WO2018168137A1 - 生体物質解析方法、生体物質解析装置、生体物質解析用プログラム及び生体物質解析システム - Google Patents

生体物質解析方法、生体物質解析装置、生体物質解析用プログラム及び生体物質解析システム Download PDF

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淳志 梶原
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Definitions

  • the present invention relates to a biological material analysis method, a biological material analysis device, a biological material analysis program, and a biological material analysis system using a substrate on which molecules capable of binding to the biological material are immobilized.
  • cell analysis / sorting devices and chips for analyzing biopolymers such as DNA have been developed. Some of the cell analysis / sorting apparatuses capture cells on a device of the apparatus, obtain a two-dimensional image by irradiation, and sort the cells. Some of the biopolymer analysis chips capture biopolymers on the chip, obtain a two-dimensional image by irradiation, and analyze the biopolymers.
  • a cell adhesive light control material in which a cell adhesive material is bonded to a cell non-adhesive material via a photolabile group is formed on the substrate.
  • Examples include cell adhesion light control substrates (Patent Document 1).
  • Detection of cells bound to the device described in Patent Document 1 uses a two-dimensional CCD camera or a photomultiplier tube to finely squeeze the excitation light in two dimensions, or by a line sensor through a dispersive element. Done.
  • the biopolymer analysis chip for example, a solid-state imaging device and an image transmitted from one surface to the other surface, and the light reception of the solid-state imaging device so that the one surface faces the light-receiving surface of the solid-state imaging device
  • a chip including an optical transmission unit placed on a surface and a plurality of types of spots made of a known biopolymer and scattered along the other surface of the optical transmission unit Patent Document 2.
  • the detection of the biopolymer bound to the chip described in Patent Document 2 is performed by applying a fluorescently labeled sample on the other surface of the optical transmission unit and preliminarily exciting the light shielding film on the other surface of the optical transmission unit.
  • a fluorescence intensity distribution appears on the other surface of the optical transmission section, and this fluorescence intensity distribution becomes an optical image. Transmission is performed from the other surface to the one surface by the transmission unit, and the entire surface is imaged by the solid-state imaging device.
  • the fluorescently labeled sample referred to in Patent Document 2 is a cell
  • the fluorescently labeled cell 1 binds to the compartment 1 via an antibody or the like on the substrate 2.
  • the fluorescently labeled cell 1 emits fluorescence in all directions as indicated by the thick arrows.
  • the fluorescence-labeled cells 1 are detected by the solid-state imaging device (CMOS Dye) on the substrate, if the fluorescence from the fluorescence-labeled cells 1 reaches the compartments 2 and 3 (dotted line in FIG. 1), the solids in the compartments 2 and 3 Since fluorescence is also detected by the imaging device, erroneous detection is made that the fluorescently labeled cells 1 are bound not only to the section 1 but also to the sections 2 and 3.
  • the distance from the solid-state imaging device to the fluorescence-labeled cell is increased to the height of the fluorescence-labeled cell 1 ′ in FIG. 1, for example, the fluorescence of the fluorescence-labeled cell 1 ′ reaches farther. Therefore, the increase in the distance from the surface of the solid-state imaging device to the cell leads to the deterioration of S / N.
  • the color filter is thickened to ensure the spectral characteristics of the color filter on the solid-state imaging device.
  • FIG. 2 shows changes in the amount of fluorescence detection signal based on the distance from the surface of the solid-state imaging device to the cell. Assuming that the relative binding efficiency (signal amount) when the fluorescently labeled cell 1 is in contact with the color filter (4 ⁇ m) (distance 0 ⁇ m) is 100%, the distance increases (the position of the fluorescently labeled cell increases). 1 detection signal becomes weak. When the distance becomes 20 ⁇ m, the detection signal of the section 1 decreases to about 40%, and the section 2 increases by about 15%. As the distance further increases, the detection signal tends to decrease in the sections 1 and 2, and the detection signal tends to increase slightly in the section 3.
  • FIG. 3 shows changes in the amount of crosstalk based on the distance from the surface of the solid-state imaging device to the cells.
  • the relative binding efficiency (signal amount) of the section 1 is 100%
  • the signal amount increases in the section 2 and the section 3 as the distance between the fluorescently labeled cells from the surface of the solid-state imaging device increases. From this, it can be seen that when the distance increases, the possibility of erroneous detection in the sections 2 and 3 increases.
  • Such a crosstalk problem is likely to occur particularly when the substrate is irradiated in a lump.
  • a molecule capable of binding to a biological material is immobilized, a substrate on which the biological material is bound to the molecule is sectioned, and the substrate is irradiated with an irradiation pattern having different sections over time, and obtained by irradiation.
  • a biological material analysis method including a step of analyzing a biological material based on information is provided.
  • the irradiation pattern has a pattern in which one or a plurality of the sections are irradiated.
  • the irradiation pattern has a pattern that irradiates the plurality of sections, and the irradiated sections form a shape selected from the group consisting of a linear shape, a lattice shape, a rectangular shape, a square shape, and a frame shape. May be.
  • the method further includes a step of acquiring image data of the entire substrate and determining a partitioning pattern and / or determining an irradiation pattern based on biological material distribution data on the substrate obtained from the image data. But you can.
  • an analysis step for analyzing the presence / absence of the biological material in the section and / or whether the target biological material is present may be included.
  • a biological material releasing step of releasing the biological material from the substrate based on the information obtained by the analyzing step may be further included.
  • a biological material analyzing apparatus comprising: an irradiation control unit configured to partition the substrate and control irradiation to irradiation patterns having different sections with time.
  • the biological material analyzing apparatus may include an analysis unit that analyzes presence / absence of biological material in the section and / or whether the biological material is a target biological material based on information obtained by irradiation with the irradiation pattern.
  • a molecule capable of binding to the biological substance can use a stimulable degradable linker.
  • the said irradiation part can irradiate 2 or more types of light.
  • a living body that causes a computer to execute partitioning on a substrate on which a molecule capable of binding to a biological substance is immobilized and irradiating with an irradiation pattern having different sections over time.
  • partitioning on a substrate on which a molecule capable of binding to a biological substance is immobilized and irradiating with an irradiation pattern having different sections over time.
  • a substrate on which molecules capable of binding to biological materials are immobilized An irradiation unit for irradiating the substrate; An irradiation control unit that partitions the substrate and controls irradiation to an irradiation pattern having different sections over time
  • a biological material analyzing apparatus including an analysis unit that analyzes presence / absence of biological material in the section and / or whether the target biological material is based on information obtained by irradiation with the irradiation pattern
  • a biological material analysis system comprising: a biological material analysis program for causing a computer to execute irradiation with the irradiation pattern; and a display device for displaying a result obtained by the analysis unit.
  • the present technology it is possible to arrange the biological material at a high density while avoiding the deterioration of the signal quality due to the crosstalk when the substrate on which the biological material is arranged is irradiated, and as a result, the reliability of the signal As a result, throughput can be improved.
  • the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.
  • the biological substance includes any chemical substance existing in the living body.
  • the chemical substance include proteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, hormones, pigments and the like.
  • cells and tissues having the chemical substance are also included in the biological material.
  • the cell may be a single cell or a cell mass.
  • the description will be given mainly assuming that cells having cell surface proteins are captured on a substrate, but the present technology is not limited to this.
  • Substrate used in the present technology has immobilized thereon molecules capable of binding to biological materials such as cell surface proteins and nucleic acids. Therefore, if cells having cell surface proteins or the like are applied on the substrate, the cells can be captured on the substrate.
