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Die Erfindung bezieht sich auf eine Testprobenvorrichtung und ein Testverfahren für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, wobei der Test einen Probenkörper, der für das Mikroskop ausgebildet ist, verwendet.
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Auf dem Gebiet der Mikroskopie haben derzeit hochauflösende Mikroskopieverfahren besondere Bedeutung. Es handelt sich dabei um Mikroskopieverfahren, die eine Ortsauflösung in einer Probe erreichen, welche über die optische Auflösungsgrenze, die sich nach der Theorie von Abbe ergibt, hinaus gesteigert ist. Solche Mikroskopieverfahren sind z. B. PALM, STORM, d-STORM oder GS-DIM. Sie basieren auf der hochgenauen fluoreszierenden Fluorophore, indem man dafür sorgt, dass die Fluorophore möglichst isoliert fluoreszieren. Man kann dann für die aufgenommene Strahlung eines solchen isolierten Fluorophors den Ort des Fluorophors mit einer Genauigkeit bestimmen, die über die Beugungsbegrenzung, also die Theorie von Abbe hinausgeht. Die Ortsbestimmung erfolgt mit hochempfindlichen Kameras im Weitfeld mit einer Genauigkeit bis in den Nanometerbereich. Wiederholt man dieses Vorgehen für die Probe mehrfach so, dass möglichst alle Fluorophore einmal isoliert abgebildet und lokalisiert wurden, kann man aus den mehreren Einzelbildern ein Bild zusammensetzen.
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Die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie bildet somit eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen ab und erreicht dabei eine Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches, also des Lichts.
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Für die Entwicklung solcher Mikroskopieverfahren und Mikroskope aber auch zur Überprüfung bestehender Systeme, zur Fehlersuche und nicht zuletzt zur Demonstration und Vermarktung von hochauflösenden Mikroskopen sind Tests unumgänglich, die die Auflösung zeigen. Man benötigt dazu Proben, deren Strukturen gut bekannt sind, um zu überprüfen, ob das Mikroskop diese bekannten Strukturen mit der gewünschten Auflösung abbilden kann.
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Die
DE 10 2010 006 773 A1 betrifft ein wellenlängensensitives plasmonisch aktives Modul zur spektral aufgelösten Detektion von Licht. Aus der
US 2010 / 0 248 379 A1 ist ein optischer Sensor mit Plasmonenschichtstruktur für effizienteren Nachweis chemischer Gruppen mittels SERS bekannt. In der
DE 10 2007 037 201 A1 wird ein Element zur oberflächenverstärkten Spektroskopie und ein Verfahren zur Herstellung eines Elements offenbart.
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Es ist im Stand der Technik zwar bekannt, periodische Strukturen mit definierten Größen oder Abständen herzustellen und als Testproben für die Mikroskopie zu verwenden, für die erwähnte lokalisierungsbasierte Hochauflösung sind diese Testproben jedoch nicht geeignet. Die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie benötigt aus den eingangs genannten Gründen Fluoreszenzmoleküle, die individuell zur Fluoreszenzstrahlung angeregt werden können. Periodische Strukturen mit definierten Größen und Abständen erfüllen diese Anforderung nicht.
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Weiter sind im Stand der Technik Auflösungstests bekannt, die die Amplitude oder Phase des beleuchtenden Lichtes modulieren. Auch solche Auflösungstests sind für die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie, also für ein Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen abbildet, nicht geeignet.
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Man setzt deshalb für diese Mikroskopieverfahren derzeit biologische Proben ein, die entsprechend markierte Strukturen aufweisen. Hierbei ergeben sich folgende Nachteile:
- Die Proben haben eine geringe Haltbarkeit. Es ist deshalb nicht oder nur sehr eingeschränkt möglich, diese Proben bereits vorzubereiten und an einen Verwender zu versenden.
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Die Reproduzierbarkeit ist bei biologischen Proben prinzipiell eingeschränkt. Man weiß also nicht, welche Struktur im Test gerade vorliegt.
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Biologische Proben sind komplex in der Handhabung, benötigen beispielsweise entsprechende Nährmedien, Puffer etc., was eine einfache Überprüfung oder Demonstration eines lokalisierungsbasierten hochauflösenden Mikroskops nicht möglich macht.
