CN1483142A - 荧光辉度测量方法及装置 - Google Patents

Abstract

照射激励标识荧光物质的波长光，得到荧光图像(101)，由从照射不激励所述荧光物质的波长光所得到的附在所述被测量物上的异物图像(102)中抽取的异物区域图像(103)形成掩膜，取该掩膜与所述荧光图像(101)的逻辑积，由此得到从所述荧光图像(101)中去除异物区域后的荧光图像(104)。

Description

荧光辉度测量方法及装置

技术领域

本发明涉及一种将排列在平面上的多个微小点作为对象来测量微小点辉度的装置，尤其是涉及适用于如下系统的荧光辉度测量方法及装置，该系统将用荧光物质标识的DNA或蛋白质等物质作为微小点并高密度排列在平面上的生物芯片(biochip)作为对象，进行荧光分析。

背景技术

例如，在特开2000-121559号公报中，公开了测量微小点荧光辉度的装置。

图17是上述特开2000-121559号公报中公开的荧光辉度测量装置的示意构成图。该公报中公开的荧光辉度测量装置包括：芯片驱动部503，沿图中Y方向对将进行了荧光标识的试件作为微小点形成在基板表面上的生物芯片520进行扫描；作为激励光源的激光器506；分色镜508，透过来自被测量物的荧光；聚光透镜509；头(head)驱动部502，沿图中X方向扫描包含该聚光透镜509和上述分色镜508的读取头507；分色镜511，将来自所述微小点的荧光分离成每个波长的光；滤光器515、519，分离激光与荧光；光圈透镜514、518；针孔板513、517；和光电倍增器512、516。

如此构成的荧光辉度测量装置的作用如下。即，激光器506发生的激光由分色镜108反射后，射向聚光透镜509，聚光在生物芯片520上，形成激光点。此时，在该激光点照明的部分中存在荧光物质的情况下，激光激励荧光物质，发生荧光。发生的荧光被聚光透镜509聚光后，透过分色镜508，由分色镜511分离成每个波长的光，光圈透镜514、518对各个波长进行聚光，通过针孔板513、517，并入射到光电倍增器512、516。光电倍增器512、516是检测光子并将其变换为TTL电平脉冲的传感器，入射到光电倍增器512、516的光变为脉冲信号，通过测量脉冲数，可测量微小点的荧光辉度。并且，通过边由芯片驱动部503和头驱动部502机构扫描激光点边实施以上动作，可测量生物芯片520整体中的微小点的荧光辉度。

但是，若向生物芯片520的表面反射激励光，且存在发出荧光的异物时，除来自生物芯片520上的斑点521的荧光外，还检测到来自异物的成为噪声的光，因此就测量辉度中产生误差这点上不能进行应对。

另外，在现有的荧光辉度测量装置中，因为不能判断有无异物，所以对于微小点的辉度值可靠性不能进行定量判断。

发明内容

本发明鉴于上述问题而作出，其目的在于提供一种荧光辉度测量装置及方法，即使在生物芯片上表面附近存在异物的情况下，也可减少测量误差，并可在识别存在异物后，定量判断辉度测量值的可靠性。

为了实现上述目的，本发明的荧光辉度测量方法测量包含排列在具有大致平面的基板上的荧光物质微小点的辉度，其特征在于：包含

第1摄像步骤，照射可激励所述荧光物质的波长的光，取得包含荧光物质的微小点的图像，作为第1图像；

第2摄像步骤，通过照射不激励所述荧光物质的波长的光，取得附在所述基板上的异物的图像，作为第2图像；

抽取步骤，从该第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像；和

异物去除步骤，将该2值化图像作为掩膜，将所述第1图像中与异物区域重合的部分图像无效。

另外，本发明的荧光辉度测量装置，测量向包含在具有大致平面的基板上排列的荧光物质的微小点照射激励光所得到的荧光像的辉度，其特征在于：具备

光源；

第1波长选择部件，选择激励光的波长；

成像部件，用于形成所述荧光物质的像；

第2波长选择部件，仅选择发生的荧光的波长；

光电变换部件，扫描荧光像，得到图像；

存储部件，存储该图像；

和图像处理部件，该部件进行如下处理：

控制所述第1波长选择部件，照射来自所述光源的光中可激励所述荧光物质的波长的光，同时，控制所述第2波长选择部件，由所述光电变换部件取得包含荧光物质的微小点的图像，作为第1图像，并存储在所述存储部件中；

控制所述第1波长选择部件，照射来自所述光源的光中不能激励所述荧光物质的波长的光，同时，控制所述第2波长选择部件，由所述光电变换部件取得附在所述基板上的异物的图像，作为第2图像，并存储在所述存储部件中；

从存储在所述存储部件中的所述第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像；和

将所述2值化图像作为掩膜，将存储在所述存储部件中的所述第1图像中与所述异物区域重合的部分的图像无效。

即，根据本发明的荧光辉度测量方法及装置，照射激励标识荧光物质的波长光，得到第1图像，由从照射不激励所述荧光物质的波长光所得到的附在所述被测量物上的异物图像中抽取的异物区域图像形成掩膜，取该掩膜与所述第1图像的逻辑积，由此从所述第1图像中去除异物区域，所以可去除来自附在生物芯片上的异物的噪声光。

