WO2006037472A1 - Referenzkörper für fluoreszenzmessungen und verfahren zur herstellung desselben - Google Patents

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WO2006037472A1
WO2006037472A1 PCT/EP2005/010193 EP2005010193W WO2006037472A1 WO 2006037472 A1 WO2006037472 A1 WO 2006037472A1 EP 2005010193 W EP2005010193 W EP 2005010193W WO 2006037472 A1 WO2006037472 A1 WO 2006037472A1
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reference body
fluorescence
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fluorescent
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PCT/EP2005/010193
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Peter Westphal
Daniel Bublitz
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Carl Zeiss Microimaging Gmbh
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Publication date
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    • G01N21/645Specially adapted constructive features of fluorimeters
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Definitions

  • the present invention relates to a reference body for fluorescence measurements and a method for the production thereof.
  • Fluorescence or luminescence measurements can be used to determine in a sample the presence of fluorescent or luminescent substances and in particular also the amount of these substances in the examined spatial area of the sample.
  • a typical application for such fluorescence measurements is the examination of biological or biochemical samples, for example, in which samples are introduced with substances containing fluorophores, which couple only to specific target molecules. After removal of unbound fluorophores, the samples thus prepared can be examined by means of suitable fluorescence measuring devices, in particular so-called biochip readers, the detected fluorescence radiation providing information about the presence of target molecules with fluorophores bound thereto and ideally also about the concentration of the target molecules.
  • fluorescence standards which have known fluorescence properties, ie.
  • fluorescence radiation having defined spatial, spectral and / or intensity-related properties is emitted.
  • An investigation of such reference samples with a fluorescence or luminescence measuring device allows an evaluation of the sensitivity, linearity and dynamics of the fluorescence or luminescence measuring device used.
  • US Pat. No. 004/005243 A1 describes a carrier with a layer of a fluorescent material which can be structured to examine imaging properties of a fluorescence measuring apparatus so that a mask is not necessary.
  • flat cuvettes having a height of, for example, a few ⁇ m can be filled with a fluorophore solution as reference samples.
  • a variation of the fluorescence intensity emitted by such a reference sample is possible by a variation of the concentration of the fluorophore solution introduced into the cuvettes.
  • a disadvantage of such reference samples is that the fluorophores are usually not long-term stable and bleach relatively quickly upon irradiation.
  • the fluorescence intensity depends on the height or thickness of the liquid or fluorophore solution layer in the cuvette, so that the fluorescence intensity can not be specified very precisely.
  • a known possibility for producing such fluorescence standards is to bring fluorophores, for example Cy3 or Cy5, into aqueous solution and to prepare a series of dilutions.
  • the dissolved fluorophores are then applied dropwise to suitable carriers, for example slides, and dried.
  • suitable carriers for example slides, and dried.
  • the drop volumes used here and also the diameters of the dried drops are constant, there are obtained supports having fluorophore coverage densities which are proportional to the fluorophore concentration in the liquid.
  • the drop volume and diameter vary greatly, so that the proportionality no longer exists.
  • the fluorophores used even when cooled, are usually not stable over a long period of time and bleach out relatively quickly.
  • fluorescence standards can be obtained by arranging polymer layers containing fluorophores on a support.
  • US 2004/005243 A1 describes a support provided for calibration, to which a layer of a fluorescence coating is applied.
  • decorative material of constant or varying thickness.
  • DE 12 00 865 A1 discloses a device for referencing fluorescence signals and / or for calibrating fluorescence detection systems, which has a substantially non-fluorescent carrier, with fluorescent polymer layers in part in several defined areas of varying thickness and / or composition are applied.
  • DE 201 04 445 U1 and DE 201 04 446 U1 describe a fluorescence standard which is produced by applying to a support a plastic dispersion with a fluorophore, which is then cured.
  • reference samples with polymer-fluorophore layers applied to a support which have different thicknesses and / or different fluorophore concentrations, have the disadvantage that the fluorophores bleach with frequent use.
  • the calibration of bio-chip readers which have a very large dynamic range, requires reference samples, by means of which fluorescence radiation of greatly differing fluorescence intensity can be generated.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a reference sample for fluorescence measurements. provide, by means of which in fluorescences with predetermined optical radiation reproducibly fluorescence radiation un ⁇ different pluoreszenzintensticianen can be generated, and to provide a method for producing the reference sample.
  • the object is achieved by a reference body for fluorescence measurements with a fluorescence layer, by means of which fluorescence radiation can be emitted in the case of optical irradiation, and with at least two fields each having an attenuation layer arranged above and / or below the fluorescence layer Fluorescent layer dealtgebe ⁇ ne fluorescence radiation is partially transparent, with the transmissivity of the attenuation layers in the fields differ from each other.
  • the object is further achieved by a method for producing a reference body according to the invention for fluorescence measurements, in which a fluorescent layer is produced, by means of which fluorescence radiation can be emitted upon optical irradiation, and in at least two different fields one each for fluorescence
  • the transmissivity of the attenuation layers in the various fields differs from each other, the attenuation layers being arranged above and / or below the fluorescence layer.
  • the attenuation layers can be produced before, simultaneously with or after the fluorescent layer.
  • a reference body according to the invention is used, wherein optical excitation radiation is radiated into the fluorescence layer and corresponding fluorescence radiation passing through the attenuation layers is detected in a field-resolved manner.
  • the sensitivity, the linearity and the dynamic range of the fluorescence measuring device can then be evaluated given known transmission of the attenuation layers.
  • the transmittance of the Abschwumbleungsschich ⁇ th is preferably known and particularly preferred for interesting types of fluorescence meter specified.
  • Attenuating layers of different transmissivity can be produced simply and precisely over a wide range of different transmission powers, so that a reference body which can be produced at low cost is provided, with which very accurately different fluorescence radiation intensities can also be generated over a larger intensity range.
  • the fluorescence excitation can be done in transmitted light or reflected light.
  • the transmission of an attenuation layer can be selected as desired, as long as it is at least partially transparent for the fluorescence radiation, ie, as long as the transmission is less than 1 and preferably greater than about 10 s .
  • the transmission of the attenuation layers is preferably between ICT 5 and 0.5 in the case of the inventive reference bodies.
  • the ratio of the transmission of the attenuation layer of greatest transmissivity to the transmission of the attenuation layer of the smallest transmissivity is greater than 10 4 .
  • Attenuation layers are arranged above and / or below the fluorescent layer in the inventive reference body ⁇ orders whose transmissions are graded logarith ⁇ relative to each other.
  • the weakening layers in the individual fields can basically be formed from the same or different materials. In addition, they may be interconnected in the areas between the fields or separated by these areas.
  • the transmissivity of the attenuating layers can basically be adjusted in various ways.
  • the reflectivity of the attenuation layers for fluorescence radiation can be varied.
  • the attenuation layers absorb fluorescent radiation emitted by the fluorescent layer. The absorption of an attenuation layer in the production of the same is easier to vary over a wide range than their reflectivities.
  • the material of the attenuation layer can be changed.
  • at least two of the attenuation layers should differ in their layer thickness.
  • a variation of the transmittance by variation of the layer thickness of the attenuation layers preferably when using the same material for the attenuation layers, has the advantage that the transmissivity depends exponentially on the thickness of the layer, so that by simple variation of the layer thickness the Ab ⁇ weakening layers a large transmission range can be till ⁇ covers.
  • layers of given thickness can be produced very simply and accurately.
  • the production of the layers can be carried out using any method for producing a layer.
  • inventive methods for producing a layer.
  • the attenuation layer can be applied to a carrier layer or the fluorescent layer. With this method, the layer thicknesses of the attenuation layers can be controlled particularly precisely.
  • the material of the attenuation layers may in principle be chosen differently for each attenuation layer.
  • at least one of the attenuation layers is preferably a metal layer.
  • Metal layers show with respect to the optical properties, in particular the absorption for optical radiation, and the production, for example by Auf ⁇ vapor, great advantages over other materials such as polymers.
  • any metals can be used, but the metal layer is preferably a chromium layer or titanium layer, since chromium and titanium have good adhesive properties on typical support materials.
  • An inventive reference body can be designed for use with transmitted light and / or incident light.
  • the sample is frequently irradiated with excitation light in reflected light illumination, which is why reflective properties of the reference body are often undesirable.
  • the attenuation layers are preferably non-reflective on at least one side, preferably the side facing away from the fluorescent layer. Their reflectivity is preferably less than 10%, more preferably less than 4%.
  • the reference body according to the invention is preferably substantially non-transparent in an area between the fields. This means that the transmission in this range is preferably less than 10.sup.- 6 . By means of this embodiment, a clear demarcation between the various fields can be achieved.
