REFERENZKÖRPER FÜR FLUORESZENZMESSUNGEN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DESSELBEN
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Referenz¬ körper für Fluoreszenzmessungen und ein Verfahren zur Her¬ stellung desselben.
Fluoreszenz- oder Lumineszenzmessungen können dazu verwen¬ det werden, in einer Probe das Vorhandensein von fluores¬ zierenden beziehungsweise lumineszierenden Substanzen und insbesondere auch die Menge dieser Substanzen in dem unter¬ suchten Raumbereich der Probe festzustellen. Ein typischer Anwendungsfall für solche Fluoreszenzmessungen stellt die Untersuchung biologischer beziehungsweise biochemischer Proben dar, bei der beispielsweise in Proben Substanzen mit Fluorophoren eingebracht werden, die nur an bestimmte Ziel- moleküle ankoppeln. Nach Entfernen nicht gebundener Fluo- rophore können die so präparierten Proben mittels geeigne¬ ter Fluoreszenzmeßgeräte, insbesondere sogenannter Bio- Chip-Reader, untersucht werden, wobei die detektierte Fluo¬ reszenzstrahlung Auskunft über das Vorhandensein von Ziel- molekülen mit daran gebundenen Fluorophoren und idealerwei¬ se auch über die Konzentration der Zielmoleküle gibt .
Um quantitativ verläßliche Ergebnisse erhalten zu können, ist es notwendig, Aussagen über die Detektionseigenschaften des verwendeten Fluoreszenz- beziehungsweise Lumineszenz¬ meßgeräts zu erhalten. Neben rein optischen Abbildungsei¬ genschaften solcher Meßgeräte, beispielsweise dem Auflö¬ sungsvermögen, kommt der Empfindlichkeit der Meßgeräte für die verwendete Fluoreszenzstrahlung, der Linearität, das heißt genauer der Linearität der Abhängigkeit der Größe der Detektionssignale von der Intensität der Fluoreszenzstrah-
lungsintensität, und der Dynamik der verwendete Meßgeräte, das heißt der Größe des Bereichs zwischen minimal und maxi¬ mal detektierbaren Fluoreszenzstrahlungsintensitäten, be¬ sondere Bedeutung zu.
Zur Ermittlung oder Prüfung dieser Eigenschaften können auch als Fluoreszenzstandards bezeichnete Referenzproben verwendet werden, die bekannte Fluoreszenzeigenschaften be¬ sitzen, d.h. bei Bestrahlung mit optischer Anregungsstrah¬ lung vorgegebener Anregungsintensität Fluoreszenzstrahlung mit definierten räumlichen, spektralen und/oder Intensi¬ tätsbezogenen Eigenschaften abgeben. Eine Untersuchung sol¬ cher Referenzproben mit einem Fluoreszenz- beziehungsweise Lumineszenzmeßgerät gestattet eine Bewertung der Sensitivi- tät, Linearität und Dynamik des verwendeten Fluoreszenz¬ bzw. Lumineszenzmeßgeräts.
Die Eigenschaften solcher Referenzproben sollen sich im Laufe der Zeit oder auch in Abhängigkeit von der Anzahl der Messungen an der Referenzprobe nicht oder nur unwesentlich verändern. Solche Veränderungen können aber sehr leicht auftreten, wenn sich die geometrische Form der Referenzpro¬ be ändert oder eine signifikante Änderung der Fluoreszenz¬ eigenschaften durch Ausbleichen, insbesondere bei wieder¬ holter Verwendung, oder Lagerung auftritt.
In US 6,472,671 wird zur Bewertung optischer Abbildungsei¬ genschaften eines Fluoreszenzmeßgeräts vorgeschlagen, ein Kalibrierwerkzeug zu verwenden, das auf einer festen, nicht transparenten Trägerplatte eine dünne Schicht fester Fluo- rophore besitzt, wobei die Trägerplatte teilweise durch ei¬ ne strukturierte, nicht transparente Maske abgedeckt ist. In die Maske, bei der es sich um eine dünne Metallschicht
handeln kann, ist ein Muster mit feinen Strukturen bis hin¬ unter in den Bereich von 0,5 μm eingeätzt. Da die Schicht mit festen Fluorophoren eine jeweils konstante Dicke auf¬ weist, ist das beschriebene Kalibrierwerkzeug nicht zur Un¬ tersuchung der Linearität und des Dynamikbereichs eines Fluoreszenzmeßgerät geeignet.
In US 004/005243 Al ist ein Träger mit einer Schicht eines fluoreszierenden Materials beschrieben, die zur Untersu¬ chung von Abbildungseigenschaften eines Fluoreszenzmeßge¬ räts strukturiert sein kann, so daß eine Maske nicht not¬ wendig ist .
Zur Untersuchung der Empfindlichkeit, der Linearität und/oder des Dynamikbereichs von Fluoreszenzmeßgeräten sind Referenzproben bzw. Fluoreszenzstandards verschiedener Art bekannt .
Beispielsweise können als Referenzproben flache Küvetten mit einer Höhe von beispielsweise wenigen μm mit einer FIu- orophorlösung gefüllt werden. Eine Variation der von einer solchen Referenzprobe abgegebenen Fluoreszenzintensität ist durch eine Variation der Konzentration der in die Küvetten eingefüllten Fluorophorlösung möglich. Ein Nachteil solcher Referenzproben besteht darin, daß die Fluorophore in der Regel nicht langzeitstabil sind und bei Bestrahlung relativ schnell ausbleichen. Zudem ist es schwierig, Küvetten mit genau definierter Höhe reproduzierbar zu präparieren. Von der Höhe bzw. Dicke der Flüssigkeits- beziehungsweise Fluo- rophorlösungsschicht in der Küvette hängt jedoch die Fluo¬ reszenzintensität ab, sodaß die Fluoreszenzintensität nicht sehr genau vorgegeben werden kann.
