DE3212219C2

DE3212219C2 - Spektrophotometer, das auch zur Untersuchung der Fluoreszenzcharakteristika von Lösungen geeignet ist

Info

Publication number: DE3212219C2
Application number: DE3212219A
Authority: DE
Inventors: Omar Soliman Plano Tex. Khalil
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1981-04-02
Filing date: 1982-04-01
Publication date: 1986-05-07
Also published as: FR2503369B1; GB8412735D0; CA1185705A; GB2150704A; GB8412736D0; FR2503369A1; GB2142156A; GB2142156B; GB2096352A; GB2096352B; GB2150704B; DE3212219A1

Abstract

Es wird eine Vorrichtung zur Fluoreszenzspektroskopie zur Verfügung gestellt, deren Empfindlichkeit für präzise Fluoreszenzimmunoassaymessungen in extrem verdünnten Lösungen ausreicht. Ein verbessertes Filteraggregat ist drehbar zwischen einer Testposition und einer Referenzposition vorgesehen. Das Filteraggregat umfaßt zwei Testfilter, von denen einer Anregungslicht einer ersten Wellenlänge durchläßt, zwei Referenzfilter, die jeweils Licht der ersten Wellenlänge durchlassen, und eine Lichtabschirmvorrichtung, um Streulicht zu blockieren und an einer optischen Kopplung zwischen den Filtern zu hindern. Ein Vorfilter reduziert das transmittierte Hintergrundlicht auf ein Minimum. Ein handels übliches automatisiertes klinisches Photometer kann nach Einsetzen dieses Filteraggregats als Filterfluorimeter verwendet werden.

Description

dadurch gekennzeichnet,

daß zwischen Lichtquelle (1) und Filterscheibe (9) ein Vorfilter(17) in einer Halterung (16) angeordnet ist;
daß die Filterscheibe (9) auf der Oberseite durch Rippen (19) gebildete Abteile zur Aufnahme der Filter aufweist, wobei die Rippen (19) zur Abschirmung von Streulicht dienen, und auf der Unterseite der Filterscheibe <!s) mindestens eine umlaufende Rippe (20, 21) ausgebildet ist, die ebenfalls zur Abschirmung von Streulicht in eine entsprechende Ausnehmung (22,23) in der Halterung (16) eingreift, und
daß das Vorfilter (17), das erste Filterpaar (7, 8) und ein Filter (5) des zweiten Filterpaares (5, 6) für Anregungslicht und das weitere Filter (6) des zweiten Filterpaares (5,6) für Fluoreszenzlicht durchlässig ist

Die Erfindung betrifft ein Spektrophotometer, das auch zur Untersuchung der Fluoreszenzcharakteristika von Lösungen geeignet ist, nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Bei einem Spektrophotometer nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs, wie es aus der US-PS 38 33 304 bekannt ist, fS'll das Licht der Lichtquelle unmittelbar auf eine Filterscheibe, in der Filterpaare für Messungen bei unterschiedlichen Wellenlängen angeordnet sind. Mittels Messungen bei verschiedenen Wellenlängen kann ' die Konzentration einer bestimmten Substanz auch bei Anwesenheit störender Substanzen gemessen werden. Die beiden Filter jedes Fiitevpaares haben dabei dieselben Durchlaßeigenschaften. Das bekannte Spektrophotometer ist nur zur Messung der Abjorption geeignet

Aus der US-PS 41 17 338 ist zwar ein Spektrophotometer bekannt, das auch zur Untersuchung der Fluoreszenzcharakteristika von Gegenständen geeignet ist Hierbei werden jedoch zur Erzeugung des Referenzsignals und des Meßsignals unterschiedliche Lichtquellen verwendet, wobei die Lichtquellen zur Erzeugung des Meßsignals neben der optischen Achse angeordnet sind, so daß Anregungslicht, das durch den v< untersuchenden Gegenstand hindurchgeht, nicht auf die Detektorvorrichtung trifft

Aus der US-PS 38 11 777 ist ein FIuorometer-Reflektometer bekannt, das zwar in einer Ausführungsform nur mit einer einzigen Lichtquelle arbeitet und bei dem ein erstes Filterpaar und ein Filter eines zweiten Filterpaares für Anregungslicht und das weitere Filter des zweiten Filterpaares für Fluoreszenzlicht durchlässig ist Das Referenzsignal wird dabei jedoch durch Streulicht gewonnen. Auf die Schwierigkeiten, die bei Messung in Richtung des Anregungslichtes auftreten, wird hingewiesen. Dadurch, daß das Referenzsignal aus der Messung von Streulicht abgeleitet wird, ist das bekannte FIuorometer-Reflektometer nur zur Untersuchung von Gegenständen mit lichtstreuender Oberfläche geeignet.