  • the reference body according to the invention is preferably in an area between at least two fields or along at least one of the fields transparent.
  • the reference body is preferably dimensionally stable.
  • the reference body according to the invention may have a dimensionally stable carrier layer.
  • the carrier layer, the fluorescent layer and the attenuation layers can be formed and arranged in different ways.
  • the fluorescent layer preferably forms a form-stable carrier layer.
  • a layer of glass with incorporated “quantum dots”, that is to say fluorescent semiconductor nanoparticles, preferably of cadmium sulfide, zinc selenide, cadmium telluride or mercury selenide may be used as the carrier layer, and may preferably be formed as a carrier plate.
  • the fluorescent layer is arranged on a dimensionally stable, substantially non-fluorescent carrier layer. In particular, it can be applied directly to the carrier layer, which may be designed in particular as a carrier plate.
  • glass can be used as the carrier material, while as the fluorescent layer, for example, a polymer containing "quantum dots", such as PMMA, is spin-coated onto the carrier. Alternatively, it is also possible to stick the fluorescent layer onto the carrier layer.
  • the attenuation layer can be arranged on the fluorescent layer arranged on the carrier layer.
  • the non-fluorescent carrier layer is transparent and the attenuation layers are applied to it.
  • This arrangement of the attenuation layers makes it possible to determine or to control their, preferably spectral, transmittance during the production of the reference body.
  • the attenuation layers are preferably applied to a dimensionally stable, substantially non-fluorescent, transparent carrier layer, the transmissions of the attenuation layers are determined, and then the fluorescent layer is applied to the carrier layer.
  • the carrier layer preferably forms a carrier plate.
  • the attenuation layers between the carrier layer and the fluorescent layer are particularly preferably arranged.
  • the attenuation coated the fluorescent layer on the attenuation layer after the determination of the transmission, the attenuation coated the fluorescent layer on the attenuation layer.
  • the fluorescent layer and the carrier layer thus form a protection of the optionally not very robust attenuation layers against mechanical damage and other environmental influences.
  • the excitation light is irradiated into the transparent support layer.
  • the intensity of the fluorescence emitted by the reference body upon excitation with optical excitation radiation depends not only on the layer thicknesses and materials of the attenuation layers, but also on the properties of the fluorescent layer, in particular its layer thickness and the concentration of the fluorescence contained therein Fabrics, off.
  • the fluorescence properties of the fluorescence layer are preferably homogeneous in directions parallel to the fluorescence layer. This can preferably be achieved by homogeneously distributing a fluorescent substance or substances which give the fluorescent layer its fluorescent properties in the directions parallel to the fluorescent layer.
  • the fluctuations in the concentration of the fluorescent substance or of the fluorescent substances in directions parallel to the fluorescent layer by the fluorescence radiation onto which attenuation layers are irradiated, ie parallel to their surface, are preferably less than 5%.
  • the concentration of fluorescent substances in the fluorescent layer can in principle be chosen arbitrarily. Preferably, the maximum possible concentration is selected, at which no mutual deletion of the fluorescence occurs.
  • the fluorescence layer preferably has the form of a plane-parallel plate in the reference body according to the invention.
  • the thickness of the fluorescent layer can in principle be chosen arbitrarily.
  • the fluorescent layer is formed so that the fluorescence is emitted from an active layer less than 2 microns.
  • the thickness of such a layer is thus smaller than the depth of field of ty ⁇ pischer fluorescence, so that it can be completely and sharply demarcated imaged.
  • the fluorescent layer does not simultaneously constitute a carrier layer
  • its thickness may preferably be selected to be smaller than 10 ⁇ m, in particular smaller than 2 ⁇ m.
  • the fluorescent effect of the fluorescent layer can be achieved in the inventive reference body in any desired manner.
  • the fluorescent layer contains at least one organic fluorophore. This allows one to For a given application suitable fluorophore from the large number of available organic fluorophor aus ⁇ select.
  • fluorophores can be selected which are also used in the investigation of biological samples.
  • the fluorophore is particularly preferably selected from the group NileBlue, Cy3, Cy5, Cy7, fluorescein and rhodamine.
  • the fluorescent layer contains fluorescing ions. These may in particular be ions of heavy metals and / or rare earths, preferably in colored glasses. Such fluorescent layers are distinguished by a particularly high stability.
  • the fluorescent layer contains fluorescent quantum dots.
  • These may be fluorescent semiconductor nanoparticles of cadmium sulfide, zinc selenide, cadmium selenide or mercury telluride.
  • Such quantum dots are characterized by a particularly high fluorescence yield.
  • the encapsulation of the quantum dots in a matrix material of the fluorescent layer makes it possible to prevent oxidation and fading of the quantum dots.
  • the fluorescent layer of a reference body according to the invention can in principle be designed only for optical excitation radiation of a predetermined excitation wavelength and a corresponding fluorescence wavelength of the fluorescence radiation excited thereby.
  • optical radiation In this case, infrared radiation, visible light and UV light are understood.
  • the mentioned transmission of the attenuation layers is given at the corresponding, predefined fluorescence wavelength.
  • the transmission of metallic attenuation layers is generally dependent on the radiation wavelength, which must be taken into account when using the reference body.
  • the fluorescent layer preferably contains at least two different fluorescent materials. These preferably have different fluorescence spectra from one another.
  • the reference bodies according to the invention are suitable, in particular, for the calibration of bio-chip readers.
  • FIG. 1 shows a schematic plan view of a reference body for fluorescence measurements according to a first preferred embodiment of the invention
  • FIG. 2 shows a schematic lateral sectional view of the reference body from FIG.
  • FIG. 3 is a schematic plan view of a Referenzk ⁇ r ⁇ per according to a second preferred embodiment of the invention.
  • FIG. 4 is a schematic side sectional view of a reference body according to a third preferred embodiment of the invention Aus ⁇ ,
  • FIG. 7 shows a schematic representation of a device for determining the transmission of fields with attenuation layers of the reference body from FIG. 6 during its production
  • FIG. 8 is a schematic side sectional view of a reference body according to a sixth preferred embodiment of the invention.
  • a reference body 1 for fluorescence measurements comprises a fluorescence layer 2 serving as a dimensionally stable carrier layer and a metal layer 3 arranged above it, which is typically, and more particularly in the example, thinner than 1 ⁇ m.
  • the fluorescent layer 2 has the dimensions of a conventional object carrier and in particular the shape of a plane-parallel plate. It is made of glass with embedded therein fluorescent materials. In the example, a colored glass is used which receives its fluorescent properties by incorporating ions of heavy metals and / or rare earths. In another preferred embodiment, instead of the ions, quantum dots can be incorporated in the fluorescent layer. In yet another embodiment, the fluorescent layer 2 may be provided by a dimensionally stable, through-colored plastic plate containing appropriate fluorophores. The base material of the fluorescent layer, ie the glass (or alternatively plastic), is so strongly absorbing for the fluorescence radiation that the fluorescence radiation is substantially Lent only from a very thin layer of less than 10 microns thickness is emitted.
  • the metal layer 3 has fields 4 to 16, in which the thickness of the metal layer 3 is reduced to different degrees. As a result, weakening layers 17 to 29 are formed in each of the fields 4 to 16, the thickness of which increases beginning with field 4 from field to field up to field 16.
  • the thickness of the metal layer 3 is selected so that the transmission of the attenuating layers takes 17 to 29 values between 0.5 and 10 "6 in a logarithmic Stu ⁇ evaporation.
  • the attenuating layers 17 are to 29 in the fields 4 to 16 by the remaining Regions of the metal layer 3, which have a transmission less than 10 "6 and therefore are to be regarded as non-transparent, separated from each other, so that fluorescence radiation from one of the attenuation layers does not penetrate into the region of a neighboring be ⁇ field.
  • the outer surface of the metal layer 3 is antireflected, with the exception of a residual reflectivity of 4%, so that a reflectivity comparable to conventional glass slides is achieved. This is useful for auto focus devices.
  • the reference body 1 can be easily manufactured by firstly preparing the fluorescent layer 2. This is then vapor-deposited with a corresponding metal, in example chromium, wherein the predetermined height profile shown in FIG. 2 is produced by using corresponding masks. In FIG. 2, the predetermined layer thicknesses, in particular those of the attenuation layers, are drawn disproportionately thick for the sake of better visibility.
  • a fluorescence measuring device for example a fluorescence microscope.
  • optical excitation radiation is radiated onto the reference body 1, which penetrates the metal layer 3 and in particular also the attenuation layers 17 to 29 under weakening and excites the emission of fluorescence radiation in the fluorescence layer 2.
