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HINTERGRUND
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.
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Verfahren der Fluoreszenzspektroskopie gehören zu den wichtigsten Untersuchungsmethoden in der biochemischen und pharmakologischen Forschung. Zur Messwerterfassung werden Vorrichtungen zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben eingesetzt. Diese können als reine Fluorometer ausschließlich für Fluoreszenzmessungen ausgelegt sein oder in Multi-Technologie-Geräte, z. B. sogenannten Multi-Label-Reader (MLR), integriert sein, die neben Fluoreszenzmessungen auch andere Messmethoden ermöglichen, z. B. Lumineszenzmessungen, Absorptionsmessungen etc.
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Bei der Messung der Fluoreszenz wird über einen optischen Anregungspfad die Probe mit Licht einer bestimmten Anregungswellenlänge beaufschlagt und dadurch Fluoreszenzlicht erzeugt. Das aus der Probe emittierte Fluoreszenzlicht (Emissionslicht), welches gegenüber dem Anregungslicht normalerweise zu längeren Wellenlängen (niedrigeren Energien) verschoben ist, wird in einem optischen Emissionspfad einem Detektor zugeleitet und die resultierenden Intensitäten gemessen.
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Empfindliche Fluoreszenzbestimmungen erfordern eine starke Blockung des Anregungslichtes gegenüber dem schwachen Emissionslicht aus der Probe. Wenn das Anregungslicht aus einer breitbandigen bzw. polychromatischen Lichtquelle erzeugt wird, sollten alle Wellenlängen, die nicht der Anregung dienen, unterdrückt werden.
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Dazu wird bei hochgenauen und empfindlichen Vorrichtungen das breitbandige Licht der primären Lichtquelle mit Hilfe eines Monochromators aufbereitet. Im Rahmen dieser Anmeldung bezeichnet der Begriff „Monochromator” ein optisches System zur spektralen Isolierung einer bestimmten Wellenlänge bzw. eines engen Wellenlängenbereichs aus einer einfallenden Lichtintensität mit größerer spektraler Bandbreite. Ein Monochromator erlaubt dabei in gewissen Grenzen eine stufenlose Einstellung der zu selektierenden Wellenlänge bzw. des zu selektierenden Wellenlängenbereichs. In einem Monochromator wird einfallendes Licht mittels eines dispersiven Elements stufenlos aufgefächert bzw. in seine spektralen Anteile zerlegt. Mittels einer Spaltblende wird aus diesem Spektrum ein engerer Spektralbereich um die gewüschte Wellenlänge selektiert, wobei die Spaltbreite dieses Spalts die Bandbreite des ausgewählten Lichts mitbestimmt. Als dispersives Element kann z. B. ein Prisma (wirkt über die Dispersion des Prismenmaterials) oder ein Beugungsgitter (wirkt über Beugung) verwendet werden.
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Auch im Emissionspfad wird häufig ein Monochromator zur Wellenlängenselektion genutzt. Die
WO 2012/095312 A1 zeigt eine Vorrichtung zur Messung von optischen Eigenschaften von Proben in Mikroplatten, die auch zur Fluoreszenzmessung genutzt werden kann und im Anregungspfad sowie im Emissionspfad einen Monochromator aufweist.
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Die
WO 2010/111166 beschreibt Vorrichtungen zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben, die einen kompakten, in doppeltem Durchtritt genutzten Monochromator („Dual Pass Monochromator”) enthalten. Die Vorrichtung hat ein Gehäuse mit einer Eintrittsöffnung, einer ersten Austrittsöffnung und einer zweiten Austrittsöffnung. Eine Lichtquelle stellt Licht bereit, das durch die Eintrittsöffnung eintritt. Ein optisch dispersives Element ist dafür konfiguriert, Licht einer ersten Wellenlänge durch die erste Austrittsöffnung in Richtung einer Probe zu richten und von der Probe emittiertes Licht einer zweiten Wellenlänge durch die erste Austrittsöffnung wieder aufzunehmen und durch eine räumlich getrennt von der ersten Austrittsöffnung liegende zweite Austrittsöffnung zu schicken. Das optisch dispersive Element ist somit sowohl im Anregungspfad als auch im Emissionspfad angeordnet. Die Eintritts- und Austrittsöffnungen haben feste Lagen zueinander. Dadurch sind die Wellenlängen der Anregung und Emission fixiert. Die Einstellung unterschiedlicher Wellenlängen z. B. bei einer spektralen Aufnahme eines Emissionsspektrums einer Probe erfordert eine koordinierte Verstellung mehrerer optischer Elemente. Dadurch wird der Aufbau relativ kompliziert.
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AUFGABE UND LÖSUNG
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Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine gattungsgemäße Vorrichtung zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben bereitzustellen, die einen einfachen, robusten Aufbau hat, empfindliche Fluoreszenzmessungen erlaubt und sich einfach auf unterschiedliche Wellenlängen der Anregung und Emission einstellen lässt.
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Zur Lösung dieser und anderer Aufgaben stellt die Erfindung eine Vorrichtung zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben mit den Merkmalen von Anspruch 1 bereit. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
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Bei gattungsgemäßen Vorrichtungen zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben befindet sich im Anregungspfad, d. h. optisch zwischen der Lichtquelle und der Messposition, eine erste Spaltblende, die einen ersten Spalt definiert. Zwischen dem ersten Spalt und der Messposition ist im Anregungspfad ein erstes dispersives Element angeordnet, welches gleichzeitig auch im Emissionspfad angeordnet ist und daher doppelt genutzt wird. Das erste dispersive Element ist im Emissionspfad in Bezug auf die Messposition derart angeordnet, dass Emissionslicht, welches von einer in der Messposition befindlichen Probe emittiert wird, über das erste dispersive Element in einen Bereich neben dem ersten Spalt übertragen werden kann. Es erfolgt somit mit Hilfe des ersten dispersiven Elementes eine spektrale Aufteilung von Anregungspfad und Emissionspfad in der Weise, dass das Emissionslicht, welches im Vergleich zum Anregungslicht eine niedrigere Energie bzw. größere Wellenlänge hat, in einen Bereich neben dem ersten Spalt übertragen wird. Dagegen wird resonantes Anregungslicht, welches von der Probe in Richtung des ersten dispersiven Elementes zurückgeworfen wird, vom ersten dispersiven Element wieder durch den ersten Spalt hindurch zurückgeworfen und kann somit nicht in den Emissionspfad gelangen.