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Die verwendeten Strukturen sind schließlich nicht strikt vordefiniert, da biologische Proben immer eine gewisse Variabilität haben. Ein wiederholbarer Auflösungstest ist damit nicht erreichbar.
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Im Stand der Technik wurde von Steinhauer et al., (Steinhauer, C. [et al.]: DNA-Origami als Nanometerlineal für die superauflösende Mikroskopie. In: Angewandte Chemie, Vol. 121, Issue 47, 2009, S. 9030 - 9034. - ISSN 1521-3757) die Verwendung sogenannter DNA-Origami vorgeschlagen. Fluorophore wurden an bestimmten Stellen solcher DNA-Origamistrukturen gebunden, so dass zwei Fluorophore in bestimmtem Abstand im Sub-100 nm-Bereich angeordnet sind. Allerdings gelten auch für diese Proben die genannten Einschränkungen bezüglich Haltbarkeit und Handhabung, da die Fluorophore erst durch chemische Einwirkung in einem Redox-System in ihren schaltbaren Zustand gebracht werden müssen. Zudem sind die Abstände der Fluorophore nicht so wohldefiniert, wie man sich es wünscht, da sich die DNA-Strukturen verbiegen können. Zudem ist es schwer, die Bindung der DNA-Strukturen an eine Substratoberfläche so definiert zu erreichen, dass keine Unterschiede zwischen theoretisch erwartetem Abstand der gebundenen Fluorophore und realem, durch Projektionseffekte beeinflusstem Abstand auftreten. Zudem können pro Bindungsposition nur eines oder wenige Moleküle angebracht werden. Da Fluorophore bei der lokalisationsbasierten Hochauflösungsmikroskopie in der Regel bleichen, wären die Proben im Ergebnis nur ganz kurz verwendbar. Zudem erwarten bestimmte Algorithmen oder auch Einstellungen im Algorithmus für Hochauflösungsmikroskope bestimmte Blinkstatistiken der Fluorophore; das lässt sich weder gemäß Steinhauer noch mit allen vorgenannten bekannten Verfahren realisieren.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Testprobenvorrichtung für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, anzugeben, die es erlaubt reproduzierbar ein solches Mikroskop zu überprüfen, ohne dass die eingangs genannten Probleme auftreten.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Testprobenvorrichtung für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, wobei die Testprobenvorrichtung umfasst: einen Probenkörper, der zum Mikroskopieren mit dem Mikroskop ausgebildet ist, ein Substrat aus einem Dielektrikum und eine darauf aufgebrachte Metallschicht, die eine Oberfläche hat, und mehrere Nanostrukturen aufweist, die als Erhebungen oder Vertiefungen oder Stufen an der Oberfläche der Metallschicht ausgebildet sind, wobei jede Nanostruktur längs der Oberfläche gesehen eine Ausdehnung im Sub-Wellenlängenbereich hat und mindestens zwei Nanostrukturen einen Abstand voneinander haben, der im Sub-Wellenlängenbereich liegt, ein Anregungsmodul, das zur Erzeugung von Oberflächenplasmonen mit Frequenzen des sichtbaren Spektralbereiches in der Metallschicht des Probenkörpers ausgebildet sind, wobei das Anregungsmodul ein Stehwellenfeld erzeugt, und ein Steuergerät, das mit dem Anregungsmodul verbunden ist und das Anregungsmodul so ansteuert, dass sich im Stehwellenfeld Maxima der Oberflächenplasmonen einstellbar an wechselnden der mehreren Nanostrukturen befinden, wodurch die Nanostrukturen an wechselnden Orten an der Oberfläche eine optische Fernfeldauskopplung bewirken und so verschiedene Leuchtzustände erzeugen.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Testverfahren für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, wobei ein Probenkörper zum Mikroskopieren in das Mikroskop eingelegt wird, der ein Substrat aus einem Dielektrikum und eine darauf aufgebrachte Metallschicht, die eine Oberfläche hat, und mehrere Nanostrukturen aufweist, die als Erhebungen oder Vertiefungen oder Stufen an der Oberfläche der Metallschicht ausgebildet sind, wobei jede Nanostruktur längs der Oberfläche gesehen eine Ausdehnung im Sub-Wellenlängenbereich hat und mindestens zwei Nanostrukturen einen Abstand voneinander haben, der im Sub-Wellenlängenbereich liegt, ein Stehwellenfeld von Oberflächenplasmonen mit Frequenzen des sichtbaren Spektralbereiches in der Metallschicht des Probenkörpers so ausgebildet wird (z.B. durch Verstellen eines Phasenunterschiedes der Oberflächenplasmonen), dass sich im Stehwellenfeld Maxima der Oberflächenplasmonen an wechselnden der mehreren Nanostrukturen befinden, wodurch die Nanostrukturen an wechselnden Orten an der Oberfläche eine optische Fernfeldauskopplung bewirken und so verschiedene Leuchtzustände erzeugen.