Alternativ wurde vorgeschlagen, Trägerschichten mit Schich¬ ten zu belegen, die Fluorophore enthalten.
In US 6,471,916 ist beschrieben, Träger mit Bereichen un¬ terschiedlicher Fluorophorkonzentration als Fluoreszenz¬ standard zu verwenden. Es wird jedoch nicht angegeben, wie diese hergestellt werden können.
Eine bekannte Möglichkeit zur Herstellung solcher Fluores¬ zenzstandards besteht darin, Fluorophore, beispielsweise Cy3 oder Cy5 in wäßrige Lösung zu bringen und eine Verdün¬ nungsreihe zu erstellen. Die gelösten Fluorophore werden dann tröpfchenweise auf geeignete Träger, beispielsweise Objektträger, aufgebracht und eingetrocknet. Unter der Vor¬ aussetzung, daß die dabei verwendeten Tropfenvolumina und auch die Durchmesser der eingetrockneten Tropfen konstant sind, erhält man Träger mit Fluorophor-Belegungsdichten, die der Fluorophorkonzentration in der Flüssigkeit propor¬ tional sind. In der Praxis variieren allerdings die Trop¬ fenvolumina- und Durchmesser stark, so daß die Proportiona¬ lität nicht mehr gegeben ist . Darüber hinaus bilden sich beim Eintrocknen häufig sehr inhomogene Fluorophor- Belegungen. Schließlich sind die verwendeten Fluorophore auch gekühlt meist nicht langzeitstabil und bleichen rela¬ tiv schnell aus.
Fluoreszenzstandards können alternativ dadurch erhalten werden, daß auf einem Träger Polymerschichten mit darin enthaltenen Fluorophoren angeordnet werden.
So ist in US 2004/005243 Al ein zur Kalibrierung vorgesehe¬ ner Träger beschrieben, auf den eine Schicht eines fluores-
zierenden Materials mit konstanter oder variierender Dicke aufgebracht ist .
In DE 12 00 865 Al ist eine Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder zur Kalibrierung von Fluo- reszenzdetektionssystemen offenbart, die einen im wesentli¬ chen nicht fluoreszierenden Träger besitzt, auf den in meh¬ reren definierten Bereichen fluoreszierende Polymerschich¬ ten mit zum Teil unterschiedlicher Dicke und/oder Zusammen¬ setzung aufgebracht sind.
In DE 201 04 445 Ul und DE 201 04 446 Ul ist ein Fluores¬ zenzstandard beschrieben, der dadurch hergestellt wird, daß auf einen Träger eine Kunststoffdispersion mit einem Fluo- rophor aufgebracht wird, die dann ausgehärtet wird.
Referenzproben mit auf einen Träger aufgebrachten Polymer- Fluorophor-Schichten, die unterschiedliche Dicken und/oder unterschiedliche Fluorophorkonzentrationen aufweisen, haben jedoch den Nachteil, daß die Fluorophore bei häufiger Ver¬ wendung ausbleichen. Darüber hinaus erfordert die Kalibrie¬ rung von Bio-Chip-Readern, die einen sehr großen Dynamikbe¬ reich aufweisen, Referenzproben, mittels derer Fluoreszenz¬ strahlung stark unterschiedlicher Fluoreszenzintensität er¬ zeugt werden kann. Durch Variation der Dicken der Fluo¬ rophore enthaltenden Schichten und/oder der Fluorophorkon¬ zentrationen in solchen Schichten kann die erforderliche Variation der Fluorophormenge in dem untersuchten Bereich und damit der Fluoreszenzintensität jedoch nicht ohne wei¬ teres erreicht werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrun¬ de, eine Referenzprobe für Fluoreszenzmessungen bereitzu-
stellen, mittels derer bei Beleuchtungen mit vorgegebener optischer Strahlung reproduzierbar Fluoreszenzstrahlung un¬ terschiedlicher Pluoreszenzintensitäten erzeugt werden kann, und ein Verfahren zur Herstellung der Referenzprobe anzugeben.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen Referenzkörper für Flu¬ oreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzschicht, mittels de¬ rer bei optischer Bestrahlung Fluoreszenzstrahlung abgebbar ist, und mit wenigsten zwei Feldern mit jeweils einer über und/oder unter der Fluoreszenzschicht angeordneten Abschwä- chungsschicht, die für von der Fluoreszenzschicht abgegebe¬ ne Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, wobei sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten in den Feldern voneinander unterscheiden.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Referenzkörpers für Fluoreszenzmessungen, bei dem eine Fluoreszenzschicht her¬ gestellt wird, mittels derer bei optischer Bestrahlung Flu¬ oreszenzstrahlung abgebbar ist, und in wenigsten zwei ver¬ schiedenen Feldern jeweils eine für von der Fluoreszenz¬ schicht abgegebene Fluoreszenzstrahlung teiltransparente Abschwächungsschicht hergestellt wird, so daß sich die Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten in den verschiedenen Feldern voneinander unterscheiden, wobei die Abschwächungsschichten über und/oder unter der Fluoreszenz¬ schicht angeordnet sind. Je nach Reihenfolge und Art der Schichten können dabei die Abschwächungsschichten vor, gleichzeitig mit oder nach der Fluoreszenzschicht herge¬ stellt werden.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prüfung und/oder Kalibrierung einer Fluoreszenzmeßvorrichtung wird ein er¬ findungsgemäßer Referenzkörper verwendet, wobei optische Anregungsstrahlung in die Fluoreszenzschicht gestrahlt und entsprechende, durch die Abschwächungsschichten hindurch¬ tretende Fluoreszenzstrahlung aufgelöst nach Feldern detek- tiert wird.