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Erfindungsgemäß ist im Emissionspfad, d. h. im optischen Pfad zwischen der Messposition und dem Detektor, ein Lichtleiter zur Übertragung von durch das erste dispersive Element in dem Bereich neben dem ersten Spalt übertragenem Emissionslicht in Richtung des Detektors angeordnet. Der Lichteintritt des Lichtleiters ist dabei in der durch den ersten Spalt definierten ersten Spaltebene oder in deren Nähe neben dem ersten Spalt angeordnet. Am Lichteintritt tritt Emissionslicht in den Lichtleiter ein und wird durch den Lichtaustritt des Lichtleiters wieder abgegeben, welcher sich am gegenüberliegenden Ende des Lichtleiters befindet. Innerhalb des Lichtleiters findet eine verlustarme Übertragung des Emissionslichts überwiegend mittels Totalreflexion an Grenzflächen zwischen optisch dichtem und optisch dünneren Material statt. Durch die Anordnung des Lichteintritts neben dem ersten Spalt wird erreicht, dass das Emissionslicht gut fokussiert in den Lichtleiter eintreten und mit entsprechender numerischer Apertur auch wieder aus dem Lichtleiter austreten kann. Am Lichtaustritt bietet der Lichtleiter eine definierte, von der Wellenlänge des Emissionslichts unabhängige Position des Emissionslichts für die Weiterleitung bis zum Detektor, wodurch eine besonders präzise Analyse des Emissionsspektrums bei unterschiedlichen Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereichen des Emissionslichts möglich wird.
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Obwohl das aus dem Lichtaustritt austretende Emissionslicht gegebenenfalls ohne weitere Verarbeitung in den Detektor geleitet werden kann, ist bei bevorzugten Ausführungsformen vorgesehen, dass zwischen dem Lichtaustritt des Lichtleiters und dem Detektor ein wellenlängenselektives optisches System angeordnet ist. Hierdurch kann aus dem Spektrum des Emissionslichts eine bestimmte Wellenlänge bzw. ein enger Wellenlängenbereich für die Detektion und Weiterverarbeitung ausgewählt werden.
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Vorzugsweise weist das wellenlängenselektive optische System einen Monochromator mit einem dispersiven Element und einer dem dispersiven Element nachgeschaltete weiteren Spaltblende mit einem weiteren Spalt auf. Hierdurch wird für die Analyse des Emissionsspektrums ein weiterer Monochromator geschaffen, bei dem der Lichtaustritt des Lichtleiters oder der Spalt einer eine diesem Lichtaustritt unmittelbar nachgeschaltete Spaltblende den Eintrittsspalt des Monochromators und der weitere Spalt den Austrittsspalt des Monochromators auf der Detektorseite bildet. Dadurch wird eine effiziente Blockung des Anregungslichts erreicht und eine empfindliche spektrale Analyse des Emissionslichts ermöglicht. Bei anderen Anordnungen kann das wellenlängenselektive optische System auch einen Bandpassfilter oder Langpassfilter enthalten oder durch einen solchen Filter oder eine Kombination solcher Filter gebildet sein.
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Es kann günstig sein, wenn das wellenlängenselektive optische System so konfiguriert ist, dass das aus dem Lichtaustritt austretende Emissionslicht auf den Detektor fokussiert wird. Hierdurch wird eine besonders hohe Lichtausbeute möglich. Bei Nutzung eines Filters im wellenlängenselektiven optischen System kann eine Fokussierung beispielsweise dadurch erreicht werden, dass zusätzlich mindestens eine Linse vorgesehen ist.
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Bei bevorzugten Ausführungsformen weist das wellenlängenselektive optische System ein Konkavgitter auf. Besonders günstig ist es, wenn das wellenlängenselektive optische System durch ein Konkavgitter gebildet wird, so dass außer dem Konkavgitter kein weiteres beugendes oder brechendes oder fokussierendes optisches Element zwischen Lichtaustritt und Detektor benötigt wird. Wenn die dispersive Wirkung durch ein beugendes Element erreicht werden soll, kann anstelle eines Konkavgitters auch ein ebenes Gitter (Plangitter) verwendet werden, wobei dieses gegebenenfalls mit weiteren fokussierenden Elementen kombiniert sein kann.
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Obwohl es möglich ist, dass das (doppelt genutzte) erste dispersive Element ein Prisma ist, ist bei bevorzugten Varianten vorgesehen, dass das erste dispersive Element ein Beugungsgitter aufweist, so dass die spektrale Aufweitung des Emissionslichts im Emissionspfad mittels Beugung stattfindet. Besonders günstig ist die Verwendung eines Konkavgitters als erstes dispersives Element, da hierdurch gegebenenfalls weitere Elemente zur Fokussierung des Lichts entfallen können.
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Es können unterschiedliche Arten von Lichtleitern genutzt werden. Bei manchen Varianten weist der Lichtleiter eine Vielzahl von Lichtleitfasern auf, die beispielsweise im Kern (core) und im Mantel (Cladding) aus Quarzglas oder einem anderen Glas im gewünschten Brechzahlbereich bestehen können. Bei Verwendung von Quarzglas kann der Lichtleiter für viele Anwendungsfälle eine optimal an die Leitung von Emissionslicht angepasste numerische Apertur haben, so dass im Wesentlichen das komplette Emissionsspektrum in Richtung Detektor übertragen werden kann.
