DE3212219A1

DE3212219A1 - Fluoreszenzspektrophotometer

Info

Publication number: DE3212219A1
Application number: DE19823212219
Authority: DE
Inventors: Omar Soliman Plano Tex. Khalil
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1981-04-02
Filing date: 1982-04-01
Publication date: 1982-11-04
Also published as: GB2150704A; GB2142156A; GB2096352A; CA1185705A; GB8412736D0; GB2142156B; FR2503369B1; GB2096352B; GB2150704B; GB8412735D0; DE3212219C2; FR2503369A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzspektrophotometer, bei dem eine Anregung einer zu analysierenden Substanz durch Strahlungsenergie, erfolgt und die durch diese Anregung hervorgerufene Fluoreszenz bestimmt wird.

Die US-PSen 3 664 744, 3 748 044, 3 831 618, 3 811 780, 3 900 289, 3 833 304 und 3 817 425 beschreiben eingehend bichromatische Spektrophotorneter und damit im Zusammenhang stehende Vorrichtungen. Hingewiesen sei auch auf die US-PSen 3 8II 777, 3 97 3 129, M 058 732, 3 906 226, H 117 338 und andere Literaturstellen, die im Verfahren der US-Anmeldung 86 202 vom 17.1ο.1979 genannt wurden. Die Bedienungsanleitung Abbott VP Bichromatic Analyzer (1978) (erhältlich durch Abbott Laboratories Diagnostic Division, 1921 Hurd Drive, Irving, Texas 75062, beschreibt bichromatische Änalysengeräte und Einzelheiten bezüglich ihrer Bedienung.

Erf induiigsgemäss wird ein verbesserte s Filteraggregat zur Verfügung gestellt, das' derartige bichromatische Spektrophotometer zu fluoreszierenden Spektrophotometern macht, deren Empfindlichkeit ausreicht, genaue Fluoreszenzimmunoassay-Messungen in extrem verdünnten Lösungen durchzuführen. Die vorgenannten Literaturstellen stellen für die Erfindung und deren bevorzugte Ausführungsformen einen wesentlichen allgemeinen Stand der Technik dar.

Um die Konzentration einer bestimmten Substanz in einer chemischen Probe, wie Blut, Serum und Urin, rasch und genau bestimmen zu können, bedient man sich weitgehend photometrischer Messungen unter Verwendung von Filterphotometern und monochromatischen Spektrophotometersystemen mit Servoeinrichtungen.

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Die gestiegenen Bedürfnisse im Bezug auf Empfindlichkeit und Spezifität bei optischen Nachweisverfahren und die Einführung von neuen Techniken mit Immunmarkierung haben zu einem zunehmenden Interesse für fluorimetrische Messungen und Messgeräte geführt. Es wurden spezielle Filterfluorimeter und Spektrofluorimeter entwickelt und in den Handel gebracht. Jedoch haben alle diese herkömmlichen Instrumente den schwerwiegenden Nachteil, dass beim gleichen Gerät der Übergang von einer Messweise, beispielsweise der Photometrie, auf die andere Messweise, beispielsweise die Fluorimetrie, nicht möglich ist. Dieser Nachteil schränkt die Anwendungsmöglichkeiten derartiger Geräte ein.

Da spezielle Fluorimeter vorwiegend eine rechtwinklige Geometrie des Lichtstrahls und Absorptionsspektrophotometer vorwiegend eine geradlinige Geometrie des Lichtstrahls anwenden, erfordert der Übergang von einer Messweise auf die andere wesentliche bauliche Änderungen der Vorrichtung, beispielsweise das Einsetzen von Spiegeln zur Ablenkung des Lichtstrahls oder die Verwendung einer Hilfslichtquelle. Beide Änderungen erfordern jedoch wesentliche aufwendige Eingriffe und Eichvorgänge durch das Bedienungspersonal.

