DE102008057115B4

DE102008057115B4 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe und Vorrichtung zu seiner Durchführung

Info

Publication number: DE102008057115B4
Application number: DE102008057115A
Authority: DE
Inventors: Dr. Egger Rafael
Original assignee: LRE Medical GmbH
Current assignee: LRE Medical GmbH
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2013-11-28
Anticipated expiration: 2028-11-14
Also published as: DE102008057115A1; US8334522B2; US20100117003A1

Abstract

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren mindestens einer Substanz in einer Probe, bei dem in einem ersten Messvorgang von einem optischen Element (REM) ein konstanter Anteil des von einer Referenzlichtquelle (28) ausgesandten Referenzlichts einer Referenzlichtwellenlänge (λr) in Richtung eines Empfangselements (38) eingekoppelt wird, wobei ein dem Teil des eingekoppelten Referenzlichts, der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender erster Messwert (Es2) erfasst wird, in einem zweiten Messvorgang die Probe mit dem von einer Anregungslichtquelle (26) ausgesandten Anregungslicht einer Anregungswellenlänge (λex) bestrahlt wird, wobei ein dem Teil des von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzlichtes einer Emissionswellenlänge (λem), der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender zweiter Messwert (Emes2) erfasst wird, und wobei beim zweiten Messvorgang das optische Element (REM) nicht im Strahlengang zwischen der Anregungslichtquelle (26) und dem Empfangselement (38) angeordnet ist, das Verhältnis (Emes2/Es2) des zweiten Messwerts (Emes2) und des ersten Messwerts (Es2) ermittelt wird, und bei dem die Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich unter Berücksichtigung des ermittelten Verhältnisses (Emes2/Es2) ermittelt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren mindestens einer Substanz in einer Probe, wobei diese mit von einer Anregungslichtquelle ausgesandtem Licht einer Anregungswellenlänge bestrahlt wird und die Intensität des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichtes einer Emissionswellenlänge mittels eines Empfangselementes gemessen wird.
Üblicherweise wird zum Kalibrieren eines gemessenen Intensitätswertes des Fluoreszenzlichts ein sogenannter Fluoreszenzstandard verwendet, der bei der Einstrahlung eines Anregungslichtes vorgegebener Wellenlänge und Intensität Fluoreszenzlicht mit einer bekannten Wellenlängenverteilung und Intensität abstrahlt. Die Langzeitstabilität von Fluoreszenzstandards dieser Art ist aber im Allgemeinen ungenügend. Ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen der Fluoreszenz eines Testmusters sind beispielsweise aus dem Dokument EP 0 237 363 A2 bekannt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, das in zuverlässiger und reproduzierbarer Weise eine Kalibrierung des gemessenen Fluoreszenzlichtes auch über längere Zeiträume hin gewährleistet.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, ein optisches Element vorzusehen, das einen konstanten Anteil des von einer Referenzlichtquelle ausgesandten Referenzlichts einer Referenzlichtwellenlänge in Richtung eines Empfangselements einkoppelt. Für das optische Element ist dieser Anteil auch über längere Zeiträume konstant, sodass dieses optische Element geeignet ist, einen Vergleichsstandard zum Bewerten eines Messwerts von erfasstem Fluoreszenzlicht zu bilden. Es wird ein erster Messwert erfasst, der dem Teil des durch das optische Element eingekoppelten Referenzlichts, der auf das Empfangselement auftrifft, entspricht. Ferner wird die Probe mit dem von einem Anregungslicht ausgesandten Anregungslichts einer Anregungswellenlänge bestrahlt. Es wird ein zweiter Messwert erfasst, der dem Teil des von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzlichts einer Emissionswellenlänge entspricht. Ferner wird das Verhältnis des zweiten Messwerts und des ersten Messwerts ermittelt. Die Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich wird unter Berücksichtigung des ermittelten Verhältnisses ermittelt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit der ermittelte Messwert bei der Erfassung des Fluoreszenzlichts auf den Messwert des vom optischen Element eingekoppelten Referenzlichts bezogen, sodass das optische Element als Referenzobjekt bzw. Referenzstandard dient. Um die Anzahl der Fluorophore der Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich exakt bestimmen zu können, kann eine einmalige Eichung des als Vergleichsstandard dienenden optischen Elements auf einen Fluoreszenzstandard mit einer bekannten Anzahl Fluorophore in einem Erfassungsbereich erfolgen. Bei weiteren Messungen zum Ermitteln der Anzahl der Fluorophore in einem Erfassungsbereich kann ein korrigierter Messwert bzw. kann die Anzahl der Fluorophore einfach unter Bezug auf das optische Element ermittelt werden.
Vorteilhaft ist es, zum Ermitteln der Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe im Erfassungsbereich eine Messvorrichtung zu verwenden. Mit Hilfe des ermittelten Verhältnisses und des während einer Kalibrierung der Messvorrichtung ermittelten Verhältnisses eines dritten Messwerts und eines vierten Messwerts wird die Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich der Probe bestimmt. Während der Kalibrierung wird von dem optischen Element der konstante Anteil des von der Referenzlichtquelle ausgesandten Referenzlichts in Richtung des Empfangselements eingekoppelt. Dabei wird ein dritter Messwert erfasst, der dem Teil des eingekoppelten Lichts, der auf das Empfangselement auftrifft, entspricht. Ein Fluoreszenzstandard wird mit dem von der Anregungslichtquelle ausgesandten Anregungslicht bestrahlt. Es wird ein vierter Messwert erfasst, der dem Teil des von dem Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichts, das auf das Empfangselement auftrifft, entspricht. Dadurch wird auf einfache Art und Weise die Beziehung zwischen dem Fluoreszenzstandard und dem optischen Element beim Kalibrierungsvorgang ermittelt, sodass dann die ermittelten Messwerte einer Probe auf das optische Element bezogen werden können. Über die bei der Kalibrierung ermittelte Beziehung zwischen dem optischen Element und dem Fluoreszenzstandard kann dann die Anzahl der Fluorophore der Probe oder ein korrigierter Messwert, der dem auf das Empfangselement auftreffenden Fluoreszenzlichts entspricht, ermittelt werden.
Das optische Element ist vorzugsweise ein Remissionsstandard. Ein solcher Remissionsstandard reflektiert aufgrund seiner optischen Eigenschaften einen konstanten Anteil des auftreffenden Lichts zumindest in einem Wellenlängenbereich. Dadurch kann der Remissionsstandard auf einfache Art und Weise anstatt einer Probe oder anstatt des Fluoreszenzstandards und/oder neben der Probe oder neben dem Fluoreszenzstandard zum Ermitteln der Messwerte positioniert werden.
Die Anzahl der Fluorophore der Probe wird vorzugsweise nach folgender Formel ermittelt:
wobei

