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Die Erfindung bezieht sich auf eine Testprobenvorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Testverfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 10.
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Auf dem Gebiet der Mikroskopie haben derzeit hochauflösende Mikroskopieverfahren besondere Bedeutung. Es handelt sich dabei um Mikroskopieverfahren, die eine Ortsauflösung in einer Probe erreichen, welche über die optische Auflösungsgrenze, die sich nach der Theorie von Abbe ergibt, hinaus gesteigert ist. Solche Mikroskopieverfahren sind z. B. PALM, STORM, d-STORM oder GS-DIM. Sie basieren auf der hochgenauen Lokalisierung einzelner fluoreszierender Fluorophore, indem man dafür sorgt, dass die Fluorophore möglichst isoliert fluoreszieren. Man kann dann für die aufgenommene Strahlung eines solchen isolierten Fluorophors den Ort des Fluorophors mit einer Genauigkeit bestimmen, die über die Beugungsbegrenzung, also die Theorie von Abbe hinausgeht. Die Ortsbestimmung erfolgt mit hochempfindlichen Kameras im Weitfeld mit einer Genauigkeit bis in den Nanometerbereich. Wiederholt man dieses Vorgehen für die Probe mehrfach so, dass möglichst alle Fluorophore einmal isoliert abgebildet und lokalisiert wurden, kann man aus den mehreren Einzelbildern ein Bild zusammensetzen.
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Diese optischen Mikroskope bilden eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches ab. Die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie erreicht dabei eine Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches, also des Lichts.
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Die
WO 2012 / 050 942 A1 stellt für ein solches optisches Mikroskop eine gattungsgemäße Testprobenvorrichtung und ein gattungsgemäßes Testverfahren bereit. Es ist ein Muster aus regelmäßigen Löchern vorgesehen, die kollektiv zum Leuchten gebracht werden. Das Muster wird mit dem Mikroskop abgebildet, um eine Verzeichnungs- oder Farbfehlerkorrektur durchzuführen.
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Für die Entwicklung solcher Mikroskopieverfahren und Mikroskope aber auch zur Überprüfung bestehender Systeme, zur Fehlersuche und nicht zuletzt zur Demonstration und Vermarktung von hochauflösenden Mikroskopen sind jedoch auch Tests unumgänglich, die die Auflösung zeigen, was die Testprobenvorrichtung und das Testverfahren der
WO 2012 / 050 942 A1 nicht leisten kann. Man benötigt dazu Proben, um zu überprüfen, ob das Mikroskop diese bekannten Strukturen mit der gewünschten Auflösung abbilden kann.
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Es ist im Stand der Technik zwar bekannt periodische Strukturen mit definierten Größen oder Abständen herzustellen und als Testproben für die Mikroskopie zu verwenden, für die erwähnte lokalisierungsbasierte Hochauflösung sind diese Testproben jedoch nicht geeignet. Die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie benötigt aus den eingangs genannten Gründen Fluoreszenzmoleküle, die individuell zur Fluoreszenzstrahlung angeregt werden können. Periodische Strukturen mit definierten Größen und Abständen erfüllen diese Anforderung nicht.
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Weiter sind im Stand der Technik Auflösungstests bekannt, die die Amplitude oder Phase des beleuchtenden Lichtes modulieren. Auch solche Auflösungstests sind für die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie, also für ein Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen abbildet, nicht geeignet.
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Man setzt deshalb für diese Mikroskopieverfahren derzeit biologische Proben ein, die entsprechend markierte Strukturen aufweisen. Hierbei ergeben sich folgende Nachteile:
- Die Proben haben eine geringe Haltbarkeit. Es ist deshalb nicht möglich, diese Proben bereits vorzubereiten und an einen Verwender zu versenden.
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Die Reproduzierbarkeit ist bei biologischen Proben prinzipiell eingeschränkt. Man weiß also nicht, welch Struktur im Test gerade vorliegt.
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Biologische Proben sind komplex in der Handhabung, benötigen beispielsweise entsprechende Nährmedien, Puffer etc., was eine einfache Überprüfung oder Demonstration eines lokalisierungsbasierten hochauflösenden Mikroskops nicht möglich macht.
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Die verwendeten Strukturen sind schließlich nicht strikt vordefiniert, da biologische Proben immer eine gewisse Variabilität haben. Ein wiederholbarer Auflösungstest ist damit nicht erreichbar.