附图说明

图1是表示根据本发明实施例1的荧光辉度测量装置的示意构成图。

图2A是表示用于生物芯片的荧光物质的吸收波长与荧光波长的相对强度的分光特性一例的图。

图2B是表示荧光测量用滤光器单元的分光透过率特性的图。

图2C是表示异物图像摄影用滤光器单元的分光透过率特性的图。

图3是表示生物芯片格式的示意图。

图4是实施例1中测量微小点辉度时的数据处理方法的示意图。

图5A是表示异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的辉度信号S的图。

图5B是表示将最大辉度Smax的1/2作为阈值时的2值化结果的图。

图6是表示参考图像的辉度分布特性的图。

图7A是表示将向图5A的辉度信号乘以最大辉度信号SRmax与参考辉度信号SR之比SRmax/SR的值作为辉度信号S’时、异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的辉度信号S’的图。

图7B是表示将最大值S’max的1/2作为阈值时的2值化结果的图。

图8表示使用一次微分算符时、异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的微分信号S”的图。

图9表示使用二次微分算符时、异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的微分信号S”的图。

图10表示由其它方法求出微分信号时、使用一次微分算符情况下、异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的微分信号S”的图。

图11表示同样由其它方法求出微分信号时、使用二次微分算符情况下、异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的微分信号S”的图。

图12用于说明两种异物混合存在时的适当阈值的设定方法，是将横轴作为均等分割的微分信号S”的代表值、将纵轴作为对应于该微分信号S”的象素总数的频数分布图。

图13A是表示对1个微小点的分割图像的图。

图13B是表示来自图13A所示线段AB上的CCD的输出信号的图。

图14是表示根据本发明实施例2的荧光辉度测量装置的示意构成图。

图15是参考芯片的示意图。

图16是表示实施例2的测量方法的流程图。

图17是现有荧光辉度测量装置的示意构成图。

具体实施方式

下面，参照附图来说明本发明的实施例。

实施例1

首先，用图1至图13B来说明根据本发明实施例1的荧光辉度测量方法及装置。

如图1所示，在本实施例的荧光辉度测量装置中，照明单元1具有水银灯等光源2，从光源2投射的光束由聚光透镜3聚光，并由开口光圈4及视野光圈5缩小后，经透镜6入射到滤光器组7。

在本实施例中，将具有图2所示特性的荧光物质用作标识物质。即，图2中，具有由参照序号26表示的吸收光谱和波长比该吸收光谱26长的发光光谱27。

如图2B所示，荧光测量用滤光器组7包括：波长选择滤光器8(下面记作激励滤光器)，具有分光透过率特性28，选择地透过被用作标识物质的具有图2A所示特性的荧光物质激励的光波长；分色镜9，具有分光特性29，反射透过该激励滤光器8的波长的光，并仅使从生物芯片上微小点的标识荧光物质发生的荧光波长在一定滤长频域透过；和波长选择滤光器10(下面记作吸收滤光器)，具有分光透过率特性30，仅选择地透过从生物芯片上微小点的标识荧光物质发生的荧光波长，并吸收不需要的波长成分。

异物图像摄影用滤光器组11如图2C所示，包括：波长选择滤光器12，具有分光透过率特性31，不激励用作标识物质的荧光物质，选择地透过在生物芯片上的异物上反射或异物发出荧光的波长的光；分色镜(dichroicmirror)13，具有分光特性32，反射透过该波长选择滤光器12的光，并透过在生物芯片上的异物发生的荧光或异物上反射的光；和滤光器14，具有分光特性33，仅选择地透过发生的来自异物的光或异物中反射的光的波长。

这些滤光器组7、11安装在滤光器组安装部件15上，将一个滤光器组配置成使照明光轴与观察光轴的交点和分色镜9、13一致，根据来自后述滤光器组控制部件的切换信号，由滤光器组切换机构16来进行切换。

如图3所示，生物芯片24例如由10mm×20mm方形玻璃板制成，在其表面上按例如100微米的间隔将例如由FITC(聚三氟氯乙烯异硫氰酯)或若丹明等荧光物质标识的DNA或蛋白质等被检物排列成棚格状，该被检物例如为直径为50微米的微小的大致圆形的微小点25。并且，为了识别形成微小点的区域，在角部形成4个用于标识的荧光物质的位置检测用微小点35。另外，将生物芯片24设置在未图示的2轴(XY)台上，可在水平面内移动，并可在物镜34的视野内定位。

物镜34间隔其动作距离地设置在生物芯片24的上方，形成观察光路，以便激励照明生物芯片24后发生的荧光通过物镜34聚光，通过成像透镜17，在作为光电变换元件的CCD元件18上形成所述生物芯片24的像。作为该装置的一例，可使用一般的反射荧光显微镜。在本实施例中，采用同轴反射照明来作为照明方法，但也可偏离观察光路，作为偏斜照明，或将照明光作为轮带，成为暗视野反射照明。

CCD元件18电扫描生物芯片24的荧光像，输出模拟图像信号。控制部件23具有将该模拟信号变换为数字数据的A/D变换器19和图像存储器21，并且还包括具有图像2值化功能、进行多个图像间的逻辑积的功能、测量任意区域的面积的功能、将任意区域内的辉度值相乘的功能的图像处理部件22、进行四则运算的运算部件42和滤光器组控制部件20。

下面，用图1至图13B来说明本实施例的作用。

首先，由未图示的2轴台定位生物芯片24，使由生物芯片24上的4个定位用微小点35规定的测量范围与由观察光学系统的像倍率和CCD元件18的感光面尺寸确定的视野范围一致。接着，通过滤光器组切换机构16将荧光测量用滤光器组定位在摄影位置上，以摄影生物芯片24上的微小点25的荧光图像。