  • the fluorescence radiation which occurs in the direction of the metal layer 3 can then be emitted in each case through the attenuation layers 17 to 29 in the fields 4 to 16, wherein it is weakened in accordance with the transmission of the attenuation layers 17 to 29. With respect to the intensity of the excitation radiation, the attenuation layers 17 to 29 therefore attenuate twice the detectable intensity or the corresponding measurement signal.
  • the fluorescence radiation emitted by the attenuation layer 17 to 29 is then detected spatially resolved by the fluorescence microscope, so that corresponding to each of the fields 4 to 16, the detection of the intensity of the fluorescence radiation passing through the respective attenuation layers reproducing detection signals are detected.
  • a reference body 30 shown in a schematic plan view in FIG. 3 according to a second preferred embodiment of the invention differs from the reference body 1 of the first exemplary embodiment in the structure of the metal layer.
  • the other layers are opposite unchanged in the first embodiment, so that the same reference numerals are used for die ⁇ se and the Er ⁇ explanations to these apply accordingly also here.
  • the metal layer is structured as follows. In an outer frame 31, four non-transparent regions 33 to 36 are arranged separated from each other and from the frame 31 by a transparent pattern 32, in each of which six fields 37 with attenuation layers 38 of different attenuation layer thickness and thus transmission are formed.
  • the frame 31 and the regions 33 to 36 without the fields 37 or attenuation layers 38 have a transmission smaller than ICT 6 and are therefore practically not transparent.
  • the layer thicknesses of the attenuation layers 38 in the fields 37 increase, from top left to bottom right in FIG. 3, from field to field, so that a logarithmic gradation of the transmissions is achieved.
  • the thicknesses of the attenuation layers are selected such that the same transmission range is covered as in the first exemplary embodiment. Due to the larger number of fields 37 or attenuation layers 38 with different transmissivity, a substantially finer logarithmic grading of the fluorescence intensities is achieved than in the first exemplary embodiment.
  • the upper side of the metal layer is de-mirrored to a residual reflectivity of 4%, so that a glass slide with conventional glass slides is used. equivalent reflectivity is achieved. This is useful for autofocus devices.
  • the transparent region 32 in which no metallic layer is present makes it possible to test the homogeneity of the fluorescence sensitivity of the fluorescence measuring device in the lateral direction, that is to say in the direction of the plane of the plate-shaped reference body 30.
  • a reference body 39 shown schematically in a lateral sectional view in FIG. 4 according to a third preferred embodiment of the invention differs from the reference body 1 of the first exemplary embodiment in that the fluorescent layer 2 is replaced by a carrier layer 40 into which, in FIG. 4, from above, fluorescent materials are introduced, for example by ion implantation, the concentration of these materials decreasing as the distance from the metal layer 3 facing the surface of the carrier layer 40 increases.
  • the concentration of the fluorescent materials is chosen so that the effective fluorescent layer is only less than 10 microns thick.
  • the other layers are unchanged from the first embodiment, so that the same reference numerals are used for them and the explanations on these also apply accordingly.
  • a reference body 41 shown in a schematic lateral sectional view in FIG. 5 according to a fourth preferred embodiment of the invention differs from the reference body 1 of the first exemplary embodiment or the reference body 39 of the third exemplary embodiment in that instead of the fluorescent layer 2 be ⁇ as the support layer 40 is a dimensionally stable, not fluorescent, transparent, plane-parallel plate 42, for example made of glass, is used as a carrier layer, to which a thin, fluorescent plate 43 of constant thickness is glued. On the transparent plate 42, a metal layer with fields with attenuation layers corresponding to the metal layer 3 in the first embodiment is vapor-deposited, which is therefore marked with the same reference character.
  • the fluorescent plate 43 contains a mixture of fluorescent materials, in the example organic fluorophores, so that fluorescence radiation in individual bands in the wavelength range between the UV and the NIR range can be generated by excitation with appropriate optical radiation.
  • a reference body 44 illustrated in a schematic lateral sectional view in FIG. 6 according to a fifth preferred embodiment of the invention differs from the reference body 41 of the fourth embodiment in that the fluorescent layer or fluorescent plate 43 is disposed on another side of the carrier layer 42 is arranged as the metal layer 3, which is vapor-deposited directly onto the carrier layer 42.
  • the carrier layer 42 is first vapor-deposited with the metal layer 3.
  • the spectral transmission of the Abschwownungs ⁇ layers 17 to 29 in the fields 4 to 16 is then determined with the roughly schematically shown in Figure 7 device.
  • This device has an illumination device 45 with a light source 46, a spectral filter 47 for filtering the light emitted by the light source 46 and a collimating optics 48 for focusing the light passing through the spectral filter 47 and a transmission detector 49, for example a spectrometer.
  • a transmission detector 49 for example a spectrometer.
  • the transparent fluorescent plate 43 is glued to the carrier layer 42 ver ⁇ .
  • a reference body schematically shown in FIG. 8 according to a sixth preferred embodiment of the invention differs from the reference body of the fifth embodiment only in the sequence of the layers, so that the same reference numerals are used.
  • the fluorescent layer 43 which in the example has a thickness of approximately 2 .mu.m, is now not arranged directly on the carrier layer or plate 42, but rather on the metal layer 3 in which the weakening layers have different transmissivity in the fields it ⁇ forms are.
  • the metal layer 3 and in particular the attenuation layers 17 to 29 are thereby shielded from environmental influences.
  • the reference body is produced as in the preceding exemplary embodiment, but now the fluorescent layer 43, in the example of a polymer with incorporated quantum dots, is spin-coated onto the metal layer 3 and thus the attenuation layers 17 to 29, after the latter Transmittance was determined.

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Abstract

Ein Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen umfaßt eine Fluoreszenzschicht (2) , mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigstens zwei Feldern mit jeweils einer über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2) angeordneten Abschwächungsschicht (17 bis 29), die für von der Fluoreszenzschicht (2) abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten (17 bis 29) in den Feldern voneinander unterscheiden.

Description

REFERENZKÖRPER FÜR FLUORESZENZMESSUNGEN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DESSELBEN
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Referenz¬ körper für Fluoreszenzmessungen und ein Verfahren zur Her¬ stellung desselben.
Fluoreszenz- oder Lumineszenzmessungen können dazu verwen¬ det werden, in einer Probe das Vorhandensein von fluores¬ zierenden beziehungsweise lumineszierenden Substanzen und insbesondere auch die Menge dieser Substanzen in dem unter¬ suchten Raumbereich der Probe festzustellen. Ein typischer Anwendungsfall für solche Fluoreszenzmessungen stellt die Untersuchung biologischer beziehungsweise biochemischer Proben dar, bei der beispielsweise in Proben Substanzen mit Fluorophoren eingebracht werden, die nur an bestimmte Ziel- moleküle ankoppeln. Nach Entfernen nicht gebundener Fluo- rophore können die so präparierten Proben mittels geeigne¬ ter Fluoreszenzmeßgeräte, insbesondere sogenannter Bio- Chip-Reader, untersucht werden, wobei die detektierte Fluo¬ reszenzstrahlung Auskunft über das Vorhandensein von Ziel- molekülen mit daran gebundenen Fluorophoren und idealerwei¬ se auch über die Konzentration der Zielmoleküle gibt .
Um quantitativ verläßliche Ergebnisse erhalten zu können, ist es notwendig, Aussagen über die Detektionseigenschaften des verwendeten Fluoreszenz- beziehungsweise Lumineszenz¬ meßgeräts zu erhalten. Neben rein optischen Abbildungsei¬ genschaften solcher Meßgeräte, beispielsweise dem Auflö¬ sungsvermögen, kommt der Empfindlichkeit der Meßgeräte für die verwendete Fluoreszenzstrahlung, der Linearität, das heißt genauer der Linearität der Abhängigkeit der Größe der Detektionssignale von der Intensität der Fluoreszenzstrah- lungsintensität, und der Dynamik der verwendete Meßgeräte, das heißt der Größe des Bereichs zwischen minimal und maxi¬ mal detektierbaren Fluoreszenzstrahlungsintensitäten, be¬ sondere Bedeutung zu.
Zur Ermittlung oder Prüfung dieser Eigenschaften können auch als Fluoreszenzstandards bezeichnete Referenzproben verwendet werden, die bekannte Fluoreszenzeigenschaften be¬ sitzen, d.h. bei Bestrahlung mit optischer Anregungsstrah¬ lung vorgegebener Anregungsintensität Fluoreszenzstrahlung mit definierten räumlichen, spektralen und/oder Intensi¬ tätsbezogenen Eigenschaften abgeben. Eine Untersuchung sol¬ cher Referenzproben mit einem Fluoreszenz- beziehungsweise Lumineszenzmeßgerät gestattet eine Bewertung der Sensitivi- tät, Linearität und Dynamik des verwendeten Fluoreszenz¬ bzw. Lumineszenzmeßgeräts.