Aus Danckwortt-Eisenbrand: Lumineszenzanalyse im filtrierten, ultravioletten Licht, Akademische Verlagsgesellschaft Geest und Portik KG, 1956, Seiten 42 und 43, ist es bekannt, daß Fruoreszenzlicht, das in der gleichen so Richtung wie das Anregungslicht austritt, beobachtet werden kann. Auf die Notwendigkeit einer besonders sorgfältigen Reinigung des Lichts wird zwar hingewiesen, ohne daß jedoch nähere Angaben über deren Verwirklichung und der Art und Weise der Messung des Fluoreszenzlichtes und des Referenzlichtes gemacht werden.

Der Erfindung liegt ausgehend von der US-PS 38 33 304 die Aufgabe zugrunde, ein Spektrophotometer so auszubilden, daß es bei möglichst geringem Aufwand auch für Fluoreszenzmessungen geeignet ist.
Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs gelöst.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Spektrophotometers reicht aus für genaue Fluoreszenzimmunoassay-Messungen in extrem verdünnten Lösungen. Dadurch, daß sowohl das Referenzsignal als auch das Meßsignal ohne Veränderung der Position der Lichtquelle und des Behälters für die Testlösung gewonnen werden, sind die Meßfehler sehr klein. Bei der Messung der Fluoreszenzintensität werden außerdem die ^ Meßfehler vermieden, die sich ergeben, wenn die Fluoreszenzintensität im rechten Winkel zum Strahlengang

fj_t des Anregungslichtes gemessen wird und dann zusätzlich von der Form des Behälters für die Testlösung und

£ dessen Position abhängt. Die erzielbare Empfindlichkeit liegt dadurch in der Größenordnung von 10-'°mol

f, Fluorescein.

' 65 Bei der Filterscheibe kann es sich um eine rotierende, kreisförmige Filterscheibe handeln, bei der die Filter

J₁ ¹ jedes Filterpaares einander gegenüberliegend angeordnet sind. Die Filterscheibe kann auch hin- und herbewegte lieh sein.

, Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung erläutert. Es zeigt

F i g. 1 das Spektrophotometer im Schnitt in der Ebene des Strahlengangs;

F i g. 2 die Filterscheibe von unten;

F i g. 3 die Filterscheibe von oben und

Fig.4 die Halterung von oben, wobei die Filterscheibe strichpunktiert dargestellt ist und die Ebene der Schnittdarstellung von F i g. 1 angegeben ist.

Das dargestellte Spektrophotometer enthält eine Lichtquelle 1 und eine Filtereinrichtung 3, die eine Filterscheibe 9 mit darin angebrachten Filtern 5,6,7 und 8 aufweist, wobei die Filter 7,8 ein erstes Filterpaar und die Filter 5, 6 ein zweites Filterpaar bilden. Ein Filterscheibenschaft 15, der drehbar in einer Halterung 16 angebracht ist, ist an die Filterscheibe 9 angeformt und verbindet die Filterscheibe mit einem Antriebsmotor. Die Testlösung befindet sich in einem Behälter 4 und ein Detektor 13, beispielsweise ein Photomultiplier, liefert die Detektor-Ausgangsinformation an eine Datenverarbeitungsanlage 14.

