DE102004047593A1

DE102004047593A1 - Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen und Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE102004047593A1
Application number: DE102004047593A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Westphal; Daniel Dr. Bublitz
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2006-04-13
Also published as: US20080038835A1; WO2006037472A1

Abstract

Ein Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen umfaßt eine Fluoreszenzschicht (2), mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigstens zwei Feldern mit jeweils einer über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2) angeordneten Abschwächungsschicht (17 bis 29), die für von der Fluoreszenzschicht (2) abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten (17 bis 29) in den Feldern voneinander unterscheiden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen und ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Fluoreszenz- oder Lumineszenzmessungen können dazu verwendet werden, in einer Probe das Vorhandensein von fluoreszierenden beziehungsweise lumineszierenden Substanzen und insbesondere auch die Menge dieser Substanzen in dem untersuchten Raumbereich der Probe festzustellen. Ein typischer Anwendungsfall für solche Fluoreszenzmessungen stellt die Untersuchung biologischer beziehungsweise biochemischer Proben dar, bei der beispielsweise in Proben Substanzen mit Fluorophoren eingebracht werden, die nur an bestimmte Zielmoleküle ankoppeln. Nach Entfernen nicht gebundener Fluorophore können die so präparierten Proben mittels geeigneter Fluoreszenzmeßgeräte, insbesondere sogenannter Bio-Chip-Reader, untersucht werden, wobei die detektierte Fluoreszenzstrahlung Auskunft über das Vorhandensein von Zielmolekülen mit daran gebundenen Fluorophoren und idealerweise auch über die Konzentration der Zielmoleküle gibt.
Um quantitativ verläßliche Ergebnisse erhalten zu können, ist es notwendig, Aussagen über die Detektionseigenschaften des verwendeten Fluoreszenz- beziehungsweise Lumineszenzmeßgeräts zu erhalten. Neben rein optischen Abbildungseigenschaften solcher Meßgeräte, beispielsweise dem Auflösungsvermögen, kommt der Empfindlichkeit der Meßgeräte für die verwendete Fluoreszenzstrahlung, der Linearität, das heißt genauer der Linearität der Abhängigkeit der Größe der Detektionssignale von der Intensität der Fluoreszenzstrah lungsintensität, und der Dynamik der verwendete Meßgeräte, das heißt der Größe des Bereichs zwischen minimal und maximal detektierbaren Fluoreszenzstrahlungsintensitäten, besondere Bedeutung zu.
Zur Ermittlung oder Prüfung dieser Eigenschaften können auch als Fluoreszenzstandards bezeichnete Referenzproben verwendet werden, die bekannte Fluoreszenzeigenschaften besitzen, d.h. bei Bestrahlung mit optischer Anregungsstrahlung vorgegebener Anregungsintensität Fluoreszenzstrahlung mit definierten räumlichen, spektralen und/oder intensitätsbezogenen Eigenschaften abgeben. Eine Untersuchung solcher Referenzproben mit einem Fluoreszenz- beziehungsweise Lumineszenzmeßgerät gestattet eine Bewertung der Sensitivität, Linearität und Dynamik des verwendeten Fluoreszenz- bzw. Lumineszenzmeßgeräts.
Die Eigenschaften solcher Referenzproben sollen sich im Laufe der Zeit oder auch in Abhängigkeit von der Anzahl der Messungen an der Referenzprobe nicht oder nur unwesentlich verändern. Solche Veränderungen können aber sehr leicht auftreten, wenn sich die geometrische Form der Referenzprobe ändert oder eine signifikante Änderung der Fluoreszenzeigenschaften durch Ausbleichen, insbesondere bei wiederholter Verwendung, oder Lagerung auftritt.

In US 6,472,671 wird zur Bewertung optischer Abbildungseigenschaften eines Fluoreszenzmeßgeräts vorgeschlagen, ein Kalibrierwerkzeug zu verwenden, das auf einer festen, nicht transparenten Trägerplatte eine dünne Schicht fester Fluorophore besitzt, wobei die Trägerplatte teilweise durch eine strukturierte, nicht transparente Maske abgedeckt ist. In die Maske, bei der es sich um eine dünne Metallschicht handeln kann, ist ein Muster mit feinen Strukturen bis hinunter in den Bereich von 0,5 μm eingeätzt. Da die Schicht mit festen Fluorophoren eine jeweils konstante Dicke aufweist, ist das beschriebene Kalibrierwerkzeug nicht zur Untersuchung der Linearität und des Dynamikbereichs eines Fluoreszenzmeßgerät geeignet.

In US 004/005243 A1 ist ein Träger mit einer Schicht eines fluoreszierenden Materials beschrieben, die zur Untersuchung von Abbildungseigenschaften eines Fluoreszenzmeßgeräts strukturiert sein kann, so daß eine Maske nicht notwendig ist.

Zur Untersuchung der Empfindlichkeit, der Linearität und/oder des Dynamikbereichs von Fluoreszenzmeßgeräten sind Referenzproben bzw. Fluoreszenzstandards verschiedener Art bekannt.

