JP4195374B2 - 二次元生化学分析画像のフラット・フィールド補正 - Google Patents
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Description
1.発明の属する技術分野
本発明は、二次元電気泳動ゲルの読み取りで用いられるような二次元画像システムに関し、詳しくは、光学系で遭遇する、光学系の一部である光源や光分散に内在する非一様性を生ずる問題に関する。
二次元電気得移動ゲルでは、蛍光染料、化学発光ラベル、比色ラベル、ならびに光吸収などを用いて溶質ゾーンの位置を示す。溶質を構成する個々のタンパク質、核酸、その他の分子種の同定と定量は多くの場合に電子画像を生成することによって行われる。そのような画像を形成できるデバイスの一例は電荷結合素子、又はCCD、であり、これは画素の二次元配列を含み、それが入射する光をゾーンの配列に対応する電荷パケットの二次元電子アレーに変換する。光学系が一様でないと、画像が歪み。結果の正確さが損なわれる。このような非一様性を補正する方法は、米国特許Nos. 5.799,773(1998年9月1日交付)、5,891,314(1999年4月6日交付)、5,897,760(1999年4月27日交付)、5,951,838(1999年9月14日交付)(すべてがHeffelfinger, D.M., and C. Van Hornを発明者として列記し、Bio-Rad Laboratories, Inc. に譲渡されている)に開示されている。これらの特許で開示された方法は、走査光源を用いて一様な照明を実現したり、ミラーやビーム・スプリッターを用いて光源をサンプルしたり、ある範囲の開口と倍率の設定に対する補正データを生成したりいろいろな仕方でレンズと検出器装置の校正を含んでいる。
二次元電気得移動ゲルの下の光源と光分散の非一様性による画像の不規則性は、ゲルの画像を入射光に対して長さと幅の方向で一様に応答する基準プレートの画像と比較することによって補正できることが見出された。したがって、ゲルの溶質ゾーンが画像になる仕方に応じて、例えば、基準プレートは光を一様に吸収及び/又は透過する、又はプレートに一様に分布する蛍光物質を含み、入射光によって一様に励起される。基準プレートは、画像形成システムに、ゲルと独立に、すなわち、ゲルの代わりに載置され、基準プレートの画像はゲルの画像と同じ仕方で取り込まれる。次に、2つの画像が比較され、好ましくは画素毎に比較され、ゲル画像は基準プレートの画像の非一様性又は偏差を考慮に入れる適当な公式又はアルゴリズムによって補正される。基準プレートの画像はフラット・フィールド画像と呼ぶことができ、補正されたゲルの画像は同様にフラット・フィールド補正画像と呼ぶことができる。
本発明の実施の形態において、分析媒質が二次元電気泳動厚板ゲルである場合、分析結果は公知のいろいろな電気泳動法のいずれかによって分離された溶質ゾーンの列である。各ゾーンの位置は、そのゾーンを占める溶質が何であるかという指標を、場合によってはその溶質が最初に存在していたサンプルのアイデンティティーを示し、各ゾーンの強度はもとのサンプルにおけるその溶質の量又は濃度を示す。二次元の配列は、個々のゲルのレーンで同時に行われるいろいろなサンプルの一連の平行な直線の分離を表す。あるいはまた、二次元の配列は、二次元電気泳動から生じた列を表す、すなわち、第1段階の直線の分離に続いて第2段階の分離が最初の方向と直角方向に行われて、第1段階で形成されたゾーンがさらにサブゾーンに分離される。さらに別のやり方としては、2つの互いに直交する方向で交替する振動又は交流電界によって溶質混合物を分離するものがある。
Piff(XY) = Pi(XY)×(AνFlat/P(XY)Flat)
を用いて、ソフトウエアによって実行できる、ここで:
Piff(XY)は、位置XYにおける画素の補正された値
Pi(XY)は、位置XYにおける画素の補正される前の値
AνFlat は、基準プレートで得られた値の平均から得られた係数
P(XY)Flat は、基準プレートの位置XYにおける画素の値、である。
Claims (11)
- 二次元マイクロアレーにおける光学的に検出可能な生化学分析結果を検出する方法であって、以下のステップ、すなわち:
(a) 前記マイクロアレーを二次元光学画像化システムのプラテンに載せ、当該プラテン上のマイクロアレーに二次元光学画像化システムにおいて光源からの光を照射して前記マイクロアレーの二次元画像を生成するステップ;
(b) 前記マイクロアレーとは独立に前記プラテンの上に基準プレートを載せ、そしてそのプラテン上の基準プレートに、前記二次元光学画像化システムにおいて前記光源からの光で照射して前記基準プレートの二次元画像を生成するステップ、ここで前記基準プレートは、入射光に対して前記基準プレートの長さ及び幅の方向で一様に応答する;及び
(c) 前記マイクロアレーの前記画像を前記基準プレートの前記画像と比較して、前記基準プレートの前記画像に示された前記光源の非一様性に関して前記マイクロアレーの前記画像を補正するステップ;
を含み、ステップ(a)と(b)は任意の順序で行われ、(c)は(a)と(b)の両方が完了した後で行われることを特徴とする方法。 - 前記マイクロアレーが顕微鏡スライド上に載っていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記マイクロアレーがマイクロタイター・プレートに載っていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記基準プレートが光を一様に吸収するものであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基準プレートが入射光によって一様に励起されて蛍光を放出することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記入射光が紫外光源からのものであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記入射光が白色光源からのものであることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生化学分析は蛍光ラベルをもつ分析試薬によって結果が示される分析であり、前記基準プレートは蛍光染料を含む明澄透明なプレートであり、前記入射光が前記蛍光ラベル及び前記蛍光染料を励起させて蛍光を放出させる光源からのものであり、ステップ(a)と(b)が蛍光信号の画像を生成するステップを含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生化学分析は選ばれた波長で光を吸収する比色ラベルをもつ分析試薬によって結果が示される分析であり、前記基準プレートは前記選ばれた波長で光を一様に吸収し、ステップ(a)と(b)が吸収の画像を生成するステップを含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)がステップ(b)の前に行われることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)と(b)の前記二次元画像が画素の二次元アレーから成り、各前記アレーにおける画素の位置が直交座標XとYによって定められ、各前記画素は前記光学画像化システムによって検出可能な値を有し、ステップ(c)が前記マイクロアレーの画像の各画素を次の関係:
Piff(XY) = Pi(XY)×(AνFlat/P(XY)Flat)
ここで:
Piff(XY)は、前記マイクロアレーの画像の座標XとYにおける画素の補正された値
Pi(XY)は、前記マイクロアレーの画像の座標XとYにおける画素の補正される前の値
AνFlat は、基準プレートの前記画像の全ての画素の値の平均に等しい係数
P(XY)Flat は、基準プレートの前記画像の座標XとYにおける画素の値、
に従って補正するステップを含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
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