstrahlung 4 in Richtung eines interferenzbasierten Anregungsfilters 5 und dichroitischen Strahlteilers 6 ab. Eine zwischen der Strahlungsquelle 2 und dem Anregungsfilter 5 angeordnete Beleuchtungsoptik 3 kollimiert dabei die Anregungsstrahlung 4 so, dass die Strahlen annähernd parallel verlaufen und somit näherungsweise senkrecht auf den Anregungsfilter 5 treffen. Der Anregungsfilter 5 weist das Anregungsfilter-Transmissionsspektrum 15 auf, welches das Emissionsspektrum der Strahlungsquelle beschneidet. In 4 ist wiederum der Fall dargestellt, dass eine rote LED als Strahlungsquelle 2 dient, deren Emissionsspektrum 14 eine Peak-Wellenlänge bei etwa 630 nm aufweist. Das Emissionsspektrum 14 der LED wird durch den Anregungsfilter 5 beschnitten, der, wie dessen Transmissionsspektrum 15 zeigt, Strahlung kurzwelliger als etwa 600 nm und langwelliger als etwa 650 nm weitestgehend reflektiert. Die derart spektral beschnittene Anregungsstrahlung 4 trifft nun auf den dichroitischen Strahlteiler 6. Der dichroitische Strahlteiler 6 weist für einen Einfallswinkel ½ α von beispielsweise 45° das Strahlteiler-Transmissionsspektrum 16 mit Filterkanten bei etwa 660 nm und 820 nm auf, wobei hier nur die ansteigende Filterkante bei etwa 660 nm von Bedeutung ist Die in einem Winkel von 45° auftreffende spektral beschnittene Anregungsstrahlung 4 wird somit von dem Strahlteiler 6 weitgehend reflektiert. Die vom Strahlteiler 6 reflektierte Anregungsstrahlung 4 wird nun durch ein Objektiv auf die zu analysierende Probe 8 gelenkt und regt dort ein Fluorophor, beispielsweise Cy5, an. Das angeregte Fluorophor emittiert infolgedessen Lumineszenzstrahlung 9, die in Bezug auf die eingestrahlte Anregungsstrahlung ernergieärmer ist. Beispielsweise emittiert angeregtes Cy5 Fluoreszenzstrahlung mit einer Peak-Wellenlänge von etwa 665 nm und einer Halbwertsbreite von etwa 40 nm. Für Strahlung ab etwa 660 nm ist der Strahlteiler 6 bei einem Einfallswinkel ½ α weitgehend transparent, d. h. die von dem Fluorophor ausgesandte Lumineszenzstrahlung 9 kann den Strahlteiler 6 weitgehend ungehindert passieren und durchläuft anschließend eine Abbildungsoptik 10, die die Lumineszenzstrahlung 9 auf eine Kamera 11, beispielsweise eine CCD- oder CMOS-Kamera, fokussiert. Die Kamera 11 detektiert die von der Probe ausgesandte Lumineszenzstrahlung 9.
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Zwischen Strahlteiler und Kamera ist zumindest ein absorbierender Farbfilter 18 vorgesehen. Dieser hält insbesondere gestreute Anregungsstrahlung und andere unerwünschte Strahlungseinflüsse effizient von der Kamera 11 fern. Ein absorbierender Farbfilter absorbiert die unerwünschten Spektralanteile. Es handelt sich dabei um einen Volumeneffekt, das heißt, die Filterwirkung nimmt mit der Filterdicke monoton zu. Da die Filtercharakteristik von Farbfiltern unabhängig vom Einfallswinkel der einfallenden Strahlung ist, gelangt unerwünschtes Streulicht nicht mehr zur Kamera, wie in 3 anhand des gestrichelten Streulichtstrahls 13' angedeutet ist. Bevorzugt wird der Farbfilter 18 zwischen Abbildungsoptik 10 und Kamera 11, in der Nähe der Kamera 11, platziert.
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Nach dem Ausführungsbeispiel der 3b wird ein Filterset 19 bestehend aus zwei absorbierenden Farbfiltern verwendet. Vorzugsweise bestehen die beiden Farbfilter aus unterschiedlichem Material, und sie können auch unterschiedliche Dicken aufweisen. Zum einen findet ein Rotglas RG665, zum anderen ein Rotglas RG695 Verwendung. In 4 sind die Rotglas-Transmissionsspektren RG665 (20) und RG695 (21) für eine Dicke der Rotgläser von jeweils 3 mm gezeigt.
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Durch Multiplikation des normierten LED-Emissionsspektrums 14 mit den Transmissionsspektren 15, 16, 20 und 21 erhält man spektral aufgelöst den relativen Anteil der LED-Anregungsstrahlung, der zur Kamera gelangen und dort einen Signaluntergrund verursachen kann. Es hat sich herausgestellt, dass man mit einem 6 mm dicken RG665-Filter eine hinreichende Unterdrückung des Signaluntergrunds erreichen kann. Ein Glasweg von 6 mm im Abbildungsstrahlengang vermindert jedoch die Abbildungsqualität bereits merklich. Bevorzugt wird daher eine Kombination aus zwei verschiedenen Filtergläsern verwendet, die zusammen eine ähnlich gute Signalunterdrückung liefern, jedoch eine geringere Gesamtdicke aufweisen.
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Um von der Fluoreszenzstrahlung nicht mehr als unbedingt nötig zu unterdrücken, werden die Farbfilter außerdem bevorzugt nicht dicker als nötig gewählt. Die Dicke der verwendeten Farbfilter wird also bevorzugt so angepasst, dass die geforderte Unterdrückung der LED-Anregungsstrahlung gerade erreicht wird. Im vorliegenden Beispiel hat sich eine Kombination aus 3 mm RG665 und 1 mm RG695 als günstig erwiesen.