另一方面，从光源2发出的光束由聚光透镜3聚光，在由开口光圈4及视野光圈5缩小后，经透镜6导入荧光测量用滤光器组7。导向该荧光测量用滤光器组7的光通过具有与标识荧光物质的吸收波长域16一致的分光透过特性28的激励滤光器8，变为具有特定半值幅度波长的光束(下面称为激励光)。因为分光镜9具有分光特性29，所以该光束被分光镜9反射，通过物镜34，照射在生物芯片24上。此时，生物芯片24上排列成微小点25的荧光物质发出波长比由其物性及环境确定的激励光还长的荧光。各微小点25发出的荧光由物镜34聚光，这里，因为发生的荧光是分色镜9的透过波长域，所以透过荧光测量用滤光器组7的分色镜9，并透过吸收滤光器10，在CCD元件18上形成微小点25的像。

之后，CCD元件18电扫描CCD元件18上的微小点25的像，并变换为模拟电信号。该模拟信号被A/D变换器19变换为数字信号，作为图4所示微小点的荧光图像101存储在图像存储器21中。

接着，通过滤光器组切换机构16从荧光测量用滤光器组7切换到异物图像摄影用滤光器组11，向生物芯片24提供不激励荧光物质的光波长的照明光，通过与上述步骤一样的操作，将图4所示异物图像102存储在图像存储器21中。此时，因为不激励微小点25的标识荧光物质，所以异物图像102中不包含微小点25的像。

接着，为了从异物图像102中抽取异物区域，通过图像处理部件22对异物图像102进行2值化处理。此时，通常在由无象差透镜在γ值为[1]的感光元件上成像均匀辉度的物体的情况下，将得到的图像最大辉度的1/2作为阈值来2值化时的边界认为是主光线与最佳像面的交点，将得到的2值化区域采用为异物的外形。

在照射到生物芯片24上的激励光中存在空间不均的情况下，异物发出的荧光的辉度中也产生空间不均。若将最大辉度的1/2一律设为阈值，则即使假定存在多个相同异物，也会由于激励光的空间不均而不能将部分异部识别为异物。

用图5A及图5B来详细说明该现象。图5A是表示异物存在的y方向位置中相对x方向象素位置的辉度信号S的图。如图所示，在激励光中存在空间不均的情况下，当存在多个(图中为A、B及C3个)同一特性的异物时，得不到相同的辉度信号。现在，将异物A作为最大的辉度信号，设为Smax，将异物B及异物C的辉度信号分别设为S1及S2，在Smax/2＜S1＜Smax、S2＜Smax/2的情况下，若将最大辉度的1/2一律设为阈值，则如图5B所示，仅异物A在2值化时的边界与主光线和最佳像面的交点一致，表示正确的区域，但对于异物B，则变得比正确区域小。并且，对于异物C，完全不识别。

下面，说明去除该缺点的方法。

第一方法是测量激励光的不均并由此来补正的方法。因此，摄入具有均匀反射率或发光率的平面板图像(参考图像)，作为例如图6所示辉度分布特性(实际上是二维辉度分布，但这里为了方便由一维来表示)。在图6中，纵轴设为参考辉度信号SR，设其最大值为最大辉度信号SRmax。接着，若设将向图5A所示那样得到的辉度信号S乘以SRmax/SR的值为辉度信号S’，则如图7A所示，3个异物的辉度信号S’相等。因此，代替使用辉度信号S，若将辉度信号S’的最大值S’max的1/2作为阈值，则如图7B所示，3个都一样，2值化时的边界与主光线和最佳像面的交点一致，表示正确的区域。以上说明了将异物以外的辉度作为0，但由于散光或感光元件的暗电流等有时会混入噪声，所以期望最好将阈值设为(S’min+S’max)/2。这里，S’min是辉度信号S’的最小值。

下面，说明同样去除该缺点的第二方法。该方法与上述第一方法不同，是不需要参考图像的方法。

即，现在用f(i，j)来表示辉度信号S，使用公式

公式

$S^{\′\′}=\frac{g(i,j)}{\underset{m={-m}_1}{\overset{m_2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{n={-n}_1}{\overset{n_2}{\mathrm{\Σ}}}{C}_{0,m,n}f(i+m,j+n)}$

来求出微分信号S”。这里，将(i，j)作为中心的i方向及j方向附近(不限于相邻象素)分别由[-m1，m2]及[-n1，n2]表示。另外，C₀，m，n是平均算符，通常为

$C_{0,m,n}=\frac{\left[\begin{array}{ccc}1& 1& 1\\ 1& 1& 1\\ 1& 1& 1\end{array}\right]}{9}$ 或 $\frac{\left[\begin{array}{ccc}1& 2& 1\\ 2& 4& 2\\ 1& 2& 1\end{array}\right]}{16}$

并且，g(i，j)表示微分图像，

$g(i,j)=\underset{m={-m}_1}{\overset{m_2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{n={-n}_1}{\overset{n_2}{\mathrm{\Σ}}}{C}_{1,m,n}f(i+m,j+n)$

或由

$g(i,j)=\left|\underset{m={-m}_1}{\overset{m_2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{n={-n}_1}{\overset{n_2}{\mathrm{\Σ}}}{C}_{1,m,n}f(i+m,j+n)\right|$

$+\left|\underset{m={-m}_1}{\overset{m_2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{n={-n}_1}{\overset{n_2}{\mathrm{\Σ}}}{C}_{2,m,n}f(i+m,j+n)\right|$

表示。这里，C₁，m，n及C₂，m，n是微分算符，例如作为一次微分算符，多使用

$C_{1,m,n}=\left[\begin{array}{ccc}-1& 0& 1\\ -1& 0& 1\\ -1& 0& 1\end{array}\right],$ $C_{2,m,n}=\left[\begin{array}{ccc}-1& -1& -1\\ 0& 0& 0\\ 1& 1& 1\end{array}\right]$