Durch Analyse der Meßergebnisse kann dann bei bekannter Transmission der Abschwächungsschichten die Empfindlich¬ keit, die Linearität und der Dynamikbereich der Fluores¬ zenzmeßvorrichtung bewertet werden.
Erfindungsgemäß erfolgt also eine Variation der Fluores¬ zenzintensitäten in erster Linie durch die Abschwächungs¬ schichten, die unterschiedliche Transmissionsvermögen auf¬ weisen. Das Transmissionsvermögen der Abschwächungsschich¬ ten ist vorzugsweise bekannt und besonders bevorzugt für interessante Typen von Fluoreszenzmeßgerät vorgegeben. Dies hat den Vorteil, daß die Fluoreszenzschicht sehr einfach hergestellt werden kann und insbesondere keine Variation der Dicke und/oder der Konzentration darin enthaltener flu¬ oreszierender Materialien notwendig ist. Abschwächungs¬ schichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens sind ü- ber einen großen Bereich verschiedener Transmissionsvermδ- gen einfach und genau herstellbar, so daß ein kostengünstig herstellbarer Referenzkörper bereitgestellt wird, mit dem sehr genau verschiedene Fluoreszenzstrahlungsintensitäten auch über einen größeren Intensitätsbereich erzeugt werden können. Die Fluoreszenzanregung kann im Durchlicht oder im Auflicht erfolgen.
Grundsätzlich kann die Transmission einer Abschwächungs- schicht beliebig gewählt sein, solange diese wenigstens für die Fluoreszenzstrahlung teiltransparent ist, d.h. solange die Transmission kleiner als 1 und vorzugsweise größer als etwa 10~s ist. Um eine Prüfung oder Kalibrierung auch von Bio-Chip-Readern zu gestatten, liegt bei den erfindungsge¬ mäßen Referenzkörpern die Transmission der Abschwächungs- schichten bevorzugt zwischen ICT5 und 0,5.
Dabei ist es besonders bevorzugt, daß das Verhältnis der Transmission der Abschwächungsschicht größten Transmissi- onsvermδgens zu der Transmission der Abschwächungsschicht kleinsten Transmissionsvermögens größer als 104 ist. Eine solche Gestaltung ermöglicht eine Kalibrierung über einen entsprechend großen Dynamikbereich.
Obwohl es prinzipiell genügt, daß nur zwei Felder mit Ab¬ schwächungsschichten unterschiedlichen Transmissionsvermö- gens vorgesehen sind, besitzt ein erfindungsgemäßer Refe-1 renzkörper vorzugsweise mehrere, d.h. mehr als zwei Felder mit Abschwächungsschichten jeweils unterschiedlichen Trans¬ missionsvermögens, da hierdurch auch eine Überprüfung der Linearität einer Fluoreszenzmeßvorrichtung ermöglicht wird.
Um zur Prüfung eines großen Dynamikbereichs eine möglichst günstige Verteilung von mittels des Referenzkörpers erzeug¬ ten Fluoreszenzintensitäten zu erreichen, sind bei dem er¬ findungsgemäßen Referenzkörper bevorzugt mehr als zwei je¬ weils in verschiedenen Feldern angeordnete Abschwächungs¬ schichten über und/oder unter der Fluoreszenzschicht ange¬ ordnet, deren Transmissionen relativ zueinander logarith¬ misch abgestuft sind.
Die Abschwächungsschichten in den einzelnen Feldern können grundsätzlich aus den gleichen oder verschiedenen Materia¬ lien gebildet sein. Darüber hinaus können sie in den Berei¬ chen zwischen den Feldern miteinander verbunden oder durch diese Bereiche getrennt sein.
Das Transmissionsvermögen der Abschwächungsschichten kann grundsätzlich auf verschiedene Art und Weise eingestellt werden. Beispielsweise kann das Reflexionsvermögen der Ab¬ schwächungsschichten für Fluoreszenzstrahlung variiert wer¬ den. Bevorzugt ist bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper jedoch vorgesehen, daß die Abschwächungsschichten von der Fluoreszenzschicht abgegebene Fluoreszenzstrahlungen absor¬ bieren. Die Absorption einer Abschwächungsschicht ist bei der Herstellung derselben einfacher über einen weiten Be¬ reich zu variieren als deren Reflexionsvermδgen.
Zur Variation der Absorption kann das Material der Abschwä¬ chungsschicht verändert werden. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper sollen sich jedoch bevorzugt wenigstens zwei der Abschwächungsschichten in ihrer Schichtdicke unter¬ scheiden. Eine Variation des Transmissionsvermögens durch Variation der Schichtdicke der Abschwächungsschichten, vor¬ zugsweise bei Verwendung desselben Materials für die Ab¬ schwächungsschichten, hat den Vorteil, daß das Transmissi¬ onsvermögen exponentiell von der Dicke der Schicht abhängt, so daß durch einfache Variation der Schichtdicke der Ab¬ schwächungsschichten ein großer Transmissionsbereich abge¬ deckt werden kann. Darüber hinaus können Schichten vorgege¬ bener Dicke sehr einfach und genau hergestellt werden.