  • the substrate for example, a material such as plastic, glass, or silicon can be used.
  • a material such as plastic, glass, or silicon
  • the substrate on which the cells are captured is irradiated from above or below and light is allowed to pass through the substrate, it is preferably a transparent material, and preferably plastic and glass.
  • a solid-state imaging device CCD, CMOS
  • CCD solid-state imaging device
  • a molecule that can bind to a biological substance can be selected according to the biological substance.
  • the biological substance is a cell surface protein or sugar chain
  • an antibody, complement, aptamer, or molecular recognition polymer specific to the cell surface protein or sugar chain can be selected.
  • the biological substance is a cell membrane lipid
  • a compound having an oleyl group that binds to the cell membrane lipid can be selected.
  • complementary DNA or RNA or nucleic acid aptamer can be selected as a molecule that can bind to the biological material. If the biological material is an antigen, an antibody or complement can be selected as a molecule that can bind to the biological material.
  • antibodies and complements for example, antibodies or complements to CD antigens that appear on the cell surface upon differentiation, antibodies or complements to various cancer-specific antigens, antibodies or complements to major histocompatibility antigens, antibodies to sugar chains or complements Etc.
  • Aptamers are nucleic acid molecules and peptides that specifically bind to molecules of cells that you want to capture.
  • a DNA aptamer, an RNA aptamer, a peptide aptamer, a modified aptamer whose specificity has been improved by introducing a modification into a nucleic acid skeleton or base, and the like can be mentioned.
  • the molecular recognition polymer captures the target cell surface molecule with high selectivity even in the presence of a compound having physicochemical properties similar to the cell surface molecule of the cell to be captured. Also called molecular imprinted polymer, it has a selectively synthesized compound recognition region.
  • a molecule capable of binding to a biological material may be immobilized on the substrate by first immobilizing a stimulable degradable linker on the substrate and further binding a molecule capable of binding to the biological material to the stimulable degradable linker.
  • a polymer such as PEG or MPC may be first immobilized on a substrate, and then a stimulable degradable linker may be bound to the polymer, and further a molecule capable of binding to a biological substance may be bound to the stimulable degradable linker.
  • the stimulating degradable linker When a stimulating degradable linker is used, after the cells are captured on the substrate, the stimulating degradable linker is cleaved by applying a stimulus to the stimulating degradable linker at the position of the substrate where the desired cells are captured. Can be recovered from the substrate.
  • the stimuli-degradable linker is a connecting molecule that is decomposed by a specific external stimulus.
  • a linker that is decomposed by light of a specific wavelength there are a linker that is decomposed by an enzyme, a linker that is decomposed by temperature, and the like.
  • the stimulable degradable linker is not particularly limited, but when a single cell is captured on a substrate, it is preferable to use a photodegradable linker because it can be controlled for each single cell and the degradation time is short.
  • a photodegradable linker is a molecule having a structure that is degraded by a specific wavelength.
  • methoxynitrobenzyl group nitrobenzyl group
  • nitrobenzyl group Japanese Patent Laid-Open No. 2010-260831
  • parahydroxyphenacyl group Tetrahedron Letters, 1962, Volume 1, Page 1
  • 7 -Nitroindoline group Journal of American Chemical Society, 1976, 98, 843
  • 2- (2-nitrophenyl) ethyl group tetrahedron, 1997, 53, 4247
  • coumarin- 4-yl coumarin- 4-yl
  • the specific wavelength for degrading the photodegradable linker is approximately the same as the absorption wavelength of the photodegradable molecule.
  • the absorption at 346 nm is 1, it shows 0.89 at 364 nm, 0.15 at 406 nm, and 0.007 at 487 nm. That is, if a 365 nm light source is used, the photodegradable linker has a good decomposition efficiency, and the 488 nm light source has a property that it is hardly decomposed.
  • the wavelength of the light irradiated to the photodegradable linker may be a wavelength corresponding to each photodegradable linker. For example, the wavelength is around 330 to 450 nm.
  • the specific wavelength for decomposing the photodegradable linker is preferably a wavelength that does not damage the biological material.
  • irradiation is preferably performed at 30 mW / cm ⁇ 2,100 sec. ⁇ 3 J / cm ⁇ 2.
  • a wavelength of 300 nm or less is preferably not used because it may damage cells.
  • the biological material can be labeled after it has been captured on the substrate.
  • a labeled antibody, complement, aptamer, molecular recognition polymer, oleyl group or the like specific to the biological material may be bound to the biological material on the substrate.
  • a biological substance labeled in advance may be captured on the substrate.
  • a fluorescent compound, an enzyme, biotin, a metal, or the like can be used as the label. Fluorescent compounds can be detected with emitted light of a specific wavelength. Enzymes can be detected by developing color with an enzyme substrate. Biotin can be detected by developing an avidin complex bound to a fluorescent dye or the like. Metals can be detected by irradiation at a specific wavelength.
  • the label may be a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a radioisotope, or the like. In the case of these labels, emitted light of a specific wavelength may be detected.
  • Irradiation to substrate and detection of biological material Irradiation to the biological material captured on the substrate is performed with an irradiation pattern in which the substrate is sectioned and has different sections over time. That is, different sections are irradiated at different timings, and the timing and sections are variously patterned.
  • the shape of partitioning may be a grid shape or a honeycomb shape, but is not limited thereto.
  • the size and number of partitioning can be optimally selected. These optimum selections can be determined on the basis of data on the distribution of biological material on the substrate obtained from image data of the entire substrate in a biological material described later method described later. A specific example of the irradiation pattern will be described later. Irradiation may be performed from above the substrate or from below the substrate.
  • Irradiation mechanism For example, when a fluorescent compound is used as a label, excitation light corresponding to the fluorescent compound is irradiated.
  • a transmission liquid crystal device For example, a transmission liquid crystal device, a reflection liquid crystal device, DMD (Digital Micromirror Device), MEMS ( Micro Electro Mechanical Systems) An irradiation apparatus using a shutter or the like can be used.
  • liquid crystal device for example, a Silicon X-tal Reflective Display that drives millions of pixels or more on a silicon substrate can be used.
  • a 0.74-inch (18.8mm diagonal) liquid crystal device has already been developed.
  • a known DMD can be used. For example, if it is possible to control 1920 ⁇ 1080 sites at the same time (irradiation ON / OFF) by DMD, individual control of about 2 ⁇ 10 6 cells becomes possible at the same time.
  • the MEMS shutter does not have a color filter or a polarizing film that transmits light from a backlight like a liquid crystal device, and has a shutter that directly transmits backlight (red light, green light, and blue light).
  • a well-known MEMS shutter can be used.
  • a MEMS shutter having a laminated structure (in order from the bottom, light source, light guide plate, polarizing plate, array substrate, transparent electrode (subpixel electrode), alignment film, liquid crystal layer, alignment film, transparent electrode (common electrode), color filter substrate , Polarizing plate).
  • irradiation can be controlled for each section.
  • the irradiation mechanism is not particularly limited as long as it is a mechanism capable of controlling the area and time of a two-dimensional irradiation pattern described later.
  • the irradiation mechanism may control the irradiation after confirming the section in which the biological material is captured and determining whether the section is irradiated. For example, if the biological material is captured on the substrate using the image pickup device on the substrate as described above, the image indicates that the biological material is captured in each section, and whether to irradiate each section is determined. The original data is obtained.
  • FIG. 4 shows an irradiation pattern considered to be strongly influenced by crosstalk.
  • the upper left figure of FIG. 4 is an irradiation pattern that does not consider crosstalk.