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Die Erfindung verwendet zum Anregen leuchtender Strukturen Oberflächenplasmonen. Diese sind bekannter Weise gebundene, für sich alleine nicht-strahlende Oberflächenwellen, die an der Grenzflächen von Metallen mit elektrischen Materialien auftreten können. Oberflächenplasmonen oszillieren zwar mit der Lichtfrequenz, haben jedoch aufgrund ihrer materialgebundenen Eigenschaft eine Plasmonenwellenlänge, die deutlich kleiner ist als die Lichtwellenlänge, auch wenn sie mit Lichtstrahlung angeregt wurden. So haben Oberflächenplasmonen auch bei Anregung im sichtbaren Spektralbereich eine deutlich kürzere Wellenlänge an der Grenzfläche zwischen Metallschicht und Dielektrikum des Substrates, als es der Lichtwellenlänge entspricht.
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Damit hat das Stehwellenfeld eine Periode, die kleiner ist als die Lichtwellenlänge. Das Stehwellenfeld hat lokalisierte Maxima und Minima, wobei der Abstand zwischen Maxima und Minima ein Viertel der Plasmonenwellenlänge beträgt, somit noch mal deutlich kürzer ist, als die Lichtwellenlänge.
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Oberflächenplasmonen sind lokalisierte, nicht strahlende Oszillationen mit einem evaneszenten Abklingverhalten aus der Metallschicht heraus. Entsprechend ist das Stehwellenfeld als solches mikroskopisch nicht beobachtbar. Durch die Streuung an den Nanostrukturen bilden sind jedoch propagierende Fernfeldmoden, die dazu führen, dass die Nanostrukturen leuchtende Punkte sind.
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Somit ist auf einfache Weise erreicht, dass Nanostrukturen leuchten, die eine Abmessung haben, welche kleiner ist als die Lichtwellenlänge, und die auch voneinander um einen Abstand beabstandet sind, der ebenfalls kleiner ist als die Lichtwellenlänge. Diese leuchtenden Punkte sind ortsfest, können reproduzierbar zum Leuchten gebracht werden, und benötigen keine aufwendige chemische Probenpräparation. Bei der erfindungsgemäßen Testprobenvorrichtung können somit in vorteilhafter Weise Leuchter (Nanostrukturen mit Fernfeldauskopplung) örtlich selektiv an- und ausgeschaltet werden, wobei bevorzugt auch einstellbar ist, wann und wie oft der jeweilige Leuchter angeht. Damit können z.B. Algorithmen für die (z.B. lokalisierungsbasierte) Hochauflösungsmikroskopie gut überprüft werden.
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Um die leuchtenden Punkte ein- und auszuschalten, muss man lediglich das Stehwellenfeld so verschieben, dass ein Maximum an der Stelle eines vorherigen Minimums liegt. Eine vorher leuchtende Nanostruktur wird dadurch abgeschaltet und eine vorher dunkle Nanostruktur zum Leuchten angeregt. Die Testprobenvorrichtung kann dadurch auf einfache Weise in unterschiedliche Leuchtzustände gebracht werden und erfüllt damit exakt die Anforderungen für die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie.
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Das Verschieben des Stehwellenfeldes kann z.B. einfach durch Verstellen eines Phasenunterschiedes zweier gegenläufigen Oberflächenplasmonen erreicht werden. Es ist darüber hinaus völlig unproblematisch, mit der Testprobenvorrichtung ein gewünschtes Blinkverhalten zu realisieren.