FD_P: die Anzahl der Fluorophore der Probe im Erfassungsbereich ist;
E_mes2: ein dem Teil des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichts einer Emissionswellenlänge, der auf das Empfangselement auftrifft, entsprechender zweiter Messwert ist;
E_s2: ein dem Teil des eingekoppelten Lichts, der auf das Empfangselement auftrifft, entsprechender erster Messwert ist; und
X: ein konstanter Skalierungsfaktor ist, der eine Beziehung zwischen dem verwendeten optischen Element und dem Fluoreszenzstandard repräsentiert und der für das optische Element bei der Kalibrierung der Messvorrichtung bestimmt wird.

Ferner kann der Skalierungsfaktor X nach folgender Gleichung bestimmt werden:
wobei

E_s1: ein dem während der Kalibrierung von dem optischen Element in Richtung des Empfangselements eingekoppelten konstanten Anteil des von der Referenzlichtquelle ausgesandten Referenzlichts, das auf das Empfangselement auftrifft, entsprechender dritter Messwert ist;
E_mes1: ein dem Teil des vom Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichts, das auf das Empfangselement auftrifft, entsprechender vierter Messwert ist;
FD_FS: die bekannte Anzahl der Fluorophore des Fluoreszenzstandards im Erfassungsbereich ist.

Vorteilhaft ist es auch, die Intensität des von der Referenzlichtquelle ausgehenden Referenzlichts mit Hilfe eines weiteren Empfangselements zu messen. Ferner kann die Intensität des von der Anregungslichtquelle ausgesendeten Anregungslichts mit Hilfe des weiteren Empfangselements gemessen werden. Das Verhältnis der Intensität des Anregungslichts und der Intensität des Referenzlichts wird dann beim Bestimmen der Anzahl der Fluorophore der Probe berücksichtigt. Dadurch müssen keine Lichtquellen mit jeweils einer konstanten Lichtabgabe verwendet werden sondern die Lichtabgabe der Lichtquellen kann in einem Bereich variieren, wobei eine geänderte Lichtabgabe beim Bewerten des erfassten von der Probe emittierten Fluoreszenzlichts berücksichtigt wird.
Vorteilhaft ist es auch, das optische Element als Vergleichsstandard zum Kalibrieren des ermittelten zweiten Messwerts zu verwenden, wobei mit Hilfe des Vergleichsstandards insbesondere Verschmutzungen, Temperatureffekte und/oder Alterungseffekte von Elementen einer Messvorrichtung zum Durchführen des Verfahrens kompensiert werden können.
Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn der optische Weg zwischen der Referenzlichtquelle und dem optischen Element, das zum Einkoppeln des konstanten Anteils des von der Referenzlichtquelle ausgesandten Referenzlichts in Richtung des Empfangselements dient, durch dieselben optischen Elemente verläuft wie der optische Weg des Anregungslichts zwischen der Anregungslichtquelle und der Probe bzw. zwischen der Anregungslichtquelle und dem Fluoreszenzstandard. Dadurch ist ein einfacher Aufbau einer Anordnung zum Durchführen des Verfahrens möglich. Ferner wirkt sich eine Änderung der Eigenschaft der optischen Elemente im optischen Weg sowohl auf das Referenzlicht als auch auf das Anregungslicht aus. Alternativ kann im optischen Weg des Anregungslichts zusätzlich ein Filter angeordnet werden, dessen Transmissionsbereich um die Anregungswellenlänge zentriert ist. Das Filter ist nicht im optischen Weg des Referenzlichts zwischen der Referenzlichtquelle und dem optischen Element angeordnet.
Ferner ist es vorteilhaft, die optischen Wege des Anregungslichts und des Referenzlichts unter unterschiedlichen Winkeln auf das optische Element zu richten. Dadurch ist ein einfacher Aufbau einer Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens möglich. Insbesondere ist ein geringer Platzbedarf zum Anordnen der Referenzlichtquelle und der Anregungslichtquelle erforderlich.
Ferner ist es vorteilhaft, wenn der optische Weg zwischen dem optischen Element, das zum Einkoppeln des konstanten Anteils des von der Referenzlichtquelle ausgesandten Referenzlichts in Richtung des Empfangselements dient, und dem Empfangselement durch dieselben optischen Elemente verläuft wie der optische Weg des Fluoreszenzlichts zwischen der Probe und dem Empfangselement bzw. zwischen dem Fluoreszenzstandard und dem Empfangselement. Dadurch wirken sich veränderte optische Eigenschaften der optischen Elemente in gleicher Weise auf das Referenzlicht aus wie auf das Fluoreszenzlicht.
Ferner ist es vorteilhaft, beim Kalibrieren der Messvorrichtung zur Bestimmung des Skalierungsfaktors zunächst den Fluoreszenzstandard mit Hilfe des Anregungslichts nach folgender Gleichung zu vermessen: E_mes1 = P_ex1·FD_FS·K_ex wobei