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Im Stand der Technik wurde von Steinhauer et al., Angew. Chem., 121, 2, 2009, die Verwendung sogenannter DNA-Origami vorgeschlagen. Fluorophore wurden an bestimmten Stellen solcher DNA-Origamistrukturen gebunden, so dass zwei Fluorophore in bestimmtem Abstand im Sub-100 nm-Bereich angeordnet sind. Allerdings gelten auch für diese Proben die genannten Einschränkungen bezüglich Haltbarkeit und Handhabung, da die Fluorophore erst durch chemische Einwirkung in einem Redox-System in ihren schaltbaren Zustand gebracht werden müssen. Zudem sind die Abstände der Fluorophore nicht so wohldefiniert, wie man sich es wünscht, da sich die DNA-Strukturen verbiegen. Zudem ist es schwer, die Bindung der DNA-Strukturen an eine Substratoberfläche so definiert zu erreichen, dass keine Unterschiede zwischen theoretisch erwartetem Abstand der gebundenen Fluorophore und realem, durch Projektionseffekte beeinflusstem Abstand auftreten. Zudem können pro Bindungsposition nur eines oder wenige Moleküle angebracht werden. Da Fluorophore bei der lokalisationsbasierten Hochauflösungsmikroskopie in der Regel bleichen, wären die Proben im Ergebnis nur ganz kurz verwendbar. Zudem gibt es Lokalisierungsmikroskope, die eine bestimmte Blinkstatistik der Fluorophore erwarten oder eine Modifikation dieser Blinkstatistik benötigen. Dies ist mit den DNA-Origamistrukturen gemäß Steinhauer auch nicht möglich.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Testprobenvorrichtung für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, anzugeben, die es erlaubt reproduzierbar ein solches Mikroskop zu überprüfen, ohne dass die eingangs genannten Probleme auftreten.
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Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 und 10 definiert.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Testprobenvorrichtung für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, wobei die Testprobenvorrichtung umfasst: einen Probenkörper, der zum Mikroskopieren mit dem Mikroskop ausgebildet ist und eine Oberfläche aufweist, auf der Nanostrukturen angeordnet sind, wobei jede Nanostruktur längs der Oberfläche gesehen eine Ausdehnung im Sub-Wellenlängenbereich hat, wobei die Nanostrukturen voneinander um ein Maß beabstandet sind, das oberhalb der Wellenlänge des sichtbaren Spektralbereiches liegt, und wobei die Nanostrukturen kollektiv zwischen einem Hellzustand, in dem sie leuchten, und einem Dunkelzustand, in dem sie nicht leuchten, umschaltbar sind, und einen Antrieb, der zur Verschiebung des Probenkörpers im Sub-Wellenlängenbereich (insbesondere während des Dunkelzustandes) ausgebildet ist, wodurch die verschiedenen Leuchtzustände durch verschiedene Verschiebezustände des Probenkörpers realisierbar sind.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Testverfahren für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, wobei ein Probenkörper zum Mikroskopieren in das Mikroskop eingelegt wird, der eine Oberfläche aufweist, auf der Nanostrukturen angeordnet sind, wobei jede Nanostruktur längs der Oberfläche gesehen eine Ausdehnung im Sub-Wellenlängenbereich hat, wobei die Nanostrukturen voneinander um ein Maß beabstandet sind, das oberhalb der Wellenlänge des sichtbaren Spektralbereiches liegt, und die Nanostrukturen zum kollektiven Leuchten gebracht werden, und der Probenkörper im Sub-Wellenlängenbereich verschoben wird, wodurch die verschiedenen Leuchtzustände durch verschiedene Verschiebezustände des Probenkörpers realisiert werden.
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Die Erfindung sieht eine Testprobe vor, welche Nanostrukturen aufweist, deren Beabstandung eigentlich für die Überprüfung des Mikroskops gar nicht geeignet wäre, weil sie größer ist, als die Auflösung, die das Mikroskop erreichen soll. Mittels des Antriebes ist der Probenkörper so verschiebbar, dass zeitlich nacheinander zwei Verschiebezustände realisiert werden, deren Lage sich um einen Abstand unterscheidet, der kleiner ist als die Lichtwellenlänge und damit in der Größenordnung liegt, die mit dem Mikroskop aufgelöst werden soll. Die Erfindung verwendet also Strukturen, die eigentlich für einen Test nicht geeignet wären, um die Auflösungsgrenze des Mikroskops zu prüfen, und erreicht es dennoch, unterschiedliche Leuchtzustände zu realisieren, in denen Strukturen, die kleiner sind als die Wellenlänge des Lichtes an Positionen leuchten, die ihrerseits geringer beabstandet sind, als die Wellenlänge des Lichtes.