或

$C_{1,m,n}=\left[\begin{array}{ccc}-1& 0& 1\\ -2& 0& 2\\ -1& 0& 1\end{array}\right],$ $C_{2,m,n}=\left[\begin{array}{ccc}-1& -2& -1\\ 0& 0& 0\\ 1& 2& 1\end{array}\right]$

作为二次微分算符，多使用已知作为拉普拉斯算符的

$C_{1,m,n}=\left[\begin{array}{ccc}1& 2& 1\\ 0& 0& 0\\ -1& -2& -1\end{array}\right],$ $C_{1,m,n}=\left[\begin{array}{ccc}1& 2& 1\\ 0& 0& 0\\ -1& -2& -1\end{array}\right]$

如此求出的微分信号S”在使用一次微分算符的情况下，如图8所示，3个都变为相同的微分信号，异物的轮廓线在最大微分信号S”max下为一定幅度的线。连接该幅度中心的线为实际的异物轮廓线。另外，使用二次微分算符的情况如图9所示，3个都变为相同的微分信号，在微分信号S”的正负反转的点连接的线为异物轮廓线。

此前任何情况下为了方便而将辉度信号S的边界附近斜度说明为一定，但实际上该斜度不一定，因此，图8及图9的微分信号S”的图案不是矩形分布，而是接近正态分布的图案，所以期望使用利用阈值进行处理后的信号来确定异物区域，或使用微分信号S”的峰值点来确定异物区域。在前者的情况下，原理上未必要将阈值设为最大微分信号S”max的1/2。另外，在后者的情况下，求出微分信号S”的公式不必是上述公式，只要是公式

S”＝g(i，j)

就足以。即，如图10及图11所示。在图10中，将由对应于S”极大值的点形成的区域作为异物区域，在图11中，将由对应于S”极大值的点与对应于极小值的点的中央点形成的区域作为异物区域。

下面，说明前者情况下更适当的阈值设定方法。

即，此前说明同一种类的异物，但实际上存在多种异物。现在说明异物1和异物2混合存在情况下适当的阈值设定方法。图12是将横轴作为均等分割的微分信号S”的代表值、将纵轴作为对应于该微分信号S”的象素总数(后面称为频数)的频数分布图。如图所示，噪声集中出现在微分信号S”小的区中，异物1及异物2对应于其特性而发散地出现在固有区中。因此，可使用该频数分布图来设定阈值。即，若采用图示的阈值1，则可得到异物1及异物2的轮廓线，若采用图示的阈值2，则仅可得到异物2的轮廓线。并且，若采用阈值1及阈值2，则仅可得到异物1的轮廓线。

最后，通过图像处理部件22，将异物的轮廓线与其内部例如设为0或-1、将其它部件设为1后，作为异物区域图像103存储在图像存储器21中。

另外，对于微小点25的荧光图像101，将该异物区域图像103作为掩膜，由图像处理部件22取两个图像间的积，得到去除异物区域后的微小点25的荧光图像104。即，可得到可将0或-1值的区域识别为异物区域的荧光图像104。

另外，这里直接将通过2值化处理得到的区域采用为异物区域后，从微小点25的荧光图像101中去除，但也可对2值化得到的异物区域，作为从绕射像的中心到二次绕射峰值与三次绕射峰值之间波谷的距离(绕射的模糊量，下式(1)的右边第1项)、与考虑聚焦误差时的最大模糊量(式(1)的右边第2项)之和，由下式(1)来提供光学模糊量，使异物区域膨胀该量后，从微小点的荧光图像中去除。其中，β为光学系统的像倍率，λ为形成异物像的光的波长，α为物镜34在生物芯片侧的数值孔径，Δ为散焦量。

$\mathrm{\δ}=\mathrm{\β}\·(1.619\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{\α}}+\mathrm{\α}|\mathrm{\Δ}\left|\right)---\left(1\right)$

接着，检测形成于生物芯片24上的位置检测用微小点35，求出4个位置检测用微小点35的重心位置或位置检测用微小点35的2值化图像的图心位置，根据该坐标与生物芯片24的排列信息，如参照序号105所示，将所述微小点的荧光图像104分割成各微小点单位。

另外，按如下步骤来设定对各微小点25的测量区域。

即，对去除了异物区域的每个微小点的分割图像106、107，将分割图像内的最大辉度的1/2或最大辉度与最小辉度的平均值作为阈值，进行2值化处理，求出2值化区域的最大X坐标、最小X坐标、最大Y坐标及最小Y坐标，分别设为xmax、xmin、ymax、ymin。根据这些坐标，如图13A所示，由下式提供将提供确定测量区域及尺寸采样区域用的矩形区域的两个坐标，作为(x’min、y’min)及(x’max、y’max)。

x’_min＝x_min-δ    ...(2)

y’_min＝y_min-δ    ...(3)

x’_max＝x_max+δ    ...(4)

y’_max＝x_max+δ    ...(5)

这里，考虑矩形区域来作为测量区域，但也可对所述2值化区域采用保持区域形状不变、仅膨胀由上述式(1)确定的量的区域。

下面，根据象素数和光学系统的倍率来计算作为相当于所述2值化区域的物体的微小点的实面积，并将该面积设为D。这里，根据形成生物芯片24时设定的微小点的标准面积D0和测量的微小点的面积D来计算下式(6)。

σ＝D₀/D    ...(6)

此时，在象分割图像106所示那样异物未覆盖微小点25的情况下，有σ≈1，但在象分割图像107所示那样异物覆盖微小点的情况下，有σ＞＞1。使用σ，例如仅在σ＜10的情况下实施辉度测量，在与其不一致的情况下，作为异物或微小点本身的缺陷，判断关于该微小点的数据没有可靠性。