Ein herkömmliches, arbeitsaufwendiges Mehrzweck-Fluorimeter-Spektrophotometer wird beispielsweise von Britton Chance, D. Mayer und V. Legallais in Analytical Biochemistry, Bd. 42 (1971) S. 494 bis 504 beschrieben. Hierbei handelt es sich um ein Dual-Wellenlängen-Spektrophotometer und -Fluorimeter unter Verwendung von Interferenzfiltern. Dabei wird ein Fluoreszenz/Absorptions-Differenzverhältnis unter Verwendung von zwei Lichtquellen und 3 Detektoren gemessen. In der US-PS 3 811 ist eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzintensität von Gewebematerial und zu deren Korrektur oder zu getrennten Reflektionsmessungen an der gleichen Probe beschrieben. Diese

Arbeitsweise ist jedoch wegen der geringen Penetration des anregenden Strahls in die Lösung und wegen des geringen Reflektionssignals nicht auf verdünnte Lösungen, wie sie bei Immunoassaymessungen auftreten, anwendbar. Ferner lässt sich diese Technik im Gegensatz zur erfindungsgemässen Technik nicht zu Absorptionsmessungen heranziehen. Erfindungsgemäss lassen sich unter Überwindung der vorstehend aufgezeigten Schwierigkeiten entweder Fluoreszenz oder Absorption in einer verdünnten Lösung mit dem gleichen Lichtweg unter Verwendung der gleichen Lichtquelle und des gleichen Detektors messen, wodurch der apparative Aufwand und der Bedienungsaufwand auf ein Minimum reduziert werden.

Eine weitere Schwierigkeit bei herkömmlichen Fluoreszenzintensitätsinstrumenten ist die Abhängigkeit der erfassten Intensität von der Probengeometrie und -position. Um eine genaue Korrelation zwischen Fluoreszenzintensität und Konzentration zu erreichen, ist daher eine sehr genaue Probenpositionierung erforderlich. CA. Parker, Photoluminescence of Solutions, Elsevier, Amsterdam, 1968, S. 220 bis 234, lehrt, dass eine gerade durchgehende, geradlinige (in-line) Beleuchtung wesentlich weniger von der exakten Position der die Probe enthaltenden Küvette abhängig ist als eine frontale Beleuchtung und bei der genauen Messung der Fluoreszenzintensität von Lösungen in zylindrischen Zellen oder Küvetten mit optisch nicht perfekten Oberflächen der rechtwinkligen Anregung vorzuziehen ist. Es ist deshalb erwünscht, von diesen Vorteilen der geradlinigen Anregungsgeometrie Gebrauch zu machen.

Ein Nachteil bei dieser geradlinigen, gerade durchgehenden Anregungsgeometrie besteht darin, dass der Teil, des durch die Optik transmittierten anregenden Strahls einen hohen Lehrwert verursacht; vgl. CA. Parker, 1968,.a.a.O. In der vor-

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erwähnten US-SN 86 202 wird die Verwendung von bekannten mehrlagigen Filtern mit 3 Vertiefungen (multilayered threecavity filters), scharfen Ausschlussfiltern (.sharp cut-off filters) und Neutral-Dichtefiltern (neutral density filters) beschrieben, um eine starke Abweisung des Ar.regungsstrahls und eine Empfindlichkeit, die der bei senkrechter Anregung erzielbaren vergleichbar ist, zu erreichen. Beispielsweise sind gemäss dieser Anmeldung Fluoreseeinkonzentrationen von 1,^8 χ

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10 m bis zu 7,4 χ 10 m unter Anwendung der dort beschriebenen Techniken nachweisbar.