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Vorzugsweise haben die Lichtleitfasern am Lichtaustritt eine andere Anordnung als am Lichteintritt. Die Lichtleitfasern können im Wesentlichen ungeordnet durch den Lichtleiter verlaufen, so dass am Lichtaustritt eine räumliche Durchmischung der am Lichteintritt eintretenden Wellenlängen stattfindet. Dies ist besonders günstig in Kombination mit einer optional vorgesehenen verstellbaren Spaltblende am Lichtaustritt des Lichtleiters. Bei einer willkürlichen räumlichen Durchmischung der verschiedenen Wellenlängen des Emissionslichts wirkt eine Verstellung der Spaltbreite dieser Spaltblende nicht wellenlängenselektiv, sondern ändert unselektiv lediglich die Intensität des austretenden Emissionslichts. Über die verstellbare Spaltblende kann die Bandbreite eines dem Lichtleiter nachgeschalteten Monochromators eingestellt werden.
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Es kann auch ein Lichtleiter mit einer transparenten Flüssigkeit verwendet werden.
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Der Lichtleiter kann grundsätzlich unterschiedliche Querschnittsformen haben. Bei manchen Ausführungsformen hat der Lichtleiter am Lichteintritt einen rechteckigen Querschnitt und eine lange Seite des Querschnitts liegt parallel zu der durch das erste dispersive Element definierten Dispersionsebene. Die Spaltgröße in der längeren Richtung sollte ausreichen, um das gesamte im Anwendungsfall erzeugte Spektrum des Emissionslichts aufnehmen zu können. Vorzugsweise liegt auch am Lichtaustritt ein rechteckiger Querschnitt vor, der dem rechteckigen Querschnitt der Eintrittsseite entspricht.
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Bei einer Ausführungsform hat der Lichtleiter am Lichtaustritt einen rechteckigen Querschnitt und eine kurze Seite des Querschnitts liegt in der Dispersionsebene eines nachgeschalteten dispersiven Elementes. Die kurze Seite kann unmittelbar die Spaltbreite des Eintrittsspaltes eines nachgeschalteten Monochromators definieren. Alternativ kann die Spaltbreite durch eine nachgeschaltete gesonderte Spaltblende definiert werden.
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Die Vorteile erfindungsgemäßer Vorrichtungen können in unterschiedlich konfigurierten Anordnungen genutzt werden.
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Bei einer Gruppe von Ausführungsformen ist zwischen der Lichtquelle und dem ersten Spalt ein Kondensor zur Fokussierung des von der Lichtquelle abgegebenen Lichts auf den ersten Spalt angeordnet und eine zweite Spaltblende mit einem zweiten Spalt ist zwischen dem ersten dispersiven Element und der Messposition angeordnet. Hierdurch wird ein Anregungspfad mit einem einfachen Monochromator geschaffen, wobei der erste Spalt als Eintrittsspalt fungiert und eine räumliche Begrenzung des für die Messung genutzten Lichtes der Lichtquelle bewirkt, während der zweite Spalt als Austrittsspalt des Monochromators fungiert, um eine gewünschte Anregungswellenlänge bzw. eine Anregungsbandbreite aus demjenigen Spektrum zu selektieren, welches durch das erste dispersive Element erzeugt wird.
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Bei einem einfachen Monochromator können unerwünschte Reflexionen und Streuungen an optischen Bauteilen und Wänden des Monochromators einen gewissen Anteil an Streulicht liefern, welches mit dem erwünschten Anregungslicht zur Probe gelangen und die Empfindlichkeit einer Fluoreszenzmessung beeinträchtigen kann. Daher wird bei manchen Ausführungsformen im Anregungspfad noch ein zweiter Monochromator hinter den ersten Monochromator geschaltet, um das Streulicht weiter zu unterdrücken und die erwünschte Bandbreite spektral zu reinigen. Hierzu ist bei entsprechenden Ausführungsformen im Anregungspfad zwischen der Lichtquelle und dem ersten Spalt ein zweites dispersives Element derart angeordnet, dass Licht der Lichtquelle über das zweite dispersive Element in den Bereich des ersten Spalts übertragbar ist. Der zweite Spalt ist dabei zwischen der Lichtquelle und dem zweiten dispersiven Element angeordnet. Bei diesem Doppelmonochromator im Anregungspfad dient der erste Spalt zur Wellenlängenselektion und der zweite Spalt dient als Eintrittsspalt des der Lichtquelle unmittelbar folgenden Monochromators.
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Der Doppelmonochromator wird vorzugsweise in subtraktiver Dispersion betrieben. Dabei wird die aus dem ersten Monochromator austretende spektrale Bandbreite im zweiten Monochromator beibehalten und nicht weiter dispergiert, die spektrale Reinheit wird aber verbessert und Streulicht reduziert.
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Mit Hilfe einer Verstelleinrichtung zur gekoppelten Verstellung des ersten und des zweiten dispersiven Elementes können diese beiden Elemente in koordinierter Weise beispielsweise synchron gegenläufig verkippt oder auf andere Weise bewegt werden, so dass jeweils die gewünschte Wellenlänge durch den ersten Spalt bis zur Messposition gelangen kann.
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Die Erfindung betrifft auch ein Messgerät, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält. Es kann sich dabei z. B. um ein dediziertes Fluorometer handeln, welches ausschließlich für Fluoreszenzmessungen ausgestattet ist, oder um ein Mehrzweckgerät, insbesondere einen Multi-Label-Reader.