Beispielsweise können als Referenzproben flache Küvetten mit einer Höhe von beispielsweise wenigen μm mit einer Fluorophorlösung gefüllt werden. Eine Variation der von einer solchen Referenzprobe abgegebenen Fluoreszenzintensität ist durch eine Variation der Konzentration der in die Küvetten eingefüllten Fluorophorlösung möglich. Ein Nachteil solcher Referenzproben besteht darin, daß die Fluorophore in der Regel nicht langzeitstabil sind und bei Bestrahlung relativ schnell ausbleichen. Zudem ist es schwierig, Küvetten mit genau definierter Höhe reproduzierbar zu präparieren. Von der Höhe bzw. Dicke der Flüssigkeits- beziehungsweise Fluorophorlösungsschicht in der Küvette hängt jedoch die Fluoreszenzintensität ab, sodaß die Fluoreszenzintensität nicht sehr genau vorgegeben werden kann.

Alternativ wurde vorgeschlagen, Trägerschichten mit Schichten zu belegen, die Fluorophore enthalten.

In US 6,471,916 ist beschrieben, Träger mit Bereichen unterschiedlicher Fluorophorkonzentration als Fluoreszenzstandard zu verwenden. Es wird jedoch nicht angegeben, wie diese hergestellt werden können.

Eine bekannte Möglichkeit zur Herstellung solcher Fluoreszenzstandards besteht darin, Fluorophore, beispielsweise Cy3 oder Cy5 in wäßrige Lösung zu bringen und eine Verdünnungsreihe zu erstellen. Die gelösten Fluorophore werden dann tröpfchenweise auf geeignete Träger, beispielsweise Objektträger, aufgebracht und eingetrocknet. Unter der Voraussetzung, daß die dabei verwendeten Tropfenvolumina und auch die Durchmesser der eingetrockneten Tropfen konstant sind, erhält man Träger mit Fluorophor-Belegungsdichten, die der Fluorophorkonzentration in der Flüssigkeit proportional sind. In der Praxis variieren allerdings die Tropfenvolumina- und Durchmesser stark, so daß die Proportionalität nicht mehr gegeben ist. Darüber hinaus bilden sich beim Eintrocknen häufig sehr inhomogene Fluorophor-Belegungen. Schließlich sind die verwendeten Fluorophore auch gekühlt meist nicht langzeitstabil und bleichen relativ schnell aus.

Fluoreszenzstandards können alternativ dadurch erhalten werden, daß auf einem Träger Polymerschichten mit darin enthaltenen Fluorophoren angeordnet werden.

So ist in US 2004/005243 A1 ein zur Kalibrierung vorgesehener Träger beschrieben, auf den eine Schicht eines fluores zierenden Materials mit konstanter oder variierender Dicke aufgebracht ist.

In DE 12 00 865 A1 ist eine Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen offenbart, die einen im wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger besitzt, auf den in mehreren definierten Bereichen fluoreszierende Polymerschichten mit zum Teil unterschiedlicher Dicke und/oder Zusammensetzung aufgebracht sind.

In DE 201 04 445 U1 und DE 201 04 446 U1 ist ein Fluoreszenzstandard beschrieben, der dadurch hergestellt wird, daß auf einen Träger eine Kunststoffdispersion mit einem Fluorophor aufgebracht wird, die dann ausgehärtet wird.

Referenzproben mit auf einen Träger aufgebrachten Polymer-Fluorophor-Schichten, die unterschiedliche Dicken und/oder unterschiedliche Fluorophorkonzentrationen aufweisen, haben jedoch den Nachteil, daß die Fluorophore bei häufiger Verwendung ausbleichen. Darüber hinaus erfordert die Kalibrierung von Bio-Chip-Readern, die einen sehr großen Dynamikbereich aufweisen, Referenzproben, mittels derer Fluoreszenzstrahlung stark unterschiedlicher Fluoreszenzintensität erzeugt werden kann. Durch Variation der Dicken der Fluorophore enthaltenden Schichten und/oder der Fluorophorkonzentrationen in solchen Schichten kann die erforderliche Variation der Fluorophormenge in dem untersuchten Bereich und damit der Fluoreszenzintensität jedoch nicht ohne weiteres erreicht werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Referenzprobe für Fluoreszenzmessungen bereitzu stellen, mittels derer bei Beleuchtungen mit vorgegebener optischer Strahlung reproduzierbar Fluoreszenzstrahlung unterschiedlicher Fluoreszenzintensitäten erzeugt werden kann, und ein Verfahren zur Herstellung der Referenzprobe anzugeben.

Die Aufgabe wird gelöst durch einen Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzschicht, mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigsten zwei Feldern mit jeweils einer über und/oder unter der Fluoreszenzschicht angeordneten Abschwächungsschicht, die für von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten in den Feldern voneinander unterscheiden.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Referenzkörpers für Fluoreszenzmessungen, bei dem eine Fluoreszenzschicht hergestellt wird, mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und in wenigsten zwei verschiedenen Feldern jeweils eine für von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparente Abschwächungsschicht hergestellt wird, so daß sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten in den verschiedenen Feldern voneinander unterscheiden, wobei die Abschwächungsschichten über und/oder unter der Fluoreszenzschicht angeordnet sind. Je nach Reihenfolge und Art der Schichten können dabei die Abschwächungsschichten vor, gleichzeitig mit oder nach der Fluoreszenzschicht hergestellt werden.

Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prüfung und/oder Kalibrierung einer Fluoreszenzmeßvorrichtung wird ein erfindungsgemäßer Referenzkörper verwendet, wobei optische Anregungsstrahlung in die Fluoreszenzschicht gestrahlt und entsprechende, durch die Abschwächungsschichten hindurchtretende Fluoreszenzstrahlung aufgelöst nach Feldern detektiert wird.

Durch Analyse der Meßergebnisse kann dann bei bekannter Transmission der Abschwächungsschichten die Empfindlichkeit, die Linearität und der Dynamikbereich der Fluoreszenzmeßvorrichtung bewertet werden.

Erfindungsgemäß erfolgt also eine Variation der Fluoreszenzintensitäten in erster Linie durch die Abschwächungsschichten, die unterschiedliche Transmissionsvermögen aufweisen. Das Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten ist vorzugsweise bekannt und besonders bevorzugt für interessante Typen von Fluoreszenzmeßgerät vorgegeben. Dies hat den Vorteil, daß die Fluoreszenzschicht sehr einfach hergestellt werden kann und insbesondere keine Variation der Dicke und/oder der Konzentration darin enthaltener fluoreszierender Materialien notwendig ist. Abschwächungsschichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens sind über einen großen Bereich verschiedener Transmissionsvermögen einfach und genau herstellbar, so daß ein kostengünstig herstellbarer Referenzkörper bereitgestellt wird, mit dem sehr genau verschiedene Fluoreszenzstrahlungsintensitäten auch über einen größeren Intensitätsbereich erzeugt werden können. Die Fluoreszenzanregung kann im Durchlicht oder im Auflicht erfolgen.

Grundsätzlich kann die Transmission einer Abschwächungsschicht beliebig gewählt sein, solange diese wenigstens für die Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, d.h. solange die Transmission kleiner als 1 und vorzugsweise größer als etwa 10^–6 ist. Um eine Prüfung oder Kalibrierung auch von Bio-Chip-Readern zu gestatten, liegt bei den erfindungsgemäßen Referenzkörpern die Transmission der Abschwächungsschichten bevorzugt zwischen 10^–5 und 0,5.

Dabei ist es besonders bevorzugt, daß das Verhältnis der Transmission der Abschwächungsschicht größten Transmissionsvermögens zu der Transmission der Abschwächungsschicht kleinsten Transmissionsvermögens größer als 10⁴ ist. Eine solche Gestaltung ermöglicht eine Kalibrierung über einen entsprechend großen Dynamikbereich.

Obwohl es prinzipiell genügt, daß nur zwei Felder mit Abschwächungsschichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens vorgesehen sind, besitzt ein erfindungsgemäßer Referenzkörper vorzugsweise mehrere, d.h. mehr als zwei Felder mit Abschwächungsschichten jeweils unterschiedlichen Transmissionsvermögens, da hierdurch auch eine Überprüfung der Linearität einer Fluoreszenzmeßvorrichtung ermöglicht wird.

Um zur Prüfung eines großen Dynamikbereichs eine möglichst günstige Verteilung von mittels des Referenzkörpers erzeugten Fluoreszenzintensitäten zu erreichen, sind bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper bevorzugt mehr als zwei jeweils in verschiedenen Feldern angeordnete Abschwächungsschichten über und/oder unter der Fluoreszenzschicht angeordnet, deren Transmissionen relativ zueinander logarithmisch abgestuft sind.

Die Abschwächungsschichten in den einzelnen Feldern können grundsätzlich aus den gleichen oder verschiedenen Materialien gebildet sein. Darüber hinaus können sie in den Bereichen zwischen den Feldern miteinander verbunden oder durch diese Bereiche getrennt sein.

Das Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten kann grundsätzlich auf verschiedene Art und Weise eingestellt werden. Beispielsweise kann das Reflexionsvermögen der Abschwächungsschichten für Fluoreszenzstrahlung variiert werden. Bevorzugt ist bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper jedoch vorgesehen, daß die Abschwächungsschichten von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlungen absorbieren. Die Absorption einer Abschwächungsschicht ist bei der Herstellung derselben einfacher über einen weiten Bereich zu variieren als deren Reflexionsvermögen.

Zur Variation der Absorption kann das Material der Abschwächungsschicht verändert werden. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper sollen sich jedoch bevorzugt wenigstens zwei der Abschwächungsschichten in ihrer Schichtdicke unterscheiden. Eine Variation des Transmissionsvermögens durch Variation der Schichtdicke der Abschwächungsschichten, vorzugsweise bei Verwendung desselben Materials für die Abschwächungsschichten, hat den Vorteil, daß das Transmissionsvermögen exponentiell von der Dicke der Schicht abhängt, so daß durch einfache Variation der Schichtdicke der Abschwächungsschichten ein großer Transmissionsbereich abgedeckt werden kann. Darüber hinaus können Schichten vorgegebener Dicke sehr einfach und genau hergestellt werden.

Die Herstellung der Schichten kann mit beliebigen Verfahren zur Schichtherstellung erfolgen. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch bevorzugt wenigstens eine der Abschwächungsschichten aufgedampft. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist bevorzugt wenigstens eine der Abschwächungsschichten aufgedampft. Die Abschwächungsschicht kann dabei je nach Aufbau des Referenzkörpers auf eine Trägerschicht oder die Fluoreszenzschicht aufgebracht sein. Mit diesem Verfahren können die Schichtdicken der Abschwächungsschichten besonders genau gesteuert werden.