Obgleich diese hohe Empfindlichkeit für viele Fluoreszenzmessungen ausreichend ist, ist für präzise Fluoreszenzimmunoassaymessungen eine Steigerung der Empfindlichkeit um mindestens eine Zehnerpotenz erforderlich. Beispielsweise ist bei Anwendung einer gerade durchgehenden Anregungsgeometrie die erfasste Fluoreszenzlichtstärke extrem gering, so dass für Immunoassaymessungen

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eine Empfindlichkeit in der Grössenordnung von 10 tn Fluorescein erforderlich ist. Es wurde nunmehr festgestellt, dass die Empfindlichkeit der Vorrichtung gemäss der vorgenannten Anmeldung sowohl durch das transmittierte Hintergrundlicht als auch durch die Kopplung von Streulicht zwischen den Filterelementen begrenzt ist.

Erfindungsgemäss wird ein verbessertes Fluoreszenzspektrophotoraeter zur Untersuchung der Fluoreszenzcharakteristika von Testlösungen mit einer signifikant erhöhten Fluoreszenznachweisempfindlichkeit, die ausreicht präzise Fluoreszehzimmunoassaymessungen von sehr stark verdünnten Lösungen durchzuführen , zur Verfügung gestellt.

Die erfindungsgemässe Vorrichtung umfasst einen beweglich auf einer Basis angebrachten Filterrahmen und weist 2 Testfilter und 2 Referenzfilter auf, die jeweils am Filterrahmen angebracht sind,

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wobei der Rahmen zwischen einer Testposition und einer Referenzposition bewegbar ist. Bei einer geradlinigen oder gerade durchgehenden optischen Geometrie und bei Stellung des Filterrahmens in der Referenzposition wird von einer Lichtquelle ausgehende Anregungsstrahlung einer ersten Wellenlänge durch einen der Referenzfilter, durch einen Testlösungsbehälter und durch den anderen Referenzfilter gelassen. Befindet sich der Filterrahmen in der Testposition, wird Anregungsstrahlung durch einen der Testfilter gelassen und gelangt zum Testlösungsbehälter, wobei der andere Testfilter von der Testlösung stammendes fluoreszierendes Licht einer zweiten Wellenlänge durchlässt. Zwischen der Anregungsstrahlungsquelle und' den Filtern ist ein Vorfilter eingesetzt, der Anregungsstrahlung durchlässt und fluoreszierende Strahlung blockiert. Dadurch wird der Hintergrund an transmittierter und fluoreszierender Strahlung in unerwünschten optischen Wegen auf ein Minimum gesenkt, so dass die optische Kopplung zwischen den Filterelementen verringert wird. Vorrichtungen zum Abschirmen oder Ablenken von Strahlung sind vorgesehen, um die unerwünschte Kopplung von Streulicht oder reflektiertem Licht zwischen den Filterelementen zu verhindern. Dadurch wird die Empfindlichkeit des Instruments beträchtlich erhöht.

Eine erste Ablenkeinrichtung an der Oberseite des Filterrahmens bildet für jeden Filter ein getrenntes, mit Wänden versehenes Abteil, um eine optische Kopplung von Streulicht zwischen den Filtern quer zur Oberseite des Filterrahmens zu verhindern. Eine zweite Ablenkeinrichtung an der Unterseite des Filterrahmens verhindert eine optische Kopplung von Streulicht zwischen den Filtern quer zur Unterseite des Filterrahmens.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung betrug die nachgewiesene Empfindlichkeit 1,9 x 10" m Fluorescein. Somit er-

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inöglicht die Vorrichtung der Erfindung im Vergleich zur Ausführungsform der US-SN 86 202 eine Steigerung der Empfindlichkeit um 2 Zehnerpotenzen.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnugn näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht eines Fluoreszenzspektrophotometers, mit einem im Schnitt gezeigten erfindungsgemässen Filter aggregat mit einem Vorfilter und einer Abschirm- oder Ablenkeinrichtung für Strahlung;

Fig. 2 eine Ansicht von unten einer Filterscheibe im Filter aggregat;

Fig. 3 eine Draufsicht der Filterscheibe im Filteraggregat; und

Fig. H eine Draufsicht eines Schlittens oder Basis, wobei die Filterscheibe gestrichelt eingezeichnet ist.