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Die vorstehenden und weitere Merkmale gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der Beschreibung und den Zeichnungen hervor. Dabei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich alleine oder zu mehreren in Form von Unterkombinationen bei einer Ausführungsform der Erfindung und auf anderen Gebieten verwirklicht sein und vorteilhafte Ausführungsformen darstellen. Bevorzugte Ausführungsformen werden an Hand der beigefügten Zeichnungen erläutert.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt schematisch ein erstes Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben mit einem Doppelmonochromator im Anregungspfad;
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2 zeigt schematisch ein zweites Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben mit einem Einfachmonochromator im Anregungspfad; und
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3 zeigt schematisch ein drittes Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben mit einem Plangitter.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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In 1 ist schematisch ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 zur Ermittlung von Fluoreszenzeigenschaften von Proben gezeigt. Sie ist Bestandteil eines nicht näher dargestellten Messgeräts, bei dem es sich z. B. um ein Fluorometer, einen Dual-Label-Reader oder einen Multil-Laber-Reader handeln kann. In der Beschreibung werden relative Positionen optischer Elemente mit Präpositionen wie „zwischen”, „vor”, „hinter” oder dergleichen beschrieben. Diese Präpositionen beziehen sich auf Positionen entlang des optischen Pfades von der Lichtquelle über die Messposition bis zum Detektor. Bezeichnungen wie „erster”, „zweiter” „dritter” etc. dienen ausschließlich der eindeutigen Identifizierung der entsprechenden Elemente und beschreiben im Allgemeinen nicht die Reihenfolge, in der Elemente im optischen Pfad angeordnet sind.
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Die Vorrichtung 100 hat eine primäre Lichtquelle LQ in Form eine Xenon-Lampe mit einem kurzen Elektrodenabstand. Es kann sich je nach Anwendung um eine Blitzlampe oder eine Dauerstrich-Lampe handeln. Alternativ kann z. B. auch eine Glühlampe als Lichtquelle verwendet werde. Die Lichtquelle hat ein breites Emissionsspektrum im sichtbaren Spektralbereich („Weisslicht”). Ein optischer Anregungspfad AP führt von der Lichtquelle LQ bis zu einer Messposition MP, in der sich bei der Nutzung der Vorrichtung eine Probe P befindet. Die Probe befindet sich in einer Vertiefung bzw. einem Topf einer mit vielen Töfpen ausgestatteten Mikroplatte.
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Die optischen Elemente des optischen Anregungspfades dienen der Übertragung von spektralen Anteilen von Licht der primären Lichtquelle als Anregungslicht in die Messposition. In der Probe befindet sich eine Substanz, die durch das Anregungslicht dazu angeregt werden kann, Fluoreszenzlicht zu emittieren. Das Fluoreszenzlicht ist gegenüber dem Anregungslicht zu niedrigeren Energien bzw. größeren Wellenlängen verschoben. Das Ausmaß der spektralen Rotverschiebung ist für die Substanz spezifisch und wird als Stokes-Verschiebung bzw. Stokes-Shift bezeichnet.
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Das Emissionslicht gelangt über einen optischen Emissionspfad EP von der Probe zu einem Detektor DET, der in Abhängigkeit vom auftreffenden Licht elektrische Signale erzeugt, die einer nicht gezeigten Auswerteeinheit zugeführt werden, um das Emissionslicht zur Charakterisierung der Probe spektral auszuwerten.
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Bei der Vorrichtung aus 1 erfolgt die Anregung mit Hilfe eines Doppelmonochromators DM, der insgesamt drei Spalte enthält, nämlich einen Eintrittsspalt SP2, der im Folgenden auch als zweiter Spalt SP2 bezeichnet wird, einen Mittenspalt SP1, der im Folgenden auch als erster Spalt SP1 bezeichnet wird, sowie einen Austrittsspalt, der im Folgenden auch als dritter Spalt SP3 bezeichnet wird. Jeder der Spalte wird durch eine entsprechende Spaltblende (erste, zweite bzw. dritte Spaltblende) in einer zugehörigen Spaltebene definiert, die Spaltbreite ist jeweils stufenlos verstellbar.
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Der Lichtbogen der Lichtquelle wird üblicherweise auf den Eintrittsspalt SP2 abgebildet. Die spektrale Bandbreite des Doppelmonochromators kann über die Breite des Eintrittsspalts verändert werden. Innerhalb des Doppelmonochromators wird der Eintrittsspalt SP2 auf dem Austrittsspalt SP3 abgebildet. Bei der bildlich dargestellten bevorzugten Variante liegt der Austrittsspalt SP3 in der Messposition bzw. in der Probenposition, so dass keine Zwischenabbildung des Austrittsspaltes auf die Probe mittels Linsen und/oder Spiegeln erfolgt. Damit kann Intensität in der Anregung gewonnen werden. Bei anderen Ausführungsformen kann zwischen dem Austrittsspalt und der Messposition ein entsprechendes Abbildungssystem zwischengeschaltet sein.
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Es können Doppelmonochromatoren mit unterschiedlichen Bauformen verwendet werden, wobei je nach Anwendung Prismen und/oder Beugungsgitter als dispersive Elemente genutzt werden können. Beim dargestellten Ausführungsbeispiel hat der Doppelmonochromator zwei Konkavgitter als dispersive Elemente. Eines der Konkavgitter ist in Lichtlaufrichtung zwischen der Lichtquelle LQ und dem ersten Spalt SP1 (Mittenspalt) angeordnet und wird hier auch als zweites dispersives Element DE2 bezeichnet. Das andere Konkavgitter ist in Laufrichtung des Anregungslichtes zwischen dem ersten Spalt SP1 und der Messposition MP angeordnet und wird hier auch als erstes dispersives Element DE1 bezeichnet. Zwischen dem Mittenspalt und dem ersten dispersiven Element ist im Beispielsfall noch ein Planspiegel PS zur Faltung des Anregungsstrahlengangs (und des Emissionsstrahlengangs) angeordnet. Dieser Planspiegel kann aus Bauraumgründen vorteilhaft sein, ist jedoch optisch nicht nötig. Der Austrittsspalt SP3 ist ebenfalls nicht zwingend erforderlich und kann bei Varianten der dargestellten Ausführungsform auch entfallen.