E_mes1: die gemessene Intensität von Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichtes ist;
P_ex1: die gemessene Intensität des Anregungslichtes ist;
FD_FS: die Anzahl der Fluorophore des Fluoreszenzstandards im Erfassungsbereich ist; und
K_ex: eine Proportionalitätskonstante ist;

E_s1 = P_em1·REM·K_em

E_s1: die gemessene Intensität des vom optischen Element in Richtung des Empfangselements eingekoppelten Referenzlichtes ist;
P_em1: die gemessene Intensität des von der Referenzlichtquelle abgestrahlten Referenzlichtes ist;
REM: der konstante Anteil des vom optischen Element in Richtung des Empfangselements eingekoppelten Referenzlichts ist; und
K_em: eine Proportionalitätskonstante ist;

X' unterscheidet sich von X dadurch, dass die gemessene Lichtintensität des Anregungslichts und des Referenzlichts mit berücksichtigt werden. Somit kann der Faktor X vorzugsweise bei Messanordnungen mit einer stabilisierten Referenzlichtquelle und einer stabilisierten Anregungslichtquelle verwendet werden, die Referenzlicht bzw. Anregungslicht mit jeweils einer konstanten Intensität abgeben.
Die Probe bzw. das optische Element können vorteilhafterweise scannend vermessen werden. Alternativ ist auch eine nicht scannende Vermessung der Probe und des optischen Elements möglich.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfasst vorzugsweise eine Auflage für eine zu vermessende Probe, einen Senderzweig mit einer Anregungslichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht einer Anregungswellenlänge, ein erstes Empfangselement zur Messung der Intensität des Anregungslichts und ein im Weg des Anregungslichts angeordnetes erstes Filter, dessen Transmissionsbereich um die Anregungswellenlänge zentriert ist, sowie einen Empfangszweig mit einem zweiten Empfangselement zur Messung der Intensität des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichts einer Emissionswellenlänge und einem zweiten Filter, dessen Transmissionsbereich um die Emissionswellenlänge zentriert ist. Dabei ist im Sendezweig eine Referenzlichtquelle zum Aussenden mindestens eines Referenzstrahls der Emissionswellenlänge vorgesehen. Das erste Empfangselement ist zur Messung der Intensität des Lichts beider Lichtquellen des Sendezweigs vorgesehen. In der Vorrichtung ist ein optisches Element so angeordnet, dass es das Licht der Referenzlichtquelle des Sendezweigs empfängt. Mit einer solchen relativ einfach aufgebauten Vorrichtung kann die Anzahl der Fluorophore einer Probe in einem Erfassungsbereich einfach ermittelt werden, wobei die Änderungen von Eigenschaften der Vorrichtung durch die Referenzmessung mit Hilfe des optischen Elements kompensiert werden können. Der Sendezweig und der Empfangszweig sind vorzugsweise zu einem Optikmodul zusammengeführt, das relativ zu dem optischen Element und zu der Probenauflage verstellbar ist. Ferner ist es vorteilhaft, das erste Empfangselement zwischen dem ersten Filter und der Probenauflage bzw. zwischen dem ersten Filter und dem optischen Element anzuordnen.
Da die Intensität des Fluoreszenzlichtes im Vergleich zum Anregungslicht um mehrere Größenordnungen geringer sein kann, muss vermieden werden, dass gestreutes Anregungslicht oder sonstiges Fremdlicht das Empfangselement erreicht. Im Allgemeinen werden hierzu Filter verwendet, die so gewählt sind, dass ein im Anregungslichtstrahl angeordnetes Filter im Wesentlichen nur die Wellenlänge des Anregungslichtes und ein im Messzweig angeordnetes Filter im Wesentlichen nur die Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes durchlässt. Daher wird für die Vermessung des optischen Elements bei einer vorteilhaften Weiterbildung der erfindungsgemäßen Lösung Referenzlicht mit der Emissionswellenlänge, d. h. der Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes, verwendet.
Die beiden Lichtquellen des Senderzweiges können so angeordnet sein, dass die optischen Wege der Lichtstrahlen der beiden Lichtquellen des Senderzweiges zumindest annähernd gleich sind. Sie können aber auch so angeordnet sein, dass die optischen Wege von Anregungslicht und Referenzlicht unter unterschiedlichen Winkeln auf den Remissionsstandard gerichtet sind. Im ersteren Fall muss die Referenzlichtquelle stärker sein, da das Referenzlicht auch durch das im Anregungslichtstrahl angeordnete Filter fällt, dessen Transmissionsbereich im wesentlichen der Anregungswellenlänge entspricht und daher die Intensität des Referenzlichtes mit der Emissionswellenlänge stark schwächt. Dies wird im zweiten Fall vermieden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann also eine Kalibrierung mit Hilfe eines optischen Elements bzw. Remissionsstandards durchgeführt werden, der mit der gewünschten Langzeitstabilität hergestellt werden kann. Es ist lediglich eine einmalige Eichung dieses optischen Elements während einer Inbetriebnahmekalibrierung einer Messvorrichtung zum Durchführen des Verfahrens mittels eines geeichten Fluoreszenzstandards notwendig. Anschließend kann die Fluoreszenzdichte immer unter Bezug auf einen hinterlegten internen optischen Element bzw. Remissionsstandard erfolgen. Die Inbetriebnahmekalibrierung erfolgt beispielsweise beim Hersteller der Messvorrichtung vor der Auslieferung der Messvorrichtung an einen Kunden oder alternativ bei einer Inbetriebnahme oder Wiederinbetriebnahme der Messvorrichtung bei einem Kunden bzw. Anwender. Eine solche Inbetriebnahmekalibrierung hat insbesondere das Ziel, die Variation der Messergebnisse zwischen mehreren hergestellten Messvorrichtungen zu minimieren und/oder eine Rückführbarkeit der Messergebnisse einer Messvorrichtung auf einen verbindlichen und langzeitstabilen Standard oder auf ein Kollektiv aus mehreren Messvorrichtungen zu ermöglichen. Bei einer Rückführung der Messergebnisse einer Messvorrichtung auf ein Kollektiv aus mehreren Messvorrichtungen sind die Messergebnisse aller Messvorrichtungen des Kollektivs untereinander einfach vergleichbar.
Für eine Messvorrichtung sind zwei alternative Vorgehensweisen möglich:

1. Der Fluoreszenzstandard FD_FS wird bei der Inbetriebnahme jeder einzelnen Messvorrichtung als Vergleichsstandard für die Inbetriebnahmekalibrierung verwendet. Dies setzt voraus, dass dieser Fluoreszenzstandard hochstabil ist oder mit Hilfe eines Referenzgerätes nachgemessen werden kann und die beim Nachmessen ermittelten Änderungen der Eigenschaften des Fluoreszenzstandards bei der Inbetriebnahmekalibrierung berücksichtigt werden.
2. Der Fluoreszenzstand FD_FS wird bei der Inbetriebnahme einer Referenzmessvorrichtung verwendet. Ferner wird mit Hilfe der Referenzmessvorrichtung ein optisches Element, insbesondere ein Remissionsstandard, vermessen und eine Beziehung zwischen dem Fluoreszenzstandard und den optischen Eigenschaften des optischen Elements, insbesondere den Remissionseigenschaften des Remissionsstandards, ermittelt. Dadurch wird eine eindeutige Korrelation zwischen den Remissionswerten des optischen Elements und den Fluoreszenzeigenschaften des Fluoreszenzstandards FD_FS ermittelt und in Messvorrichtungen als Korrelation zwischen den Remissionswerten eines in diesen weiteren Messvorrichtungen enthaltenen optischen Elements voreingestellt. Das optische Element der weiteren Messvorrichtungen hat die gleichen optischen Remissionseigenschaften, wie das optische Element der Referenzmessvorrichtung. Zur Bestimmung der Fluoreszenzeigenschaften einer zu untersuchenden Probe wird dann der Skalierungsfaktor X oder X' genutzt, wie weiter oben bereits ausführlich erläutert. Die Angabe des Fluoreszenzstandards FD_FS ist nicht zwangsläufig die Anzahl der Fluorophore pro Fläche bzw. die Fluorophordichte. Alternativ kann FD_P auch allgemein ein Maß für die Konzentration einer Substanz in der Probe sein.