Das Material der Abschwächungsschichten kann prinzipiell für jede Abschwächungsschicht anders gewählt sein. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist jedoch bevorzugt wenigstens eine der Abschwächungsschichten eine Metallschicht. Metallschichten zeigen in Bezug auf die optischen Eigenschaften, insbesondere die Absorption für optische Strahlung, und die Herstellung, beispielsweise durch Aufdampfen, große Vorteile gegenüber anderen Materialien wie beispielsweise Polymeren. Prinzipiell können beliebige Metalle verwendet werden, doch ist bevorzugt die Metallschicht eine Chromschicht oder Titanschicht, da Chrom und Titan gute Hafteigenschaften auf typischen Trägermaterialien aufweisen.

Ein erfindungsgemäßer Referenzkörper kann zur Verwendung mit Durchlicht und/oder Auflicht ausgebildet sein. Bei Fluoreszenzmessungen wird häufig die Probe mit Anregungslicht in Auflichtbeleuchtung bestrahlt, weswegen reflektive Eigenschaften des Referenzkörpers oft unerwünscht sind. Daher sind bevorzugt die Abschwächungsschichten auf wenigstens einer Seite, vorzugsweise der von der Fluoreszenzschicht abgewandten Seite, entspiegelt. Bevorzugt ist deren Reflexionsvermögen kleiner als 10%, besonders bevorzugt kleiner als 4%.

Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Referenzkörper in einem Bereich zwischen den Feldern im wesentlichen nicht transparent. Dies bedeutet, daß die Transmission in diesem Bereich vorzugsweise kleiner als 10^–6 ist. Durch diese Ausbildung kann eine klare Abgrenzung zwischen den verschiedenen Feldern erreicht werden.

Um die Homogenität der Empfindlichkeit eines Fluoreszenzmeßgeräts in lateraler Richtung, das heißt quer zur Richtung der Anregungs- bzw. Fluoreszenzstrahlung überprüfen zu können, ist der erfindungsgemäße Referenzkörper vorzugsweise in einem Bereich zwischen wenigstens zwei Feldern oder entlang wenigstens eines der Felder transparent.

Um reproduzierbar Fluoreszenzstrahlung erzeugen zu können, ist der Referenzkörper vorzugsweise formstabil. Hierzu kann der erfindungsgemäße Referenzkörper eine formstabile Trägerschicht aufweisen. Die Trägerschicht, die Fluoreszenzschicht und die Abschwächungsschichten können dabei in unterschiedlicher Art und Weise ausgebildet und angeordnet sein.

Bei einer Ausbildungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers bildet bevorzugt die Fluoreszenzschicht eine formstabile Trägerschicht. Damit ergibt sich ein besonders einfacher Aufbau. Als Trägerschicht kann insbesondere eine Schicht aus Glas mit eingelagerten „Quantum-dots", das heißt fluoreszierenden Halbleiter-Nanopartikeln, vorzugweise aus Cadmiumsulfid, Zinkselenid, Cadmiumtellurid oder Quecksilberselenid, verwendet werden. Sie kann vorzugsweise als Trägerplatte ausgebildet sein.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers ist die Fluoreszenzschicht auf einer formstabilen, im wesentlich nicht fluoreszierenden Trägerschicht angeordnet. Insbesondere kann sie unmittelbar auf die Trägerschicht, die insbesondere als Trägerplatte ausgebildet sein kann, aufgebracht sein. Als Trägermaterial kann dabei Glas dienen, während als Fluoreszenzschicht beispielsweise ein "Quantum-Dots" enthaltendes Polymer, wie PMMA, auf die Träger aufgeschleudert wird. Alternativ ist es auch möglich, die Fluoreszenzschicht auf die Trägerschicht aufzukleben.

Die Abschwächungsschicht kann zum einen auf der auf der Trägerschicht angeordneten Fluoreszenzschicht angeordnet sein. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist jedoch bei einer bevorzugten Ausführungsform die nicht fluoreszierende Trägerschicht transparent, und auf ihr sind die Abschwächungsschichten aufgebracht. Diese Anordnung der Abschwächungsschichten erlaubt es, während der Herstellung des Referenzkörpers deren, vorzugsweise spektrales, Transmissionsvermögen zu bestimmen beziehungsweise zu kontrollieren. So werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt die Abschwächungsschichten auf eine formstabile, im wesentlichen nicht fluoreszierende, transparente Trägerschicht aufgebracht, die Transmissionen der Abschwächungsschichten ermittelt, und danach wird auf die Trägerschicht die Fluoreszenzschicht aufgebracht. Auch hier bildet die Trägerschicht vorzugsweise eine Trägerplatte.

Besonders bevorzugt sind jedoch die Abschwächungsschichten zwischen der Trägerschicht und der Fluoreszenzschicht angeordnet. Hierzu wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nach der Ermittlung der Transmission der Abschwächungs schichten die Fluoreszenzschicht auf die Abschwächungsschicht aufgebracht. Die Fluoreszenzschicht und die Trägerschicht bilden so einen Schutz der gegebenenfalls nicht sehr robusten Abschwächungsschichten gegen mechanische Beschädigungen und andere Umwelteinflüsse. Bei der Verwendung dieser Ausführungsform im Auflicht wird das Anregungslicht in die transparente Trägerschicht gestrahlt.