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Vorteilhaft weisen die Farbfilter 18 ein Langpassverhalten auf. Die Transmissionsspektren 20, 21 zeigen, dass die beispielhaft verwendeten Rotgläser Fluoreszenzstrahlung mit einer Wellenlänge von 720 nm bis 820 nm transmittieren. Ein interferenzbasierter Emissionsfilter 12 nach dem Stand der Technik würde, wie das zugehörige Transmissionsspektrum 17 zeigt, diesen Fluoreszenzstrahlungsanteil hingegen unterdrücken und nicht zur Kamera 11 gelangen lassen.
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Es ist natürlich möglich, auch mehr als zwei Filtergläser zu verwenden, um das Signal/Untergrund-Verhältnis noch weiter zu optimieren. Natürlich können auch andere Farbgläser als die genannten Varianten RG665 und RG695 verwendet werden. Insbesondere ist es auch möglich, statt glasbasierten Farbfiltern kunststoffbasierte Farbfilter einzusetzen bzw. Glas- und Kunststoff-Filter zu kombinieren, wobei Glasfilter aus anorganischen Materialien und Kunststofffilter aus organischen Materialien bestehen Die Reihenfolge der Filter kann in der Regel beliebig gewählt werden, ohne die Filterfunktion nennenswert zu beeinflussen.
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Bei Verwendung eines Filtersets 19 aus zwei oder mehr Farbfiltern ist es bevorzugt, die Filter mit einem Optikkitt direkt miteinander zu verbinden, um Reflexionsverluste zu vermindern.
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Weiterhin ist es bevorzugt, einige oder alle zugänglichen Flächen der absorbierenden Farbfilter 18 mit einer Anti-Reflexbeschichtung für die zu transmittierenden Wellenlängen zu versehen.
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Nach einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen optischen Anordnung 1 ist es möglich, einen oder mehrere Farbfilter 18 als den erfindungsgemäß vorgesehenen Strahlteiler 6 einzurichten und zu platzieren.
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Bei Verwendung eines Farbfilter-Sets 19 können ein oder mehrere Farbfilter 18 auch zwischen Strahlteiler 6 und Abbildungsoptik 10 platziert werden.
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Es ist natürlich auch denkbar und liegt im Rahmen der Erfindung, aus Anregungsfilter 5, Strahlteiler 6 und absorbierenden Farbfiltern 18 einen wechselbaren Filterwürfel 22 vorzugsweise zum Einsatz in der erfindungsgemäßen optischen Anordnung gemäß 3c aufzubauen, um einem Fluoreszenzfarbstoffwechsel durch Wechsel des Filterwürfels leicht Rechnung tragen zu können. Die Zusammenstellung und Ausrichtung der Filter in dem Filterwürfel erfolgt dabei angepasst an die mittels der optischen Anordnung zu detektierende Lumineszenzstrahlung. Bei einer veränderetn Aufgabenstellung, wenn also in derselben oder einer weiteren Probe ein weiteres Fluorophor zu detektieren ist, kann der Filterwürfel 22 entfernt und gegen einen für dieses weitere Fluorophor optimierten Filterwürfel 22 getauscht werden. Es versteht sich, dass in diesem Fall Mittel vorgesehen sein sollten, die es erlauben, die spektrale Zusammensetzung der von der Stahlungsquelle ausgesendeten Anregungsstahlung zu justieren. Dies kann beispielsweise geschehen, indem zugleich mit dem Wechsel des Filterwürfels ein Wechsel der Stahlungsquelle erfolgt. Beispielsweise kann in der optischen Anordnung an Stelle der Strahlungsquelle eine Wechseleinheit vorgesehen sein, die eine Platzierung unterschiedlicher, für den jeweiligen Detektionszweck optimierter Strahlungsquellen, insbesondere LEDs, erlaubt. Um die Filterwirkung bei gleichzeitig guten Abbildungseigenschaften zu optimieren kann der Farbfilter 18 dabei wiederum als Filterset 19 aufgebaut sein, dessen einzelne Filterelemente vorzugsweise verkittet und/oder an den zugänglichen Flächen mit Antireflexschichten versehen sind.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- optische Anordnung
- 2
- Strahlungsquelle
- 3
- Beleuchtungsoptik
- 4
- Anregungsstrahlung
- 5
- interferenzbasierter Anregungsfilter
- 6
- dichroitischer Strahlteiler
- 7
- Objektiv
- 8
- Probe
- 9
- Lumineszenzstrahlung
- 10
- Abbildungsoptik
- 11
- Kamera
- 12
- interferenzbasierter Emissionsfilter
- 13
- Streulichtstrahl
- 14
- Emissionsspektrum einer roten LED
- 15
- Anregungsfilter-Transmissionsspektrum
- 16
- Transmissionsspektrum eines dichroitischen Strahlteilers
- 17
- Transmissionsspektrum eines interferenzbasierten Emissionsfilters
- 18
- absorbierender Farbfilter
- 19
- Filterset aus absorbierenden Farbfiltern
- 20
- Rotglas-Transmissionsspektrum RG665
- 21
- Rotglas-Transmissionsspektrum RG695
- 22
- Filterwürfel
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1598688 B1 [0002]
- US 5710663 [0002]
- US 2005/0099677 A1 [0002]
- DE 10317615 B4 [0027]
- DE 102005045165 [0027]