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Für eine derartige Einstellung des Blinkverhaltens ist es bevorzugt, dass Metallschicht, Dielektrikum und der Abstand zweier benachbarter Nanostrukturen so gewählt wird, dass die Wellenlänge der Oberflächenplasmonen etwa das Vierfache des Abstandes der benachbarten Nanostrukturen entspricht. Natürlich kann auch ein ganzzahliges Mehrfaches des Vierfachen eingestellt werden.
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Bei der erfindungsgemäßen Testvorrichtung kann das Anregungsmodul hinsichtlich eines Phasenunterschiedes der Oberflächenplasmonen einstellbar sein und kann das Steuergerät zur Ansteuerung des Anregungsmoduls den Phasenunterschied der Oberflächenplasmonen verstellen.
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Die Anregung von Oberflächenplasmonen kann nicht direkt mit Licht erfolgen, da die Wellenvektoren des Lichts und der Oberflächenplasmonen nicht übereinstimmen. Für die Anpassung der Wellenvektoren kann TIRF-Beleuchtung (Total Internal Reflection Fluorescense), eine Prismenkopplung oder ein Gitter verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Oberflächendefekten in der Metallschicht in Form von zwei Öffnungen, die durch das Substrat mit Beleuchtungsstrahlung beleuchtet werden. So kann z.B. ein Stehwellenfeld an Oberflächenplasmonen sehr einfach durch zwei parallele Schlitze erzeugt werden, zwischen denen sich dann die mindestens zwei Nanostrukturen befinden. Es ist deshalb bevorzugt, dass das Anregungsmodul zwei Öffnungen in der Metallschicht und eine diese Öffnungen durch das Substrat mit Beleuchtungsstrahlung beleuchtende Beleuchtungsquelle umfasst.
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Die Verstellung des Einfallswinkels der Beleuchtungsstrahlung bewirkt die Phasenverschiebung der Oberflächenplasmonen. Es ist deshalb eine Weiterbildung bevorzugt, dass das Steuergerät zum Verstellen des Phasenunterschiedes und damit zum Verschieben des Stehwellenfeldes die Einfallsrichtung der Beleuchtungsstrahlung verstellt.
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Eine besonders einfache Ausgestaltung der Beleuchtungsquelle und ein insgesamt kompakter Aufbau der Testprobenvorrichtung wird erreicht, wenn die Beleuchtungsquelle mindestens zwei mit dem Substrat verbundene Laserdioden aufweist. Liegen diese am Substrat nebeneinander, kann man durch Umschalten von der einen Laserdiode auf die andere schnell und unproblematisch die Einfallsrichtung der Beleuchtungsstrahlung verstellen.
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Natürlich sind auch andere Beleuchtungsmöglichkeiten gegeben, beispielsweise die Beleuchtung durch einen Kondensor oder Einstellung der Einfallsrichtung über ein DMD (Digital Mirror Device), einen beweglichen Spiegel, etc. Generell ist es bevorzugt, wenn zwischen zwei Beleuchtungsrichtungen umgeschaltet werden kann, entweder indem zwischen mehreren Beleuchtungsquellen gewechselt wird oder indem der Beleuchtungsstrahl schnell in der Richtung geändert wird, da dann ein Blinkverhalten der Nanostrukturen auch bei nahezu beliebig wählbaren Frequenzen realisiert werden kann. Dies ist zum Überprüfen bestimmter Hochauflösungsverfahren besonders vorteilhaft, beispielsweise für das sogenannte SOFI-Verfahren, das die Blinkstatistik auswertet.
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Verwirklicht man die Öffnungen als parallele Schlitze, ist der Phasenunterschied und damit die Lage der Minima und Maxima im Stehwellenfeld einfach dadurch einzustellen, dass die Einfallsrichtung der Beleuchtungsrichtung quer zur Schlitzrichtung, also in einer Ebene senkrecht zur Schlitzrichtung verstellt wird. Eine Verstellung senkrecht dazu, also in einer Ebene längs der Schlitzrichtung dreht das Stehwellenfeld, so dass sich ein Interferenzmuster von Oberflächenplasmonen einstellt, was eine zweidimensionale Modulation mehrerer Nanostrukturen an der Oberfläche hinsichtlich des Leuchtens bzw. Nichtleuchtens ergibt.