  • molecules that can bind to the biological material are immobilized on the substrate at a high density as shown in the upper right of FIG. 4 to capture the biological material.
  • the density of the substrate is increased, the influence of crosstalk due to the signal of the fluorescent label from the section in contact with the periphery of the central section becomes stronger (lower left in FIG. 4).
  • the central section is irradiated and vertically and horizontally in the central section.
  • An irradiation pattern may be employed in which the irradiation mechanism is controlled so as not to irradiate the adjacent section (black section in the figure, shutter is closed).
  • a lattice pattern shown in FIG. 6 is obtained.
  • the present technology is not limited to these irradiation patterns.
  • the irradiation pattern include a pattern that forms a shape selected from the group consisting of a linear shape, a lattice shape, a rectangular shape, a square shape, and a frame shape.
  • FIG. 7 shows an irradiation pattern when a cell having a cell surface protein, which is a biological material, is larger than one section of a substrate.
  • the left diagram in FIG. 7 shows an irradiation pattern (square (small) pattern) in which a fluorescently labeled cell 1 larger than one section of the substrate 2 is captured and a part of the section where the fluorescently labeled cell 1 overlaps is irradiated. It is.
  • the middle diagram of FIG. 7 is an irradiation pattern (square (large) pattern) for irradiation so that the fluorescently labeled cells 1 overlap each other.
  • the figure on the right side of FIG. 7 is an irradiation pattern (frame pattern) for irradiation so as not to include a section where fluorescently labeled cells 1 overlap.
  • More accurate signals with reduced crosstalk can be obtained by irradiating with the left, center, and right irradiation patterns in FIG. 7 while shifting the time.
  • the order of these irradiation patterns is not particularly limited.
  • FIG. 8 shows an irradiation pattern of a substrate on which a large number of molecules capable of binding to cellular material are immobilized.
  • the right side of FIG. 8 shows the irradiation pattern (lattice pattern) of the entire substrate.
  • the left side of FIG. 8 shows an enlarged view of the irradiation pattern.
  • irradiation can be performed with various patterns such as the following linear pattern.
  • FIG. 9 shows an example of a linear pattern. As shown from the left to the right in FIG. 9, linear irradiation can be performed by shifting the time from the section where the fluorescently labeled cells 1 do not overlap to the section where they overlap.
  • Detection unit The detection of the biological material captured on the substrate can be performed by a detection unit that receives a signal from the label of the biological material.
  • the detection unit include a fluorescence measuring device, a scattered light measuring device, a transmitted light measuring device, a reflected light measuring device, a diffracted light measuring device, an ultraviolet spectroscopic measuring device, an infrared spectroscopic measuring device, a Raman spectroscopic measuring device, and a FRET measuring device.
  • FISH measuring devices and other various spectrum measuring devices and so-called multi-channel photodetectors in which a plurality of photodetectors are arranged in an array.
  • a solid-state imaging device CCD, CMOS
  • the detection part of this technique is not limited to these.
  • the biological material analysis method using the irradiation method of this technology is: A molecule capable of binding to a biological material is immobilized, a substrate on which the biological material is bound to the molecule is sectioned, and the substrate is irradiated with an irradiation pattern having different sections over time, and obtained by irradiation. A step of analyzing the biological material based on the information is included.
  • the substrate after contacting a sample that may contain biological material to bind to the substrate, the substrate may be compartmentalized, for example, Based on the information obtained by the irradiation with the first irradiation pattern and the second irradiation pattern after the irradiation with the first irradiation pattern and the irradiation with the second irradiation pattern, the biological material A step of analyzing.
  • the biological material analysis method of the present technology can be performed, for example, in the steps shown in FIG. First, a sample containing a biological material is applied to a substrate (S101), and a molecule that can bind to the biological material on the substrate is brought into contact with the sample. After the biological material in the sample is captured on the substrate, unnecessary samples are removed by washing or the like.
  • Image data may be scanned one-dimensionally or two-dimensionally as a surface, but can be selected as a surface from the viewpoint of time reduction.
  • a step of determining a partitioning pattern from the knowledge of the distribution of the biological material on the substrate may be included. This is a process of determining the shape, size, number, etc. of the compartmentalization.
  • An irradiation pattern can also be selected from the image data (S103).
  • the optimal partitioning pattern and irradiation pattern may be selected from the partitioning pattern and irradiation pattern stored in the storage medium in advance, or the optimal partitioning pattern and irradiation pattern calculated by the calculation program from the distribution density
  • An irradiation pattern can also be selected.
  • a known image processing program may be used.
  • the distribution density may be divided according to the level of distribution density, where the distribution density is high and the area is finely divided, and the low density is large. Further, it may be possible to perform image data processing several times and allow a computer to learn and to select an optimal segmentation pattern and irradiation pattern.
  • the irradiation pattern can be determined by appropriately combining one pattern or two or more patterns.
  • the substrate is irradiated with the determined irradiation pattern (S104).
  • the detection unit receives and detects signal data from the label of the biological material generated by the irradiation (S105). When two or more patterns are adopted, a time difference is provided to irradiate the substrate with each pattern. Referring to FIG. 10, the substrate is irradiated with the second irradiation pattern (S106), and the signal data from the label of the biological material generated by the irradiation is received and detected by the detection unit (S107).
  • the biological material analysis method of the present technology may include an analysis step of analyzing the presence / absence of biological material in each section based on information obtained by the detection unit (S108). In addition, when there is a biological material in each section, an analysis step of analyzing whether or not the target biological material is desired to be acquired may be included (S108).
  • the biological material analysis method of the present technology may include a biological material releasing step of releasing the biological material from the substrate based on the information obtained by the analyzing step (S109).
  • a stimulus may be given to a stimulus-degradable linker interposed between a molecule that can bind to the biological material and the substrate.
  • the biological material to be released may be a target or non-target biological material.
  • the irradiation pattern can also be used in the biological material releasing step (S109). If the irradiation pattern is used for irradiation, the accuracy of liberation of the biological material can be improved as in the crosstalk reduction effect during the fluorescence measurement. For example, a target biological material that is desired to remain without being released may be surrounded by a non-target biological material that is desired to be released. In such a case, by irradiating the substrate with light having a wavelength specific to the photodegradable linker in the same irradiation pattern as in the fluorescence measurement, the amount of light irradiated to the target biological material is reduced. And the accuracy of free fractionation of target or non-target biological material is improved.
  • the released biological material is the target biological material, it is recovered and used for further processes such as analysis, growth, amplification, and the like.
  • the released biological material is a non-target biological material, it is discarded as it is, and the target biological material remaining on the substrate is used for further processes on the substrate.
  • An apparatus for realizing the biological material analysis method of the present technology is as follows.
  • An irradiation control unit configured to partition the substrate and control irradiation to irradiation patterns having different sections with time;
  • FIG. 11 shows an example of a biological material analyzing apparatus.
  • the substrate 2 has a plurality of compartments, and each compartment has a polymer substance 3 (collagen, PEG, MPC, etc.), a stimulus-degradable linker 4 (photodegradable linker, etc.), and a molecule 5 (antibody that can bind to a biological substance) Complementary DNA, aptamer, etc.) are immobilized.
  • the cell 11 is applied to the substrate 2, and the biological material 10 (cell surface protein, nucleic acid, etc.) on the cell 11 is bound to the molecule 5 that can bind to the biological material, and the cell 11 is captured.
  • the captured cells 11 are labeled with a label 12 (fluorescent material or the like).