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Zum Überprüfen eines lokalisierungsbasierten Mikroskops ist es erforderlich, dass die einzelnen Leuchtzustände für sich stabil sind. Die Nanostrukturen sind deshalb so gestaltet, dass sie zwischen einem Hellzustand, in dem sie kollektiv leuchten, und einem Dunkelzustand, in dem sie kollektiv nicht leuchten, schaltbar sind. Die Verschiebung des Probenkörpers erfolgt ausschließlich während des Dunkelzustandes, so dass die zwei Leuchtzustände in sich jeweils stabil sind und nicht durch den Verschiebevorgang vermischt werden.
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Die Testprobenvorrichtung kann dadurch realisiert werden, dass eine Platte mit Nanostrukturen in Form von Löchern vorgesehen wird, die jeweils einen Durchmesser haben, der kleiner ist als die Lichtwellenlänge. Die Platte ist hinterleuchtet, so dass die Löcher kollektiv leuchten. Zum Verschieben genügt es, die Platte zu verschieben.
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Bekanntermaßen ist die Transmission durch Sub-Wellenlängen-Löcher sehr gering. Näherungsweise beträgt die Transmission (Lochdurchmesser/Wellenlänge)4, so dass z. B. bei einem 20 nm-Loch die Transmission (20/500)4 ≈ 2,5 × 10-6 beträgt. Dies ist hier nicht nachteilig, sondern aufgrund der bei den hochauflösenden Mikroskopierverfahren häufig auftretenden geringen Photonenzahlen (wie z. B. bei PALM) und den EMCCD-Kameras sogar vorteilhaft, da man typischerweise lediglich einige 100 bis 1.000 Photonen pro virtuellem Molekül möchte.
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Die Platte kann beispielsweise in Form eines transparenten Substrates ausgebildet werden, auf dem die Metallschicht, beispielsweise eine Silberschicht angeordnet ist, welche die Nanostrukturen in Form der Löcher hat.
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Ferner kann die Platte auch als transparente Platte ausgebildet sein, in der sich Licht durch Totalreflexion ausbreitet und an Störungen an der Oberfläche (kleine Spots) ausgekoppelt wird.
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Einen besonders kompakten Aufbau erreicht man, wenn die Metallschicht auf einer Leuchtquelle, beispielsweise einer LED oder einer OLED ausgebildet ist.
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Die Testvorrichtung bzw. das Testverfahren ermöglicht es einfach, ein gewünschtes Spektralverhalten für die Probe einzustellen. Man muss dazu lediglich die Beleuchtungsquelle, welche den Probenkörper beleuchtet und/oder die Nanostrukturen zum kollektiven Leuchten bringt, mit den gewünschten Spektraleigenschaften versehen, die man für ein zu überprüfendes oder vorzuführendes Mikroskop bzw. Mikroskopieverfahren haben möchte. Es ist deshalb bevorzugt, eine spektral einstellbare Beleuchtungsquelle zu verwenden, da dann die Testvorrichtung für eine Vielzahl an Mikroskopen und Mikroskopierverfahren brauchbar ist. Durch die Wahl des Spektrums der Beleuchtungsquelle können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe simuliert werden.
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Als Antrieb für die Verschiebung kommen beispielsweise 2D-Piezostellelemente oder ein MEMS-Device in Frage.
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Wegen des geringen Bildfeldes üblicher hochauflösender Mikroskope ist eine maximaler Abstand aufeinanderfolgender Verschiebestellungen von 10 bis 100 nm ausreichend.