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Verwendet man mehrere nicht-parallele Schlitze können auch flächenhaft verteilte Nanostrukturen nahezu beliebig ein- oder ausgeschaltet werden.
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Zur Überprüfung eines dreidimensional auflösenden Mikroskopieverfahrens ist es bevorzugt, wenn die Nanostrukturen in unterschiedlicher Höhe über der Metallschicht liegen. Man kann sie dazu auf entsprechenden Füßen anordnen, deren Länge variiert. Dies ist deshalb möglich, da die Abklinglänge der Oberflächenplasmonen in Richtung Dielektrikum in der Größenordnung einer halben Lichtwellenlänge liegt. Füße in dieser Länge sind damit ohne störende Auswirkung auf das Leuchtverhalten der an ihrer Spitze angeordneten Nanostrukturen.
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Die Nanostrukturen sind Störungen, an welchen das Nahfeld der Oberflächenplasmonen in ein Fernfeld auskoppelt. Besonders gute Auskopplung erhält man bei Quantenpunkten, wie sie aus der Literatur bekannt sind. Die Quantenpunkte fluoreszieren, sind aber photostabil, so dass sie die Vorteile fluoreszierender Moleküle und der Plasmonenanregung quasi kombinieren.
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Die mehreren Nanostrukturen können in einem Array angeordnet sein, das z.B. so ausgebildet sein kann, dass eine vollständige oder zumindest weitestgehende Ausfüllung des Sichtfeldes des Mikroskops vorliegt, so dass die feldabhängige Abbildungsqualität mit einer (bevorzugt einzigen) Messung bestimmt werden kann.
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Soweit vorstehen oder nachfolgend Vorrichtungsmerkmale beschrieben sind, gelten sie auch analog für des Testprobenverfahren. Gleiches gilt für die Beschreibung von Verfahrensmerkmalen und deren Bezug auf die Testprobenvorrichtung.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
- 1 schematische Darstellungen zur Verdeutlichung der lokalisierungsbasierten Hochauflösungsmikroskopie und der sich daraus ergebenden Anforderungen für eine Testprobenvorrichtung,
- 2 eine weitere Darstellung zur Verdeutlichung der lokalisierten Hochauflösungsmikroskopie,
- 3 eine Schnittdarstellung einer Testprobenvorrichtung in einem Mikroskop,
- 4 eine Darstellung ähnlich der 3, die die Testprobe der 3 in einem anderen Leuchtzustand enthält,
- 5 eine Darstellung der Testprobe der 3 zur Verdeutlichung der Anregung von Oberflächenplasmonen,
- 6 eine Darstellung ähnlich der 5 zur Verdeutlichung der Verstellmöglichkeit der Testprobenvorrichtung bezüglich unterschiedlicher Leuchtzustände,
- 7 und 8 Draufsichten auf die Testprobe der 6 zur Erläuterung der Einstellung unterschiedlicher Leuchtzustände und
- 9 eine Darstellung ähnlich der 5 für eine Testprobenvorrichtung, die eine dreidimensionale Ortsauflösungsüberprüfung ermöglicht.
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Die 1 und 2 verdeutlichen die Anforderungen der lokalisierten Hochauflösungsmikroskopie bezüglich einer Testprobe, mit der Funktionsweise bzw. Auflösung eines hochauflösenden Mikroskops demonstriert werden kann.