  • the detection unit 8 includes a solid-state imaging device, and the irradiation pattern is determined based on the image data.
  • the irradiation pattern can be implemented by the irradiation unit 6 and the irradiation control unit 7.
  • the irradiation unit 6 irradiates light having a wavelength corresponding to the label 12.
  • the irradiation unit 6 may be configured to emit a plurality of lights having different wavelengths. Examples of the irradiation light include light having a wavelength suitable for seeing whether or not a biological substance is bound to each compartment, light having a wavelength that excites the label 12, light that cleaves the photodegradable linker, and the like. .
  • the irradiation control unit 7 controls the light from the irradiation unit 6 according to the determined irradiation pattern.
  • An irradiation pattern is executed by a shutter mechanism, a digital mirror device, or the like included in the irradiation control unit 7.
  • the detection unit 8 receives and detects signal data and the like obtained by irradiation with the irradiation pattern. Based on the information of the obtained signal data, the analysis unit 9 analyzes the presence / absence of a biological material or cell in the section and / or whether the target biological material or cell is present.
  • Biomaterial analysis program allows a computer to partition a substrate on which a molecule capable of binding to the biological material is immobilized and irradiate with an irradiation pattern having different partitions over time. Let it run. Specifically, it is programmed to execute the aforementioned irradiation pattern.
  • the biological material analysis program may be stored in a recording medium such as a magnetic disk, an optical disk, a magneto-optical disk, or a flash memory, and may be distributed via a network.
  • the biological material analysis program may be executed by attaching a computer to the biological material analysis device, or may be incorporated in the biological material analysis device and executed.
  • the biological material analysis system of this technology A substrate on which molecules capable of binding to a biological substance are immobilized, an irradiation unit that irradiates the substrate, an irradiation control unit that partitions the substrate and controls irradiation into irradiation patterns having different sections over time, A biological material analyzing apparatus including an analysis unit that analyzes presence / absence of biological material in the section and / or whether the target biological material is based on information obtained by irradiation with the irradiation pattern, A biological material analysis program that causes a computer to execute irradiation with the irradiation pattern, and a display device that displays a result obtained by the analysis unit.
  • FIG. 12 shows an example of a biological material analysis system.
  • the biological material analysis system 1001 includes a biological material analysis device 101, a computer 301, and a display device 401.
  • the biological material analysis apparatus 101 includes an irradiation unit 6, an irradiation control unit 7, a molecule 5 that can bind to a biological material, a substrate 2, a detection unit 8, and an analysis unit 9.
  • the computer 301 includes a biological material analysis program 201.
  • the biological material analysis program 201 communicates with the irradiation unit 6 and the irradiation control unit 7.
  • the display device 401 is connected to the analysis unit 9 of the biological material analysis device 101.
  • Examples of the display unit 401 include a monitor and a printing apparatus. Based on analysis data displayed by a monitor or printing, an operation of applying a sample to the substrate 2 is performed by a mouse operation or a keyboard operation on the computer 301, or the irradiation unit 6, the irradiation control unit 7, and the detection unit 8 are performed.
  • the analysis unit 9, the biological material analysis program 201, and the like can be arbitrarily or automatically controlled.
  • this technique can also take the following structures.
  • the irradiation pattern has a pattern in which one or a plurality of the sections are irradiated.
  • the irradiation pattern is a pattern in which the plurality of sections are irradiated and the irradiated sections form a shape selected from the group consisting of a linear shape, a lattice shape, a rectangular shape, a square shape, and a frame shape.