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Die leuchtenden Nanostrukturen können auch durch Elemente realisiert werden, die mittels externer Strahlung zum Leuchten angeregt werden, beispielsweise durch Quantenpunkte. Man kann in diesem Fall die Aufnahmen, die während der Verschiebung aufgenommen werden, bei der Auswertung nicht berücksichtigen. Man könnte daher eine permanente externe Strahlung zum Anregen des Leuchtens verwenden. Es ist jedoch auch möglich, die Anregungsstrahlung mit der Verschiebung synchronisiert an- und auszuschalten, so dass während der Verschiebung keine Anregungsstrahlung abgegeben wird. Bei der Verwendung von Quantenpunkten können in üblicher Weise mikroskopseitig die üblichen Emissionsfilter zur Unterdrückung der Anregungsstrahlung zugeschaltet werden.
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Bei der erfindungsgemäßen Testprobenvorrichtung kann der Antrieb den Probenkörper um eine Entfernung verschieben, die um einen Wert aus dem Bereich von 10 bis 100 nm kürzer ist als der Abstand zweier Nanostrukturen.
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Es wird ferner eine Testprobenvorrichtung für ein optisches Mikroskop, das eine Probe in verschiedenen Leuchtzuständen mit einer Ortsauflösung im Sub-Wellenlängenbereich des sichtbaren Spektralbereiches abbildet, bereitgestellt, wobei die Testprobenvorrichtung einen Probenkörper, der zum Mikroskopieren mit dem Mikroskop ausgebildet ist und eine Oberfläche aufweist, auf der zumindest eine Nanostruktur angeordnet ist, wobei jede Nanostruktur längs der Oberfläche gesehen eine Ausdehnung im Sub-Wellenlängenbereich hat und die Nanostruktur(en) (kollektiv) zwischen einem Hellzustand, in dem sie leuchtet bzw. leuchten, und einem Dunkelzustand, in dem sie nicht leuchtet bzw. nicht leuchten, umschaltbar ist/sind, und einen Antrieb umfasst, der zur Verschiebung des Probenkörpers im Sub-Wellenlängenbereich (insbesondere während des Dunkelzustandes) ausgebildet ist, wodurch die verschiedenen Leuchtzustände durch verschiedene Verschiebezustände des Probekörpers realisiert sind.
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Soweit vorstehend oder nachfolgend Vorrichtungsmerkmale beschrieben sind, gelten sie auch analog für des Testprobenverfahren. Gleiches gilt für die Beschreibung von Verfahrensmerkmalen und deren Bezug auf die Testprobenvorrichtung.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
- 1 schematische Darstellungen zur Verdeutlichung der lokalisierungsbasierten Hochauflösungsmikroskopie und der sich daraus ergebenden Anforderungen für eine Testprobenvorrichtung,
- 2 eine weitere Darstellung zur Verdeutlichung der lokalisierten Hochauflösungsmikroskopie,
- 3 eine schematische Darstellung durch eine Testprobenvorrichtung zum Überprüfen eines hochauflösenden Mikroskops und
- 4 und 5 alternative Ausführungsformen für Elemente der Testprobenvorrichtung der 3.
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Die 1 und 2 verdeutlichen die Anforderungen der lokalisierenden Hochauflösungsmikroskopie bezüglich einer Testprobe, mit der Funktionsweise bzw. Auflösung eines hochauflösenden Mikroskops demonstriert werden kann.
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Betrachtet man zwei Emitter 1 und 2, die in einer Probe leuchten, beispielsweise nachdem sie zur Fluoreszenz angeregt wurden, so lassen sich diese Emitter 1 und 2 nur dann unterscheiden, wenn ihr Beugungsbild 3 bzw. 4 voneinander getrennt werden kann. Liegen die Emitter 1 und 2 so dicht beieinander, dass die Beugungsbilder 3 und 4 optisch nicht unterschieden werden können, ergibt sich ein gemeinsames Beugungsbild, das beispielsweise ein vergrößertes Beugungsscheibchen sein kann, solange beide Emitter leuchten. Man kann a priori nicht sagen, ob das Beugungsbild 5 von zwei nebeneinanderliegenden Emittern 1 und 2 herrührt, also aus der Überlagerung der Beugungsbilder 3 und 4 entstand, oder ob nur ein einziger Emitter das Beugungsbild 5 erzeugte. Dabei ist darauf hinzuweisen, dass die Beugungsbilder 3, 4 und 5 in 1 nur schematisch als scharf umgrenzte Kreise eingezeichnet sind. Z. B. kann die im Beugungsbild 5 der 1 wiedergegebene Struktur, die die Überlagerung zweier einzelner Beugungsbilder 3 und 4 nahelegt, mit einem Mikroskop nicht erkannt werden.