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Betrachtet man zwei Emitter 1 und 2, die in einer Probe leuchten, beispielsweise nachdem sie zur Fluoreszenz angeregt wurden, so lassen sich diese Emitter 1 und 2 nur dann unterscheiden, wenn ihr Beugungsbild 3 bzw. 4 voneinander getrennt werden kann. Liegen die Emitter 1 und 2 so dicht beieinander, dass die Beugungsbilder 3 und 4 optisch nicht unterschieden werden können, ergibt sich ein gemeinsames Beugungsbild, das beispielsweise ein vergrößertes Beugungsscheibchen sein kann, solange beide Emitter leuchten. Man kann a priori nicht sagen, ob das Beugungsbild 5 von zwei nebeneinanderliegenden Emittern 1 und 2 herrührt, also aus der Überlagerung der Beugungsbilder 3 und 4 entstand, oder ob nur ein einziger Emitter das Beugungsbild 5 erzeugte. Dabei ist darauf hinzuweisen, dass die Beugungsbilder 3, 4 und 5 in 1 nur schematisch als scharf umgrenzte Kreise eingezeichnet sind. Z. B. kann die im Beugungsbild 5 der 1 wiedergegebene Struktur, die die Überlagerung zweier einzelner Beugungsbilder 3 und 4 nahelegt, mit einem Mikroskop nicht erkannt werden.
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Die lokalisierungsbasierte hochauflösende Mikroskopie ist nun in der Lage, die Lage zweier solcher Emitter 1 und 2 aufzulösen, die auf einer Probe 6 in einem Abstand d liegen, der mit der optischen Auflösungsgrenze nicht unterscheidbar wäre. 2 zeigt dies im oberen Teil schematisch durch eine Strahltaille 7, die sich aus der Punktbildverwaschungsfunktion des verwendeten Mikroskops ergibt. Innerhalb dieser Strahltaille 7 liegen die Emitter 1 und 2 in einem Abstand d in der Probe 6 und könnten nicht unterschieden werden, wenn sie beide gleichzeitig leuchten, wie es im oberen Teil der 1 schematisch dargestellt ist.
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Die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie bewirkt, dass die beiden Emitter 1 und 2 in der Probe 6 nacheinander leuchten und nacheinander abgebildet werden. Dies geschieht im Verfahrensablauf 8 mehrfach, so dass die Probe in unterschiedlichen Leuchtzuständen abgebildet ist. Für jeden Leuchtzustand wird die Lage des jeweils leuchtenden Emitters 1 oder 2 ermittelt, da man weiß, dass das Beugungsbild 3 bzw. 4 nur von einem Emitter herrührt. Bezogen auf die Darstellung der 1 wird der Schwerpunkt des Beugungsbildes 3 oder 4 ermittelt, je nachdem welcher der Emitter leuchtete. Somit kann man den Ort der Emitter sehr viel genauer lokalisieren, als es die Punktbildverwaschungsfunktion oder die Strahltaille 7 zulässt.
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Diese Art der Lokalisierung ist mit verschiedenen Mikroskopieverfahren möglich, wie bereits im allgemeinen Teil der Beschreibung einleitend erwähnt. Die Arbeitsweise der lokalisierungsbasierten Hochauflösungsmikroskopie ist für die nachfolgend beschriebene Testprobenvorrichtung nur insoweit relevant, als daraus die Rahmenbedingung folgt, dass das Mikroskop eine Probe benötigt, die in unterschiedliche Leuchtzustände geschaltet werden kann, in denen wechselweise Strukturen leuchten, welche einen Abstand und eine Ausdehnung kleiner als die Wellenlänge des verwendeten Mikroskops haben. Dies gilt natürlich auch für eine Testprobenvorrichtung.
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3 zeigt schematisch eine Testprobe 9. Sie umfasst einen Probenkörper 10, der aus einem dielektrischen Substrat 11 mit einer darauf angeordneten Metallschicht 12 aufgebaut ist. Auf der Metallschicht wird ein Stehwellenfeld aus Oberflächenplasmonen 13 ausgebildet, welche durch eine geeignete Anregungseinrichtung 14 in der Metallschicht 12 erzeugt werden. Wie bereits im allgemeinen Teil der Beschreibung erläutert, haben Oberflächenplasmonen die Eigenschaft, dass die Wellenlänge deutlich kürzer ist als die Lichtwellenlänge, auch wenn diese Oberflächenplasmonen mittels optischer Strahlung von der Anregungseinrichtung 14 erzeugt werden. Die Oberflächenplasmonen werden als Stehwellenfeld ausgebildet. Das Stehwellenfeld der Oberflächenplasmonen 13 besteht aus Maxima und Minima.