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Das von der Probe P emittierte Emissionslicht der Fluoreszenz ist gegenüber dem Anregungslicht spektral rotverschoben und strahlt prinzipiell in den gesamten Raumwinkelbereich oberhalb der Probe. Von diesem Raumwinkelbereich wird nur derjenige Teil genutzt, den das der Probe nächstliegende dispersive Element, nämlich das erste dispersive Element DE1 (Konkavgitter), aufnehmen kann. Die Raumwinkel der Anregung und der Emission sind somit gleich groß. Das erste dispersive Element DE1 ist im Emissionspfad EP in Bezug auf die Messposition MP derart angeordnet, dass von der Probe emittiertes Emissionslicht über das erste dispersive Element DE1 in einen Bereich B seitlich neben dem ersten Spalt SP1 übertragen werden kann. Mit Hilfe des Konkavgitters (erste dispersives Element DE1) wird das Emissionslicht nicht nur gebeugt, sondern auch in die Spaltebene SE1 des ersten Spalts, d. h. in die Mittelspaltebene, fokussiert. Dabei liegt das fokussierte Emissionsspektrum in einem Bereich B, der mit Abstand seitlich (horizontal) neben dem ersten Spalt SP1 liegt.
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Zum Verständnis sei noch angemerkt, dass das zweite dispersive Element DE2 und das erste dispersive Element DE1 synchron allein auf die gewünschte Anregungswellenlänge eingestellt sind. Das resonant gestreute Anregungslicht, dessen Wellenlänge nicht rotverschoben ist, trifft wieder durch den Mittenspalt (erster Spalt SP1) und gelangt somit nicht in den Emissionspfad. Dadurch wird das Streulicht im Emissionspfad deutlich reduziert.
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Im Bereich B neben dem ersten Spalt liegt ein fokussiertes Emissionsspektrum vor, in welchen Strahlen unterschiedlicher Wellenlängen in unterschiedliche Richtungen bzw. in unterschiedlichen Winkeln verlaufen. Hinter der ersten Spaltebene (in Richtung Detektor) divergieren diese Strahlen. Für eine empfindliche Analyse des Emissionsspektrums sollten diese Strahlen „eingesammelt” und kontrolliert in Richtung Detektor weitergeleitet werden.
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Dies wird bei der Ausführungsform auf einfache und wirkungsvolle Weise dadurch erreicht, dass im Emissionspfad ein Lichtleiter LL zur Übertragung von durch das erste dispersive Element DE1 in den Bereich B neben dem ersten Spalt übertragenem Emissionslicht in Richtung des Detektors DET angeordnet ist. Der Lichteintritt LE des Lichtleiters liegt dabei in der ersten Spaltebene SE1 (Mittelspaltebene) oder nahe dieser Spaltebene seitlich mit Abstand neben dem ersten Spalt SP1. Innerhalb des Lichtleiters LL wird das Emissionslicht durch vielfache innere Totalreflexion vom Lichteintritt LE zum Lichtaustritt LA des Lichtleiters weitgehend verlustfrei transportiert. Am Lichtaustritt des Lichtleiters ist eine verstellbare Spaltblende angeordnet, die einen fünften Spalt SP5 mit variabler Spaltbreite definiert.
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Dieser Spalt dient als Eintrittsspalt eines einfachen Monochromators EM, der als wellenlängenselektives optisches System zwischen dem Lichtaustritt LA des Lichtleiters und dem Detektor DET angeordnet ist. Der Monochromator hat ein drittes dispersives Element DE3 in Form eines Konkavgitters, welches den durch den fünften Spalt SP5 gebildeten Eintrittsspalt in einen sechsten Spalt SP6 abbildet, der durch eine sechste Spaltblende definiert wird, die unmittelbar vor dem Detektor DET sitzt.
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Der Lichtaustritt LA des Lichtleiters bzw. die dort angeordnete Spaltblende bieten eine definierte, von der Wellenlänge des Emissionslichts unabhängige Position am Eintritt des detektorseitigen Monochromators EM. Zur Einstellung auf unterschiedliche Wellenlängen muss lediglich das Konkavgitter (drittes dispersives Element DE3) entsprechend verkippt werden, so dass Licht mit der dem Beugungswinkel entsprechenden Wellenlänge vom Eintrittsspalt SP5 zum Austrittsspalt SP6 des Monochromators EM gebeugt wird.
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Der Lichtleiter LL hat im Beispielsfall am Lichteintritt LE einen rechteckigen Querschnitt, dessen lange Seite in der Dispersionsebene des ersten dispersiven Elementes DE1 (d. h. in der Zeichnungsebene) liegt. Die Länge des Spaltes in dieser Richtung sollte mindestens der geometrischen Spektrumslänge des Emissionslichtes in der Mittenspaltebene entsprechen. Die Höhe des Lichtleiters (gemessen parallel zur schmalen Seite des Lichteintritts, senkrecht zur Zeichnungsebene) überträgt die gesamte Intensität der Emission bei jeder Wellenlänge. Die im Beispielsfall aus Quarzglas bestehenden Lichtleitfasern im Lichtleiterbündel sind willkürlich angeordnet, so dass das Emissionsspektrum auf der Austrittsseite des Lichtleiters nicht mehr in einer Linie vorliegt, sondern über die gesamte Länge und Höhe des rechteckigen Austrittsquerschnitts verteilt ist. In 1 ist dies beispielhaft am Beispiel der Fasern F1 bis F5 dargestellt. Selbstverständlich hat ein realer Lichtleiter typischerweise mehrere hundert oder mehrere tausend einzelne Lichtleitfasern.