下面，对分割图像106进行以下处理。

即，如图13B所示，在从CCD元件18得到的图像信号中通常包含噪声。该噪声分量取决于装置构成和测量环境，但通常基于激励光在基板(生物芯片24)的反射光、激励光引起的基板自身发光的激励光噪声(激励光引起的噪声)是主要的，偶尔也不能忽视散光噪声(激励光以外的光源引起的噪声)。图13A及图13B为了简化说明而模块化表现，但实际上应检测的信号及噪声信号不平坦，因位置不同而有不均。尤其是因为所述激励光噪声反映照明不均，所以是噪声分量不均的最大原因。

因此，在本实施例中，将分割图像区域内且在测量区域外的区域作为噪声采样区域，从测量区域内象素的信号中减去通过由噪声采样区域的面积去除噪声采样区域内的信号总和求出的平均噪声信号。

接着，将减法得到的检测信号在测量区域内的总和设为微小点的信号强度P0。并且，用微小点的实面积补正微小点的信号强度P₀(标准化处理)，由下式(7)求出该P，作为微小点的辉度测量值P₀。这里，D₀是微小点的标准面积，D是根据先计算的各微小点的2值化图像求出的实面积。

P＝(D₀/D)P₀    ...(7)

通过该补正，即标准化处理，可去除微小点形成误差产生的噪声、或由于异物而隐藏微小点25一部分时的误差。

通过使用本实施例的CCD元件18等的电扫描来统一摄像生物芯片24的像，并存储在图像存储器中，但不限于此，不用说，也可象以前那样，进行机械扫描，分割生物芯片24的像后再摄像，并在图像存储器上得到生物芯片24的整体像。并且，也可通过将两者组合，使用不能由CCD元件18一次摄像整体的大的生物芯片。

另外，在本实施例中，除本发明的效果外，还有以下特有效果。

即，因为使用CCD元件18，所以可统一处理生物芯片24的像，可缩短测量时间。另外，因为也可将曝光时间取得长，所以在辉度测量灵敏度方面是有利的。另外，本实施例中各构成当然可进行各种变形、变更。例如，可将图像处理装置设为个人计算机，或在CCD元件18中使用由珀尔帖元件等冷却类型的冷却CCD。

另外，若使异物区域膨胀来去除微小点的荧光图像，则可吸收与光学系统的焦点一致有关的误差，可进一步降低微小点荧光图像中异物的噪声光影响。

另外，在本实施例中，即使在2值化区域因应检测的信号不均而不是图示的圆形的情况下，或1个分割图像中存在多个2值化区域的情况下，也可通过将由(x’min、y’min)及(x’max、y’max)确定的矩形区域设为测量区域，保证该测量区域内包含应检测的全部信号。

另外，因为在微小点附近设定噪声采样区域，并补正距微小点的信号强度，所以可提高应检测信号的检测精度。并且，因为如上所述考虑散焦来设定测量区域，所以可知不会发生散焦噪声。

实施例2

下面，用图14至图16来说明根据本发明实施例2的荧光辉度测量方法及装置。

这里，图14是表示根据本发明实施例2的荧光辉度测量装置的示意构成图，图15是参考芯片的示意图。另外，图16是表示本实施例的测量方法的流程图。

在本实施例中，如图14所示，为了调整入射到CCD元件18的光量，在成像透镜17与CCD元件18之间的光路上选择插入分别具有已知透过率的多个ND滤光器39。即，将多个ND滤光器安装在滤光器保持部件40上，根据来自ND滤光器控制部件38的命令，由ND滤光器切换部件41切换插入光路中的透过率不同的ND滤光器。

另外，在本实施例中，除图3所示生物芯片24外，还使用图15所示的参考芯片36。这里，参考芯片36将在与上述生物芯片24的微小点相同位置上具有已知荧光分子数的参照微小点37、和与生物芯片24一样在微小点群的4个角上与标识相同的荧光分子分别作为位置检测用微小点35，移动在平面玻璃等基板中用作荧光标识的荧光物质。

移动方法确定使用的荧光分子的重量和根据该分子量使用的荧光分子数，将该荧光分子数的荧光分子溶液作为既定量，通过喷墨方式，向基板上喷出一定量的溶液。另外，也可使用使溶液附在销(pin)上后使之与基板接触的方法。另外，每个参照微小点的荧光分子数可根据它们各量(溶液量及溶液中的荧光分子数)和溶液喷出量计算求出。另外，若使用固化试剂来作为荧光分子的保持方法，则可确实保持，但也可不必。

如图14所示，在未图示的2轴台上，在与上述生物芯片24相同的平面内设置参考芯片36，通过2轴台，可定位在光学系统的视野内。

其它构成与上述实施例1一样，所以省略说明。

下面，使用图16的流程图来说明使用这种构成的荧光辉度测量装置的测量方法。

首先，定位，使参考芯片36与物镜34的视野一致(步骤S1)。

即，通过未图示的2轴台来定位参考芯片36，使由参考芯片36上的4个定位用微小点35规定的测量范围包含于通过观察光学系统的像倍率和CCD元件18的感光面噪声确定的视野范围内。

接着，将荧光测量用滤光器组7定位在摄影位置上(步骤S2)。

即，通过滤光器组切换机构16将荧光测量用滤光器组7定位在摄影位置上，以摄影参考芯片36上的参照微小点37的荧光图像。

接着，边切换ND滤光器39边由CCD元件18摄影参考芯片36的荧光图像(步骤S3)。

即，边切换多个ND滤光器39边摄入激励照明参考芯片36后参照微小点37内的荧光分子发生的荧光图像。在本实施例中，使用CCD元件18来作为感光元件，但不特定为CCD元件，也可是其它面积传感器。因此，下述[CCD元件]可通用面积传感器。