Die Eigenschaften solcher Referenzproben sollen sich im Laufe der Zeit oder auch in Abhängigkeit von der Anzahl der Messungen an der Referenzprobe nicht oder nur unwesentlich verändern. Solche Veränderungen können aber sehr leicht auftreten, wenn sich die geometrische Form der Referenzpro¬ be ändert oder eine signifikante Änderung der Fluoreszenz¬ eigenschaften durch Ausbleichen, insbesondere bei wieder¬ holter Verwendung, oder Lagerung auftritt.
In US 6,472,671 wird zur Bewertung optischer Abbildungsei¬ genschaften eines Fluoreszenzmeßgeräts vorgeschlagen, ein Kalibrierwerkzeug zu verwenden, das auf einer festen, nicht transparenten Trägerplatte eine dünne Schicht fester Fluo- rophore besitzt, wobei die Trägerplatte teilweise durch ei¬ ne strukturierte, nicht transparente Maske abgedeckt ist. In die Maske, bei der es sich um eine dünne Metallschicht handeln kann, ist ein Muster mit feinen Strukturen bis hin¬ unter in den Bereich von 0,5 μm eingeätzt. Da die Schicht mit festen Fluorophoren eine jeweils konstante Dicke auf¬ weist, ist das beschriebene Kalibrierwerkzeug nicht zur Un¬ tersuchung der Linearität und des Dynamikbereichs eines Fluoreszenzmeßgerät geeignet.
In US 004/005243 Al ist ein Träger mit einer Schicht eines fluoreszierenden Materials beschrieben, die zur Untersu¬ chung von Abbildungseigenschaften eines Fluoreszenzmeßge¬ räts strukturiert sein kann, so daß eine Maske nicht not¬ wendig ist .
Zur Untersuchung der Empfindlichkeit, der Linearität und/oder des Dynamikbereichs von Fluoreszenzmeßgeräten sind Referenzproben bzw. Fluoreszenzstandards verschiedener Art bekannt .
Beispielsweise können als Referenzproben flache Küvetten mit einer Höhe von beispielsweise wenigen μm mit einer FIu- orophorlösung gefüllt werden. Eine Variation der von einer solchen Referenzprobe abgegebenen Fluoreszenzintensität ist durch eine Variation der Konzentration der in die Küvetten eingefüllten Fluorophorlösung möglich. Ein Nachteil solcher Referenzproben besteht darin, daß die Fluorophore in der Regel nicht langzeitstabil sind und bei Bestrahlung relativ schnell ausbleichen. Zudem ist es schwierig, Küvetten mit genau definierter Höhe reproduzierbar zu präparieren. Von der Höhe bzw. Dicke der Flüssigkeits- beziehungsweise Fluo- rophorlösungsschicht in der Küvette hängt jedoch die Fluo¬ reszenzintensität ab, sodaß die Fluoreszenzintensität nicht sehr genau vorgegeben werden kann. Alternativ wurde vorgeschlagen, Trägerschichten mit Schich¬ ten zu belegen, die Fluorophore enthalten.
In US 6,471,916 ist beschrieben, Träger mit Bereichen un¬ terschiedlicher Fluorophorkonzentration als Fluoreszenz¬ standard zu verwenden. Es wird jedoch nicht angegeben, wie diese hergestellt werden können.
Eine bekannte Möglichkeit zur Herstellung solcher Fluores¬ zenzstandards besteht darin, Fluorophore, beispielsweise Cy3 oder Cy5 in wäßrige Lösung zu bringen und eine Verdün¬ nungsreihe zu erstellen. Die gelösten Fluorophore werden dann tröpfchenweise auf geeignete Träger, beispielsweise Objektträger, aufgebracht und eingetrocknet. Unter der Vor¬ aussetzung, daß die dabei verwendeten Tropfenvolumina und auch die Durchmesser der eingetrockneten Tropfen konstant sind, erhält man Träger mit Fluorophor-Belegungsdichten, die der Fluorophorkonzentration in der Flüssigkeit propor¬ tional sind. In der Praxis variieren allerdings die Trop¬ fenvolumina- und Durchmesser stark, so daß die Proportiona¬ lität nicht mehr gegeben ist . Darüber hinaus bilden sich beim Eintrocknen häufig sehr inhomogene Fluorophor- Belegungen. Schließlich sind die verwendeten Fluorophore auch gekühlt meist nicht langzeitstabil und bleichen rela¬ tiv schnell aus.
Fluoreszenzstandards können alternativ dadurch erhalten werden, daß auf einem Träger Polymerschichten mit darin enthaltenen Fluorophoren angeordnet werden.
So ist in US 2004/005243 Al ein zur Kalibrierung vorgesehe¬ ner Träger beschrieben, auf den eine Schicht eines fluores- zierenden Materials mit konstanter oder variierender Dicke aufgebracht ist .
In DE 12 00 865 Al ist eine Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder zur Kalibrierung von Fluo- reszenzdetektionssystemen offenbart, die einen im wesentli¬ chen nicht fluoreszierenden Träger besitzt, auf den in meh¬ reren definierten Bereichen fluoreszierende Polymerschich¬ ten mit zum Teil unterschiedlicher Dicke und/oder Zusammen¬ setzung aufgebracht sind.
In DE 201 04 445 Ul und DE 201 04 446 Ul ist ein Fluores¬ zenzstandard beschrieben, der dadurch hergestellt wird, daß auf einen Träger eine Kunststoffdispersion mit einem Fluo- rophor aufgebracht wird, die dann ausgehärtet wird.
Referenzproben mit auf einen Träger aufgebrachten Polymer- Fluorophor-Schichten, die unterschiedliche Dicken und/oder unterschiedliche Fluorophorkonzentrationen aufweisen, haben jedoch den Nachteil, daß die Fluorophore bei häufiger Ver¬ wendung ausbleichen. Darüber hinaus erfordert die Kalibrie¬ rung von Bio-Chip-Readern, die einen sehr großen Dynamikbe¬ reich aufweisen, Referenzproben, mittels derer Fluoreszenz¬ strahlung stark unterschiedlicher Fluoreszenzintensität er¬ zeugt werden kann. Durch Variation der Dicken der Fluo¬ rophore enthaltenden Schichten und/oder der Fluorophorkon¬ zentrationen in solchen Schichten kann die erforderliche Variation der Fluorophormenge in dem untersuchten Bereich und damit der Fluoreszenzintensität jedoch nicht ohne wei¬ teres erreicht werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrun¬ de, eine Referenzprobe für Fluoreszenzmessungen bereitzu- stellen, mittels derer bei Beleuchtungen mit vorgegebener optischer Strahlung reproduzierbar Fluoreszenzstrahlung un¬ terschiedlicher Pluoreszenzintensitäten erzeugt werden kann, und ein Verfahren zur Herstellung der Referenzprobe anzugeben.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen Referenzkörper für Flu¬ oreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzschicht, mittels de¬ rer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigsten zwei Feldern mit jeweils einer über und/oder unter der Fluoreszenzschicht angeordneten Abschwä- chungsschicht, die für von der Fluoreszenzschicht abgegebe¬ ne Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten in den Feldern voneinander unterscheiden.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Referenzkörpers für Fluoreszenzmessungen, bei dem eine Fluoreszenzschicht her¬ gestellt wird, mittels derer bei optischer Bestrahlung Flu¬ oreszenzstrahlung abgebbar ist, und in wenigsten zwei ver¬ schiedenen Feldern jeweils eine für von der Fluoreszenz¬ schicht abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparente Abschwächungsschicht hergestellt wird, so daß sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten in den verschiedenen Feldern voneinander unterscheiden, wobei die Abschwächungsschichten über und/oder unter der Fluoreszenz¬ schicht angeordnet sind. Je nach Reihenfolge und Art der Schichten können dabei die Abschwächungsschichten vor, gleichzeitig mit oder nach der Fluoreszenzschicht herge¬ stellt werden. Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prüfung und/oder Kalibrierung einer Fluoreszenzmeßvorrichtung wird ein er¬ findungsgemäßer Referenzkörper verwendet, wobei optische Anregungsstrahlung in die Fluoreszenzschicht gestrahlt und entsprechende, durch die Abschwächungsschichten hindurch¬ tretende Fluoreszenzstrahlung aufgelöst nach Feldern detek- tiert wird.
Durch Analyse der Meßergebnisse kann dann bei bekannter Transmission der Abschwächungsschichten die Empfindlich¬ keit, die Linearität und der Dynamikbereich der Fluores¬ zenzmeßvorrichtung bewertet werden.