1 bedeutet eine Lichtquelle und 3 ein Filter aggregat, das eine Filterscheibe 9 mit darin angebrachten Filtern 5, 6, 7 und 8 aufweist. Ein Filterscheibenschaft 15, der drehbar in einem Schlitten bzw. Basis 16 angebracht ist, ist integral an die Filterscheibe 9 angeformt und wird zur Verbindung der Filterscheibe mit einem Antriebsmotor verwendet. Ein Testlösungbehälter 4 und ein Detektor, beispielsweise ein Photomultiplier-Detektor 13, liefert die Detektor-Ausgangsinformation an ein Datenverarbeitungsgerät T4.

Ein Vorfilter 17 ist in einer im Schlitten 16 gebildeten Vertiefung 18 angebracht, um transmittiertes Hintergrundlicht möglichst gering zu halten. Eine Reihe von durchlaufenden,

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erhabenen Rippen 19 (vgl. Fig. 3), die an der Oberseite der Filterscheibe 9 vorgesehen sind, bilden mit Wänden versehene Abteile, die jeweils die Filter 5, 6, 7 bzw. 8 umgeben, um eine optische Kopplung von Streulicht zwischen den Filtern an der Filterscheibenoberfläche zu verhindern. Ferner ragen entsprechende ringförmige Rippen 20, 21 von der Unterseite der Filterscheibe 9 nach unten (vgl. Fig. 1 und 2), die dazu dienen, Streulicht unterhalb der Filterscheibe an einer optischen Kopplung zwischen den Filtern zu hindern. Dieses Streulicht kann teilweise aus Anregungsstrahlung, die von zahlreichen Oberflächen unterhalb der Filterscheibe reflektiert ist, bestehen.' Die Rippen 20, 21 passen zu entsprechenden ringförmigen Vertiefungen 22, 23, die am.Schlitten 16 vorgesehen sind.

Bei Betrieb in der Testposition wird Strahlung von der Lichtquelle 1 mittels des Prismas 2 auf die Filter 17 und 5 gelenkt, bei denen es sich um 500 nm Schmalband-Interferenzfilter handelt, die dazu dienen, Strahlung einer Anregungswellenlänge auf dat. Prisma 11 gelangen zu lassen, welches die Anregungsstrahlung auf die Testprobe 4 lenkt. Von der Testlösung ausgehende fluoreszierende Strahlung wird mittels des Prismas

12 auf einen 530 nm scharfen Kantenfilter (sharp cut-off filter) 6 gelenkt, von wo aus die Strahlung in den Detektor

13 gelangt. Durch Drehung der Filterscheibe 9 um 18O° gelangen die Filter 7 und 8 (500 nm-Schmalband-Interferenzfilter und Neutral-Dichtefilter) in den Strahlengang von der Lichtquelle zum Detektor, wodurch ein Referenzsignal erzeugt wird. - '

Ein auswechselbarer Einsatz, der das Filteraggregat 3 und den Schlitten 16 enthält, kann zweckmässigerweise in ein Abbott VP bichromatisches Absorptionsspektrophotometer ein-

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gesetzt werden, wodurch dieses zu einem Fluoreszenzspektrophotometer wird. Das erfindungsgemässe Prinzip kann auch dazu verwendet werden, andere Spektrophotometer zur Durchführung von Fluoreszenzmessungen auszurüsten.

Das Signal eines herkömmlichen bichromatischen Spektrophotometers, das erfindungsgemäss in ein Fluoreszenzspektrophotometer umgewandelt worden ist, ist proportional zum Logarithmus des Verhältnisses von Fluoreszenzintensität zu Referenzintensität. Im Fall von stark verdünnten Lösungen verläuft das Signal bei Konzentrationsänderungen innerhalb einer Zehnerpotenz linear zur Konzentration. Im Fall von höheren Konzentrationsbereichen verläuft das Signal bei Konzentrationsänderungen von mehreren Zehnerpotenzen proportional zum Loagarithmus der Konzentration.