  • the biological material analysis method according to [2].
  • the biological material analysis method according to any one of [1] to [3].
  • a biological material analyzing apparatus comprising: an irradiation control unit configured to partition the substrate and control irradiation to irradiation patterns having different sections over time.
  • the biological material analysis apparatus includes an analysis unit that analyzes presence / absence of biological material in the section and / or whether the biological material is a target biological material based on information obtained by irradiation with the irradiation pattern.
  • the biological material analyzing apparatus according to [7] or [8], wherein the molecule capable of binding to the biological material is a stimulable degradable linker.
  • the biological material analyzer according to any one of [7] to [9], wherein the irradiation unit can irradiate two or more types of light.
  • a biological material analysis program that causes a computer to execute the irradiation of a substrate on which a molecule capable of binding to a biological material is immobilized with an irradiation pattern having different partitions over time.
  • a biological material analyzing apparatus including an analysis unit that analyzes presence / absence of biological material in the section and / or whether the target biological material is based on information obtained by irradiation with the irradiation pattern,
  • a biological material analysis system comprising: a biological material analysis program that causes a computer to execute irradiation with the irradiation pattern; and a display device that displays a result obtained by the analysis unit.

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Abstract

本技術では、生体物質を基板上に捕捉し、生体物質を基板への照射により検出するときに、検出データの信頼性を確保しながら検出のスループットを向上させる照射方法、生体物質解析方法及び生体物質解析装置を提供する。　これに対し、本技術では、生体物質と結合し得る分子が固定化され、該分子に生体物質が結合した基板を区画化し、該基板に対して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射する工程、及び照射により得られた情報に基づいて、生体物質を解析する工程を含む生体物質解析方法などを提供する。

Description

生体物質解析方法、生体物質解析装置、生体物質解析用プログラム及び生体物質解析システム
　本発明は、生体物質と結合し得る分子が固定化された基板を用いた生体物質解析方法、生体物質解析装置、生体物質解析用プログラム及び生体物質解析システムに関する。
　近年、細胞の解析分別装置や、DNA等の生体高分子を分析するチップ等が開発されている。
　前記細胞解析分別装置では、該装置のデバイス上に細胞を捕捉し、照射により2次元の画像を得て、細胞を分別するものがある。
　前記生体高分子分析チップでは、該チップ上に生体高分子を捕捉し、照射により2次元の画像を得て、生体高分子の分析を行うものがある。
　前記細胞解析分別装置に用いるデバイスの基材として、例えば、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材が挙げられる（特許文献１）。
　特許文献１に記載のデバイスに結合した細胞の検出は、2次元CCDカメラ又は光電子増倍管を用い、励起光を細く絞って２次元に走査することや、分散素子を通したラインセンサにより、行われる。
　前記生体高分子分析チップとして、例えば、固体撮像デバイスと、一方の面から他方の面に像を伝送し、前記一方の面を前記固体撮像デバイスの受光面に対向するよう前記固体撮像デバイスの受光面上に載置された光学伝送部と、既知の生体高分子からなり、前記光学伝送部の他方の面に沿って点在した複数種のスポットと、を備えるチップが挙げられる（特許文献２）。
　特許文献２に記載のチップに結合した生体高分子の検出は、蛍光標識されたサンプルを光学伝送部の他方の面上に塗布し、予め光学伝送部の該他方の面上の励起光遮蔽膜に固定化した特異的スポットにサンプルを結合させ、該他方の面に向かって励起光を照射すれば、光学伝送部の他方の面には蛍光強度分布が現れ、この蛍光強度分布が像として光学伝送部によって他方の面から一方の面に伝送され、固体撮像デバイスで面一括を撮像することにより、行われる。
国際公開第２０１１／０５８７２１号パンフレット 特開２００６－７１４１７号明細書
　しかしながら、特許文献１に記載のようにデバイスを走査した場合、デバイスの面全体を一端から他端まで位置をずらしながら照射を行って画像データを得るため、面内の位置によって観察時間にタイムラグが生ずる問題がある。また、走査に時間がかかり、一度にハイスループットでデータを得ることができない。
　また、特許文献２に記載のように面一括を撮像した場合、面を照射するので前記特許文献１のような問題は生じないが、蛍光標識サンプル同士の距離が近い場合に蛍光が重なり、光学伝送部からの信号が影響しあうクロストークが生じる。クロストークにより信号品質の劣化や誤検出のおそれがあるため、蛍光標識サンプルを高密度に結合させることに限界が生じる。
　クロストークの問題は、例えば図１のように示すことができる。
　前記特許文献２でいう蛍光標識サンプルが細胞であるとすると、蛍光標識細胞１は基板２上の抗体等を介して区画１に結合する。蛍光標識細胞１は、太線矢印に示すように四方八方に蛍光を発する。
　蛍光標識細胞１が基板の固体撮像デバイス（CMOS Dye）により検出されるとき、蛍光標識細胞１からの蛍光が区画２や区画３まで届くと（図１の点線）、区画２や区画３の固体撮像デバイスでも蛍光が検出されるので、区画１のみならず区画２や区画３にも蛍光標識細胞１が結合している、という誤った検出がなされる。
　また、固体撮像デバイスから蛍光標識細胞までの距離が拡大して例えば図１の蛍光標識細胞１’の高さになると、蛍光標識細胞１’の蛍光がより遠くまで届いてしまう。よって、固体撮像デバイス表面から細胞までの距離の拡大はS/Nの悪化につながる。
　ここで、固体撮像デバイスから蛍光標識細胞までの距離が拡大する要因としては、固体撮像デバイス上のカラーフィルタの分光特性確保のためにカラーフィルタを厚くすること等が考えられる。
　図２に、固体撮像デバイス表面から細胞までの距離に基づく蛍光の検出信号量の変化を示す。カラーフィルタ（4μｍ）に蛍光標識細胞１が接している（距離0μｍ）ときの相対結合効率（信号量）を100％とすると、距離が拡大するほど（蛍光標識細胞の位置が高くなるほど）、区画１の検出信号が弱くなる。距離が20μｍになると、区画１の検出信号は約40％に低下し、区画２で約15％上昇する。更に距離が拡大すると、区画１及び区画２で検出信号が低下し、区画３でわずかに検出信号が上昇する傾向が見られる。
　図３に、固体撮像デバイス表面から細胞までの距離に基づくクロストーク量の変化を示す。
　区画１の相対結合効率（信号量）を100％とすると、固体撮像デバイス表面から蛍光標識細胞の距離が拡大するほど、区画２及び区画３で信号量が増加する。このことから、距離が拡大すると区画２及び区画３で誤った検出がなされる可能性が高まることがわかる。
　このようなクロストークの問題は、特に、基板に対する照射を面一括で行うときに生じやすい。
　前記課題解決のため、本技術は、
　生体物質と結合し得る分子が固定化され、該分子に生体物質が結合した基板を区画化し、該基板に対して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射する工程、及び
　照射により得られた情報に基づいて、生体物質を解析する工程を含む
生体物質解析方法を提供する。
　前記照射パターンは、前記区画を１つ又は複数照射するパターンを有する。
　また、前記照射パターンは、前記複数の区画を照射して、該照射された区画が直線状、格子状、長方形状、正方形状及び枠状からなる群から選択される形を形成するパターンを有してもよい。
　更に、前記基板の全体の画像データを取得し、該画像データから得られる基板上の生体物質の分布データに基づき、区画化のパターンを決定する工程及び／又は照射パターンを決定する工程を更に含んでもよい。