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Die lokalisierungsbasierte hochauflösende Mikroskopie ist nun in der Lage, die Lage zweier solcher Emitter 1 und 2 aufzulösen, die auf einer Probe 6 in einem Abstand d liegen, der mit der optischen Auflösungsgrenze nicht unterscheidbar wäre. 2 zeigt dies im oberen Teil schematisch durch eine Strahltaille 7, die sich aus der Punktbildverwaschungsfunktion des verwendeten Mikroskops ergibt. Innerhalb dieser Strahltaille 7 liegen die Emitter 1 und 2 in einem Abstand d in der Probe 6 und könnten nicht unterschieden werden, wenn sie beide gleichzeitig leuchten, wie es im oberen Teil der 1 schematisch dargestellt ist.
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Die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie bewirkt, dass die beiden Emitter 1 und 2 in der Probe 6 nacheinander leuchten und nacheinander abgebildet werden. Dies geschieht im Verfahrensablauf 8 mehrfach, so dass die Probe in unterschiedlichen Leuchtzuständen abgebildet ist. Für jeden Leuchtzustand wird die Lage des jeweils leuchtenden Emitters 1 oder 2 ermittelt, da man weiß, dass das Beugungsbild 3 bzw. 4 nur von einem Emitter herrührt. Bezogen auf die Darstellung der 1 wird der Schwerpunkt des Beugungsbildes 3 oder 4 ermittelt, je nachdem welcher der Emitter leuchtete. Somit kann man den Ort der Emitter sehr viel genauer lokalisieren, als es die Punktbildverwaschungsfunktion oder die Strahltaille 7 zulässt.
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Diese Art der Lokalisierung ist mit verschiedenen Mikroskopieverfahren möglich, wie bereits im allgemeinen Teil der Beschreibung einleitend erwähnt. Die Arbeitsweise der lokalisierungsbasierten Hochauflösungsmikroskopie ist für die nachfolgend beschriebene Testprobenvorrichtung nur insoweit relevant, als daraus die Rahmenbedingung folgt, dass das Mikroskop eine Probe benötigt, die in unterschiedliche Leuchtzustände geschaltet werden kann, in denen wechselweise Strukturen leuchten, welche einen Abstand und eine Ausdehnung kleiner als die Wellenlänge des verwendeten Mikroskops haben. Dies gilt natürlich auch für eine Testprobenvorrichtung.
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3 zeigt eine Testprobe 9. Sie umfasst einen Probenkörper 10, der mit einer Beleuchtungsquelle 26 hinterleuchtet wird, die Beleuchtungsstrahlung 27 auf die Unterseite des Probenkörpers 10 abgibt. Der Begriff „Unterseite“ ist dabei darauf bezogen, dass der Probenkörper 10 von einem Mikroskop 17 in einer abgebildet wird.
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Der Probenkörper 10 weist ein Array von Löchern 28 auf. Jedes Loch 28 hat eine Abmessung, die kleiner ist als die Lichtwellenlänge, welche bei der verwendet wird. Jedes Loch 28 stellt damit eine Nanostruktur dar. Die Löcher 28 sind jeweils im Array um ein Maß beabstandet, das größer ist als die Wellenlänge, welche bei der verwendet ist.
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Durch die Beleuchtungsstrahlung 27 leuchten die Löcher 28. Sie werden mit dem Mikroskop 17 abgebildet.
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Der Probenkörper 10 ist mit einem Antrieb 29 verbunden, welcher dem Probenkörper 10 um ein Maß lateral, d.h. quer zur Richtung der verschiebt, das kleiner ist als die bei der verwendete Wellenlänge. Während eines solchen Verschiebevorgangs von einer ersten in eine zweite Verschiebelage des Probenkörpers 10 schaltet ein Steuergerät 25, das den Antrieb 29 und die Beleuchtungsquelle 26 ansteuert, die Beleuchtungsstrahlung 27 ab. Sie wird erst wieder eingeschaltet, wenn der Probenkörper 10 in der zweiten Verschiebestellung angekommen ist. Damit sind zwei unterschiedliche Leuchtzustände des Probenkörpers 10 realisiert, in denen Nanostrukturen, nämlich die Löcher 28, die kleiner sind als die Wellenlänge, in unterschiedlichen Ortslagen leuchten, die ihrerseits weniger beabstandet sind, als die Wellenlänge der .