Die Herstellung der Schichten kann mit beliebigen Verfahren zur Schichtherstellung erfolgen. Bei den erfindungsgemäßen
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Verfahren wird jedoch bevorzugt wenigstens eine der Ab- schwächungsschichten aufgedampft. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist bevorzugt wenigstens eine der Abschwä- chungsschichten aufgedampft. Die Abschwächungsschicht kann dabei je nach Aufbau des Referenzkörpers auf eine Träger¬ schicht oder die Fluoreszenzschicht aufgebracht sein. Mit diesem Verfahren können die Schichtdicken der Abschwä- chungsschichten besonders genau gesteuert werden.
Das Material der Abschwächungsschichten kann prinzipiell für jede Abschwächungsschicht anders gewählt sein. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist jedoch bevorzugt we¬ nigstens eine der Abschwächungsschichten eine Metall- Schicht. Metallschichten zeigen in Bezug auf die optischen Eigenschaften, insbesondere die Absorption für optische Strahlung, und die Herstellung, beispielsweise durch Auf¬ dampfen, große Vorteile gegenüber anderen Materialien wie beispielsweise Polymeren. Prinzipiell können beliebige Me¬ talle verwendet werden, doch ist bevorzugt die Metall¬ schicht eine Chromschicht oder Titanschicht, da Chrom und Titan gute Hafteigenschaften auf typischen Trägermateria¬ lien aufweisen.
Ein erfindungsgemäßer Referenzkörper kann zur Verwendung mit Durchlicht und/oder Auflicht ausgebildet sein. Bei Flu¬ oreszenzmessungen wird häufig die Probe mit Anregungslicht in Auflichtbeleuchtung bestrahlt, weswegen reflektive Ei¬ genschaften des Referenzkörpers oft unerwünscht sind. Daher sind bevorzugt die Abschwächungsschichten auf wenigstens einer Seite, vorzugsweise der von der Fluoreszenzschicht abgewandten Seite, entspiegelt. Bevorzugt ist deren Refle¬ xionsvermögen kleiner als 10%, besonders bevorzugt kleiner als 4%.
Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Referenzkörper in ei¬ nem Bereich zwischen den Feldern im wesentlichen nicht transparent. Dies bedeutet, daß die Transmission in diesem Bereich vorzugsweise kleiner als 10"6 ist. Durch diese Aus¬ bildung kann eine klare Abgrenzung zwischen den verschiede¬ nen Feldern erreicht werden.
Um die Homogenität der Empfindlichkeit eines Fluoreszenz¬ meßgeräts in lateraler Richtung, das heißt quer zur Rich¬ tung der Anregungs- bzw. Fluoreszenzstrahlung überprüfen zu können, ist der erfindungsgemäße Referenzkörper vorzugswei¬ se in einem Bereich zwischen wenigstens zwei Feldern oder entlang wenigstens eines der Felder transparent .
Um reproduzierbar Fluoreszenzstrahlung erzeugen zu können, ist der Referenzkörper vorzugsweise formstabil . Hierzu kann der erfindungsgemäße Referenzkörper eine formstabile Trä¬ gerschicht aufweisen. Die Trägerschicht, die Fluoreszenz¬ schicht und die Abschwächungsschichten können dabei in un¬ terschiedlicher Art und Weise ausgebildet und angeordnet sein.
Bei einer Ausbildungsform des erfindungsgemäßen Referenz¬ körpers bildet bevorzugt die Fluoreszenzschicht eine form¬ stabile Trägerschicht. Damit ergibt sich ein besonders ein¬ facher Aufbau. Als Trägerschicht kann insbesondere eine Schicht aus Glas mit eingelagerten „Quantum-dots" , das heißt fluoreszierenden Halbleiter-Nanopartikeln, vorzugwei¬ se aus Cadmiumsulfid, Zinkselenid, Cadmiumtellurid oder Quecksilberselenid, verwendet werden. Sie kann vorzugsweise als Trägerplatte ausgebildet sein.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Referenzkörpers ist die Fluoreszenzschicht auf einer formstabilen, im wesentlich nicht fluoreszierenden Trägerschicht angeordnet . Insbesondere kann sie unmittelbar auf die Trägerschicht, die insbesondere als Trägerplatte ausgebildet sein kann, aufgebracht sein. Als Trägermaterial kann dabei Glas dienen, während als Fluoreszenzschicht bei¬ spielsweise ein "Quantum-Dots" enthaltendes Polymer, wie PMMA, auf die Träger aufgeschleudert wird. Alternativ ist es auch möglich, die Fluoreszenzschicht auf die Träger¬ schicht aufzukleben.