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Die Austrittsseite des Lichtleiters bildet den Eintrittsspalt des detektorseitigen Monochromators EM, mit dem das Emissionslicht spektral analysiert werden kann. Bei der dargestellten Anordnung liegt nun die kurze Seite des rechteckigen Querschnitts des Lichtleiters in der Dispersionsebene des dritten dispersiven Elementes DE3 (Zeichnungsebene). Diese Richtung entspricht der Spaltbreite. Die lange Seite senkrecht zur Dispersionsebene liefert die Spalthöhe des Monochromators EM und bestimmt damit die Lichtintensität des Lichteintritts und der Beugung.
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Bei der gezeigten Anordnung reicht ein Einzelmonochromator EM zwischen dem Lichtaustritt des Lichtleiters und dem Detektor völlig aus, da eventuell störendes Anregungslicht bereits bei der spektralen Separation von Anregungspfad und Emissionspfad am Mittenspalt SP1 weitgehend eliminiert ist. Der Monochromator EM besitzt im Beispielsfall einen variablen Eintrittsspalt SP5 und einen variablen Austrittsspalt SP6, um eine variable Bandbreite bereitzustellen. Der Monochromator EM, der auch als Emissions-Monochromator bezeichnet werden kann, kann zur Analyse beispielsweise auf die Peak-Wellenlänge der Emission eingestellt werden, so dass deren Intensität mittels des Detektors ermittelt werden kann. Es ist auch möglich, durch sukzessive Verkippung des dritten dispersiven Elementes DE3 das Emissionsspektrum sukzessive abzuscannen, um die Intensität als Funktion der Wellenlänge zu analysieren. Der Detektor DET in Form eines Photomultipliers ist im Beispielsfall direkt hinter dem Austrittsspalt SP6 positioniert. Es ist auch möglich, zwischen den Austrittsspalt und den Detektor noch ein Abbildungssystem zwischenzuschalten.
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Im Prinzip kann das wellenlängenselektive optische System auch als Doppelchromator ausgeführt sein.
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Das Ausführungsbeispiel von 1 ermöglicht sehr empfindliche Fluoreszenzbestimmungen, da eine starke Blockung des Anregungslichts gegenüber dem schwachen Emissionslicht aus der Probe erreicht wird. Da das Anregungslicht aus einer breitbandigen „weißen” Lichtquelle erzeugt wird, müssen alle Wellenlängen, die nicht der Anregung dienen, unterdrückt werden. Dazu wird das breitbandige primäre Licht mit Hilfe eines ersten Monochromators, der das zweite dispersive Element DE2 enthält, in seine spektralen Anteile aufgeteilt. Mit Hilfe des Mittenspalts SP1 wird ein schmaler Bandbereich daraus selektiert. Unerwünschte Reflexionen und Streuungen an den optischen Bauteilen und Wänden des Monochromators können einen gewissen Anteil an Streulicht liefern, welches mit dem erwünschten Anregungslicht hindurchtritt und die Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessung beeinträchtigen kann. Daher wird ein mit dem ersten dispersiven Element DE1 ausgestatteter zweiter Monochromator hinter den ersten geschaltet, um das Streulicht weiter zu unterdrücken und die erwünschte Bandbreite spektral zu reinigen.
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Der Doppelmonochromator DM wird in subtraktiver Dispersion betrieben. Dies bedeutet, dass die aus dem ersten Monochromator durch den Mittenspalt SP1 austretende spektrale Bandbreite im zweiten Monochromator beibehalten und nicht weiter dispergiert wird. Das spektral präzise eingegrenzte und gereinigte Anregungslicht trifft dann auf die Probe. Das resultierende Emissionslicht wird durch den Emissionspfad verlustarm und ohne störende Verfälschung zum Detektor geleitet.
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Ein Monochromator mit Konkavgitter ist optimiert für eine Abbildung der Spalte aufeinander bei allen Wellenlängen. Die Abbildung des Eintrittsspalts auf den Austrittsspalt oder umgekehrt ist optimal scharf, während die Abbildung der Emission vom Austrittsspalt in die Nachbarschaft des Mittenspaltes (insbesondere Bereich B) aufgrund der Rotverschiebung geringfügig andere Brennweiten aufweist. Das Emissionslicht aus der Probe wird durch den Lichtleiter LL aufgenommen. Um der leichten Brennweitenverschiebung Rechnung zu tragen, kann der Lichteintritt des Lichtleiters bei dem Ausführungsbeispiel mit Hilfe einer nicht dargestellten Justiereinrichtung in der Dispersionsebene des ersten dispersiven Elementes DE1 verschoben und/oder gedreht und dann fixiert werden, so dass die Fokussierung am Ort des Lichteintritts optimiert werden kann. Zu beachten ist, dass die Fokussierung auf das Lichtleiterbündel nur hinsichtlich der Intensitätsübertragung von Bedeutung ist, nicht aber für die Auflösung des nachgeschalteten Monochromators EM im Emissionspfad. Auch bei fester Lage des Lichteintritts des Lichtleiters ist also eine präzise Analyse möglich.
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Ein subtraktiv arbeitender Doppelmonochromator mit festem Eintrittsspalt bzw. definierter Größe der primären Lichtquelle besitzt auch ein gleich großes Bild am Austrittsspalt, d. h. im Bereich der Fokussierung in der Messposition MP. Das Bild an der Messposition bzw. in der Probe ist unabhängig von der Größe des Mittenspalts. Die Breite des Mittenspalts bestimmt die Bandbreite des Anregungslichts, so lange die Spaltbreite größer ist als der Eintrittsspalt. Wenn der Mittenspalt kleiner ist als der Eintrittsspalt, wird die Bandbreite konstant und ist gegeben durch den Eintrittsspalt.