Die Intensität der bei Anregung mit optischer Anregungsstrahlung von dem Referenzkörper abgegebenen Fluoreszenzstrahlung hängt nicht nur von den Schichtdicken und Materialien der Abschwächungsschichten, sondern auch von den Eigenschaften der Fluoreszenzschicht, insbesondere deren Schichtdicke und der Konzentration der darin enthaltenen fluoreszierenden Stoffe, ab.

Soll eine Variation der von dem Referenzkörper abgebenden Fluoreszenzstrahlungsintensitäten allein durch die Eigenschaft der Abschwächungsschichten erfolgen, so sind bevorzugt die Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzschicht in Richtungen parallel zu der Fluoreszenzschicht homogen. Dies kann vorzugsweise dadurch erreicht werden, daß ein fluoreszierender Stoff oder mehrere fluoreszierende Stoffe, die der Fluoreszenzschicht ihre fluoreszierenden Eigenschaften verleihen, in den Richtungen parallel zu der Fluoreszenzschicht homogen verteilt sind. Die Schwankungen in der Konzentration des fluoreszierenden Stoffs bzw. der fluoreszierenden Stoffe in Richtungen parallel zur Fluoreszenzschicht durch die Fluoreszenzstrahlung, auf die Abschwächungsschichten gestrahlt wird, d.h. parallel zu deren Oberfläche, ist dabei vorzugsweise geringer als 5%.

Die Konzentration von fluoreszierenden Stoffen in der Fluoreszenzschicht kann prinzipiell beliebig gewählt werden. Vorzugsweise wird die maximal mögliche Konzentration gewählt, bei der keine gegenseitige Löschung der Fluoreszenz eintritt.

Um einerseits den Referenzkörper einfach herstellen und handhaben zu können und andererseits für die verschiedenen Felder mit Abschwächungsschichten die jeweils gleiche Fluoreszenzstrahlungsintensität bereitstellen zu können, hat bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper die Fluoreszenzschicht bevorzugt die Form einer planparallelen Platte.

Die Dicke der Fluoreszenzschicht kann prinzipiell beliebig gewählt werden. Bevorzugt ist jedoch die Fluoreszenzschicht so ausgebildet, daß die Fluoreszenz aus einer aktiven Schicht kleiner als 2 μm abgestrahlt wird. Die Dicke einer solchen Schicht ist damit kleiner als die Schärfentiefe typischer Fluoreszenzmeßgeräte, so daß sie vollständig und scharf abgrenzt abgebildet werden kann.

Für den Fall, daß die Fluoreszenzschicht nicht gleichzeitig eine Trägerschicht darstellt, kann deren Dicke vorzugsweise kleiner als 10 μm, insbesondere kleiner als 2 μm gewählt sein.

Die fluoreszierende Wirkung der Fluoreszenzschicht kann bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper prinzipiell auf beliebige Art und Weise erreicht werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht wenigstens ein organisches Fluorophor. Dies gestattet es, ein für ei nen vorgegebenen Anwendungszweck geeignetes Fluorophor aus der großen Anzahl verfügbarer organischer Fluorophore auszuwählen. Insbesondere können Fluorophore gewählt werden, die auch bei der Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt werden.

Besonders bevorzugt ist das Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe NileBlue, Cy3, Cy5, Cy7, Fluorescein und Rhodamin.

Bei einer anderen bevorzugten Aufführungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht fluoreszierend wirkende Ionen. Bei diesen kann es sich insbesondere um Ionen von Schwermetallen und/oder seltenen Erden, vorzugsweise in Farbgläsern, handeln. Solche Fluoreszenzschichten zeichnen sich durch eine besonders hohe Stabilität aus.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht fluoreszierend wirkende Quantum-Dots. Bei diesen kann es sich um fluoreszierende Halbleiter-Nanopartikel aus Cadmiumsulfid, Zinkselenid, Cadmiumselenid oder Quecksilbertellurid handeln. Solche Quantum-Dots zeichnen sich durch eine besonders hohe Fluoreszenzausbeute aus. Durch die Einkapselung der Quantum-Dots in ein Matrixmaterial der Fluoreszenzschicht können eine Oxidation und ein Ausbleichen der Quantum-Dots verhindert werden.

Die Fluoreszenzschicht eines erfindungsgemäßen Referenzkörpers kann prinzipiell nur für optische Anregungsstrahlung einer vorgegebenen Anregungswellenlänge und eine entsprechende Fluoreszenzwellenlänge der dadurch angeregten Fluoreszenzstrahlung ausgelegt zu sein. Unter optischer Strah lung wird hierbei infrarote Strahlung, sichtbares Licht und UV-Licht verstanden. Die erwähnte Transmission der Abschwächungsschichten ist dabei bei der entsprechenden, vorgegebenen Fluoreszenzwellenlänge gegeben. Die Transmission metallischer Abschwächungsschichten ist in der Regel von der Strahlungswellenlänge abhängig, was bei der Verwendung des Referenzkörpers zu berücksichtigen ist. Um einen möglichst großen Wellenlängenbereich, beispielsweise von UV bis NIR abzudecken, enthält bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper die Fluoreszenzschicht bevorzugt wenigstens zwei verschiedene fluoreszierende Materialien. Diese weisen vorzugsweise voneinander verschiedene Fluoreszenzspektren auf.