Erfindungsgemäß erfolgt also eine Variation der Fluores¬ zenzintensitäten in erster Linie durch die Abschwächungs¬ schichten, die unterschiedliche Transmissionsvermögen auf¬ weisen. Das Transmissionsvermögen der Abschwächungsschich¬ ten ist vorzugsweise bekannt und besonders bevorzugt für interessante Typen von Fluoreszenzmeßgerät vorgegeben. Dies hat den Vorteil, daß die Fluoreszenzschicht sehr einfach hergestellt werden kann und insbesondere keine Variation der Dicke und/oder der Konzentration darin enthaltener flu¬ oreszierender Materialien notwendig ist. Abschwächungs¬ schichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens sind ü- ber einen großen Bereich verschiedener Transmissionsvermδ- gen einfach und genau herstellbar, so daß ein kostengünstig herstellbarer Referenzkörper bereitgestellt wird, mit dem sehr genau verschiedene Fluoreszenzstrahlungsintensitäten auch über einen größeren Intensitätsbereich erzeugt werden können. Die Fluoreszenzanregung kann im Durchlicht oder im Auflicht erfolgen. Grundsätzlich kann die Transmission einer Abschwächungs- schicht beliebig gewählt sein, solange diese wenigstens für die Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, d.h. solange die Transmission kleiner als 1 und vorzugsweise größer als etwa 10~s ist. Um eine Prüfung oder Kalibrierung auch von Bio-Chip-Readern zu gestatten, liegt bei den erfindungsge¬ mäßen Referenzkörpern die Transmission der Abschwächungs- schichten bevorzugt zwischen ICT5 und 0,5.
Dabei ist es besonders bevorzugt, daß das Verhältnis der Transmission der Abschwächungsschicht größten Transmissi- onsvermδgens zu der Transmission der Abschwächungsschicht kleinsten Transmissionsvermögens größer als 104 ist. Eine solche Gestaltung ermöglicht eine Kalibrierung über einen entsprechend großen Dynamikbereich.
Obwohl es prinzipiell genügt, daß nur zwei Felder mit Ab¬ schwächungsschichten unterschiedlichen Transmissionsvermö- gens vorgesehen sind, besitzt ein erfindungsgemäßer Refe-1 renzkörper vorzugsweise mehrere, d.h. mehr als zwei Felder mit Abschwächungsschichten jeweils unterschiedlichen Trans¬ missionsvermögens, da hierdurch auch eine Überprüfung der Linearität einer Fluoreszenzmeßvorrichtung ermöglicht wird.
Um zur Prüfung eines großen Dynamikbereichs eine möglichst günstige Verteilung von mittels des Referenzkörpers erzeug¬ ten Fluoreszenzintensitäten zu erreichen, sind bei dem er¬ findungsgemäßen Referenzkörper bevorzugt mehr als zwei je¬ weils in verschiedenen Feldern angeordnete Abschwächungs¬ schichten über und/oder unter der Fluoreszenzschicht ange¬ ordnet, deren Transmissionen relativ zueinander logarith¬ misch abgestuft sind. Die Abschwächungsschichten in den einzelnen Feldern können grundsätzlich aus den gleichen oder verschiedenen Materia¬ lien gebildet sein. Darüber hinaus können sie in den Berei¬ chen zwischen den Feldern miteinander verbunden oder durch diese Bereiche getrennt sein.
Das Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten kann grundsätzlich auf verschiedene Art und Weise eingestellt werden. Beispielsweise kann das Reflexionsvermögen der Ab¬ schwächungsschichten für Fluoreszenzstrahlung variiert wer¬ den. Bevorzugt ist bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper jedoch vorgesehen, daß die Abschwächungsschichten von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlungen absor¬ bieren. Die Absorption einer Abschwächungsschicht ist bei der Herstellung derselben einfacher über einen weiten Be¬ reich zu variieren als deren Reflexionsvermδgen.
Zur Variation der Absorption kann das Material der Abschwä¬ chungsschicht verändert werden. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper sollen sich jedoch bevorzugt wenigstens zwei der Abschwächungsschichten in ihrer Schichtdicke unter¬ scheiden. Eine Variation des Transmissionsvermögens durch Variation der Schichtdicke der Abschwächungsschichten, vor¬ zugsweise bei Verwendung desselben Materials für die Ab¬ schwächungsschichten, hat den Vorteil, daß das Transmissi¬ onsvermögen exponentiell von der Dicke der Schicht abhängt, so daß durch einfache Variation der Schichtdicke der Ab¬ schwächungsschichten ein großer Transmissionsbereich abge¬ deckt werden kann. Darüber hinaus können Schichten vorgege¬ bener Dicke sehr einfach und genau hergestellt werden.
Die Herstellung der Schichten kann mit beliebigen Verfahren zur Schichtherstellung erfolgen. Bei den erfindungsgemäßen
- S - Verfahren wird jedoch bevorzugt wenigstens eine der Ab- schwächungsschichten aufgedampft. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist bevorzugt wenigstens eine der Abschwä- chungsschichten aufgedampft. Die Abschwächungsschicht kann dabei je nach Aufbau des Referenzkörpers auf eine Träger¬ schicht oder die Fluoreszenzschicht aufgebracht sein. Mit diesem Verfahren können die Schichtdicken der Abschwä- chungsschichten besonders genau gesteuert werden.
Das Material der Abschwächungsschichten kann prinzipiell für jede Abschwächungsschicht anders gewählt sein. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist jedoch bevorzugt we¬ nigstens eine der Abschwächungsschichten eine Metall- Schicht. Metallschichten zeigen in Bezug auf die optischen Eigenschaften, insbesondere die Absorption für optische Strahlung, und die Herstellung, beispielsweise durch Auf¬ dampfen, große Vorteile gegenüber anderen Materialien wie beispielsweise Polymeren. Prinzipiell können beliebige Me¬ talle verwendet werden, doch ist bevorzugt die Metall¬ schicht eine Chromschicht oder Titanschicht, da Chrom und Titan gute Hafteigenschaften auf typischen Trägermateria¬ lien aufweisen.
Ein erfindungsgemäßer Referenzkörper kann zur Verwendung mit Durchlicht und/oder Auflicht ausgebildet sein. Bei Flu¬ oreszenzmessungen wird häufig die Probe mit Anregungslicht in Auflichtbeleuchtung bestrahlt, weswegen reflektive Ei¬ genschaften des Referenzkörpers oft unerwünscht sind. Daher sind bevorzugt die Abschwächungsschichten auf wenigstens einer Seite, vorzugsweise der von der Fluoreszenzschicht abgewandten Seite, entspiegelt. Bevorzugt ist deren Refle¬ xionsvermögen kleiner als 10%, besonders bevorzugt kleiner als 4%. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Referenzkörper in ei¬ nem Bereich zwischen den Feldern im wesentlichen nicht transparent. Dies bedeutet, daß die Transmission in diesem Bereich vorzugsweise kleiner als 10"6 ist. Durch diese Aus¬ bildung kann eine klare Abgrenzung zwischen den verschiede¬ nen Feldern erreicht werden.
Um die Homogenität der Empfindlichkeit eines Fluoreszenz¬ meßgeräts in lateraler Richtung, das heißt quer zur Rich¬ tung der Anregungs- bzw. Fluoreszenzstrahlung überprüfen zu können, ist der erfindungsgemäße Referenzkörper vorzugswei¬ se in einem Bereich zwischen wenigstens zwei Feldern oder entlang wenigstens eines der Felder transparent .
Um reproduzierbar Fluoreszenzstrahlung erzeugen zu können, ist der Referenzkörper vorzugsweise formstabil . Hierzu kann der erfindungsgemäße Referenzkörper eine formstabile Trä¬ gerschicht aufweisen. Die Trägerschicht, die Fluoreszenz¬ schicht und die Abschwächungsschichten können dabei in un¬ terschiedlicher Art und Weise ausgebildet und angeordnet sein.
Bei einer Ausbildungsform des erfindungsgemäßen Referenz¬ körpers bildet bevorzugt die Fluoreszenzschicht eine form¬ stabile Trägerschicht. Damit ergibt sich ein besonders ein¬ facher Aufbau. Als Trägerschicht kann insbesondere eine Schicht aus Glas mit eingelagerten „Quantum-dots" , das heißt fluoreszierenden Halbleiter-Nanopartikeln, vorzugwei¬ se aus Cadmiumsulfid, Zinkselenid, Cadmiumtellurid oder Quecksilberselenid, verwendet werden. Sie kann vorzugsweise als Trägerplatte ausgebildet sein. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Referenzkörpers ist die Fluoreszenzschicht auf einer formstabilen, im wesentlich nicht fluoreszierenden Trägerschicht angeordnet . Insbesondere kann sie unmittelbar auf die Trägerschicht, die insbesondere als Trägerplatte ausgebildet sein kann, aufgebracht sein. Als Trägermaterial kann dabei Glas dienen, während als Fluoreszenzschicht bei¬ spielsweise ein "Quantum-Dots" enthaltendes Polymer, wie PMMA, auf die Träger aufgeschleudert wird. Alternativ ist es auch möglich, die Fluoreszenzschicht auf die Träger¬ schicht aufzukleben.