　更に、前記照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析工程を含んでもよい。
　また更に、前記解析工程により得られた情報に基づいて、基板から生体物質を遊離する生体物質遊離工程を更に含んでもよい。
　更に、本技術は、
　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
　前記基板を照射する照射部と、
　前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と
を備える生体物質解析装置を提供する。
　前記生体物質解析装置は、前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部を備えることができる。
　前記生体物質と結合し得る分子は、刺激分解性リンカーを用いることができる。
　また、前記照射部は、２以上の種類の光を照射することができる。
　また更に、本技術は、生体物質と結合し得る分子が固定化された基板に対して、前記基板を区画化して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる、生体物質解析用プログラムを提供する。
　更に、本技術は、
　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
前記基板を照射する照射部と、
前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と、
前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部と
を含む生体物質解析装置、
　前記照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる、生体物質解析用プログラム、及び
　前記解析部により得られた結果を表示する表示装置
を備える、生体物質解析システムを提供する。
　本技術によれば、生体物質が配置された基板に照射したときのクロストークに起因する信号品質の劣化を回避しつつ、生体物質を高密度に配置することができ、結果として信号の信頼性を確保しながらスループットを向上させることができる。
　なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
クロストークを説明する概念図である。 固体撮像デバイス表面から細胞までの距離に基づく蛍光の検出信号量の変化を示すグラフである。 固体撮像デバイス表面から細胞までの距離に基づくクロストーク量の変化を示すグラフである。 クロストークの影響を受ける照射パターンを示す図である。 本技術の照射パターンを示す図である。 本技術の照射パターンを示す図である。 本技術の照射パターンを示す図である。 本技術の照射パターンを示す図である。 本技術の照射パターンを示す図である。 本技術の生体物質解析方法を示す図である。 本技術の生体物質解析装置を示す図である。 本技術の生体物質解析システムを示す図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１． 基板上での生体物質の捕捉と標識
　１－１．基板
　１－２．生体物質の標識
２．基板への照射と生体物質の検出
　２－１．照射機構
　２－２．照射パターン
　２－３．検出部
３．生体物質解析方法
４．生体物質解析装置
５．生体物質解析用プログラム
６．生体物質解析システム
　なお、本技術において、生体物質は、生体に存在するあらゆる化学物質を含む。該化学物質として、タンパク質、核酸、糖質、脂質、ビタミン、無機質、ホルモン、色素等が挙げられる。そして、該化学物質を有する細胞、組織も生体物質に含むこととする。細胞は、単一細胞でも細胞塊でもよい。
　以下、細胞表面タンパク質を有する細胞を基板に捕捉することを主に想定して説明するが、本技術は、これに限定されるものではない。
＜１．基板上での生体物質の捕捉と標識＞
１－１．基板
　本技術に用いる基板には、生体物質である細胞表面タンパク質や核酸等と結合し得る分子が固定化されている。よって、基板上に細胞表面タンパク質等を有する細胞を適用すれば、基板に細胞を捕捉することができる。
　基板としては、例えば、プラスチック、ガラス、シリコン等の材料のものが使用できる。細胞が捕捉された基板に照射を上から又は下から行い、光を基板に通過させる場合、透明材料であることが好ましく、プラスチック及びガラスが好ましい。
　又は、捕捉された細胞を画像で捉えることができる固体撮像素子（CCD、CMOS）を基板としてもよい。
　生体物質と結合し得る分子は、当該生体物質に応じて選択することができる。例えば、生体物質が細胞表面タンパク質や糖鎖である場合、該細胞表面タンパク質又は糖鎖に特異的な抗体、補体、アプタマー、分子認識ポリマーを選択することができる。生体物質が細胞膜脂質である場合、該細胞膜脂質と結合するオレイル基を有する化合物を選択することができる。
　また、生体物質がDNA又はRNAであれば、生体物質と結合可能な分子として、相補的DNA又はRNA、核酸アプタマーを選択することができる。生体物質が抗原であれば、生体物質と結合可能な分子として、抗体、補体を選択することができる。
　抗体及び補体として、例えば、分化すると細胞表面に現れるCD抗原に対する抗体又は補体、各種ガン特異的抗原に対する抗体又は補体、主要組織適合抗原に対する抗体又は補体、糖鎖に対する抗体又は補体等が挙げられる。
　アプタマーは、捕捉したい細胞が有する分子と特異的に結合する核酸分子やペプチドである。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、ペプチドアプタマー、核酸骨格や塩基に修飾を導入して特異性を向上させた修飾アプタマー等が挙げられる。
　分子認識ポリマーは、捕捉したい細胞の細胞表面分子に似た物理化学特性を持つ化合物の存在下でも、高い選択性で目的の細胞表面分子を捕捉する。モレキュラーインプリントポリマーとも呼ばれ、選択的に合成された化合物認識領域を有する。
　前記生体物質と結合し得る分子を基板上に固定化するには、ELISAやウェスタンブロッティング、アフィニティー精製用等の支持体上に非共有結合的又は共有結合的に固定化する技術を用いることができる。ただし、固定化の際には、基板表面から生体物質と結合し得る分子との距離が拡大すると、S/Nの悪化につながることがあるので、できるだけ距離を拡大しないように固定化することが好ましい。
　前記生体物質と結合し得る分子の固定化の際には、距離が拡大しないように考慮しつつ、例えば、刺激分解性リンカーや、コラーゲン、PEG、MPC等の高分子物質を介して基板上に固定化することもできる。
　基板上にまず刺激分解性リンカーを固定化し、該刺激分解性リンカーに生体物質と結合し得る分子を更に結合させることによって、基板上に生体物質と結合し得る分子を固定化してもよい。又は、基板上にまずPEG、MPC等のポリマーを固定化し、次に該ポリマーに刺激分解性リンカーを結合させ、更に該刺激分解性リンカーに生体物質と結合し得る分子を結合させてもよい。
　刺激分解性リンカーを用いれば、基板に細胞を捕捉した後、所望の細胞が捕捉された基板の位置にある刺激分解性リンカーに刺激を与えることにより該刺激分解性リンカーが切断され、所望の細胞が基板から遊離して回収することができる。
　前記刺激分解性リンカーは、特定の外部からの刺激で分解する接続分子である。例えば、特定の波長の光で分解されるリンカー、酵素で分解されるリンカー、温度で分解されるリンカー等がある。刺激分解性リンカーは特に限定されないが、単一細胞を基板に捕捉する場合、単一細胞ごとの制御が可能な点及び分解時間が短い点から、光分解性リンカーを用いることが好ましい。
　光分解性リンカーは、特定の波長によって分解される構造を持つ分子である。
　例えば、以下のものを挙げることができる：メトキシニトロベンジル基、ニトロベンジル基（特開2010-260831号公報）、パラヒドロキシフェナシル基（テトラヘドロンレターズ、1962年、1巻、1頁）、7-ニトロインドリン基（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティーズ、1976年、98巻、843頁）、2-(2-ニトロフェニル)エチル基（テトラヘドロン、1997年、53巻、4247頁）及び（クマリン-4-イル）メチル基（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティーズ、1984年、106巻、6860頁）等。
　また、光分解性リンカーは、例えば前記特許文献１に光解離性基として具体的に記載されている。
　光分解性リンカーを分解する特定の波長は、光分解性分子の吸収波長とほぼ一致する。
　例えば、光分解性リンカーに用いられるメトキシニトロベンジル基の場合、346nmでの吸収を1とすると、364nmでは0.89、406nmでは0.15、487nmでは0.007の吸収を示す。すなわち、365nmの光源を用いれば、光分解性リンカーの分解効率がよく、488nmの光源ではほぼ分解されないという性質を有する。このように、光分解性リンカーに照射する光の波長は、各光分解性リンカーに対応する波長であればよい。例えば330～450nm付近の波長である。
　また、光分解性リンカーを分解する特定の波長は、生体物質にダメージを与えない波長であることが好ましい。例えば生体物質が細胞の場合、30mW/cm^2,100sec.→3J/cm^2で照射することが好ましい。特に300nm以下の波長は、細胞にダメージを与える可能性があるので使用しないことが好ましい。
１－２．生体物質の標識
　生体物質は基板上に捕捉された後に標識することができる。例えば、生体物質に特異的な標識された抗体、補体、アプタマー、分子認識ポリマー、オレイル基等を基板上の生体物質に結合させればよい。
　あるいは、予め標識した生体物質を基板上に捕捉してもよい。生体物質を予め標識する場合は、標識済みのタンパク質や核酸等の生体物質と細胞とを接触させて、生体物質を細胞導入する操作等を行えばよい。
　標識は、蛍光化合物、酵素、ビオチン、金属等を用いることができる。蛍光化合物は発せられる特異的な波長の光で検出できる。酵素は酵素基質で発色させて検出できる。ビオチンは蛍光色素等と結合したアビジン複合体を発色させて検出できる。金属は特定の波長の照射で検出できる。