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Auf der Metallschicht 12 sind mindestens zwei Nanostrukturen 15, 16 angebracht, deren laterale Abmessung klein gegen die Lichtwellenlänge der Mikroskopie sind und deren z-Ausdehnungen ebenfalls im Sub-Lichtwellenbereich sind. Im Beispiel der 3 sind exemplarisch zwei Nanostrukturen 15, 16 angeordnet, deren Abstand ein Viertel der Oberflächenplasmonenwellenlänge beträgt. Natürlich können mehrere Nanostrukturen verwendet werden.
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Die Nanostrukturen auf der Metallschicht 12, die beispielsweise als Silberfilm auf einem Glassubstrat ausgebildet sein kann, sorgen dafür, dass an Maxima des Stehwellenfeldes der Oberflächenplasmonen 13 Strahlung ausgekoppelt wird. Sie wirken dort als Störstellen. Die Nanostruktur 16 liegt exemplarisch an einem Minimum des Stehwellenfeldes, so dass dort keine Strahlung ausgekoppelt wird. Ein Mikroskop 17, dass die Testprobe 9 abbildet, sieht damit einen Leuchtzustand der Testprobe, in dem (nur) die Nanostruktur 15 leuchtet.
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Verschiebt man das Stehwellenfeld um eine halbe Wellenlänge, erhält man den in 4 dargestellten Zustand. Nun liegt die vorher dunkle Nanostruktur 16 an der Stelle eines Maximums und leuchtet. Die Nanostruktur 15 ist hingegen dunkel. Das Mikroskop 17 sieht somit einen anderen Leuchtzustand der Probe. Man hat damit unterschiedliche Leuchtzustände realisiert, bei denen Strukturen, die kleiner als die Wellenlänge der Abbildung sind und die ebenfalls geringer als die Wellenlänge der Abbildung beabstandet sind, abwechselnd leuchten, um das Mikroskop 17 zu überprüfen oder zu demonstrieren.
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Die Oberflächenplasmonen 13 können von der Anregungseinrichtung 14 bzw. dem Anregungsmodul 14 auf verschiedene Weise bereitgestellt werden. So ist es, wie bereits erwähnt, beispielsweise möglich, eine TIRF-Beleuchtung aus zwei Richtungen durch das Substrat 11 vorzunehmen, um Oberflächenplasmonen 13 anzuregen.
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5 zeigt eine weitere Alternative, die in der Realisierung besonders einfach ist. Hier wird durch das Substrat 11 Beleuchtungsstrahlung eingekoppelt, und die Metallschicht 12 weist an ihrer Oberseite Öffnungen 21, 22 auf, die beispielsweise als Schlitze mit einer Schlitzbreite unter der optischen Wellenlänge ausgebildet sein können. Durch die Öffnungen 21, 22 werden in der Metallschicht 12 die gewünschten Oberflächenplasmonen angeregt, die an den Nanostrukturen 15, 16, welche gemäß 5 in einem Abstand d liegen, der kleiner ist als die Lichtwellenlänge, abwechselnd Energie aus dem Nahfeld der Oberflächenplasmonen in das Strahlungsfernfeld auskoppeln, also für das Mikroskop 17 leuchten.
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Die Schlitzbreite muss nicht unter der optischen Wellenlänge liegen, sie kann auch größer sein. Da die Plasmonenanregung in der Regel an beiden Kanten des Schlitzes erfolgt, muss lediglich darauf geachtet werden, dass sich die Plasmonen von beiden Kanten nicht auslöschen. Die Schlitzbreite sollte daher nicht gleich der halben Plasmonenwellenlänge sein. Bei größeren Schlitzbreiten können die Plasmonen nur an der den Nanostrukturen zugewandten Seite angeregt werden. In diesem Fall würde viel propagierende Intensität durch die Schlitze treten und könnte nicht zur Plasmonenanregung benutzt werden.