Ein Vorfilter 17 ist in einer in der Halterung 16 gebildeten Vertiefung 18 angebracht, um transmittiertes Hintergrundlicht möglichst gering zu halten. Eine Reihe von umlaufenden, erhabenen Rippen 19 (vgl. F i g. 3), die an der Oberseite der Filterscheibe 9 vorgesehen sind, bilden mit Wänden versehene Abteile, die jeweils die Filter 5,6,7 bzw. 8 umgeben, um Streulicht zwischen den Filtern abzuhalten. Ferner ragen entsprechende ringförmige Rippen 20, 21 von der Unterseite der Filterscheibe 9 nach unten (vgl. Fig. 1 und 2), die ebenfalls Streulicht abhalten sollen. Dieses Streulicht kann teilweise aus Anregungslicht, das von zahlreichen Oberflächen unterhalb der Filterscheibe 9 reflektiert ist, bestehen. Die Rippen 20,21 passen zu entsprechenden ringförmigen Ausnehmungen 22,23, die in der Halterung 16 vorgesehen sind.

Zur Erzeugung eines Meßsignals des Fluoreszenzlichts wird Strghlung von der Lichtquelle 1 mittels eines Prismas 2 auf das Vorfilter 17 und das Filter 5 gelenkt, bei denen es sich um 500 nm Schmalbanr¹ Interferenzfilter handelt, die Anregungsiicht zum Prisma f 1 durchlassen, welches das Anregungslicht auf den Behälter 4 richtet. Von der Testlösung ausgehendes Fluoreszenzlicht wird mittels eines Prismas 12 auf das Filter 6 ein 530-nm-K.antenfilter, gelenkt, von wo aus die Strahlung in den Detektor 13 gelangt. Durch Drehung der Filterscheibe 9 um 180" gelangen die Filter 7 und 8 (500-nm-Schmalband-Interferenzfilter und Neutral-Dichtefilter) in den Sirahlengang von der Lichtquelle 1 zum Detektor 13, wodurch ein Referenzsignal erzeugt wird.

Ein auswechselbarer Einsatz, der die Filtereinrichtung 3 und die Halterung 16 enthält, kann zweckmäßigerweise in ein handelsübliches bichromatisches Absorptionsspektrophotometer eingesetzt werden, wodurch dieses zu einem Fluoreszenzspektrophotometer wird.

Das Signal eines herkömmlichen bichromatischen Spektrophotometers ist proportional zum Logarithmus des Verhältnisses von Fluoreszenzintensität zu Referenzintensität Im Falle von stark verdünnten Lösungen verläuft das Signal bei Konzentrationsänderungen innerhalb einer Zehnerpotenz linear zur Konzentration. Im Fall von höheren Konzentrationsbereichen verläuft das Signal bei Konzentrationsänderungen von mehreren Zehnerpotenzen proportional zum Logarithmus der Konzentration.

Die Neutral-Dichtefilter, das erste Filterpaar 7,8 sollen die Intensität des durch die Testlösung zum Detektor 13 durchgelassenen Anregungslichts entsprechend dem Empfindlichkeitsbereich der Messungen einstellen.

Die Filter 5,6,7 ur.d 8 zur Untersuchung von fluoreszierenden Lösungen sind in Tabelle I aufgezählt, wobei in jedem Fall das Vorfilter 17 das gleiche wie das Filter 5 ist.

Tabelle I

Filter	6	7	8	Fluoreszierende Substanz
5	515 nm	490 nm	490 nm
490 nm	450 nm	405 nm	405 nm	Fluorescein
405 nm	460 nm	340 nm	340 nm	Umbelliferon
340 nm	470 nm	366 nm	366 nm	Λ-Naphthol, NADH
366 nm	445 nm	319 nm	319 nm	8-Anilinonephthaiin
319 nm			Homovani!linsäure/H2O2

Zur Erläuterung der Eignung der Vorrichtung zu Fluoreszenzimmunoassay-Messungen wurde Theophyllin in menschlichen Serumproben bestimmt. Das Spektrophotometer enthält ein Vorfilter 17 mit 405 nm, ein Filter 5 mit 405 nm, ein Filter 6 mit 460 nm mit einsr Durchlaßbreite von 440 bis 470 nm und Filter 7,8 mit 405 nm. Das Vorfilter 17 und die Filter 5,7 und 8 sind Schmalband-Interferfnzfilter. Die Filtereiiirichtung ist in ein Spektrophotometer nach der US-PS 38 33 304 eingesetzt

Theophyllin wird unter Verwendung der folgenden Methoden und Reagerden bestimmt. Bei den Reagentien handelt es sich um Handelsprodukte.