Die erfindungsgemäßen Referenzkörper eignen sich insbesondere zur Kalibrierung von Bio-Chip-Readern.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielhaft anhand der Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Draufsicht auf einen Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
2 eine schematische seitliche Schnittansicht des Referenzkörpers aus 1,
3 eine schematische Draufsicht auf einen Referenzkörper nach einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
4 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörper nach einer dritten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
5 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
6 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer fünften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
7 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Ermittlung der Transmission von Feldern mit Abschwächungsschichten des Referenzkörpers aus 6 bei dessen Herstellung, und
8 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
In den 1 und 2 umfaßt ein Referenzkörper 1 für Fluoreszenzmessungen eine als formstabile Trägerschicht dienende Fluoreszenzschicht 2 und eine darüber angeordnete Metallschicht 3, die typischerweise und insbesondere im Beispiel dünner als 1 μm ist.
Die Fluoreszenzschicht 2 besitzt die Abmessungen eines konventionellen Objektträgers und insbesondere die Form einer planparallelen Platte. Sie ist aus Glas mit darin eingelagerten fluoreszierenden Materialien gebildet. Im Beispiel wird ein Farbglas verwendet, das seine fluoreszierenden Eigenschaften durch darin eingelagerte Ionen von Schwermetallen und/oder seltenen Erden erhält. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform können statt der Ionen Quantum-Dots in die Fluoreszenzschicht eingelagert sein. Bei noch einer anderen Ausführungsform kann die Fluoreszenzschicht 2 durch eine formstabile durchgefärbte Kunststoffplatte gegeben sein, die entsprechende Fluorophore enthält. Das Grundmaterial der Fluoreszenzschicht, das heißt das Glas (oder alternativ Kunststoff), ist für die Fluoreszenzstrahlung so stark absorbierend, daß die Fluoreszenzstrahlung im Wesent lichen nur aus einer sehr dünnen Schicht von weniger als 10 Mikrometern Dicke abgestrahlt wird.
Die Metallschicht 3 weist Felder 4 bis 16 auf, in denen die Dicke der Metallschicht 3 jeweils unterschiedlich stark reduziert ist. Dadurch werden in den Feldern 4 bis 16 jeweils Abschwächungsschichten 17 bis 29 gebildet, deren Dicke beginnend mit dem Feld 4 von Feld zu Feld bis zum Feld 16 zunimmt. Die Dicke der Metallschicht 3 ist dabei so gewählt, daß die Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 Werte zwischen 0,5 und 10^–6 in einer logarithmischen Stufung annimmt. Die Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 sind durch die verbleibenden Bereiche der Metallschicht 3, die eine Transmission kleiner als 10^–6 aufweisen und daher als nicht transparent anzusehen sind, voneinander getrennt, so daß Fluoreszenzstrahlung aus einer der Abschwächungsschichten nicht in den Bereich eines benachbarten Feldes eindringt.
Die äußere Oberfläche der Metallschicht 3 ist bis auf eine Restreflektivität von 4% entspiegelt, damit eine mit üblichen Glasobjektträgern vergleichbare Reflektivität erzielt wird. Dies ist für Autofokusvorrichtungen nützlich.
Der Referenzkörper 1 kann einfach hergestellt werden, indem zunächst die Fluoreszenzschicht 2 hergestellt wird. Diese wird dann mit einem entsprechenden Metall, in Beispiel Chrom, bedampft, wobei das in 2 gezeigte vorgegebene Höhenprofil durch Verwendung entsprechender Masken erzeugt wird. In 2 sind die vorgegebenen Schichtdicken, insbesondere auch die der Abschwächungsschichten, der besseren Sichtbarkeit halber überproportional dick gezeichnet.
Bei der Verwendung des Referenzkörpers 1 wird dieser in Auflicht unter eine Fluoreszenzmeßvorrichtung, beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop gebracht. Es wird dann optische Anregungsstrahlung auf den Referenzkörper 1 gestrahlt, die die Metallschicht 3 und insbesondere auch die Abschwächungsschichten 17 bis 29 unter Abschwächung durchdringt und in der Fluoreszenzschicht 2 die Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregt. Die in Richtung der Metallschicht 3 auftretende Fluoreszenzstrahlung kann dann jeweils durch die Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 abgegeben werden, wobei sie entsprechend der Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 geschwächt wird. Bezogen auf die Intensität der Anregungsstrahlung erfolgt daher eine doppelte Schwächung der detektierbaren Intensität bzw. des entsprechenden Meßsignals durch die Abschwächungsschichten 17 bis 29. Die durch die Abschwächungsschicht 17 bis 29 abgegebene Fluoreszenzstrahlung wird dann von dem Fluoreszenzmikroskop ortsaufgelöst detektiert, so daß für jedes der Felder 4 bis 16 entsprechende, die Intensität der durch die entsprechenden Abschwächungsschichten hindurch getretenen Fluoreszenzstrahlung wiedergebende Detektionssignale erfaßt werden. Durch Analyse dieser Detektionssignale bei bekannten Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten 17 bis 29 kann so in einfacher Weise die Empfindlichkeit, die Linearität und der Dynamikbereich der Fluoreszenzmeßvorrichtung, hier des Fluoreszenzmikroskops, ermittelt werden.
Ein in 3 in einer schematischen Draufsicht gezeigter Referenzkörper 30 nach einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels in der Struktur der Metallschicht. Die anderen Schichten sind gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel unverändert, so daß für diese die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen zu diesen entsprechend auch hier gelten.
Die Metallschicht ist folgendermaßen strukturiert. In einem äußeren Rahmen 31 sind voneinander und von dem Rahmen 31 durch ein transparentes Muster 32 getrennt vier nicht transparente Bereiche 33 bis 36 angeordnet, in denen wiederum jeweils sechs Felder 37 mit Abschwächungsschichten 38 unterschiedlicher Abschwächungsschichtdicke und damit Transmission ausgebildet sind.