Die Vorrichtung kann mit weiteren Merkmalen weitergebildet werden, die insbesondere in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angegeben sind. Insbesondere kann die Vorrichtung mit den Merkmalen der abhängigen Verfahrensansprüche bzw. entsprechenden Vorrichtungsmerkmalen weitergebildet werden.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den beigefügten Figuren. Es zeigen:
1 die Wellenlängenverteilung des Anregungslichtes und des Fluoreszenzlichtes sowie die Filtercharakteristiken von Interferenzfiltern für das Anregungslicht bzw. das Fluoreszenzlicht,
2 und 3 schematische Ansichten zweier Ausführungsbeispiele von Messanordnungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
4 und 5 schematische Ansichten zweier weiterer Ausführungsformen des Senderzweigs einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1 zeigt den Verlauf der Effizienz des Anregungslichtes über der Wellenlänge in einer Kurve 10 sowie die Emissionscharakteristik des zugehörigen Fluoreszenzlichtes in einer Kurve 12. Ferner ist durch ein Rechteck 14 die Filtercharakteristik für den Anregungszweig oder Senderzweig und mit dem Rechteck 16 die Filtercharakteristik für einen Empfänger- oder Messzweig dargestellt. Wenn, wie in 1 dargestellt, die Stokes-Differenz klein ist, werden für die Filter 14 und 16 vorzugsweise Interferenzfilter mit sehr steilen Flanken eingesetzt. Die Interferenzfilter für den Anregungszweig werden vorzugsweise so dimensioniert, dass die maximale Anregungseffizienz erreicht wird und auch die Wellenlänge der Anregungslichtquelle sich in dem Transmissionsbereich des Filters bewegt.
In dem in der 2 dargestellten Ausführungsbeispiel wird mit 18 schematisch eine Auflage für eine zu vermessende Probe bzw. einen Remissionsstandard bezeichnet. Oberhalb dieser Ebene 18 befindet sich ein allgemein mit 20 bezeichnetes Optikmodul mit einem Senderzweig 22 und einem Empfangs- oder Messzweig 24.
Der Senderzweig 22 hat eine erste Lichtquelle oder Anregungslichtquelle 26, die Licht mit der Anregungswellenlänge λ_ex aussendet. Neben dieser befindet sich eine zweite Lichtquelle oder Referenzlichtquelle 28, die Licht der Referenzwellenlänge λ_em aussendet. Diese Wellenlänge entspricht im Wesentlichen der Wellenlänge des von der angeregten Probe ausgesandten Fluoreszenzlichtes und fällt somit in die Filtercharakteristik 16. Die beiden Lichtquellen können LEDs sein. Die Strahlen beider Lichtquellen 26 und 28 passieren ein Filter 30, das die Filtercharakteristik 14 der 1 hat. Da die Referenzwellenlänge λ_em außerhalb der Filtercharakteristik 14 liegt, wird das Referenzlicht um einen Faktor 100 bis 1.000.000 abgeschwächt. Vorzugsweise hat die Referenzlichtquelle daher eine wesentlich höhere Leistung als die Anregungslichtquelle 26. Die Intensitäten beider Lichtquellen 26 und 28 werden mit einer ein erstes Empfangselement 32 darstellenden Monitordiode gemessen. Der Empfangszweig 24 hat eine Optik 34, ein Filter 36 mit der Filtercharakteristik 16 sowie eine als zweites Empfangselement dienende Fotodiode 38.
Vor der eigentlichen Messung einer Probe wird ein Remissionsstandard vermessen. Hierzu dient der Referenzstrahl der Referenzlichtquelle 28. Die Wellenlänge λ_em des Referenzlichtes wird zwar durch das Filter 30 abgeschwächt, jedoch erreicht die Remission des Remissionsstandards die Fotodiode 38 ungehindert. Da die Remission um mehrere Größenordnungen größer ist als die Fluoreszenz, wird ein großer Teil der Abschwächung des Referenzlichtes durch das Filter 30 wieder kompensiert. Die Leistung an der Fotodiode 38 ist daher vergleichbar mit der Leistung der Fluoreszenzemission der Probe. Die Monitordiode 32 allerdings wird durch die Referenzlichtquelle 28 wesentlich weniger ausgesteuert als durch die Anregungslichtquelle 26. Bei einem integrierenden Messverfahren kann dies durch unterschiedlich lange Integrationszeiten zum Teil kompensiert werden. Auch gibt es Messverfahren, die bei konstanter Integrationszeit mit einem Signal-/Rauschverhältnis von 100 immer noch einen Messbereich von ca. 200 aufweisen. Die Kombination aus unterschiedlicher Integrationszeit und Messbereich sollte einen Intensitätsunterschied der beiden Lichtquellen an der Monitordiode 30 von ca. 50.000 mit einem Signal-/Rauschverhältnis von 100 ermöglichen.
Während die Vermessung des Remissionstandards, d. h. des internen Standards mit Licht der Wellenlänge λ_em durchgeführt wird, erfolgt die eigentliche Fluoreszenzmessung mit Licht der Wellenlänge λ_ex. Die Kalibrierung der Messergebnisse erfolgt über Referenzierung auf die Messung des internen Standards. Damit diese Vorgehensweise gültig ist, sollten die Strahlenverläufe des Referenzlichtes und des Anregungslichtes nahezu identisch sein, wie dies bei der Ausführungsform von 1 der Fall ist. Hierzu ist es zweckmäßig, sehr kleine Lichtquellen wie SMD-LEDs zu verwenden. Die Lichtwege im Empfängerzweig sind nahezu identisch, da bei der Anregung der Fluoreszenz die emittierte Wellenlänge der Wellenlänge der Referenzwellenlänge entspricht. Die Abbildungsverhältnisse sind identisch. Die Transmission durch das Filter 36 kann leicht variieren, da die Emission ein breiteres Spektrum hat als das Spektrum der Referenzlichtquelle. Allerdings ist dies eine Konstante und ändert sich nicht mit der Zeit. Auch der Temperaturverlauf ist vernachlässigbar klein.
Bei der in 3 dargestellten Ausführungsform wird das Licht der Referenzlichtquelle 28 getrennt von der Anregungslichtquelle 26 in einen Lichtleiter 40 eingespeist. Der Lichtleiter 40 homogenisiert das Licht, so dass nach dem Austritt die Intensitätsverteilungen der beiden Lichtquellen nahezu identisch sind. Ein Teil des Lichtes wird über einen Strahlenteiler 42 ausgekoppelt und zu der Monitordiode 32 gelenkt. Der Strahlenteiler 42 kann auch entfallen, wobei dann das Licht getrennt aus dem Lichtleiter 40 ausgekoppelt und zu der Monitordiode 32 gelenkt wird. Die Lichtverteilung am Ort 44 der Probe bzw. des Remissionsstandards ist für beide Wellenlängen λ_ex und λ_em nahezu identisch.
Der Vorteil der Ausführungsform gemäß 3 im Vergleich zur Ausführungsform gemäß 2 liegt darin, dass das Referenzlicht nicht durch das Filter 30 geht und somit auch nicht abgeschwächt wird. Es kann somit eine schwächere Referenzlichtquelle verwendet werden. Die Verhältnisse der Lichtintensitäten an der Monitordiode 32 und an der Fotodiode 38 können über die Leistung der Referenzlichtquelle gesteuert werden.
4 zeigt lediglich den Senderzweig 22 einer Messanordnung. Dabei werden die Lichtstrahlen beider Lichtquellen 26 und 28 jeweils durch eine Linse 46 kollimiert. Die Lichtstrahlen werden erst in der Messebene 18 zusammengeführt. Das Filter 30 ist nur im Anregungslichtstrahl angeordnet. Das Referenzlicht trifft ohne Abschwächung durch ein Filter auf die Messebene 18. Die Leistung der beiden Lichtquellen wird wieder mittels einer Monitordiode 32 gemessen, die sich direkt im Strahlengang der Beleuchtung findet. Sie stellt aber kein Hindernis für die Ausleuchtung des Messfeldes dar, dessen Größe über eine Blende 48 festgelegt wird. Die Abbildungsoptik, d. h. der Empfangszweig 24 ist in diesem Falle nicht gezeigt. Die optische Achse des Empfangszweigs ist in der x-z-Ebene gekippt, während die optische Achse der Beleuchtung in der z-y-Ebene gekippt ist, wie dies 4 zeigt.
5 zeigt eine Ausführungsform, die vorzugsweise in nichtscannenden Systemen eingesetzt wird. Hier wird das Messfeld vollständig ausgeleuchtet und das Fluoreszenzlicht auf einen zweidimensionalen Sensor abgebildet. Wobei der Empfangszweig ebenso wie bei der Darstellung in 4 nicht abgebildet ist. Um eine gleichmäßige Beleuchtung zu erreichen, wird vorzugsweise eine Streuscheibe 50 eingesetzt. Der Aufbau ist ansonsten ähnlich wie bei der Ausführungsform gemäß 4. Allerdings wird hier nicht das Messfeld unmittelbar beleuchtet, sondern die Streuscheibe 50. Aufgrund dieser Anordnung wird die Beleuchtungsverteilung in der Messebene 18 für beide Wellenlängen λ_ex und λ_em nahezu identisch sein.
Bei einem scannenden System wird vor der eigentlichen Messung der interne Standard mit der Referenzlichtquelle vermessen, wie dies oben beschrieben wurde. Bei einem nichtscannenden System mit zum Beispiel einer flächenhaften Beleuchtung und einem 2-D-Sensor für den Empfangszweig kann die Remissionsmessung mit einem QC-Element (qualitiy cartridge) erfolgen, das anstelle des Fluoreszenzmessfeldes eine definierte Remission hat. Die QC-Messung wird dann zwar nicht vor jeder Messung durchgeführt, jedoch können Alterungseffekte der Lichtquelle oder Verschmutzungen der Optik damit frühzeitig erkannt werden.
Damit mit den Vorrichtungen nach den 2 bis 5 auf Remissionswerte bezogene Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden können, muss bei der Inbetriebnahme der Vorrichtung eine Kalibrierung durchgeführt werden. Diese wird im Folgenden anhand eines scannenden Systems mit eingebautem internen Remissionsstandard erläutert. Die Beschreibung kann jedoch auch ohne weiteres auf ein nichtscannendes System übertragen werden. Statt des internen Remissionsstandards wird dort vorzugsweise ein QC-Element auf Remissionsbasis verwendet.
Die Kalibrationsmessung ist in der Regel nur einmal erforderlich. Ein Gerät im Labor oder im Feld bezieht sich dann immer auf den internen Remissionsstandard. Vor der Inbetriebnahme eines Gerätes werden folgende Schritte ausgeführt:
Zunächst wird ein externer Fluoreszenzstandard mit der Anregungslichtquelle 26 vermessen: E_mes1 = P_ex1·FD_FS·K_ex wobei