Die Abschwächungsschicht kann zum einen auf der auf der Trägerschicht angeordneten Fluoreszenzschicht angeordnet sein. Bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper ist jedoch bei einer bevorzugten Ausführungsform die nicht fluoreszie¬ rende Trägerschicht transparent, und auf ihr sind die Ab¬ schwächungsschichten aufgebracht . Diese Anordnung der Ab- schwächungsschichten erlaubt es, während der Herstellung des Referenzkörpers deren, vorzugsweise spektrales, Trans¬ missionsvermögen zu bestimmen beziehungsweise zu kontrol¬ lieren. So werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren be¬ vorzugt die Abschwächungsschichten auf eine formstabile, im wesentlichen nicht fluoreszierende, transparente Träger¬ schicht aufgebracht, die Transmissionen der Abschwächungs¬ schichten ermittelt, und danach wird auf die Trägerschicht die Fluoreszenzschicht aufgebracht. Auch hier bildet die Trägerschicht vorzugsweise eine Trägerplatte.
Besonders bevorzugt sind jedoch die Abschwächungsschichten zwischen der Trägerschicht und der Fluoreszenzschicht ange¬ ordnet . Hierzu wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nach der Ermittlung der Transmission der Abschwächungs-
schichten die Fluoreszenzschicht auf die Abschwächungs- schicht aufgebracht. Die Fluoreszenzschicht und die Träger¬ schicht bilden so einen Schutz der gegebenenfalls nicht sehr robusten Abschwächungsschichten gegen mechanische Be¬ schädigungen und andere Umwelteinflüsse. Bei der Verwendung dieser Ausführungsform im Auflicht wird das Anregungslicht in die transparente Trägerschicht gestrahlt.
Die Intensität der bei Anregung mit optischer Anregungs¬ strahlung von dem Referenzkörper abgegebenen Fluoreszenz- Strahlung hängt nicht nur von den Schichtdicken und Materi¬ alien der Abschwächungsschichten, sondern auch von den Ei¬ genschaften der Fluoreszenzschicht, insbesondere deren Schichtdicke und der Konzentration der darin enthaltenen fluoreszierenden Stoffe, ab.
Soll eine Variation der von dem Referenzkörper abgebenden Fluoreszenzstrahlungsintensitäten allein durch die Eigen¬ schaft der Abschwächungsschichten erfolgen, so sind bevor¬ zugt die Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzschicht in Richtungen parallel zu der Fluoreszenzschicht homogen. Dies kann vorzugsweise dadurch erreicht werden, daß ein fluores¬ zierender Stoff oder mehrere fluoreszierende Stoffe, die der Fluoreszenzschicht ihre fluoreszierenden Eigenschaften verleihen, in den Richtungen parallel zu der Fluoreszenz¬ schicht homogen verteilt sind. Die Schwankungen in der Kon¬ zentration des fluoreszierenden Stoffs bzw. der fluoreszie¬ renden Stoffe in Richtungen parallel zur Fluoreszenzschicht durch die Fluoreszenzstrahlung, auf die Abschwächungs¬ schichten gestrahlt wird, d.h. parallel zu deren Oberflä¬ che, ist dabei vorzugsweise geringer als 5%.
Die Konzentration von fluoreszierenden Stoffen in der Fluo¬ reszenzschicht kann prinzipiell beliebig gewählt werden. Vorzugsweise wird die maximal mögliche Konzentration ge¬ wählt, bei der keine gegenseitige Löschung der Fluoreszenz eintritt .
Um einerseits den Referenzkörper einfach herstellen und handhaben zu können und andererseits für die verschiedenen Felder mit Abschwächungsschichten die jeweils gleiche Fluo¬ reszenzstrahlungsintensität bereitstellen zu können, hat bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper die Fluoreszenz¬ schicht bevorzugt die Form einer planparallelen Platte.
Die Dicke der Fluoreszenzschicht kann prinzipiell beliebig gewählt werden. Bevorzugt ist jedoch die Fluoreszenzschicht so ausgebildet, daß die Fluoreszenz aus einer aktiven Schicht kleiner als 2 μm abgestrahlt wird. Die Dicke einer solchen Schicht ist damit kleiner als die Schärfentiefe ty¬ pischer Fluoreszenzmeßgeräte, so daß sie vollständig und scharf abgrenzt abgebildet werden kann.
Für den Fall, daß die Fluoreszenzschicht nicht gleichzeitig eine Trägerschicht darstellt, kann deren Dicke vorzugsweise kleiner als 10 μm, insbesondere kleiner als 2 μm gewählt sein.
Die fluoreszierende Wirkung der Fluoreszenzschicht kann bei dem erfindungsgemäßen Referenzkörper prinzipiell auf belie¬ bige Art und Weise erreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht wenigstens ein organisches Fluorophor. Dies gestattet es, ein für ei-
nen vorgegebenen Anwendungszweck geeignetes Fluorophor aus der großen Anzahl verfügbarer organischer Fluorophore aus¬ zuwählen. Insbesondere können Fluorophore gewählt werden, die auch bei der Untersuchung von biologischen Proben ein¬ gesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist das Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe NileBlue, Cy3, Cy5, Cy7, Fluorescein und Rhodamin.
Bei einer anderen bevorzugten Aufführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht fluoreszierend wirkende Ionen. Bei diesen kann es sich ins¬ besondere um Ionen von Schwermetallen und/oder seltenen Er¬ den, vorzugsweise in Farbgläsern, handeln. Solche Fluores¬ zenzschichten zeichnen sich durch eine besonders hohe Sta¬ bilität aus.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Referenzkörpers enthält die Fluoreszenzschicht fluoreszierend wirkende Quantum-Dots. Bei diesen kann es sich um fluoreszierende Halbleiter-Nanopartikel aus Cadmi- umsulfid, Zinkselenid, Cadmiumselenid oder Quecksilbertel- lurid handeln. Solche Quantum-Dots zeichnen sich durch eine besonders hohe Fluoreszenzausbeute aus. Durch die Einkapse- lung der Quantum-Dots in ein Matrixmaterial der Fluores¬ zenzschicht können eine Oxidation und ein Ausbleichen der Quantum-Dots verhindert werden.