Der Rahmen 31 und die Bereiche 33 bis 36 ohne die Felder 37 bzw. Abschwächungsschichten 38 besitzen eine Transmission kleiner als 10^–6 und sind daher praktisch nicht transparent.
Die Schichtdicken der Abschwächungsschichten 38 in den Feldern 37 steigen, in 3 von links oben nach rechts unten, von Feld zu Feld an, so daß eine logarithmische Abstufung der Transmissionen erzielt wird. Die Dicken der Abschwächungsschichten sind so gewählt, daß der gleiche Transmissionsbereich abgedeckt wird wie im ersten Ausführungsbeispiel. Durch die größere Anzahl von Feldern 37 beziehungsweise Abschwächungsschichten 38 mit unterschiedlichem Transmissionsvermögen wird eine im wesentlichen feinere logarithmische Abstufung der Fluoreszenzintensitäten als im ersten Ausführungsbeispiel erzielt.
Die Oberseite der Metallschicht ist, wie im ersten Ausführungsbeispiel, bis auf eine Restreflektivität von 4% entspiegelt, damit eine mit üblichen Glasobjektträgern ver gleichbare Reflektivität erzielt wird. Dies ist für Autofokusvorrichtungen nützlich.
Der transparente Bereich 32, in dem keine metallische Schicht vorliegt, ermöglicht eine Prüfung der Homogenität der Fluoreszenzempfindlichkeit der Fluoreszenzmeßvorrichtung in lateraler Richtung, das heißt in Richtung der Ebene des plattenförmigen Referenzkörpers 30.
Ein in einer seitlichen Schnittansicht schematisch in 4 gezeigter Referenzkörper 39 nach einer dritten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels darin, daß die Fluoreszenzschicht 2 durch eine Trägerschicht 40 ersetzt ist, in die, in 4 von oben, fluoreszierende Materialien, zum Beispiel durch Ionenimplantation, eingebracht sind, wobei die Konzentration dieser Materialien mit zunehmendem Abstand von der der Metallschicht 3 zugewandten Oberfläche der Trägerschicht 40 abnimmt. Die Konzentration der fluoreszierenden Materialien ist dabei so gewählt, daß die effektiv fluoreszierende Schicht nur weniger als 10 μm dick ist. Die anderen Schichten sind gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel unverändert, so daß für diese die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen zu diesen entsprechend auch hier gelten.
Ein in 5 in einer schematischen seitlichen Schnittansicht gezeigter Referenzkörper 41 nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels beziehungsweise dem Referenzkörper 39 des dritten Ausführungsbeispiels dadurch, daß statt der Fluoreszenzschicht 2 beziehungsweise der Trägerschicht 40 eine formstabile, nicht fluoreszierende, transparente, planparallele Platte 42, beispielsweise aus Glas, als Trägerschicht verwendet wird, auf die eine dünne, fluoreszierende Platte 43 konstanter Dicke aufgeklebt ist. Auf die transparente Platte 42 ist eine Metallschicht mit Feldern mit Abschwächungsschichten entsprechend der Metallschicht 3 im ersten Ausführungsbeispiel aufgedampft, die daher mit demselben Bezugszeichen gekennzeichnet ist.
Die fluoreszierende Platte 43 enthält eine Mischung von fluoreszierenden Materialien, im Beispiel organischen Fluorophoren, so daß durch Anregung mit entsprechender optischer Strahlung Fluoreszenzstrahlung in einzelnen Bändern in dem Wellenlängenbereich zwischen dem UV- und dem NIR-Bereich erzeugt werden kann.
Ein in einer schematischen seitlichen Schnittansicht in 6 veranschaulichter Referenzkörper 44 nach einer fünften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 41 des vierten Ausführungsbeispiels dadurch, daß die Fluoreszenzschicht beziehungsweise fluoreszierende Platte 43 auf einer anderen Seite der Trägerschicht 42 angeordnet ist als die Metallschicht 3, die unmittelbar auf die Trägerschicht 42 aufgedampft ist.
Bei der Herstellung wird zunächst die Trägerschicht 42 mit der Metallschicht 3 bedampft. In einem folgenden Schritt wird dann die spektrale Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 mit der grob schematisch in 7 gezeigten Vorrichtung bestimmt. Diese Vorrichtung verfügt über eine Beleuchtungseinrichtung 45 mit einer Lichtquelle 46, einem Spektralfilter 47 zur Filterung des von der Lichtquelle 46 abgegebenen Lichts und einer Kollimationsoptik 48 zur Bündelung des durch den Spektralfilter 47 hindurchtretenden Lichts und einen Transmissionsdetektor 49, beispielsweise ein Spektrometer. Durch Bewegung des transparenten Trägers 42 mit der darauf angeordneten Metallschicht 3 quer zur Richtung des Lichts der Beleuchtungseinrichtung 45 kann die Transmission der Metallschicht 3 spektral- und ortsaufgelöst erfaßt werden.
Nach Ermittlung der Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 wird die transparente fluoreszierende Platte 43 mit der Trägerschicht 42 verklebt.
So wird ein Referenzkörper erhalten, für dessen Abschwächungsschichten das Transmissionsvermögen genau bekannt ist und der damit eine sehr genaue Kalibrierung erlaubt.
Ein in 8 schematisch gezeigter Referenzkörper nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper des fünften Ausführungsbeispiels nur durch die Reihefolge der Schichten, so daß die gleichen Bezugszeichen verwendet werden.
Die Fluoreszenzschicht 43, die im Beispiel eine Dicke von etwa 2 μm aufweist, ist nun nicht unmittelbar auf der Trägerschicht bzw. -platte 42 angeordnet, sondern auf der Metallschicht 3, in der in den Feldern die Abschwächungsschichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens ausgebildet sind. Die Metallschicht 3 und insbesondere die Abschwächungsschichten 17 bis 29 sind dadurch von Umwelteinflüssen abgeschirmt.
Der Referenzkörper wird wie im vorhergehenden Ausführungsbeispiel hergestellt, wobei jedoch nun die Fluoreszenzschicht 43, im Beispiel aus einem Polymer mit darin eingelagerten Quantum-Dots, auf die Metallschicht 3 und damit die Abschwächungsschichten 17 bis 29 aufgeschleudert wird, nachdem deren Transmissionsvermögen ermittelt wurde.