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Die Testprobe 9 stellt damit dem Mikroskop 17 unterschiedliche Leuchtzustände zur Verfügung, was eine einfache Überprüfung oder Demonstrierung des Mikroskops bzw. des Mikroskopieverfahrens ermöglicht.
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4 zeigt eine exemplarische Ausführung für den Probenkörper 10. Er besteht hier aus einem Substrat 11, auf das eine Metallschicht 12 aufgebracht ist, welche die Löcher 28 aufweist. Die Löcher 28 sind mittels FIB (Focused Ion Beam, z. B. in
http://en.wikipedia.org/wiki/Focused ion beam beschrieben) eingebracht. Durch die Löcher folgt die Emission der an der Unterseite eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung 27.
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Alternativ können vereinzelte Löcher erzeugt werden, indem Polystyrol-Kügelchen (kleine Kügelchen mit definiertem Durchmesser, die kommerziell erhältlich sind und auch Polystyrolbeads genannt werden) auf das Substrat 11 aufgebracht werden, dieses dann mit einem Metallfilm bedampft wird und danach die Kügelchen abgewaschen bzw. aufgelöst werden. Dort wo die Kügelchen lagen, befinden sich nun Löcher 28 mit dem Durchmesser der Kügelchen.
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5 zeigt eine kompaktere Bauweise, bei der die Testprobe 10 anstelle des Substrates 11 direkt eine Leuchtquelle, beispielsweise eine LED 30 umfasst, auf deren Oberseite die Metallschicht 12 ausgebildet ist. Die LED 20 emittiert dann durch die Löcher 28. Die Lichtintensität kann über die Stromstärke einfach geregelt werden.
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Zum Testen oder Demonstrieren eines hochauflösenden Mikroskops oder Mikroskopieverfahrens werden folgende Schritte ausgeführt. In einer ersten Stellung des Probenkörpers 10 wird dafür gesorgt, dass die Nanostrukturen leuchten, also in der Ausführungsform der 3 die Löcher 28. Die Intensität an der Beleuchtungsquelle 26 wird geeignet eingestellt und mit dem Mikroskop 17 ein Bild aufgenommen. Nach einiger Zeit, die durch die Bildaufnahme des Mikroskops 17 vorgegeben ist, wird die Beleuchtungsquelle 26 abgeschaltet und der Probenkörper 10 in eine zweite Position bewegt. Dann werden die oben genannten Schritte wiederholt. Dies ist natürlich für mehrere Positionen möglich.
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Zusätzlich zu den bereits im allgemeinen Teil erwähnten Abwandlungen sind auch folgende Modifikationen möglich:
- Die Form der Nanostrukturen ist nicht auf Löcher 28 eingeschränkt. Es können auch andere Nanoaperturen verwendet werden. Auch kann das Array als bereits kalibriertes Muster oder Gitter ausgeführt werden.
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Der Abstand der Aperturen, beispielsweise der Löcher 28, muss mindestens größer sein als der einfache Durchmesser eines Punktverwaschungsbildes, das sich mit dem Mikroskop 17 durch die ergibt.
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Das Array der Nanostrukturen kann symmetrisch sein, muss es aber nicht. Wesentlich ist nur, dass die Verschiebung der einzelnen Aperturen hinreichend genau bekannt ist, beispielsweise mit einer Genauigkeit von kleiner 100 nm.
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Das Array der Nanostrukturen kann z. B. so ausgebildet sein, dass eine vollständige oder zumindest weitestgehende Ausfüllung des Sichtfeldes des Mikroskops vorliegt, so dass die feldabhängige Abbildungsqualität mit einer (bevorzugt einzigen) Messung bestimmt werden kann.
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Die mechanische Bewegung kann zwischen zwei Verschiebestellungen erfolgen. Es sind aber auch mehrere Verschiebestellungen möglich, wobei die Forderung, dass die Verschiebung geringer ist als die Auflösungsgrenze der sich auf zwei direkt aufeinanderfolgende Verschiebestellungen bezieht.
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Die mechanische Bewegung wie auch das Ein- und Ausschalten des Leuchtens der Nanostrukturen kann auch periodisch erfolgen. Durch die Frequenzwahl kann man das Blinkverhalten von Fluorophoren in der Mikroskopie nachbilden.