　また、標識は、生物発光化合物、化学発光化合物、放射性同位体等を用いてもよい。これらの標識の場合、発せられる特定の波長の光を検出すればよい。
＜２．基板への照射と生体物質の検出＞
　基板上に捕捉された生体物質への照射は、基板を区画化して、経時的に異なる区画を有する照射パターンで行う。すなわち、異なるタイミングで、異なる区画に照射するが、そのタイミングと区画が様々にパターニングされている。
　例えば、区画化の形は、碁盤目状、蜂の巣状にすることが挙げられるが、これらに限定されない。また、区画化の大きさ、数等も最適に選択することができる。これらの最適な選択は、後述の生体物質後述方法における基板全体の画像データを取得し、その画像データから得られる基板上の生体物質の分布のデータに基づいて決定することができる。
　また、照射パターンの具体例については後述する。
　なお、照射は、基板の上から行ってもよいし、基板の下から行ってもよい。
２－１．照射機構
　例えば標識に蛍光化合物を用いた場合、該蛍光化合物に応じた励起光を照射するが、その際の照射機構として例えば透過型液晶デバイス、反射型液晶デバイス、DMD（Digital MicromirrorDevice）、MEMS（Micro Electro Mechanical Systems）シャッター等を用いた照射装置を用いることができる。
　液晶デバイスには、例えば、数百万以上の画素をシリコン基板上で駆動させるSilicon X-tal Reflective Displayを用いることができる。0.74型（対角18.8mm）の液晶デバイスが既に開発されている。
　DMDには公知のものを用いることができる。DMDで例えば1920×1080個のサイトを同時に制御（照射のON/OFF）ができるとすると、約2×106個の細胞への個別制御が同時に可能になる。
　MEMSシャッターは、液晶デバイスのようなバックライトの光を通すカラーフィルタや偏光フィルムが無く、バックライト（赤色光、緑色光、青色光）を直接通すシャッターを有するものである。
　MEMSシャッターには公知のものを用いることができる。例えば、積層構造を有するMEMSシャッター（下から順に光源、導光板、偏光板、アレイ基板、透明電極（サブ画素電極）、配向膜、液晶層、配向膜、透明電極（共通電極）、カラーフィルタ基板、偏光板）が挙げられる。
　前記照射機構によれば、区画ごとに照射を制御できる。照射機構は、後述の２次元的な照射パターンの領域及び時間制御ができる機構であれば特に限定されない。
　また、照射機構は、生体物質が捕捉された区画を確認してから該区画に照射の有無を判断し、照射を制御するようにしてもよい。例えば、前述のように基板に画像撮像デバイスを用いてその基板上に生体物質を捕捉すれば、画像で、各区画における生体物質の捕捉がわかり、各区画に照射を行うか否かの判断の元となるデータが得られる。
２－２．照射パターン
　クロストークの問題を低減できるように各区画への照射の有無をパターニングした照射パターンで基板を照射する。
　ここで、クロストークの影響を強く受けると考えられる照射パターンを図４に示す。
　図４の左上の図は、クロストークを考慮しない照射パターンである。ハイスループットで処理するためには、図４の右上のように生体物質と結合し得る分子を高密度に基板に固定化し、生体物質を捕捉する。しかし、基板が高密度化されると、中心区画のまわりに接する区画からの蛍光標識の信号によるクロストークの影響が強くなる（図４の左下）。
　特に、中心区画の縦横に接する区画のクロストークの影響を強く受ける（図４の左下）。斜めに接する区画からの蛍光標識の信号は比較的影響が少ないと考えられる。
　よって、中心区画の蛍光標識の信号を、クロストークの影響を低減して検出するには、図５に示すように、高密度化した基板において、中心区画には照射し、中心区画の縦横に接する区画には照射しないように照射機構を制御する（図の黒の区画、シャッターを閉じる）照射パターンを採用すればよい。
　前記照射パターンを面一括で行えるようにパターニングすると、例えば、図６に示す格子状パターンになる。
　まず、図６の左の格子状パターンで基板を照射する（時刻t=0[S]）。次に、図６の左の格子状パターンを反転させたパターンで基板を照射する（時刻t=1[S]）。このように格子状パターンの照射を、時間をずらして反転して行えば、反転前後における蛍光標識の信号検出の際にクロストークの影響を低減でき、目的の生体物質を捕捉している区画をより正確に識別できる。
　前記格子状パターンの他に図７～図９の照射パターンが挙げられるが、本技術はこれらの照射パターンに限定されない。照射パターンとして、例えば直線状、格子状、長方形状、正方形状及び枠状からなる群から選択される形を形成するパターンが挙げられる。
　図７は、生体物質である細胞表面タンパク質を有する細胞が基板の１つの区画よりも大きい場合の照射パターンを示す。
　図７の左の図は、基板２の１つの区画よりも大きい蛍光標識細胞１が捕捉されており、蛍光標識細胞１が重なる区画の一部に照射する照射パターン（正方形状（小）パターン）である。
　図７の中央の図は、蛍光標識細胞１が重なる区画を含むように照射する照射パターン（正方形状（大）パターン）である。
　図７の右の図は、蛍光標識細胞１が重なる区画を含まないように照射する照射パターン（枠状パターン）である。
　図７の左、中央、右の照射パターンで時間をずらして照射することによりクロストークの問題を低減したより正確な信号が得られる。これらの照射パターンの順番は特に限定されない。
　また、前記枠状パターンでは、照射を細胞側から行えば、照射機構の拡散板と合わせると斜め照明になり、励起光吸収が大きくなることでS/Nの改善が見込まれる。
　図８は、細胞物質と結合し得る分子が多数固定化されている基板の照射パターンを示す。
　図８の右は、基板全体の照射パターン（格子状パターン）を示す。
　図８の左は、該照射パターンを拡大したものを示す。
　図８に示す格子状パターン以外にも、以下の直線状パターン等の様々なパターンで照射を行うことができる。
　図９は、直線状パターンの例を示す。
　図９の左から右に示すように、直線状の照射を、蛍光標識細胞１が重なっていない区画から重なっている区画へと時間をずらして行うことができる。
２－３．検出部
　基板上に捕獲された生体物質の検出には、生体物質の標識からの信号を受ける検出部により行うことができる。
　検出部としては、例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器等が挙げられる。また、画像データとして検出できる固体撮像デバイス（CCD、CMOS）等を用いてもよい。本技術の検出部はこれらに限定されない。
＜３．生体物質解析方法＞
　本技術の照射方法を用いた生体物質解析方法は、
　生体物質と結合し得る分子が固定化され、該分子に生体物質が結合した基板を区画化し、該基板に対して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射する工程、及び
　照射により得られた情報に基づいて、生体物質を解析する工程
を含む。
　一実施態様として、生体物質を含みうるサンプルを接触させて基板に結合させた後、前記基板を区画化して、例えば、
第１の照射パターンで照射する工程、及び
第２の照射パターンで照射する工程
を経て、前記第１の照射パターン及び前記第２の照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、生体物質を解析する工程
を含めることができる。
　本技術の生体物質解析方法は、例えば、図１０に示す工程で行うことができる。
　まず、生体物質を含むサンプルを基板に適用し（S101）、基板上の生体物質と結合し得る分子とサンプルとを接触させる。サンプル中の生体物質を基板上に捕捉した後、不要のサンプルを洗浄等により除去する。
　次に、基板全体の画像データを取得し（S102）、どの区画に生体物質が捕捉されているかを認識する工程を入れることができる。画像データは、一次元的にスキャンしてもよいし、二次元的に面としても取得できるが、時間短縮の観点から、面として取得することを選択できる。
　あるいは、基板全体の画像データを取得（S102）後、基板上の生体物質の分布の知見から、区画化のパターンを決定する工程を入れてもよい。区画化の形、大きさ、数等を決定する工程である。
　また、画像データから照射パターンも選択することができる（S103)。
　最適な区画化のパターン及び照射パターンは、予め記憶媒体に記憶させた区画化パターンや照射パターンから選択できるようにしてもよいし、分布密度から計算プログラムにより計算して最適な区画化のパターン及び照射パターンを選択することもできる。公知の画像処理プログラムを使用してもよい。また、分布密度の高低に応じて区分けして、分布密度が高いところは細かく区画化し、低いところは大きく区画化してもよい。更に、数回の画像データ処理を行い、コンピュータに学習させて最適な区画化のパターン及び照射パターンを選択できるようにしてもよい。
　なお、照射パターンは１パターン又は２パターン以上を適宜組み合わせて決定することができる。決定された照射パターンで基板を照射する（S104）。照射により生じた生体物質の標識からの信号データを検出部で受信、検出する（S105）。
　なお、２パターン以上が採用されたときは、時間差を設けて各パターンで基板を照射する。図１０で言えば、第２の照射パターンで基板を照射し（S106）、照射により生じた生体物質の標識からの信号データを検出部で受信、検出する（S107）。
　本技術の生体物質解析方法は、検出部で得られた情報に基づいて、各区画における生体物質の有無を解析する解析工程を含んでもよい（S108）。また、各区画において生体物質がある場合に、取得したい標的の生体物質か否かを解析する解析工程を含んでもよい（S108）。
　更に、本技術の生体物質解析方法は、解析工程により得られた情報に基づいて、基板から生体物質を遊離する生体物質遊離工程を含んでもよい（S109）。基板から生体物質を遊離するには、例えば、生体物質と結合し得る分子と基板との間を介している刺激分解性リンカーに刺激を与えればよい。具体例としては、遊離させたい生体物質がある区画のみに、光分解性リンカーに特異的な波長の光を照射することが挙げられる。ここで、遊離させたい生体物質とは、標的又は非標的の生体物質であり得る。