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6 zeigt eine einfache Methode, wie das Stehwellenfeld der Oberflächenplasmonen 13 verschoben werden kann, wie also die Anregungseinrichtung 14 eine Phasenverschiebung bei der Anregung der Oberflächenplasmonen bewirkt. Dazu wird von einem Steuergerät 25 eine Beleuchtungsquelle 26, welche die Anregungsstrahlung 19 abgibt, so verstellt, dass die Anregungsstrahlung 19 unter einem variierenden oder zumindest zwischen zwei Werten wechselbaren Winkel auf die Ebene der Metallschicht 12 und damit die Öffnungen 21, 22 einfällt.
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Der Effekt dieser Verstellung ist in 7 schematisch dargestellt, in der die Öffnungen 21, 22 als Schlitze ausgebildet sind. Durch Verstellen des Winkels verschiebt sich das Stehwellenfeld 16 in Richtung der Pfeile, die an den Schlitzen 21, 22 angedeutet sind. Somit können in dieser Richtung beabstandete Nanostrukturen abwechselnd mit Maxima oder Minima des Stehwellenfeldes der Oberflächenplasmonen 13 zusammenfallen und damit abwechselnd bezüglich ihres Leuchtverhaltens ein- und ausgeschaltet werden.
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8 zeigt eine Draufsicht auf die Testprobe 9 ähnlich der 7. Hier wird nun zusätzlich die Richtung der Anregungsstrahlung 19 in einer Ebene verstellt, die senkrecht zur Metallschicht 17 und längs der Schlitze 21, 22 verläuft. Dadurch wird das Stehwellenfeld der Oberflächenplasmonen 13 gedreht. 8 zeigt exemplarisch unterschiedliche Drehlagen. Somit können auch Nanostrukturen, die in einer Richtung parallel zu den Schlitzen 21 und 22 beabstandet sind, wahlweise ein- und ausgeschaltet werden.
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9 zeigt eine Schemadarstellung ähnlich der 5. Hier befinden sich die Nanostrukturen 15 und 16 auf Füßen 24 und 23, so dass die Nanostrukturen 15, 16 einen Unterschied h in ihrer Höhe haben. Da das evaneszente Feld der Oberflächenplasmonen über einen Abstand in Größenordnung der halben Lichtwellenlänge abfällt (dies ist durch die schematisch eingetragene Kurve in 9 veranschaulicht), leuchten sowohl die Nanostruktur 15 als auch die Nanostruktur 16 ausreichend hell, wenn sie mit einem Maximum des Stehwellenfeldes der Oberflächenplasmonen zusammenfallen. Der Wert für h kann beispielsweise 100 nm betragen, so dass derzeit gebräuchliche 3D-Hochauflösungsmikroskopieverfahren mit typischen axialen Lokalisierungsgenauigkeiten von 50 nm mit einer Testprobe gemäß 9 gut überprüft werden können.
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In einer besonders hochintegrierten Variante ist die Beleuchtungsquelle 26 direkt mit dem Substrat 11 verbunden. Dies ist schematisch in 6 dargestellt. Die Beleuchtungsquelle umfasst weiter mindestens zwei Lichtquellen, beispielsweise Laserdioden, welche die Beleuchtungsstrahlung 19 in unterschiedlichen Richtungen abgeben. Durch wechselseitiges Anschalten der jeweiligen Lichtquelle ist ein Umschalten zwischen zwei Beleuchtungszuständen der Nanostrukturen auf der Probe möglich.
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Natürlich können auch anstelle der parallelen Schlitze 21 und 22 schräg zueinander liegende Schlitze verwendet werden, so dass in einem Flächenfeld Teststrukturen ein- und ausgeschaltet werden können.
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Die Teststrukturen können beispielsweise Quantenpunkte sein, wie sie beispielsweise in der Veröffentlichung Kuno, M. [et al.]: On/Off Fluorescence Intermittancy of Single Semiconductor Quantum Dots. In: J. Chem. Phys., 115 (2), 2001, S. 1028-1040. - ISSN 1089-7690 beschrieben sind. Diese Veröffentlichung wird in dieser Hinsicht vollumfänglich hier einbezogen. Strukturen können, wie in den Figuren dargestellt, Erhebungen sein. Gleichermaßen sind auch Vertiefungen möglich. Ebenfalls als Störstellen zum Auskoppeln in das Fernfeld sind Stufen in der Metallstruktur geeignet, wobei jede Stufe dann als Störstelle wirkt.