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Der gezeigte Aufbau kommt mit nur drei dispersiven Elementen DE1, DE2 und DE3 in Form von Konkavgittern aus, wodurch einfache und relativ kostengünstige Aufbauten realisierbar sind, ohne dass die Qualität der Fluoreszenzmessung leidet. Die Konkavgitter haben koplanare Dispersionsebenen, wodurch ein kompakter Aufbau möglich ist, der die Integration der Vorrichtung in komplexere Messgeräte erleichtert.
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Die Dimensionierung des Lichtleiters und die Positionierung des Lichteintritts LE können den Messaufgaben angepasst werden. In vielen Fällen liegt die spektrale Breite des Emissionsspektrums in der Größenordnung von ca. 100 nm, was bei einer linearen Dispersion des ersten dispersiven Elementes in einer Größenordnung von 8 nm/mm zu einer geometrischen Länge des Spektrums im Bereich B von ca. 12 mm führt. Lichtleiter mit entsprechenden Querschnitten sind kommerziell verfügbar. Die zu erwartenden Abstände zwischen der Position des Mittenspaltes und demjenigen Bereich B, in dem das Emissionsspektrum auftritt, liegen im Millimeter-Bereich und erlauben somit eine saubere räumliche Trennung von Anregungslicht und Emissionsspektrum.
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Bei HTRF®(Homogenous Time-Resolved Fluorescence)-Messungen kann der Stokes-Shift bei mehr als 320 nm liegen. Gleichwohl liegt das Emissionsspektrum typischerweise in einem Bereich bis maximal 100 nm. Insbesondere für HTRF-Messungen kann es sinnvoll sein, einen zweiten Lichtleiter vorzusehen, dessen Lichteintritt seitlich neben dem Lichteintritt des dargestellten Lichtleiters auf der dem Mittenspalt SE1 abgewandten Seite liegt. Bei Messungen von Proben mit größerem Stokes-Shift kann das Lichtaustrittsende des weiteren Lichtleiters anstelle des Lichtaustritts des gezeigten Lichtleiters linear durch einen geeigneten Schieber in den Bereich des Eintrittsspalts SP5 des detektorseitigen Monochromators verschoben werden. Mit geringem Aufwand ist also eine Anpassung der Vorrichtung an unterschiedliche Messaufgaben möglich.
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Es ist auch denkbar, nur einen einzigen Lichtleiter bereitzustellen und diesen so zu verschieben, dass er an den zu erwartenden Stokes-Shift angepasst ist.
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Ein anderes Ausführungsbeispiel wird nun anhand von 2 erläutert. Bei diesem vereinfachten Aufbau einer Vorrichtung 200 wird nur ein einziges dispersives Element im Anregungspfad benötigt. Die Vorrichtung hat eine Lichtquelle LQ mit breitem Emissionsspektrum. Ein Kondensor KON mit einer oder mehreren Linsen dient zur Fokussierung des Lichts der Lichtquelle auf einen ersten Spalt SP1, der durch eine erste Spaltblende in einer ersten Spaltebene SE1 definiert wird und als Eintrittsspalt eines nachfolgenden Monochromators MC dient. Das Licht fällt danach unmittelbar auf ein erstes dispersives Element DE1 in Form eines Konkavgitters. Die beugenden Strukturen des Konkavgitters (z. B. Furchen) verlaufen senkrecht zur Zeichnungsebene, so dass die Dispersionsebene in der Zeichenebene liegt. Das erste dispersive Element DE1 weitet das breitbandige Licht der Lichtquelle spektral auf und fokussiert das Licht gleichzeitig auf einen zweiten Spalt SP2, der durch eine zweite Spaltblende definiert wird und in einer zweiten Spaltebene liegt. Der zweite Spalt dient als Austrittsspalt des Monochromators, der Eintrittsspalt (erster Spalt SP1) wird auf dem Austrittsspalt (zweiter Spalt SP2) abgebildet. Der Austrittsspalt dient zur Selektion der Anregungswellenlänge des Anregungslichts, mit welchem die in der Messposition MP befindliche Probe P bestrahlt werden soll. In dem bisher beschriebenen Anregungspfad AP zwischen Lichtquelle LQ und Messposition MP liegt also das erste dispersive Element DE1 zwischen dem ersten Spalt S1 und der Messposition MP.
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In der Messposition befindet sich bei der Nutzung der Vorrichtung eine fluoreszierende Probe P, die das Anregungslicht absorbiert und Emissionslicht mit einem gegenüber dem Anregungslicht in Richtung langer Wellenlängen verschobenen Emissionsspektrum erzeugt. Das Emissionslicht, welches in denjenigen Raumwinkel fällt, der durch das erste dispersive Element DE1 abgedeckt ist, wird von diesem Element gebeugt und in der Spaltebene SE1 des Eintrittsspalts SP1 fokussiert. Wegen des Stokes-Shifts des Probenmaterials fällt das Emissionsspektrum in einen Bereich B, der außerhalb des ersten Spalts SP1 mit Abstand neben diesem in der ersten Spaltebene SP1 liegt. Die verschiedenen Wellenlängen des Emissionsspektrums sind durch Pfeile dargestellt, sie fallen unter leicht unterschiedlichen Winkeln auf die erste Spaltebene.