Die Fluoreszenzschicht eines erfindungsgemäßen Referenzkör¬ pers kann prinzipiell nur für optische AnregungsStrahlung einer vorgegebenen Anregungswellenlänge und eine entspre¬ chende Fluoreszenzwellenlänge der dadurch angeregten Fluo¬ reszenzstrahlung ausgelegt zu sein. Unter optischer Strah-
lung wird hierbei infrarote Strahlung, sichtbares Licht und UV-Licht verstanden. Die erwähnte Transmission der Abschwä- chungsschichten ist dabei bei der entsprechenden, vorgege¬ benen Fluoreszenzwellenlänge gegeben. Die Transmission me¬ tallischer Abschwächungsschichten ist in der Regel von der Strahlungswellenlänge abhängig, was bei der Verwendung des Referenzkörpers zu berücksichtigen ist. Um einen möglichst großen Wellenlängenbereich, beispielsweise von UV bis NIR abzudecken, enthält bei dem erfindungsgemäßen Referenzkör¬ per die Fluoreszenzschicht bevorzugt wenigstens zwei ver¬ schiedene fluoreszierende Materialien. Diese weisen vor¬ zugsweise voneinander verschiedene Fluoreszenzspektren auf.
Die erfindungsgemäßen Referenzkδrper eignen sich insbeson¬ dere zur Kalibrierung von Bio-Chip-Readern.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielhaft anhand der Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig.1 eine schematische Draufsicht auf einen Referenzkör¬ per für Fluoreszenzmessungen nach einer ersten be¬ vorzugten Ausführungsform der Erfindung,
Fig.2 eine schematische seitliche Schnittansicht des Re¬ ferenzkörpers aus Fig.l,
Fig.3 eine schematische Draufsicht auf einen Referenzkδr¬ per nach einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
Fig.4 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörper nach einer dritten bevorzugten Aus¬ führungsform der Erfindung,
Fig.5 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer vierten bevorzugten Aus¬ führungsform der Erfindung,
Fig.6 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer fünften bevorzugten Aus¬ führungsform der Erfindung,
Fig.7 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Ermittlung der Transmission von Feldern mit Ab- schwächungsschichten des Referenzkörpers aus Fig.6 bei dessen Herstellung, und
Fig.8 eine schematische seitliche Schnittansicht eines Referenzkörpers nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
In den Figuren 1 und 2 umfaßt ein Referenzkörper 1 für Flu¬ oreszenzmessungen eine als formstabile Trägerschicht die¬ nende Fluoreszenzschicht 2 und eine darüber angeordnete Me¬ tallschicht 3, die typischerweise und insbesondere im Bei¬ spiel dünner als 1 μm ist .
Die Fluoreszenzschicht 2 besitzt die Abmessungen eines kon¬ ventionellen Objektträgers und insbesondere die Form einer planparallelen Platte. Sie ist aus Glas mit darin eingela¬ gerten fluoreszierenden Materialien gebildet. Im Beispiel wird ein Farbglas verwendet, das seine fluoreszierenden Ei¬ genschaften durch darin eingelagerte Ionen von Schwermetal¬ len und/oder seltenen Erden erhält. Bei einer anderen be¬ vorzugten Ausführungsform können statt der Ionen Quantum- Dots in die Fluoreszenzschicht eingelagert sein. Bei noch einer anderen Ausführungsform kann die Fluoreszenzschicht 2 durch eine formstabile durchgefärbte Kunststoffplatte gege¬ ben sein, die entsprechende Fluorophore enthält. Das Grund¬ material der Fluoreszenzschicht, das heißt das Glas (oder alternativ Kunststoff) , ist für die Fluoreszenzstrahlung so stark absorbierend, daß die Fluoreszenzstrahlung im Wesent-
liehen nur aus einer sehr dünnen Schicht von weniger als 10 Mikrometern Dicke abgestrahlt wird.
Die Metallschicht 3 weist Felder 4 bis 16 auf, in denen die Dicke der Metallschicht 3 jeweils unterschiedlich stark re¬ duziert ist. Dadurch werden in den Feldern 4 bis 16 jeweils Abschwächungsschichten 17 bis 29 gebildet, deren Dicke be¬ ginnend mit dem Feld 4 von Feld zu Feld bis zum Feld 16 zu¬ nimmt. Die Dicke der Metallschicht 3 ist dabei so gewählt, daß die Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 Werte zwischen 0,5 und 10"6 in einer logarithmischen Stu¬ fung annimmt. Die Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 sind durch die verbleibenden Bereiche der Metallschicht 3, die eine Transmission kleiner als 10"6 aufweisen und daher als nicht transparent anzusehen sind, voneinander getrennt, so daß Fluoreszenzstrahlung aus einer der Abschwächungsschichten nicht in den Bereich eines be¬ nachbarten Feldes eindringt.
Die äußere Oberfläche der Metallschicht 3 ist bis auf eine Restreflektivität von 4% entspiegelt, damit eine mit übli¬ chen Glasobjektträgern vergleichbare Reflektivität erzielt wird. Dies ist für Autofokusvorrichtungen nützlich.