P_ex1: = die mit Hilfe der Monitordiode 32 gemessene Intensität des Anregungslichtes ist;
FD_FS: = die Anzahl der Fluorophore des Fluoreszenzstandards im Erfassungsbereich ist;
E_mes1: = die mit Hilfe der Fotodiode 38 gemessenen Intensität von Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichtes ist; und
K_ex: = eine aus obiger Gleichung zu bestimmender Proportionalitätskonstante.

Der Faktor K_ex gibt an, wie effizient die Leistung der Anregungswellenlänge λ_ex in Fluoreszenz umgewandelt werden kann. Da ja in der Regel nicht die gesamte Leistung der Beleuchtung in der Messfeldebene mit der Monitordiode 32 gemessen wird, steckt das Verhältnis von gemessener Leistung zur Gesamtleistung ebenfalls in diesem Faktor.
Zusätzlich wird der interne Remissionsstandard der Vorrichtung mit der Referenzlichtquelle 28 vermessen: E_s1 = P_em1·REM·K_em wobei

P_em1: = die mit Hilfe der Monitordiode 32 gemessene Intensität des Referenzlichtes ist;
REM: = der konstante Anteil des vom optischen Element REM in Richtung des Empfangselements 38 eingekoppelten Referenzlichts ist;
E_s1: = die gemessene Intensität des vom optischen Element REM in Richtung des Empfangselements 38 eingekoppelten Referenzlichtes ist;
K_em: = eine aus obiger Gleichung zu bestimmende Proportionalitätskonstante ist.