Die Abschwächungsschicht kann zum einen auf der auf der Trägerschicht angeordneten Fluoreszenzschicht angeordnet sein. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist jedoch bei einer bevorzugten Ausführungsform die nicht fluoreszie¬ rende Trägerschicht transparent, und auf ihr sind die Ab¬ schwächungsschichten aufgebracht . Diese Anordnung der Ab- schwächungsschichten erlaubt es, während der Herstellung des Referenzkörpers deren, vorzugsweise spektrales, Trans¬ missionsvermögen zu bestimmen beziehungsweise zu kontrol¬ lieren. So werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren be¬ vorzugt die Abschwächungsschichten auf eine formstabile, im wesentlichen nicht fluoreszierende, transparente Träger¬ schicht aufgebracht, die Transmissionen der Abschwächungs¬ schichten ermittelt, und danach wird auf die Trägerschicht die Fluoreszenzschicht aufgebracht. Auch hier bildet die Trägerschicht vorzugsweise eine Trägerplatte.
Besonders bevorzugt sind jedoch die Abschwächungsschichten zwischen der Trägerschicht und der Fluoreszenzschicht ange¬ ordnet . Hierzu wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nach der Ermittlung der Transmission der Abschwächungs- schichten die Fluoreszenzschicht auf die Abschwächungs- schicht aufgebracht. Die Fluoreszenzschicht und die Träger¬ schicht bilden so einen Schutz der gegebenenfalls nicht sehr robusten Abschwächungsschichten gegen mechanische Be¬ schädigungen und andere Umwelteinflüsse. Bei der Verwendung dieser Ausführungsform im Auflicht wird das Anregungslicht in die transparente Trägerschicht gestrahlt.
Die Intensität der bei Anregung mit optischer Anregungs¬ strahlung von dem Referenzkörper abgegebenen Fluoreszenz- Strahlung hängt nicht nur von den Schichtdicken und Materi¬ alien der Abschwächungsschichten, sondern auch von den Ei¬ genschaften der Fluoreszenzschicht, insbesondere deren Schichtdicke und der Konzentration der darin enthaltenen fluoreszierenden Stoffe, ab.
Soll eine Variation der von dem Referenzkörper abgebenden Fluoreszenzstrahlungsintensitäten allein durch die Eigen¬ schaft der Abschwächungsschichten erfolgen, so sind bevor¬ zugt die Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzschicht in Richtungen parallel zu der Fluoreszenzschicht homogen. Dies kann vorzugsweise dadurch erreicht werden, daß ein fluores¬ zierender Stoff oder mehrere fluoreszierende Stoffe, die der Fluoreszenzschicht ihre fluoreszierenden Eigenschaften verleihen, in den Richtungen parallel zu der Fluoreszenz¬ schicht homogen verteilt sind. Die Schwankungen in der Kon¬ zentration des fluoreszierenden Stoffs bzw. der fluoreszie¬ renden Stoffe in Richtungen parallel zur Fluoreszenzschicht durch die Fluoreszenzstrahlung, auf die Abschwächungs¬ schichten gestrahlt wird, d.h. parallel zu deren Oberflä¬ che, ist dabei vorzugsweise geringer als 5%. Die Konzentration von fluoreszierenden Stoffen in der Fluo¬ reszenzschicht kann prinzipiell beliebig gewählt werden. Vorzugsweise wird die maximal mögliche Konzentration ge¬ wählt, bei der keine gegenseitige Löschung der Fluoreszenz eintritt .
Um einerseits den Referenzkörper einfach herstellen und handhaben zu können und andererseits für die verschiedenen Felder mit Abschwächungsschichten die jeweils gleiche Fluo¬ reszenzstrahlungsintensität bereitstellen zu können, hat bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper die Fluoreszenz¬ schicht bevorzugt die Form einer planparallelen Platte.
Die Dicke der Fluoreszenzschicht kann prinzipiell beliebig gewählt werden. Bevorzugt ist jedoch die Fluoreszenzschicht so ausgebildet, daß die Fluoreszenz aus einer aktiven Schicht kleiner als 2 μm abgestrahlt wird. Die Dicke einer solchen Schicht ist damit kleiner als die Schärfentiefe ty¬ pischer Fluoreszenzmeßgeräte, so daß sie vollständig und scharf abgrenzt abgebildet werden kann.
Für den Fall, daß die Fluoreszenzschicht nicht gleichzeitig eine Trägerschicht darstellt, kann deren Dicke vorzugsweise kleiner als 10 μm, insbesondere kleiner als 2 μm gewählt sein.
Die fluoreszierende Wirkung der Fluoreszenzschicht kann bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper prinzipiell auf belie¬ bige Art und Weise erreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht wenigstens ein organisches Fluorophor. Dies gestattet es, ein für ei- nen vorgegebenen Anwendungszweck geeignetes Fluorophor aus der großen Anzahl verfügbarer organischer Fluorophore aus¬ zuwählen. Insbesondere können Fluorophore gewählt werden, die auch bei der Untersuchung von biologischen Proben ein¬ gesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist das Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe NileBlue, Cy3, Cy5, Cy7, Fluorescein und Rhodamin.
Bei einer anderen bevorzugten Aufführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht fluoreszierend wirkende Ionen. Bei diesen kann es sich ins¬ besondere um Ionen von Schwermetallen und/oder seltenen Er¬ den, vorzugsweise in Farbgläsern, handeln. Solche Fluores¬ zenzschichten zeichnen sich durch eine besonders hohe Sta¬ bilität aus.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht fluoreszierend wirkende Quantum-Dots. Bei diesen kann es sich um fluoreszierende Halbleiter-Nanopartikel aus Cadmi- umsulfid, Zinkselenid, Cadmiumselenid oder Quecksilbertel- lurid handeln. Solche Quantum-Dots zeichnen sich durch eine besonders hohe Fluoreszenzausbeute aus. Durch die Einkapse- lung der Quantum-Dots in ein Matrixmaterial der Fluores¬ zenzschicht können eine Oxidation und ein Ausbleichen der Quantum-Dots verhindert werden.
Die Fluoreszenzschicht eines erfindungsgemäßen Referenzkör¬ pers kann prinzipiell nur für optische AnregungsStrahlung einer vorgegebenen Anregungswellenlänge und eine entspre¬ chende Fluoreszenzwellenlänge der dadurch angeregten Fluo¬ reszenzstrahlung ausgelegt zu sein. Unter optischer Strah- lung wird hierbei infrarote Strahlung, sichtbares Licht und UV-Licht verstanden. Die erwähnte Transmission der Abschwä- chungsschichten ist dabei bei der entsprechenden, vorgege¬ benen Fluoreszenzwellenlänge gegeben. Die Transmission me¬ tallischer Abschwächungsschichten ist in der Regel von der Strahlungswellenlänge abhängig, was bei der Verwendung des Referenzkörpers zu berücksichtigen ist. Um einen möglichst großen Wellenlängenbereich, beispielsweise von UV bis NIR abzudecken, enthält bei dem erfindungsgemäßen Referenzkör¬ per die Fluoreszenzschicht bevorzugt wenigstens zwei ver¬ schiedene fluoreszierende Materialien. Diese weisen vor¬ zugsweise voneinander verschiedene Fluoreszenzspektren auf.
Die erfindungsgemäßen Referenzkδrper eignen sich insbeson¬ dere zur Kalibrierung von Bio-Chip-Readern.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielhaft anhand der Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig.1 eine schematische Draufsicht auf einen Referenzkör¬ per für Fluoreszenzmessungen nach einer ersten be¬ vorzugten Ausführungsform der Erfindung,
Fig.2 eine schematische seitliche Schnittansicht des Re¬ ferenzkörpers aus Fig.l,
Fig.3 eine schematische Draufsicht auf einen Referenzkδr¬ per nach einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
Fig.4 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörper nach einer dritten bevorzugten Aus¬ führungsform der Erfindung,
Fig.5 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer vierten bevorzugten Aus¬ führungsform der Erfindung, Fig.6 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer fünften bevorzugten Aus¬ führungsform der Erfindung,
Fig.7 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Ermittlung der Transmission von Feldern mit Ab- schwächungsschichten des Referenzkörpers aus Fig.6 bei dessen Herstellung, und
Fig.8 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
In den Figuren 1 und 2 umfaßt ein Referenzkörper 1 für Flu¬ oreszenzmessungen eine als formstabile Trägerschicht die¬ nende Fluoreszenzschicht 2 und eine darüber angeordnete Me¬ tallschicht 3, die typischerweise und insbesondere im Bei¬ spiel dünner als 1 μm ist .