Der Referenzkörper 1 kann einfach hergestellt werden, indem zunächst die Fluoreszenzschicht 2 hergestellt wird. Diese wird dann mit einem entsprechenden Metall, in Beispiel Chrom, bedampft, wobei das in Fig. 2 gezeigte vorgegebene Höhenprofil durch Verwendung entsprechender Masken erzeugt wird. In Fig. 2 sind die vorgegebenen Schichtdicken, insbe¬ sondere auch die der Abschwächungsschichten, der besseren Sichtbarkeit halber überproportional dick gezeichnet.
Bei der Verwendung des Referenzkörpers 1 wird dieser in Auflicht unter eine Fluoreszenzmeßvorrichtung, beispiels¬ weise ein Fluoreszenzmikroskop gebracht. Es wird dann opti¬ sche Anregungsstrahlung auf den Referenzkörper 1 gestrahlt, die die Metallschicht 3 und insbesondere auch die Abschwä- chungsschichten 17 bis 29 unter Abschwächung durchdringt und in der Fluoreszenzschicht 2 die Abgabe von Fluoreszenz¬ strahlung anregt. Die in Richtung der Metallschicht 3 auf¬ tretende Fluoreszenzstrahlung kann dann jeweils durch die Absohwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 abgegeben werden, wobei sie entsprechend der Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 geschwächt wird. Bezo¬ gen auf die Intensität der Anregungsstrahlung erfolgt daher eine doppelte Schwächung der detektierbaren Intensität bzw. des entsprechenden Meßsignals durch die Abschwächungs- schichten 17 bis 29. Die durch die Abschwächungsschicht 17 bis 29 abgegebene Fluoreszenzstrahlung wird dann von dem Fluoreszenzmikroskop ortsaufgelöst detektiert, so daß für jedes der Felder 4 bis 16 entsprechende, die Intensität der durch die entsprechenden Abschwächungsschichten hindurch getretenen Fluoreszenzstrahlung wiedergebende Detektions- signale erfaßt werden. Durch Analyse dieser Detektions- signale bei bekannten Transmissionsvermδgen der Abschwä¬ chungsschichten 17 bis 29 kann so in einfacher Weise die Empfindlichkeit, die Linearität und der Dynamikbereich der Fluoreszenzmeßvorrichtung, hier des Fluoreszenzmikroskops, ermittelt werden.
Ein in Fig.3 in einer schematischen Draufsicht gezeigter Referenzkörper 30 nach einer zweiten bevorzugten Ausfüh¬ rungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Refe¬ renzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels in der Struk¬ tur der Metallschicht. Die anderen Schichten sind gegenüber
dem ersten Ausführungsbeispiel unverändert, so daß für die¬ se die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Er¬ läuterungen zu diesen entsprechend auch hier gelten.
Die Metallschicht ist folgendermaßen strukturiert . In einem äußeren Rahmen 31 sind voneinander und von dem Rahmen 31 durch ein transparentes Muster 32 getrennt vier nicht transparente Bereiche 33 bis 36 angeordnet, in denen wie¬ derum jeweils sechs Felder 37 mit Abschwächungsschichten 38 unterschiedlicher Abschwächungsschichtdicke und damit Transmission ausgebildet sind.
Der Rahmen 31 und die Bereiche 33 bis 36 ohne die Felder 37 bzw. Abschwächungsschichten 38 besitzen eine Transmission kleiner als ICT6 und sind daher praktisch nicht transpa¬ rent.
Die Schichtdicken der Abschwächungsschichten 38 in den Fel¬ dern 37 steigen, in Fig.3 von links oben nach rechts unten, von Feld zu Feld an, so daß eine logarithmische Abstufung der Transmissionen erzielt wird. Die Dicken der Abschwä¬ chungsschichten sind so gewählt, daß der gleiche Transmis¬ sionsbereich abgedeckt wird wie im ersten Ausführungsbei¬ spiel. Durch die größere Anzahl von Feldern 37 beziehungs¬ weise Abschwächungsschichten 38 mit unterschiedlichem Transmissionsvermögen wird eine im wesentlichen feinere lo¬ garithmische Abstufung der Fluoreszenzintensitäten als im ersten Ausführungsbeispiel erzielt .
Die Oberseite der Metallschicht ist, wie im ersten Ausfüh¬ rungsbeispiel, bis auf eine Restreflektivität von 4% ent¬ spiegelt, damit eine mit üblichen Glasobjektträgern ver-
gleichbare Reflektivität erzielt wird. Dies ist für Autofo¬ kusvorrichtungen nützlich.
Der transparente Bereich 32, in dem keine metallische Schicht vorliegt, ermöglicht eine Prüfung der Homogenität der Fluoreszenzempfindlichkeit der Fluoreszenzmeßvorrich¬ tung in lateraler Richtung, das heißt in Richtung der Ebene des plattenförmigen Referenzkörpers 30.
Ein in einer seitlichen Schnittansicht schematisch in Fig.4 gezeigter Referenzkörper 39 nach einer dritten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 1 des ersten Ausführungsbeispiels darin, daß die Fluoreszenzschicht 2 durch eine Trägerschicht 40 er¬ setzt ist, in die, in Fig.4 von oben, fluoreszierende Mate¬ rialien, zum Beispiel durch Ionenimplantation, eingebracht sind, wobei die Konzentration dieser Materialien mit zuneh¬ mendem Abstand von der der Metallschicht 3 zugewandten O- berflache der Trägerschicht 40 abnimmt. Die Konzentration der fluoreszierenden Materialien ist dabei so gewählt, daß die effektiv fluoreszierende Schicht nur weniger als 10 μm dick ist. Die anderen Schichten sind gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel unverändert, so daß für diese die glei¬ chen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen zu diesen entsprechend auch hier gelten.