接着，边切换ND滤光器39边由CCD元件18摄影参考芯片36的背景图像(步骤S4)。

即，在摄入参考图像36的荧光图像后，截断激励照明，摄入背景图像。该背景图像由检测强度中不用的暗电流及散光构成。

下面，从视野中取出参考芯片36，将生物芯片24定位在视野内(步骤S5)。

即，通过未图示的2轴台来定位生物芯片24，使生物芯片24上的4个定位用微小点35与参考芯片36的定位用微小点35的位置大致一致。

接着，边切换ND滤光器39，边由CCD元件18摄影生物芯片24的荧光图像(步骤S6)。

即，由CCD元件18摄入激励照明生物芯片24后各微小点内的荧光分子发生的荧光图像。此时，边切换多个ND滤光器39边摄入荧光图像。

接着，边切换ND滤光器39边由CCD元件18摄影生物芯片24的背景图像(步骤S7)。

即，在摄入生物芯片24的荧光图像后，马上遮断激励照明，摄入背景图像。该背景图像与参考芯片36的背景图像一样，由检测强度中不用的暗电流及散光构成。

接着，切换为异物图像摄影用滤光器组11(步骤S8)。

即，通过滤光器组切换机构16将异物图像摄影用滤光器组11定位在摄影位置上，以摄影生物芯片24上的异物的图像。

之后，摄影生物芯片上的异物的图像(步骤S9)。

即，由不激励标识荧光物质的波长的光照明生物芯片24上的异物，通过异物发生的荧光(自身荧光)或反射光，由CCD元件18摄入异物的图像。

之后，2值化异物图像(步骤S10)。

即，由特定阈值来2值化摄影的异物图像或其微分图像，并特定异物区域，将该图像设为2值化异物图像。

接着，从参考芯片36与生物芯片24的荧光图像中减去各背景图像，作为补正图像(步骤S11)。

即，通常，感光元件的输出中包含暗电流噪声或散光噪声等直流噪声。为了去除该直流噪声，对参考芯片36与生物芯片24而言，从各荧光图像中减去背景图像，将其称为补正图像，并作为之后处理的对象。对各ND滤光器分别进行上述步骤。

之后，检测各补正图像中对应于位置检测用微小点的图像的重心位置(步骤S12)。

即，参考芯片36与生物芯片24中形成的微小点25及参照微小点37如图3及图15所示，二维排列，共位于4角上的4个微小点被用作位置检测用微小点35。位置检测用微小点35用于得到位置信号，所以该要素内的物质只要是发光物质或反射物质即可，但最好使用与用作标识的荧光物质的荧光波长不同的荧光波长的荧光物质。原因在于从位置检测用微小点35发生的荧光不可能用作噪声。此时，用特有的激励波长照明位置检测用微小点35，进行位置检测。位置检测中使用将4个位置检测用微小点35各自的重心位置设为位置坐标的方法或由最大强度的1/2水平2值化补正图像后将4个图心设为位置座表的方法等。

之后，旋转移动各补正图像，作为各ND滤光器的旋转图像(步骤S13)。

即，通过补正位置坐标，使分别由对参考芯片36与生物芯片24得到的4个位置检测用微小点35的位置坐标形成的4边形以最小偏差变为矩形，然后以图像中心为旋转中心，旋转移动补正图像，使该矩形的各边平行于图像的坐标轴。将移动后的图像称为旋转图像。此时，将2值化异物图像也旋转移动与生物芯片24相同的量。

下面，对于生物芯片24的荧光图像，将2值化异物图像作为掩膜，无效与异物区域一致的荧光图像的辉度信息(步骤S14)。

即，通过图像处理部件22进行作为2值化异物图像得到的图像与生物芯片24的荧光图像的逻辑积，将与2值化异物区域一致的生物芯片24的荧光图像的象素辉频数据设为[0]。

之后，将各旋转图像分割成每个参照微小点37及微小点25的图像，分别作为各ND滤光器及各微小点的分割图像(步骤S15)。

即，根据关于参考芯片36及生物芯片24的各旋转图像的4个定位用微小点的位置坐标和参照微小点37及微小点25的排列条件确定分割条件，通过该分割条件，将所有旋转图像分割成每个参照微小点37或微小点25的图像，并作为分割图像。

之后，抽取对应于最佳ND滤光器39的各分割图像，作为各要素的测量用图像(步骤S16)。

即，从相对参考芯片36上同一位置参照微小点37的ND滤光器个数的参考分割图像中，提取一个最大信号强度在CCD元件18的动态范围的范围内、其中强度信号最大的参考分割图像，将其称为测量用参考图像。同样，从相对生物芯片24上同一位置微小点25的ND滤光器个数的分割图像中，提取一个最大信号强度在CCD元件18的动态范围的范围内、其中强度信号最大的分割图像，将其称为测量用采样图像。测量用参考图像及测量用采样图像分别按摄影时使用的ND滤光器39的透过率T_k从大到小依次求出用于补正辉度R_k(＝分割图像中的最大强度×摄影中使用的ND滤光器39的透过率)。这里，k是按透过率从大到小的顺序附加在ND滤光器睥序号(k＝1～n)。在Rk的变化率(＝(P_k+1/T_k+1)-(P_k/T_k)满足负的条件时，抽取对应于ND滤光器序号k的图像。