Die Neutral-Dichtefilter werden gewählt, um die Intensität der bei Referenzbetrieb durch die Testlösung zum Detektor durchgelassenen Anregungsstrahlen einzustellen, wodurch der Empfindlichkeitsbereich der Messungen eingestellt wird.

Dem Fachmann sind verschiedene Lichtquellen, Detektoren und Filterkombinationen, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, geläufig. Verschiedene Prismen, Spiegel, Linsen und Kollimatoren eignen sich dazu, Strahlung von der Lichtquelle auf die Testprobe und von der Testprobe auf den Detektor zu lenken. Ferner stehen verschiedene Datenverarbeitungsverfahren zur Verfügung, um die von den Teststrahlen (fluoreszierende Strahlung) und Referenzstrahlen (durch die Testprobe durchgelassene Anregungsstrahlung) erhaltenen Signale zu verarbeiten.

Die Filter im Filteraggregat 3 zur Messung von fluoreszierenden Substanzen sind in Tabelle I aufgezählt,-wobei in jedem Fall der Filter 17 der gleiche wie der Filter 5 ist. Somit

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weist der Vorfilter 17 optische Durchlass- und Blockiereigenschaften auf, die denen des Anregungsfilters 5 entsprechen. Daher nehmen die blockierenden Eigenschaften des Anregungsfilters bei der Fluoreszenzwellenlänge zu.

Tabelle I

490 nm 515 nin

405 nm 450 nm

340 nm 460 nm

366 nm 470 nm

319 nm 445 nm

490 nm 490 nm

405 nm 405 nm

340 nm 340 nm

366 nm 366 nm

319 nm 319 nm

Fluoreszierende Substanz

Fluorescein Umbelliferon ot-Naphthol, NADH 8-Anilinonephthalin Homovanillinsäure/HpOo

Dem Fachmann auf dem Gebiet der Optik ist die Verwendung von Schmalbandfiltern, Cut-Off-Filtern und dergleichen für Referenz und Fluoreszenz geläufig. Zur Erläuterung der Eignung der erfindungsgemässen Vorrichtung zu Fluoreszenzimmunoassay-Messungen wurde Theophyllin in menschlichen Serumproben bestimmt. Das Filteraggregat 3 umfasste ein Vorfilter 17 mit 405 nm, ein Anregungsfilter 5 mit 405 nm, ein Fluoreszenzfilter 6 mit 460 nm mit einem Breitband von 440 bis 470 nm und Referenzfilter 7, 8 mit 405 nm. Bei Vorfilter, Anregungsund Referenzfiltern handelte es sich um Schmalband-Interferenzfilter. Das Filteraggregat wurde in ein Abbott VP bichromatisches Analysengerät der Abbott Laboratories, Irving, Texas, eingesetzt.

Theophyllin wurde unter Verwendung der folgenden Methoden und Reagentien bestimmt. Bei den Reagentien handelt es sich um Handelsprodukte der Ames Division, Miles Laboratories, Elkhardt, Indiana 46515.

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Das Theophyllin in der Lösung wurde mit einem Reagens, das Antikörper gegen Theophyllin und als Enzym ß-Galactosidase enthielt, umgesetzt. Ein mit einem Substrat für dieses Enzym markiertes Theophyllinderivat, nämlich ein ß-Galactosyl-umbelliferon-Theophyllin-Konjugat wurde zu dem Gemisch gegeben. Das Arzneistoffderivat ist unter den Testbedingungen nicht fluoreszierend. Jedoch führt die durch ß-Galactosidase katalysierte Hydrolyse zu einem fluoreszierenden Produkt. Reagiert Antikörper gegen Theophyllin mit dem markierten Theophyllin, so wird dieses geschützt, so dass es als Substrat für die ß-Galactosidase praktisch inaktiv wird. Kompetitive Bindungsreaktionen ergeben sich mit einer konstanten Menge des mit Theophyllin markierten Reagens, einer !!imitierenden Antikörpermenge und der Theophyllin enthaltenden klinischen Serum- oder Plasrnaprobe.