Die beiden Proportionalitätsfaktoren K_ex und K_em hängen über eine Konstante X zusammen, die im Folgenden zu bestimmen ist: K_ex = X·K_em
Eine Voraussetzung für die weiteren Berechnungen ist, dass der Zusammenhang zwischen K_em und K_ex konstant bleibt. Da nur das Verhältnis von P_ex und P_em für die folgende Konstante X relevant ist, und nicht die Absolutwerte, sollte diese Annahme korrekt sein. Eine Verschmutzung der Optik beispielsweise betrifft K_ex und K_em in gleichem Maße, so dass die Konstante X davon nicht beeinflusst wird.
Die Konstante X wird unmittelbar nach der Kalibrierung ermittelt zu:
Mit der Ermittlung der Konstante X' können alle Fluoreszenzmessungen nun auf einen internen Remissionsstandard bezogen werden, der im Gegensatz zu einem internen Fluoreszenzstandard langzeitstabil ist. Damit erhält man für die Anzahl der Fluorophore in mindestens einer Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich, die ein Maß FD_P für die Konzentration einer Substanz in einer vermessenen Probe im Erfassungsbereich ist, nachfolgende Gleichung:
In diese Gleichung werden während der Vermessung des Remissionsstandards die Größen P_em2 und E_s2 ermittelt. Während der Vermessung der Probe werden die Werte E_mes2 und P_ex2 gemessen. In die Berechnung gehen somit nur die gemessenen Signalstärken E_S2, E_mes2 und die Verhältnismessungen der Intensitätsmessungen P_em2 und P_ex2 ein. Die Konstante X' ist bekannt, ebenso wie der Wert REM des Remissionsstandards.
Die angesprochenen Empfangselemente können Fotodioden, Zeilensensoren, Flächensensoren oder auch Fotomultiplier sei. In scannenden Systemen werden vorzugsweise Fotodioden und Zeilensensoren eingesetzt.
Die Fotodiode 32 kann auch zur Leistungsstabilisierung der Lichtquellen eingesetzt werden. Bei Leuchtdioden reduziert sich die optische Ausgangsleistung in der Regel durch Aufheizungsprozesse während des Betriebes. Mit einer Regelung können diese Effekte reduziert werden. Auch Alterungsprozesse der LEDs können damit abgefangen werden. Die Teststreifen oder Probenträger werden somit immer mit der gleichen Leistung bestrahlt und eventuell auftretendes Ausbleichen findet somit immer unter gleichen Bedingungen statt.
Bei Laserdioden gibt es zwar in der Regel eine interne Monitordiode, welche für Leistungsregelungen eingesetzt werden kann, jedoch ist die damit erreichbare Stabilität häufig nicht ausreichend.