接着，2值化上述抽取的各测量用图像，作为各要素的2值化图像(步骤S17)。

即，对全部测量用参考图像及测量用采样图像，将各图像中的最大信号和最小信号的平均值2值化为阈值，并将它们作为各参考2值化图像及采样2值化图像。这里，对采样2值化图像计算2值化区域的面积D。

之后，通过各2值化图像设定测量区域及噪声采样区域(步骤S18)。

即，对所有参考2值化图像求出各自的最大X坐标xRmax、最小X坐标xRmin、最大Y坐标yRmax、最小Y坐标yRmin。同样，对全部采样2值化图像求出各自的最大X坐标xSmax、最小X坐标xSmin、最大Y坐标ySmax、最小Y坐标ySmin，由下式算出设定噪声采样区域用的坐标x’Rmax、x’Rmin、y’Rmax、y’Rmin、x’Smax、x’Smin、y’Smax、y’Smin。

x’_min＝x_min-δ    ...(8)

y’_min＝y_min-δ    ...(9)

x’_max＝x_max+δ    ...(10)

y’_max＝y_max+δ    ...(11)

其中，δ为提供光学系统的模糊量的量，由下式提供。

$\mathrm{\δ}=\mathrm{\β}\·(1.619\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{\α}}+\mathrm{\α}|\mathrm{\Δ}\left|\right)---\left(12\right)$

，另外，β为光学系统的像倍率，λ为形成微小点25及参照微小点37的像的光的波长，α为物镜34在生物芯片侧的数值孔径，Δ为散焦量。

这里，将算出的点(x’Rmin、y’Rmin)及点(x’Rmax、y’Rmax)确定的矩形内作为测量用参考图像的测量区域，将该矩形以外作为测量用参考图像的噪声采样区域。同样，将点(x’Smin、y’Smin)及点(x’Smax、y’Smax)确定的矩形内作为测量用采样图像的测量区域，将该矩形以外作为测量用采样图像的噪声采样区域。

之后，从测量用图像上的测量区域信号中减去平均噪声信号(步骤S19)。

即，根据测量用参考图像中设定的噪声采样区域的信号求出每单位面积的噪声，从测量用参考图像的测量区域信号中减去该信号，作为测量用参考图像的检测信号。同样，根据测量用采样图像中设定的噪声采样区域的信号求出每单位面积的噪声，从测量用采样图像的测量区域信号中减去该信号，作为测量用采样图像的检测信号。

之后，算出微小点25每标准面积的信号强度(步骤S20)。

即，计算对应于各参照微小点36的测量用参考图像的测量区域内的检测信号总和，设为P_R。并且，将对应于多个微小点25的检测信号总和P_R的最大值设为Prmax。另外，算出对应于各微小点25的测量用采样图像测量区域内的检测信号总和，设为P_D。之后，用下式(13)来计算微小点25的每标准面积的信号强度P_D。得到这些信号强度，作为去除因激励光不均、激励光噪声及微小点形成误差产生的强度误差的强度。

$P_D=\frac{D_0}{D}\·\frac{P_R}{P_{R\max }}{P}_{D0}---\left(13\right)$

根据以上实施例，因为每次测量生物芯片24的辉度时使用参考芯片36来补正激励光量，所以可消除激励光在空间、时间上的变动。

根据以上实施例说明了本发明，但本发明不限于上述实施例，不用说，在本发明的主旨的范围内可进行各种变形和应用。

这里，汇总本发明的主旨如下。

(1)一种荧光辉度测量方法，测量包含排列在具有大致平面的基板上的荧光物质微小点的辉度，其特征在于：包含

第1摄像步骤，照射可激励所述荧光物质的波长的光，取得包含荧光物质的微小点的图像，作为第1图像；

第2摄像步骤，通过照射不激励所述荧光物质的波长的光，取得附在所述基板上的异物的图像，作为第2图像；

抽取步骤，从该第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像；和

异物去除步骤，将该2值化图像作为掩膜，将所述第1图像中与异物区域重合的部分图像无效。

关于本发明的实施例对应实施例1及实施例2。

照射激励标识荧光物质的波长光，得到第1图像，由从照射不激励所述荧光物质的波长光所得到的附在所述被测量物上的异物图像中抽取的异物区域图像形成掩膜，取该掩膜与所述第1图像的逻辑积，由此从所述第1图像中去除异物区域，所以可去除来自附在生物芯片上的异物的噪声光。

可减少辉度测量的误差。

(2)根据(1)所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包含膨胀步骤，使所述2值化图像的异物区域膨胀一定量。

关于本发明的实施例对应实施例1及实施例2。

对二值化处理照射不激励所述荧光物质的波长光所得到的附在所述被测量物上的异物图像而得到的异物区域，以考虑了光学模糊量的距离，膨胀处理异物区域，形成掩膜，取该掩膜与照射激励标识荧光物质的波长的激励光得到的第一图像的逻辑积。

因为使异物区域膨胀，所以即使观察光学系统的焦点一致精度变差，测量误差也不会变大。

(3)根据(1)或(2)所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包含标准化步骤，使用微小点的基准面积来标准化测量到的微小点的辉度。

关于本发明的实施例对应实施例1。

乘上微小点内的象素辉度，通过微小点的基准面积来标准化辉度测量值。

即使微小点的面积各不相同，也可减小辉度测量值的误差。

(4)根据(1)至(3)之一所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包括可靠性判断步骤，在所述异物去除步骤后，求出各微小点的面积，通过该面积与微小点的基准面积之比率，判断测量值的可靠性。

关于本发明的实施例对应实施例1。

从微小点的基准面积与实际微小点的面积，计算实际面积对基准面积的比率，并与预定的阈值相比较。

可定量判断测量值的可靠性。

(5)根据(1)至(4)之一所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包含补正步骤，通过参考图像来补正所述第2图像。