markiertes Theophyllin + Antikörper + Theophyllin

(Antikörper/markiertes Theophyllin) + Antikörper/Theophyllin) —

ß-Galactosidase

erzeugte Fluoreszenz proportional zur Theophyllinkonzentration in der Serumprobe

Standards und Proben wurden unter Verwendung eines gemäss den Angaben des Herstellers der Testpackung verdünnten 1:20-Bicine-Puffers 1:51 vorverdünnt. 100 μΙ-Aliquotanteile von vorverdünnten Standards und Proben wurden in die Probenbehälter in der Multiküvetten-Vorrichtung des Abbott VP bichromatischen Analysengeräts gegeben. Das vom Hersteller in konzentrierter Form bereitgestellte Enzym/Antikörper-Reagens wurde unter Verwendung von Bicine-Puffer 1:30 verdünnt und in den

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Reagensbehälter gegeben. Das fluorogene Arzneimittelreagens der Firma Ames wurde in einen Hilfs-Reagensbehälter gegeben. Das Abbott VP bichromatische Analysengerät wurde auf ein Verdünnungsverhältnis 1:26 (10 ^il Probe + 250 yl Reagens) eingestellt. Der Hilfs-Reagens-Dispenser stand auf 10:22 ^l bei Station 21. Die Temperatur im Inkubator-Wasserbad betrug 3O⁰C. Die Küvette und die Probenverarbeitungseinheit wurden mit schwarzen Kunststoffdeckein abgedeckt. Das Instrument wurde nach Ansaugen der Reagens- und Hilfsverteiler in die Betriebsstellung zur Durchführung von Endpunktsmessungen gebracht. Das Signal von der 10. Umdrehung (27 Minuten Inkubationszeit) wurde gegen Standardkonzentrationen von Theophyllin aufgetragen. Die Theophyllinkonzentration in den Lösungen wurde aus dem Diagramm bestimmt. Diese Daten wurden mit den Ergebnissen eines enzymatischen Immunoassays, der an einem in Absorptionsstellung befindlichen Spektrophotometer unter Verwendung von EMIT-Reagentien der Syva Company durchgeführt wurde, verglichen. Zwischen den Daten der beiden Methoden gab es eine gute Übereinstimmung.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass mit dem gleichen Detektor sowohl Fluoreszenzsignale als auch Referenzsignale erfasst werden, wodurch bisherige Schwierigkeiten aufgrund von Schwankungen der Lichtquelle vermieden werden.

Statt mit der hier beschriebenen rotierenden Filterscheibe kann das erfindungsgemässe Prinzip auch auf andere Filteraggregate angewandt werden, beispielsweise auf ein gleitendes, vibrierendes oder sich hin- und her bewegendes Filteraggregat, bei dem die beiden Testfilter und die beiden Referenzfilter nacheinander und wiederholt in den optischen Lichtweg eingesetzt werden.

Ende der Beschreibung

Leerseite

Claims

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-FHYS. M. GRITSCHNEDER Patentanwälte

München.

Apri

ril 19»?

1' Uunnchrlfl / PoHtal Addruan Ostfach ΒΘ0100, 8O00 Münchon B6

I'ioi'.zenauerslraße 28 Telefon Θ8 32 22

Telegramme.· ChemlndUB München Telex: CO) B 23ΘΘ2

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ABBOTT LABORATORIES
North Chicago, Illinois 6OO6U V.St.A.