Claims

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren mindestens einer Substanz in einer Probe, bei dem in einem ersten Messvorgang von einem optischen Element (REM) ein konstanter Anteil des von einer Referenzlichtquelle (28) ausgesandten Referenzlichts einer Referenzlichtwellenlänge (λ_r) in Richtung eines Empfangselements (38) eingekoppelt wird, wobei ein dem Teil des eingekoppelten Referenzlichts, der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender erster Messwert (E_s2) erfasst wird, in einem zweiten Messvorgang die Probe mit dem von einer Anregungslichtquelle (26) ausgesandten Anregungslicht einer Anregungswellenlänge (λ_ex) bestrahlt wird, wobei ein dem Teil des von der Probe abgestrahlten Fluoreszenzlichtes einer Emissionswellenlänge (λ_em), der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender zweiter Messwert (E_mes2) erfasst wird, und wobei beim zweiten Messvorgang das optische Element (REM) nicht im Strahlengang zwischen der Anregungslichtquelle (26) und dem Empfangselement (38) angeordnet ist, das Verhältnis (E_mes2/E_s2) des zweiten Messwerts (E_mes2) und des ersten Messwerts (E_s2) ermittelt wird, und bei dem die Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich unter Berücksichtigung des ermittelten Verhältnisses (E_mes2/E_s2) ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Ermitteln der Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe im Erfassungsbereich eine Messvorrichtung verwendet wird, dass mit Hilfe des ermittelten Verhältnisses (E_mes2/E_s2) und des während einer Kalibrierung der Messvorrichtung ermittelten Verhältnisses (E_s1/E_mes1) eines dritten Messwerts (E_s1) und eines vierten Messwerts (E_mes1) die Anzahl der Fluorophore in der Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich der Probe bestimmt wird, wobei während der Kalibrierung von dem optischen Element (REM) der konstante Anteil des von der Referenzlichtquelle (28) ausgesandten Referenzlichts in Richtung des Empfangselements (38) eingekoppelt wird und ein dem Teil des eingekoppelten Lichts, der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender dritter Messwert (E_s1) erfasst wird, wobei ein Fluoreszenzstandard mit dem von der Anregungslichtquelle (26) ausgesandten Anregungslicht bestrahlt wird und ein dem Teil des von dem Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichtes, das auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender vierter Messwert (E_mes1) erfasst wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element ein Remissionsstandard (REM) verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (REM) als Vergleichsstandard zum Kalibrieren des ermittelten zweiten Messwerts (E_mes2) verwendet wird, wobei mit Hilfe des Vergleichsstandards insbesondere Verschmutzungen, Temperatureffekte und/oder Alterungseffekte von Elementen einer Messvorrichtung zum Durchführen des Verfahrens kompensiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Fluorophore der Probe nach folgender Formel ermittelt wird:
wobei FD_P die Anzahl der Fluorophore der Probe ist; E_mes2 ein dem Teil des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichts einer Emissionswellenlänge, der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender zweiter Messwert ist; E_s2 ein dem Teil des eingekoppelten Lichts, der auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender erster Messwert ist; und X ein konstanter Skalierungsfaktor ist, der eine Beziehung zwischen dem verwendeten optischen Element (REM) und dem Fluoreszenzstandard repräsentiert und der für das optische Element (REM) bei der Kalibrierung der Messvorrichtung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Skalierungsfaktor X nach folgender Gleichung bestimmt wird:
wobei E_s1 ein dem während der Kalibrierung von dem optischen Element in Richtung des Empfangselements (38) eingekoppelten konstanten Anteil des von der Referenzlichtquelle (28) ausgesandten Referenzlichts, das auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender dritter Messwert ist; E_mes1 ein dem Teil des vom Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichts, das auf das Empfangselement (38) auftrifft, entsprechender vierter Messwert ist; und FD_FS die bekannte Anzahl der Fluorophore des Fluoreszenzstandards im Erfassungsbereich ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Weg zwischen der Referenzlichtquelle (28) und dem optischen Element (REM), das zum Einkoppeln des konstanten Anteils des von der Referenzlichtquelle (28) ausgesandten Referenzlichts in Richtung des Empfangselements (38) dient, durch dieselben optischen Elemente verläuft wie der optische Weg des Anregungslichts zwischen der Anregungslichtquelle (26) und der Probe oder zwischen der Anregungslichtquelle (26) und dem Fluoreszenzstandard.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass im optischen Weg des Anregungslichts zwischen der Anregungslichtquelle (26) und der Probe oder zwischen der Anregungslichtquelle (26) und dem Fluoreszenzstandard ein Filter (30) angeordnet wird, dessen Transmissionsbereich um die Anregungswellenlänge (λ_ex) zentriert ist, wobei das Filter nicht im optischen Weg des Referenzlichts zwischen der Referenzlichtquelle (28) und dem optischen Element (REM) angeordnet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Wege des Anregungslichtes und des Referenzlichtes unter unterschiedlichen Winkeln auf das optische Element (REM) gerichtet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Weg zwischen dem optischen Element (REM), das zum Einkoppeln des konstanten Anteils des von der Referenzlichtquelle (28) ausgesandten Referenzlichts in Richtung des Empfangselements (38) dient, und dem Empfangselement (38) durch dieselben optischen Elemente verläuft wie der optische Weg des Fluoreszenzlichts zwischen der Probe und dem Empfangselement (38) oder zwischen dem Fluoreszenzstandard und dem Empfangselement (38).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der Referenzlichtquelle (28) und die Intensität der Anregungslichtquelle (26) mit einem weiteren Empfangselement (32) gemessen und zur Leistungsregelung der beiden Lichtquellen (26, 28) verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität (P_em) des von der Referenzlichtquelle (28) ausgehenden Referenzlichtes mit Hilfe eines weiteren Empfangselements (32) gemessen wird, dass die Intensität (P_ex) des von der Anregungslichtquelle (26) ausgehenden Anregungslichts mit Hilfe des weiteren Empfangselementes (32) gemessen wird, und dass das Verhältnis der Intensität des Anregungslichts und der Intensität des Referenzlichts beim Bestimmen der Anzahl der Fluorophore der Probe berücksichtigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass beim Kalibrieren der Messvorrichtung zur Bestimmung des Skalierungsfaktors X' zunächst der Fluoreszenzstandard mittels des Anregungslichtes nach folgender Gleichung vermessen wird: E_mes1 = P_ex1·FD_FS·K_ex wobei E_mes1 die gemessene Intensität vom Fluoreszenzstandard abgestrahlten Fluoreszenzlichtes ist; P_ex1 die gemessene Intensität des Anregungslichtes ist; FD_FS die Anzahl der Fluorophore des Fluoreszenzstandards im Erfassungsbereich ist; und K_ex eine Proportionalitätskonstante ist; dass anschließend das optische Element (REM) mittels des Referenzlichtes nach folgender Gleichung vermessen wird: E_s1 = P_em1·REM·K_em wobei E_s1 die gemessene Intensität des vom optischen Element (REM) in Richtung des Empfangselements (38) eingekapselten Referenzlichtes ist; P_em1 die gemessene Intensität des von der Referenzlichtquelle (28) abgestrahlten Referenzlichtes ist; REM der konstante Anteil des vom optischen Element (REM) in Richtung des Empfangselements (38) eingekoppelten Referenzlichts ist; und K_em eine Proportionalitätskonstante ist; und dass hieraus X' nach folgender Gleichung berechnet wird
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Fluorophore in mindestens einer Substanz der Probe in einem Erfassungsbereich nach folgender Gleichung ermittelt wird:
wobei FD_P ein Maß für die Anzahl der Fluorophore im Erfassungsbereich ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe oder das optische Element (REM) scannend vermessen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe oder das optische Element (REM) nichtscannend vermessen werden.
Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend eine Auflage (18) für eine zu vermessende Probe, einen Senderzweig (22) mit einer Anregungslichtquelle (26) zum Aussenden von Anregungslicht einer Anregungswellenlänge (λ_ex), einem ersten Empfangselement (32) zur Messung der Intensität (P_ex) des Anregungslichtes und ein im Weg des Anregungslichtes angeordnetes erstes Filter (30), dessen Transmissionsbereich um die Anregungswellenlänge (λ_ex) zentriert ist, sowie einen Empfangszweig (24) mit einem zweiten Empfangselement (38) zur Messung der Intensität (E_mes2) des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichtes einer Emissionswellenlänge (λ_em) und einem zweiten Filter (36), dessen Transmissionsbereich um die Emissionswellenlänge (λ_em) zentriert ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Senderzweig (22) eine Referenzlichtquelle (28) zum Aussenden einer Referenzstrahlung der Emissionswellenlänge (λ_em) hat, dass das erste Empfangselement (32) zur Messung der Intensität des Lichtes beider Lichtquellen (26, 28) im Senderzweig (22) angeordnet ist und dass in der Vorrichtung ein optisches Element (REM) so angeordnet ist, dass es das Licht der Referenzlichtquelle (28) des Senderzweiges (22) empfängt.
Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Senderzweig (22) und der Empfangszweig (24) zu einem Optikmodul (20) zusammengefasst sind, das relativ zu dem optischen Element (REM) und der Probenauflage (18) verstellbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Empfangselement (32) zwischen dem ersten Filter (30) und der Probenauflage (18) oder dem optischen Element (REM) angeordnet ist.