Die Fluoreszenzschicht 2 besitzt die Abmessungen eines kon¬ ventionellen Objektträgers und insbesondere die Form einer planparallelen Platte. Sie ist aus Glas mit darin eingela¬ gerten fluoreszierenden Materialien gebildet. Im Beispiel wird ein Farbglas verwendet, das seine fluoreszierenden Ei¬ genschaften durch darin eingelagerte Ionen von Schwermetal¬ len und/oder seltenen Erden erhält. Bei einer anderen be¬ vorzugten Ausführungsform können statt der Ionen Quantum- Dots in die Fluoreszenzschicht eingelagert sein. Bei noch einer anderen Ausführungsform kann die Fluoreszenzschicht 2 durch eine formstabile durchgefärbte Kunststoffplatte gege¬ ben sein, die entsprechende Fluorophore enthält. Das Grund¬ material der Fluoreszenzschicht, das heißt das Glas (oder alternativ Kunststoff) , ist für die Fluoreszenzstrahlung so stark absorbierend, daß die Fluoreszenzstrahlung im Wesent- liehen nur aus einer sehr dünnen Schicht von weniger als 10 Mikrometern Dicke abgestrahlt wird.
Die Metallschicht 3 weist Felder 4 bis 16 auf, in denen die Dicke der Metallschicht 3 jeweils unterschiedlich stark re¬ duziert ist. Dadurch werden in den Feldern 4 bis 16 jeweils Abschwächungsschichten 17 bis 29 gebildet, deren Dicke be¬ ginnend mit dem Feld 4 von Feld zu Feld bis zum Feld 16 zu¬ nimmt. Die Dicke der Metallschicht 3 ist dabei so gewählt, daß die Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 Werte zwischen 0,5 und 10"6 in einer logarithmischen Stu¬ fung annimmt. Die Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 sind durch die verbleibenden Bereiche der Metallschicht 3, die eine Transmission kleiner als 10"6 aufweisen und daher als nicht transparent anzusehen sind, voneinander getrennt, so daß Fluoreszenzstrahlung aus einer der Abschwächungsschichten nicht in den Bereich eines be¬ nachbarten Feldes eindringt.
Die äußere Oberfläche der Metallschicht 3 ist bis auf eine Restreflektivität von 4% entspiegelt, damit eine mit übli¬ chen Glasobjektträgern vergleichbare Reflektivität erzielt wird. Dies ist für Autofokusvorrichtungen nützlich.
Der Referenzkörper 1 kann einfach hergestellt werden, indem zunächst die Fluoreszenzschicht 2 hergestellt wird. Diese wird dann mit einem entsprechenden Metall, in Beispiel Chrom, bedampft, wobei das in Fig. 2 gezeigte vorgegebene Höhenprofil durch Verwendung entsprechender Masken erzeugt wird. In Fig. 2 sind die vorgegebenen Schichtdicken, insbe¬ sondere auch die der Abschwächungsschichten, der besseren Sichtbarkeit halber überproportional dick gezeichnet. Bei der Verwendung des Referenzkörpers 1 wird dieser in Auflicht unter eine Fluoreszenzmeßvorrichtung, beispiels¬ weise ein Fluoreszenzmikroskop gebracht. Es wird dann opti¬ sche Anregungsstrahlung auf den Referenzkörper 1 gestrahlt, die die Metallschicht 3 und insbesondere auch die Abschwä- chungsschichten 17 bis 29 unter Abschwächung durchdringt und in der Fluoreszenzschicht 2 die Abgabe von Fluoreszenz¬ strahlung anregt. Die in Richtung der Metallschicht 3 auf¬ tretende Fluoreszenzstrahlung kann dann jeweils durch die Absohwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 abgegeben werden, wobei sie entsprechend der Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 geschwächt wird. Bezo¬ gen auf die Intensität der Anregungsstrahlung erfolgt daher eine doppelte Schwächung der detektierbaren Intensität bzw. des entsprechenden Meßsignals durch die Abschwächungs- schichten 17 bis 29. Die durch die Abschwächungsschicht 17 bis 29 abgegebene Fluoreszenzstrahlung wird dann von dem Fluoreszenzmikroskop ortsaufgelöst detektiert, so daß für jedes der Felder 4 bis 16 entsprechende, die Intensität der durch die entsprechenden Abschwächungsschichten hindurch getretenen Fluoreszenzstrahlung wiedergebende Detektions- signale erfaßt werden. Durch Analyse dieser Detektions- signale bei bekannten Transmissionsvermδgen der Abschwä¬ chungsschichten 17 bis 29 kann so in einfacher Weise die Empfindlichkeit, die Linearität und der Dynamikbereich der Fluoreszenzmeßvorrichtung, hier des Fluoreszenzmikroskops, ermittelt werden.
Ein in Fig.3 in einer schematischen Draufsicht gezeigter Referenzkörper 30 nach einer zweiten bevorzugten Ausfüh¬ rungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Refe¬ renzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels in der Struk¬ tur der Metallschicht. Die anderen Schichten sind gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel unverändert, so daß für die¬ se die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Er¬ läuterungen zu diesen entsprechend auch hier gelten.
Die Metallschicht ist folgendermaßen strukturiert . In einem äußeren Rahmen 31 sind voneinander und von dem Rahmen 31 durch ein transparentes Muster 32 getrennt vier nicht transparente Bereiche 33 bis 36 angeordnet, in denen wie¬ derum jeweils sechs Felder 37 mit Abschwächungsschichten 38 unterschiedlicher Abschwächungsschichtdicke und damit Transmission ausgebildet sind.
Der Rahmen 31 und die Bereiche 33 bis 36 ohne die Felder 37 bzw. Abschwächungsschichten 38 besitzen eine Transmission kleiner als ICT6 und sind daher praktisch nicht transpa¬ rent.
Die Schichtdicken der Abschwächungsschichten 38 in den Fel¬ dern 37 steigen, in Fig.3 von links oben nach rechts unten, von Feld zu Feld an, so daß eine logarithmische Abstufung der Transmissionen erzielt wird. Die Dicken der Abschwä¬ chungsschichten sind so gewählt, daß der gleiche Transmis¬ sionsbereich abgedeckt wird wie im ersten Ausführungsbei¬ spiel. Durch die größere Anzahl von Feldern 37 beziehungs¬ weise Abschwächungsschichten 38 mit unterschiedlichem Transmissionsvermögen wird eine im wesentlichen feinere lo¬ garithmische Abstufung der Fluoreszenzintensitäten als im ersten Ausführungsbeispiel erzielt .
Die Oberseite der Metallschicht ist, wie im ersten Ausfüh¬ rungsbeispiel, bis auf eine Restreflektivität von 4% ent¬ spiegelt, damit eine mit üblichen Glasobjektträgern ver- gleichbare Reflektivität erzielt wird. Dies ist für Autofo¬ kusvorrichtungen nützlich.
Der transparente Bereich 32, in dem keine metallische Schicht vorliegt, ermöglicht eine Prüfung der Homogenität der Fluoreszenzempfindlichkeit der Fluoreszenzmeßvorrich¬ tung in lateraler Richtung, das heißt in Richtung der Ebene des plattenförmigen Referenzkörpers 30.
Ein in einer seitlichen Schnittansicht schematisch in Fig.4 gezeigter Referenzkörper 39 nach einer dritten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels darin, daß die Fluoreszenzschicht 2 durch eine Trägerschicht 40 er¬ setzt ist, in die, in Fig.4 von oben, fluoreszierende Mate¬ rialien, zum Beispiel durch Ionenimplantation, eingebracht sind, wobei die Konzentration dieser Materialien mit zuneh¬ mendem Abstand von der der Metallschicht 3 zugewandten O- berflache der Trägerschicht 40 abnimmt. Die Konzentration der fluoreszierenden Materialien ist dabei so gewählt, daß die effektiv fluoreszierende Schicht nur weniger als 10 μm dick ist. Die anderen Schichten sind gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel unverändert, so daß für diese die glei¬ chen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen zu diesen entsprechend auch hier gelten.