1: Referenzkörper
2: Fluoreszenzschicht
3: Metallschicht
4, ..., 16: Felder
17, ..., 29: Abschwächungsschicht
30: Referenzkörper
31: Rahmen
32: gemusterter Bereich
33, ..., 36: transparenter Bereich
37: Feld
38: Abschwächungsschicht
39: Referenzkörper
40: Trägerschicht
41: Referenzkörper
42: Trägerschicht
43: Fluoreszenzschicht
44: Referenzkörper
45: Beleuchtungseinrichtung
46: Lichtquelle
47: Spektralfilter
48: Kollimationsoptik
49: Transmissionsdetektor

Claims

Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzschicht (2, 40, 43), mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigstens zwei Feldern (4 bis 16, 37) mit jeweils einer über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) angeordneten Abschwächungsschicht (17 bis 29, 38), die für von der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) in den Feldern voneinander unterscheiden.
Referenzkörper nach Anspruch 1, bei dem die Transmission der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) zwischen 10^–5 und 0, 5 liegt.
Referenzkörper nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Verhältnis der Transmission der Abschwächungsschicht (17) größten Transmissionsvermögens zu der Transmission der Abschwächungsschicht kleinsten Transmissionsvermögens (29) größer als 10⁴ ist.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mehr als zwei jeweils in verschiedenen Feldern (4 bis 16, 37) angeordnete Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) angeordnet sind, deren Transmissionen relativ zueinander logarithmisch abgestuft sind.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) von der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) abgegebene Fluoreszenzstrahlung absorbieren.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem sich wenigstens zwei der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) in ihrer Schichtdicke unterscheiden.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigstens eine der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) aufgedampft ist.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigsten eine der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) eine Metallschicht ist.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) auf wenigstens einer Seite entspiegelt sind.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der ein Bereich zwischen den Feldern (4 bis 16, 37) im wesentlichen nicht transparent ist.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Bereich (32) zwischen wenigstens zwei Feldern (37) oder entlang wenigstens eines der Felder (37) transparent ist.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2, 40) eine formstabile Trägerschicht bildet.
Referenzkörper nach einem der der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Fluoreszenzschicht (43) auf einer formsta bilen, im wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägerschicht (42) angeordnet ist.
Referenzkörper nach Anspruch 13, bei dem die nicht fluoreszierende Trägerschicht (42) transparent ist und auf ihr die Abschwächungsschichten (17 bis 29) aufgebracht sind.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzschicht in Richtungen parallel zu der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) homogen sind.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) die Form einer planparallelen Platte hat.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) so ausgebildet ist, daß die Fluoreszenz aus einer aktiven Schicht kleiner als 2 μm abgestrahlt wird.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (43) wenigstens ein organisches Fluorophor enthält.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (40) fluoreszierend wirkende Ionen enthält.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2) fluoreszierend wirkende Quantum-Dots enthält.
Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (43) wenigstens zwei verschiedene fluoreszierende Materialien enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Referenzkörpers für Fluoreszenzmessungen, bei dem eine Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) hergestellt wird, mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und in wenigstens zwei verschiedenen Feldern (4 bis 16, 37) jeweils eine für von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparente Abschwächungsschicht (17 bis 29, 38) hergestellt wird, so daß sich die Transmission der Abschwächungsschichten in den verschiedenen Feldern voneinander unterscheiden, wobei die Abschwächungsschichten über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem wenigstens eine der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) aufgedampft wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, bei dem die Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) auf eine formstabile, im wesentlichen nicht fluoreszierende, transparente Trägerschicht (42) aufgebracht werden, die Transmissionen der Abschwächungsschichten (17 bis 29) ermittelt werden, und danach auf die Trägerschicht (42) die Fluoreszenzschicht (43) aufgebracht wird.