Ein in Fig.5 in einer schematischen seitlichen Schnittan¬ sicht gezeigter Referenzkörper 41 nach einer vierten bevor¬ zugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkδrper 1 des ersten Ausführungsbeispiels bezie¬ hungsweise dem Referenzkörper 39 des dritten Ausführungs- beispiels dadurch, daß statt der Fluoreszenzschicht 2 be¬ ziehungsweise der Trägerschicht 40 eine formstabile, nicht
fluoreszierende, transparente, planparallele Platte 42, beispielsweise aus Glas, als Trägerschicht verwendet wird, auf die eine dünne, fluoreszierende Platte 43 konstanter Dicke aufgeklebt ist . Auf die transparente Platte 42 ist eine Metallschicht mit Feldern mit Abschwächungsschichten entsprechend der Metallschicht 3 im ersten Ausführungsbei¬ spiel aufgedampft, die daher mit demselben Bezugszeichen gekennzeichnet ist .
Die fluoreszierende Platte 43 enthält eine Mischung von fluoreszierenden Materialien, im Beispiel organischen Fluo- rophoren, so daß durch Anregung mit entsprechender opti¬ scher Strahlung Fluoreszenzstrahlung in einzelnen Bändern in dem Wellenlängenbereich zwischen dem UV- und dem NIR- Bereich erzeugt werden kann.
Ein in einer schematischen seitlichen Schnittansicht in Fig.6 veranschaulichter Referenzkörper 44 nach einer fünf¬ ten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von dem Referenzkörper 41 des vierten Ausführungsbei¬ spiels dadurch, daß die Fluoreszenzschicht beziehungsweise fluoreszierende Platte 43 auf einer anderen Seite der Trä¬ gerschicht 42 angeordnet ist als die Metallschicht 3, die unmittelbar auf die Trägerschicht 42 aufgedampft ist.
Bei der Herstellung wird zunächst die Trägerschicht 42 mit der Metallschicht 3 bedampft. In einem folgenden Schritt wird dann die spektrale Transmission der Abschwächungs¬ schichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 mit der grob schematisch in Fig.7 gezeigten Vorrichtung bestimmt. Diese Vorrichtung verfügt über eine Beleuchtungseinrichtung 45 mit einer Lichtquelle 46, einem Spektralfilter 47 zur Fil¬ terung des von der Lichtquelle 46 abgegebenen Lichts und
einer Kollimationsoptik 48 zur Bündelung des durch den Spektralfilter 47 hindurchtretenden Lichts und einen Trans¬ missionsdetektor 49, beispielsweise ein Spektrometer. Durch Bewegung des transparenten Trägers 42 mit der darauf ange¬ ordneten Metallschicht 3 quer zur Richtung des Lichts der Beleuchtungseinrichtung 45 kann die Transmission der Me¬ tallschicht 3 spektral- und ortsaufgelöst erfaßt werden.
Nach Ermittlung der Transmission der Abschwächungsschichten 17 bis 29 in den Feldern 4 bis 16 wird die transparente fluoreszierende Platte 43 mit der Trägerschicht 42 ver¬ klebt .
So wird ein Referenzkörper erhalten, für dessen Abschwä¬ chungsschichten das Transmissionsvermδgen genau bekannt ist und der damit eine sehr genaue Kalibrierung erlaubt.
Ein in Fig.8 schematisch gezeigter Referenzkörper nach ei¬ ner sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung un¬ terscheidet sich von dem Referenzkörper des fünften Ausfüh¬ rungsbeispiels nur durch die Reihefolge der Schichten, so daß die gleichen Bezugszeichen verwendet werden.
Die Fluoreszenzschicht 43, die im Beispiel eine Dicke von etwa 2 μm aufweist, ist nun nicht unmittelbar auf der Trä¬ gerschicht bzw. -platte 42 angeordnet, sondern auf der Me¬ tallschicht 3, in der in den Feldern die Abschwächungs¬ schichten unterschiedlichen Transmissionsvermögens ausge¬ bildet sind. Die Metallschicht 3 und insbesondere die Ab¬ schwächungsschichten 17 bis 29 sind dadurch von Umweltein¬ flüssen abgeschirmt.
Der Referenzkörper wird wie im vorhergehenden Ausführungs- beispiel hergestellt, wobei jedoch nun die Fluoreszenz¬ schicht 43, im Beispiel aus einem Polymer mit darin einge¬ lagerten Quantum-Dots, auf die MetallSchicht 3 und damit die Abschwächungsschichten 17 bis 29 aufgeschleudert wird, nachdem deren Transmissionsvermögen ermittelt wurde.
Bezugszeichenliste
Referenzkörper
Fluoreszenzschicht
Metallschicht ... , 16 Felder , ..., 29 Abschwächungsschicht
Referenzkörper
Rahmen gemusterter Bereich , ..., 36 transparenter Bereich
Feld
Abschwächungsschicht
Referenzkörper
Trägerschicht
Referenzkörper
Trägerschicht
Fluoreszenzschicht
Referenzkörper
Beleuchtungseinrichtung
Lichtquelle
Spektralfilter
Kollimationsoptik
Transmissionsdetektor