Das Theophyllin in der Lösung wird mit einem Reagens, das Antikörper gegen Theophyllin und als Enzym /9-Galactosidase enthält, umgesetzt. Ein mit einem Substrat für dieses Enzym markiertes Theophyllinderivat nämlich ein/J-Galactosyl-umbelliferon-Theophyllin-Konjugat wird zu dem Gemisch gegeben. Das Arzneistoffderivat ist unter den Testbedingungen nicht fluoreszierend. Jedoch führt die durch ^-Galactosidase katalysierte Hydrolyse zu einem fluoreszierenden Produkt. Reagiert Antikörper gegen Theophyllin mit dem markierten Theophyllin, so wird dieses geschützt, so daß es als Substrat für die /i-Galactosiclase praktisch inaktiv wird. Kompetitive Bindungsreaktionen ergeben sich mit einer konstanten Menge des mit Theophyllin markierten Reagens, einer limitierenden Antikörpermenge und der Theophyllin enthaltenden klinischen Serum- oder Plas-

40 45 50 55 60 65

Markiertes Theophyllin + Antikörper + Theophyllin

(Antikörper/markiertes Theophyllin)

+ Antikörper/Theophyllin

/7-Galactosidase .

Erzeugte Fluoreszenz proportional zur Theopyllinkonzentration in der Serumprobe

Standards und Proben werden unter Verwendung eines gemäß den Angaben des Herstellers der Testpackung verdünnten 1 :20-Bicine-Puffers 1 :5I vorverdünnt. ΙΟΟ-μΙ-Aliquotanteile von vorverdünnten Standards und Proben werden in die Probenbehälter in der Multiküvetten-Vorrichtung des Spektrophotometers gegeben. Das vom Hersteller in konzentrierter Form bereitgestellte Enzym/Antikörper-Reagens wird unter Verwendung von Bicine-Puffer 1 :30 verdünnt und in den Reagensbehälter gegeben. Das fluorogene Arzneimittelreagens wird in einen Hilfs-Reagensbehälter gegeben. Das Spektrophotometer wird auf ein Verdünnungsverhältnis 1 :26 (10 μΙ Probe + 250 μΙ Reagens) eingestellt. Der Hilfs-Reagens-Dispenser steht auf 10 : 22 μΐ bei Station 21. Die Temperatur im Inkubator-Wasserbad beträgt 30"C. Die Küvette und die Probenverarbeitungseinheit werden mit schwarzen Kunststoffdeckeln abgedeckt. Das Instrument wird nach Ansaugen der Reagens- und Hilfsverteiler in die Betriebsstellung zur Durchführung von Endpunktmessungen gebracht. Das Signal von der 10. Umdrehung (27 Minuten Inkubationszeit) wird gegen Standardkonzentrationen von Theophyllin aufgetragen. Die Theophyllinkonzentration in den Lösungen wird aus dem Diagramm bestimmt. Diese Daten werden mit den Ergebnissen eines enzymatischen Immunoassays, der an einem in Absorptionsstellung befindlichen Spektrophotometer unter Verwendung von EMIT-Reagentien durchgeführt wurde, verglichen. Zwischen den Daten der beiden Methoden besteht eine gute Übereinstimmung.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Il Patentanspruch:

H Spektrophotometer, das auch zur Untersuchung der Fluoreszenzcharakteristika von Lösungen geeignet

SI ist, mit

.::j (a) einer Lichtquelle;

(b) einer Detektorvorrichtung zur Messung von Lichtstrahlung;

(c) einem Behälter für die Testlösung;

(d) einer Filtereinrichtung mit einer Mehrzahl in einer bewegbaren Filterscheibe angeordneter Filter^iaare, ίο wobei ein erstes Filterpaar zur Erzeugung eines Referenzsignals ausgebildet ist und Licht einer bestimmten Wellenlänge durchläßt und wobei ein zweites Filterpaar zur Erzeugung eines Meßsignals ausgebildet ist;

(e) einer Einrichtung zum Hindurchleiten der Lichtstrahlung durch die Filtereinrichtung, die Testlösung und wieder durch die Filtereinrichtung zur Detektorvorrichtung;