关于本发明的实施例对应实施例1。

通过参考图像来测量激励光的不均，由此可补正第2图像。

即使激励光中存在空间不均，也可正确识别所有异物。

(6)根据(1)至(4)之一所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

所述抽取步骤使用从所述第2图像得到的微分图像得到所述2值化图像。

关于本发明的实施例对应实施例1。

使用从第2图像得到的微分图像，从该第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像。

不使用参考图像，即使激励光中存在空间不均，也可正确识别所有异物。

(7)根据(6)所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

所述抽取步骤通过对应于各象素的微分信号的频数分布来确定所述2值化图像的2值化水平。

关于本发明的实施例对应实施例1。

由对应于各象素的微分信号的频数分布来确定2值化用的阈值。

进行适当的阈值设定。

(8)根据(6)或(7)所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

用对应于所述微分信号的微小区域下的强度来标准化所述微分信号。

关于本发明的实施例对应实施例1。

由对应于微分信号的微小区域下的强度来标准化微分信号，据此来设定2值化用的阈值。

进行更适当的阈值设定，可正确识别多种异物。

(9)一种荧光辉度测量装置测量，向包含在具有大致平面的基板上排列的荧光物质的微小点照射激励光所得到的荧光像的辉度，其特征在于：具备

光源；

第1波长选择部件，选择激励光的波长；

成像部件，用于形成所述荧光物质的像；

第2波长选择部件，仅选择发生的荧光的波长；

光电变换部件，扫描荧光像，得到图像；

存储部件，存储该图像；

和图像处理部件，该部件进行如下处理：

控制所述第1波长选择部件，照射来自所述光源的光中可激励所述荧光物质的波长的光，同时，控制所述第2波长选择部件，由所述光电变换部件取得包含荧光物质的微小点的图像，作为第1图像，并存储在所述存储部件中；

控制所述第1波长选择部件，照射来自所述光源的光中不能激励所述荧光物质的波长的光，同时，控制所述第2波长选择部件，由所述光电变换部件取得附在所述基板上的异物的图像，作为第2图像，并存储在所述存储部件中；

从存储在所述存储部件中的所述第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像；和

将所述2值化图像作为掩膜，将存储在所述存储部件中的所述第1图像中与所述异物区域重合的部分的图像无效。

关于本发明的实施例对应实施例1。

照射激励标识荧光物质的波长光，得到第1图像，由从照射不激励所述荧光物质的波长光所得到的附在所述被测量物上的异物图像中抽取的异物区域图像形成掩膜，取该掩膜与所述第1图像的逻辑积，由此从所述第1图像中去除异物区域，所以可去除来自附在生物芯片上的异物的噪声光。

可减少辉度测量的误差。

产业上的可利用性

如上所述，本发明在DNA或蛋白质等生物体物质的化学、物理的特性分析技术领域中有效。

Claims (9)

1、一种荧光辉度测量方法，测量包含排列在具有大致平面的基板上的荧光物质的微小点的辉度，其特征在于：包含

第1摄像步骤，照射可激励所述荧光物质的波长的光，取得包含荧光物质的微小点的图像，作为第1图像；

第2摄像步骤，通过照射不激励所述荧光物质的波长的光，取得附在所述基板上的异物的图像，作为第2图像；

抽取步骤，从该第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像；和

异物去除步骤，将该2值化图像作为掩膜，将所述第1图像中与异物区域重合的部分的图像无效。

2、根据权利要求1所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包含膨胀步骤，使所述2值化图像的异物区域膨胀一定量。

3、根据权利要求1或2所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包含标准化步骤，使用微小点的基准面积来标准化测量到的微小点的辉度。

4、根据权利要求1-3之一所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包括可靠性判断步骤，在所述异物去除步骤后，求出各微小点的面积，通过该面积与微小点的基准面积之比率，判断测量值的可靠性。

5、根据权利要求1-4之一所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

还包含补正步骤，通过参考图像来补正所述第2图像。

6、根据权利要求1-4之一所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

所述抽取步骤使用从所述第2图像得到的微分图像，得到所述2值化图像。

7、根据权利要求6所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

所述抽取步骤通过对应于各象素的微分信号的频数分布，来确定所述2值化图像的2值化水平。

8、根据权利要求6或7所述的荧光辉度测量方法，其特征在于：

用对应于所述微分信号的微小区域下的强度来标准化所述微分信号。

9、一种荧光辉度测量装置，测量向包含在具有大致平面的基板上排列的荧光物质的微小点照射激励光所得到的荧光像的辉度，其特征在于：具备

光源；

第1波长选择部件，选择激励光的波长；

成像部件，用于形成所述荧光物质的像；

第2波长选择部件，仅选择发生的荧光的波长；

光电变换部件，扫描荧光像，得到图像；

存储部件，存储该图像；

和图像处理部件，该部件进行如下处理：

控制所述第1波长选择部件，照射来自所述光源的光中可激励所述荧光物质的波长的光，同时，控制所述第2波长选择部件，由所述光电变换部件取得包含荧光物质的微小点的图像，作为第1图像，并存储在所述存储部件中；

控制所述第1波长选择部件，照射来自所述光源的光中不能激励所述荧光物质的波长的光，同时，控制所述第2波长选择部件，由所述光电变换部件取得附在所述基板上的异物的图像，作为第2图像，并存储在所述存储部件中；

从存储在所述存储部件中的所述第2图像中抽取异物区域，得到2值化图像；和

将所述2值化图像作为掩膜，将存储在所述存储部件中的所述第1图像中与所述异物区域重合的部分的图像无效。

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