Ein in Fig.5 in einer schematischen seitlichen Schnittan¬ sicht gezeigter Referenzkörper 41 nach einer vierten bevor¬ zugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkδrper 1 des ersten Ausführungsbeispiels bezie¬ hungsweise dem Referenzkörper 39 des dritten Ausführungs- beispiels dadurch, daß statt der Fluoreszenzschicht 2 be¬ ziehungsweise der Trägerschicht 40 eine formstabile, nicht fluoreszierende, transparente, planparallele Platte 42, beispielsweise aus Glas, als Trägerschicht verwendet wird, auf die eine dünne, fluoreszierende Platte 43 konstanter Dicke aufgeklebt ist . Auf die transparente Platte 42 ist eine Metallschicht mit Feldern mit Abschwächungsschichten entsprechend der Metallschicht 3 im ersten Ausführungsbei¬ spiel aufgedampft, die daher mit demselben Bezugszeichen gekennzeichnet ist .
Die fluoreszierende Platte 43 enthält eine Mischung von fluoreszierenden Materialien, im Beispiel organischen Fluo- rophoren, so daß durch Anregung mit entsprechender opti¬ scher Strahlung Fluoreszenzstrahlung in einzelnen Bändern in dem Wellenlängenbereich zwischen dem UV- und dem NIR- Bereich erzeugt werden kann.
Ein in einer schematischen seitlichen Schnittansicht in Fig.6 veranschaulichter Referenzkörper 44 nach einer fünf¬ ten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 41 des vierten Ausführungsbei¬ spiels dadurch, daß die Fluoreszenzschicht beziehungsweise fluoreszierende Platte 43 auf einer anderen Seite der Trä¬ gerschicht 42 angeordnet ist als die Metallschicht 3, die unmittelbar auf die Trägerschicht 42 aufgedampft ist.
Bei der Herstellung wird zunächst die Trägerschicht 42 mit der Metallschicht 3 bedampft. In einem folgenden Schritt wird dann die spektrale Transmission der Abschwächungs¬ schichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 mit der grob schematisch in Fig.7 gezeigten Vorrichtung bestimmt. Diese Vorrichtung verfügt über eine Beleuchtungseinrichtung 45 mit einer Lichtquelle 46, einem Spektralfilter 47 zur Fil¬ terung des von der Lichtquelle 46 abgegebenen Lichts und einer Kollimationsoptik 48 zur Bündelung des durch den Spektralfilter 47 hindurchtretenden Lichts und einen Trans¬ missionsdetektor 49, beispielsweise ein Spektrometer. Durch Bewegung des transparenten Trägers 42 mit der darauf ange¬ ordneten Metallschicht 3 quer zur Richtung des Lichts der Beleuchtungseinrichtung 45 kann die Transmission der Me¬ tallschicht 3 spektral- und ortsaufgelöst erfaßt werden.
Nach Ermittlung der Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 wird die transparente fluoreszierende Platte 43 mit der Trägerschicht 42 ver¬ klebt .
So wird ein Referenzkörper erhalten, für dessen Abschwä¬ chungsschichten das Transmissionsvermδgen genau bekannt ist und der damit eine sehr genaue Kalibrierung erlaubt.
Ein in Fig.8 schematisch gezeigter Referenzkörper nach ei¬ ner sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung un¬ terscheidet sich von dem Referenzkörper des fünften Ausfüh¬ rungsbeispiels nur durch die Reihefolge der Schichten, so daß die gleichen Bezugszeichen verwendet werden.
Die Fluoreszenzschicht 43, die im Beispiel eine Dicke von etwa 2 μm aufweist, ist nun nicht unmittelbar auf der Trä¬ gerschicht bzw. -platte 42 angeordnet, sondern auf der Me¬ tallschicht 3, in der in den Feldern die Abschwächungs¬ schichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens ausge¬ bildet sind. Die Metallschicht 3 und insbesondere die Ab¬ schwächungsschichten 17 bis 29 sind dadurch von Umweltein¬ flüssen abgeschirmt. Der Referenzkörper wird wie im vorhergehenden Ausführungs- beispiel hergestellt, wobei jedoch nun die Fluoreszenz¬ schicht 43, im Beispiel aus einem Polymer mit darin einge¬ lagerten Quantum-Dots, auf die MetallSchicht 3 und damit die Abschwächungsschichten 17 bis 29 aufgeschleudert wird, nachdem deren Transmissionsvermögen ermittelt wurde.
Bezugszeichenliste
Referenzkörper
Fluoreszenzschicht
Metallschicht ... , 16 Felder , ..., 29 Abschwächungsschicht
Referenzkörper
Rahmen gemusterter Bereich , ..., 36 transparenter Bereich
Feld
Abschwächungsschicht
Referenzkörper
Trägerschicht
Referenzkörper
Trägerschicht
Fluoreszenzschicht
Referenzkörper
Beleuchtungseinrichtung
Lichtquelle
Spektralfilter
Kollimationsoptik
Transmissionsdetektor

Claims

Patentansprüche
1. Referenzkörper für Fluoreszenzmessungen mit einer Fluo¬ reszenzschicht (2, 40, 43) , mittels derer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigstens zwei Feldern (4 bis 16, 37) mit jeweils ei¬ ner über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) angeordneten Abschwächungsschicht (17 bis 29, 38), die für von der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) abgege¬ bene Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschich- ten (17 bis 29, 38) in den Feldern voneinander unter¬ scheiden.
2. Referenzkδrper nach Anspruch 1, bei dem die Transmissi¬ on der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) zwischen 10"5 und 0,5 liegt.
3. Referenzkörper nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Ver¬ hältnis der Transmission der Abschwächungsschicht (17) größten Transmissionsvermögens zu der Transmission der Abschwächungsschicht kleinsten Transmissionsvermögens
(29) größer als 104 ist.
4. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mehr als zwei jeweils in verschiedenen Feldern
(4 bis 16, 37) angeordnete Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) über und/oder unter der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) angeordnet sind, deren Transmissionen rela¬ tiv zueinander logarithmisch abgestuft sind.
5. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) von der Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) abgegebene Fluores¬ zenzstrahlung absorbieren.
6. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem sich wenigstens zwei der Abschwächungsschichten
(17 bis 29, 38) in ihrer Schichtdicke unterscheiden.
7. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigstens eine der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) aufgedampft ist.
8. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigsten eine der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) eine Metallschicht ist.
9. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) auf wenigstens einer Seite entspiegelt sind.
10. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der ein Bereich zwischen den Feldern (4 bis 16, 37) im wesentlichen nicht transparent ist.
11. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Bereich (32) zwischen wenigstens zwei Fel¬ dern (37) oder entlang wenigstens eines der Felder (37) transparent ist.
12. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2, 40) eine formstabile Trägerschicht bildet .
13. Referenzkörper nach einem der der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Fluoreszenzschicht (43) auf einer formsta- bilen, im wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger¬ schicht (42) angeordnet ist.
14. Referenzkörper nach Anspruch 13, bei dem die nicht flu¬ oreszierende Trägerschicht (42) transparent ist und auf ihr die Abschwächungsschichten (17 bis 29) aufgebracht sind.
15. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenz¬ schicht in Richtungen parallel zu der Fluoreszenz¬ schicht (2, 40, 43) homogen sind.
16. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) die Form ei¬ ner planparallelen Platte hat.
17. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, bei dem die Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) so aus¬ gebildet ist, daß die Fluoreszenz aus einer aktiven Schicht kleiner als 2 μm abgestrahlt wird.
18. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (43) wenigstens ein or¬ ganisches Fluorophor enthält .
19. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (40) fluoreszierend wir¬ kende Ionen enthält .
20. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (2) fluoreszierend wir¬ kende Quantum-Dots enthält .
21. Referenzkörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fluoreszenzschicht (43) wenigstens zwei verschiedene fluoreszierende Materialien enthält.
22. Verfahren zur Herstellung eines Referenzkörpers für Fluoreszenzmessungen, bei dem eine Fluoreszenzschicht (2, 40, 43) hergestellt wird, mittels derer bei opti¬ scher Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und in wenigstens zwei verschiedenen Feldern (4 bis 16, 37) jeweils eine für von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparente Abschwächungs- schicht (17 bis 29, 38) hergestellt wird, so daß sich die Transmission der Abschwächungsschichten in den ver¬ schiedenen Feldern voneinander unterscheiden, wobei die Abschwächungsschichten über und/oder unter der Fluores¬ zenzschicht (2, 40, 43) angeordnet sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem wenigstens eine der Abschwächungsschichten (17 bis 29, 38) aufgedampft wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, bei dem die Ab¬ schwächungsschichten (17 bis 29, 38) auf eine formsta¬ bile, im wesentlichen nicht fluoreszierende, transpa¬ rente Trägerschicht (42) aufgebracht werden, die Transmissionen der Abschwächungsschichten (17 bis 29) ermittelt werden, und danach auf die Trägerschicht (42) die Fluoreszenz¬ schicht (43) aufgebracht wird.
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