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In der Ebene des Eintrittsspalts wird das fokussierte Emissionsspektrum durch den Lichteintritt LE eines Lichtleiters LL aufgenommen. Das schematisch dargestellte Lichtleiterbündel leitet das Emissionslicht an den gegenüberliegenden Lichtaustritt LA des Lichtleiters weiter. Der Lichtaustritt oder eine unmittelbar davor angebrachte Spaltblende kann als Eintrittsspalt eines nachgeschalteten Monochromators EM dienen, der als wellenlängenselektives optisches System fungiert, mit dessen Hilfe das Emissionsspektrum analysiert und auf einen Detektor DET fokussiert übertragen wird. Der Aufbau kann dem Aufbau des detektorseitigen Monochromators EM in 1 entsprechen. Auch hier ist zwischen einem Eintrittsspalt und einem Austrittsspalt ein dispersives Element DE3 in Form eines Konkavgitters angebracht.
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In 2 ist das Konkavgitter DE3 mit senkrechter Lage der Furchen gezeigt. Das über den Lichtleiter gesammelte Emissionsspektrum befindet sich willkürlich verteilt am Lichtaustritt des Lichtleiters LL. Die Breite des Lichtleiters (Schmalseite) wirkt als Eintrittsspaltbreite des Monochromators EM und bestimmt zusammen mit dem Austrittsspalt SP6 die Bandbreite des detektorseitigen Monochromators EM. Die lange Seite des rechteckigen Querschnitts des Lichtaustritts LA beeinflusst nicht die Bandbreite, sondern die Lichtstärke dieses Monochromators Das Emissionsspektrum der Probe wird über das konkave Gitter spektral zerlegt und am Austrittsspalt SP6 fokussiert, hier angedeutet durch die Pfeile. Licht aus einem Punkt des Eintrittsspalts wird wieder auf einen Punkt in der Austrittsspaltebene fokussiert, wobei dessen Lage von der jeweiligen Wellenlänge abhängt. Ein schmaler Austrittsspalt schneidet aus dem Spektrum eine entsprechend kleine Bandbreite heraus. Dieses durchgelassene Licht wird vom Detektor DET hinter dem Austrittsspalt SP6 in ein elektrisches Signal umgewandelt.
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Das dem Lichtleiter nachgeschaltete wellenlängenselektive System kann auch anders aufgebaut sein. Anstelle eines Beugungsgitters kann auch ein Prisma als dispersives Element vorgesehen sein. Der Aufbau kann auch komplexer sein, nicht nur mit einem einzigen Konkavgitter, wie dargestellt. Der dargestellte Monochromator ist vom Typ Seya-Namioka. Im Prinzip kann auch ein Czerny-Turner oder Littrow-Aufbau verwendet werden.
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Es sind zahlreiche weitere Varianten möglich. Beispielhaft zeigt 3 eine kostengünstigere Version einer Vorrichtung 300, die einen einzigen mittels Beugung arbeitenden Monochromator enthält, welcher anstelle eines Konkavgitters ein Plangitter aufweist. Entsprechende Komponenten weisen die gleichen Bezugszeichen auf wie in 2.
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Die Lichtquelle LQ mit breitem Emissionsspektrum emittiert Licht, welches über einen Kondensor KON in der Spaltebene eines Eintrittsspalts SP1 fokussiert wird. Der Austrittsspalt des Monochromators wird hier auch als zweiter Spalt SP2 bezeichnet und wird durch eine zweite Spaltblende definiert, die sich unmittelbar oberhalb der Messposition MP mit der Probe P befindet. Anstelle des Konkavgitters beim Ausführungsbeispiel von 2 ist hier als erstes dispersives Element DE1 im Anregungspfad AP ein Plangitter vorgesehen. Zwischen dem Eintrittsspalt und dem Plangitter befindet sich ein Konkavspiegel KS, der das vom Eintrittsspalt SP1 kommende Anregungslicht nach unendlich abbildet und in Kombination mit einer dem Plangitter nachgeschalteten Linse L das Licht auf die Austrittsspaltebene fokussiert. Durch den Austrittsspalt SP2 wird dabei diejenige Wellenlänge bzw. dasjenige enge Wellenlängenspektrum des Anregungslichts selektiert, welches genutzt werden soll..
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Das Emissionslicht wird beim Durchlaufen des Emissionspfades EP in der Eintrittsspaltebene fokussiert, wobei das Plangitter P für unterschiedliche Wellenlängen des Emissionslichts unterschiedliche Beugungswinkel einführt, so dass das Emissionsspektrum in der Spaltebene des Eintrittsspaltes (erste Spaltebene SEI) in einem Bereich B seitlich neben dem Eintrittsspalt liegt. Hier wird das Emissionsspektrum wie bei den anderen Ausführungsbeispielen von einem Lichtleiter LL aufgenommen und in Richtung eines nicht dargestellten weiteren Monochromators zur Analyse des Emissionsspektrums geleitet.
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Ein Vorteil dieser Lösung liegt darin, dass ein preiswertes, gegebenenfalls auch größeres Plangitter anstelle eines Konkavgitters verwendet werden kann. Zwecks variabler Fokussierung des Anregungslichtbündels kann die Linse L ausgetauscht werden. Damit sind verschiedene Bündelgeometrien in der Probe realisierbar, was hilfreich sein kann, um in einer entsprechenden Vorrichtung unterschiedliche Formate von Mikroplatten zu verwenden.
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In allen Ausführungsbeispielen gibt es zwischen dem ersten Spalt und der Messposition ein dispersives optisches Element, welches sowohl im Anregungspfad als auch im Emissionspfad verwendet wird und welches ein vom Anregungslicht spatial (räumlich) getrenntes Emissionsspektrum erzeugt, welches mit einem ausgedehnten Lichtleiter aufgenommen wird, um es über eine weitere spektrale Analyse dem Detektor zuzuführen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2012/095312 A1 [0006]
- WO 2010/111166 [0007]