Fluoreszenzspektrophotometer

Patentansprüche

■f} Fluoreszenzspektrophotoraeter zur Untersuchung der Fluoreszenzcharakteristika von Testlösungen, gekennzeichnet durch

a) eine Lichtquelle, die Strahlung einer ersten Wellenlänge zur Anregung der Testlösung liefert und dabei eine von der Testlösung ausgehende fluoreszierende Strahlung einer zweiten Wellenlänge erzeugt,

b) eine Detektorvorrichtung zur Erfassung der Strahlung der ersten und zweiten Wellenlänge,

c) einen Behälter für die Testlösung, der für die Strahlung der ersten und zweiten Wellenlänge durchlässig ist,

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d) ein einen Rahmen mit einer Mehrzahl von darin angebrachten Filtern aufweisendes Filteraggregat, das zwischen einer Testposition und einer Referenzposition bewegbar ist, wobei in der Testposition ein Filterelement den Durchgang von Strahlung der ersten Wellenlänge von der Lichtquelle zur Testlösung erlaubt und ein Filterelement den Durchgang von Strahlung der zweiten Wellenlänge von der Testlösung zur Detektorvorrichtung erlaubt und in der Referenzposition ein Filterelement den Durchgang von durch die Testlösung transmittierter Strahlung der ersten Wellenlänge zur Detektorvorrichtung erlaubt,

e) eine am Filter aggregat vorgesehene Strahlungsabschirmeinrichtung, um die Kopplung von Streulicht zwischen den Filterelementen zu verhindern,

f) eine Vorrichtung, um Strahlung von der Lichtquelle zur Testlösung zu lenken, und eine Vorrichtung, um Strahlung von der Testlösung zum Detektor zu lenken und

g) eine Vorrichtung zum Bewegen de s Filteraggregats zwischen der Test- und der Referenzposition, die mit dem Filteraggregat verbunden ist.
2. Filteraggregat , gekennzeichnet durch einen Rahmen mit darin angeordneten Testfiltern und 2 darin angeordneten Referenzfiltern, wobei die beiden Testfilter auf einer Kreislinie im Winkel von 18O° zueinander liegen und ein Element davon den Durchgang von Strahlung einer ersten Wellenlänge zur Anregung einer Testlösung und ein Element den Durchgang von fluoreszierender Strahlung einer zweiten Wellenlänge gewährleisten und wobei die beiden Referenzfilter sich im Winkel von 18O zueinander auf der Kreislinie zwischen den beiden Testfiltern befinden

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und jeweils den Durchgang von Licht der ersten Wellenlänge gewährleisten, und durch eine Abschirmvorrichtung, die eine Kopplung von Streulicht zweischen den Filte.'elementen verhindert.
3. Fluor eszenzspektrophotome r nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ,dass die Lichtabschirmvorrichtung eine mit Wänden versehene An Ordnung umfasst, die oberhalb des Rahmens für jeden der Filter ein mit Wänden versehenes Abteil bildet, um eine Kopplung von Streulicht zwischen den Filterelementen zu blockieren und zu verhindern.
4. Fluoreszenzspektrophotometer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wänden versehene Abteil eine durchlaufende Wand umfasst, die sich oberhalb des Rahmens erstreckt und jedes der Filterelemente umgibt.
5. Fluoreszenzspektrophotometer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtabschirmeinrichtung ferner mindestens einen durchlaufenden Steg aufweist, der vom Rahmen nach unten ragt, um die Kopplung von Streulicht zwischen den Filterelementen zu blockieren und zu verhindern.
6. Fluoreszenzspektrophotometer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtervorrichtung einen zwischen der Lichtquelle und den Filterelementen angebrachten Vorfilter aufweist, der den Durchgang von Licht der ersten Wellenlänge ermöglicht, aber den Durchgang von Licht der zweiten Wellenlänge im wesentlichen blockiert.
7. Fluoreszenzspektrophotometer· nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass das Filteraggregat einen zwischen der Lichtquelle und den Filterelementen angebrachten Vorfilter umfasst, der den Durchgang von Licht der ersten Wellenlänge erlaubt und den Durchgang von Licht der zweiten Wellenlänge blockiert.