　前記照射パターンは、当該生体物質遊離工程（S109）でも用いることができる。照射パターンで照射すれば、前記蛍光測定時のクロストークの低減効果と同様に、生体物質遊離の精度を向上させることができる。
　例えば、遊離させずに留めておきたい標的の生体物質が、遊離させたい非標的の生体物質に囲まれている場合もある。
　そのような場合に、光分解性リンカーに特異的な波長の光を、前記蛍光測定時と同様の照射パターンで基板に照射することにより、標的の生体物質への該光の照射光量を低減させることができ、標的又は非標的の生体物質の遊離分別の精度が向上する。
　遊離された生体物質が標的の生体物質である場合は、回収されて、更なる工程、例えば解析、増殖、増幅等に用いられる。遊離された生体物質が非標的の生体物質である場合は、そのまま破棄され、基板上に留まった標的の生体物質は、基板上で更なる工程に用いられる。
＜４．生体物質解析装置＞
　本技術の生体物質解析方法を実現する装置は、
生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
前記基板を照射する照射部と、
前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と
を備える。
　図１１に生体物質解析装置の例を示す。
　基板２は複数の区画を有し、各区画には高分子物質３（コラーゲン、PEG、MPC等）、刺激分解性リンカー４（光分解性リンカー等）、生体物質と結合し得る分子５（抗体、相補的DNA、アプタマー等）が固定化されている。基板２に細胞１１を適用し、生体物質と結合し得る分子５に細胞１１上の生体物質１０（細胞表面タンパク質、核酸等）が結合し、細胞１１が捕捉される。捕捉された細胞１１を標識１２（蛍光物質等）で標識する。
　ここで、各区画に細胞１１が捕獲されているかを画像データ等により検出してもよい。検出は検出部８で行うことができる。例えば、検出部８に固体撮像デバイスを備え、画像データに基づいて照射パターンを決定する。
　照射パターンは、照射部６と照射制御部７により実施できる。照射部６は、標識１２に応じた波長の光を照射する。照射部６は、波長が異なる複数の光を照射できるようにしてもよい。照射光としては、例えば、生体物質が各区画に結合しているか否かを見るのに適した波長の光、標識１２を励起する波長の光、光分解性リンカーを切断する光等が挙げられる。
　照射制御部７（透過型液晶デバイス、反射型液晶デバイス、DMD、MEMSシャッター等）は、決定された照射パターンに従って、照射部６からの光を制御する。照射制御部７が有するシャッター機構、デジタルミラーデバイス等により、照射パターンを実行する。
　検出部８は、照射パターンによる照射で得られた信号データ等を受信・検出する。解析部９は、得られた信号データの情報に基づいて、区画における生体物質や細胞の有無及び／又は標的の生体物質や細胞であるかを解析する。
＜５．生体物質解析用プログラム＞
　本技術の生体物質解析用プログラムは、生体物質と結合し得る分子が固定化された基板に対して、前記基板を区画化して、経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる。具体的には、前述の照射パターンを実行するようプログラミングされる。
　生体物質解析用プログラムは、例えば、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリ等の記録媒体に格納されていてもよく、また、ネットワークを介して配信することもできる。生体物質解析用プログラムは、コンピュータを前記生体物質解析装置に外付けして分析を実行するようにしてもよいし、前記生体物質解析装置に内蔵して分析を実行するようにしてもよい。
＜６．生体物質解析システム＞
　本技術の生体物質解析システムは、
　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、前記基板を照射する照射部と、前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と、前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部とを含む生体物質解析装置、
　前記照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる生体物質解析用プログラム、及び
　前記解析部により得られた結果を表示する表示装置
を備える。
　図１２に生体物質解析システムの例を示す。
　生体物質解析システム１００１は、生体物質解析装置１０１、コンピュータ３０１、表示装置４０１を含む。
　生体物質解析装置１０１は、照射部６、照射制御部７、生体物質と結合し得る分子５、基板２、検出部８、解析部９を含む。
　コンピュータ３０１は生体物質解析用プログラム２０１を含む。生体物質解析用プログラム２０１は照射部６及び照射制御部７と連絡する。
　表示装置４０１は生体物質解析装置１０１の解析部９と連結する。表示部４０１として、モニターや印刷装置が挙げられる。モニターや印刷により表示された解析データ等に基づいて、コンピュータ３０１でのマウス操作やキーボード操作等により、基板２にサンプルを適用する動作を行ったり、照射部６、照射制御部７、検出部８、解析部９、生体物質解析用プログラム２０１等を任意又は自動的に制御することができる。
　なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
［１］　生体物質と結合し得る分子が固定化され、該分子に生体物質が結合した基板を区画化し、該基板に対して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射する工程、及び
　照射により得られた情報に基づいて、生体物質を解析する工程を含む
生体物質解析方法。
［２］　前記照射パターンは、前記区画を１つ又は複数照射するパターンを有する、［１］に記載の生体物質解析方法。
［３］　前記照射パターンは、前記複数の区画を照射して、該照射された区画が直線状、格子状、長方形状、正方形状及び枠状からなる群から選択される形を形成するパターンを有する、［２］に記載の生体物質解析方法。
［４］　前記基板の全体の画像データを取得し、該画像データから得られる基板上の生体物質の分布データに基づき、区画化のパターンを決定する工程及び／又は照射パターンを決定する工程を更に含む、［１］～［３］のいずれかに記載の生体物質解析方法。
［５］　前記照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析工程を更に含む、［１］～［４］のいずれかに記載の生体物質解析方法。
［６］　前記解析工程により得られた情報に基づいて、基板から生体物質を遊離する生体物質遊離工程を更に含む、［５］に記載の生体物質解析方法。
［７］　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
　前記基板を照射する照射部と、
　前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と
を備える生体物質解析装置。
［８］　前記生体物質解析装置は、前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部を備える、［７］に記載の生体物質解析装置。
［９］　前記生体物質と結合し得る分子は刺激分解性リンカーである、［７］又は［８］に記載の生体物質解析装置。
［１０］　前記照射部は２以上の種類の光を照射し得る、［７］～［９］のいずれかに記載の生体物質解析装置。
［１１］　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板に対して、前記基板を区画化して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる、生体物質解析用プログラム。
［１２］　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
前記基板を照射する照射部と、
前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と、
前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部と
を含む生体物質解析装置、
　前記照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる、生体物質解析用プログラム、及び
　前記解析部により得られた結果を表示する表示装置
を備える、生体物質解析システム。
１　　　　　　蛍光標識細胞
２　　　　　　基板
３　　　　　　高分子物質
４　　　　　　刺激分解性リンカー
５　　　　　　生体物質と結合し得る分子
６　　　　　　照射部
７　　　　　　照射制御部
８　　　　　　検出部
９　　　　　　解析部
１０　　　　　生体物質
１１　　　　　細胞
１２　　　　　標識
１０１　　　　生体物質解析装置
２０１　　　　生体物質解析用プログラム
３０１　　　　コンピュータ
４０１　　　　表示装置
１００１　　　生体物質解析システム

Claims (12)

  1. 　生体物質と結合し得る分子が固定化され、該分子に生体物質が結合した基板を区画化し、該基板に対して経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射する工程、及び
    　照射により得られた情報に基づいて、生体物質を解析する工程を含む
    生体物質解析方法。
  2. 　前記照射パターンは、前記区画を１つ又は複数照射するパターンを有する、請求項１に記載の生体物質解析方法。
  3. 　前記照射パターンは、前記複数の区画を照射して、該照射された区画が直線状、格子状、長方形状、正方形状及び枠状からなる群から選択される形を形成するパターンを有する、請求項２に記載の生体物質解析方法。
  4. 　前記基板の全体の画像データを取得し、該画像データから得られる基板上の生体物質の分布データに基づき、区画化のパターンを決定する工程及び／又は照射パターンを決定する工程を更に含む、請求項１に記載の生体物質解析方法。
  5. 　前記照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析工程を更に含む、請求項１に記載の生体物質解析方法。
  6. 　前記解析工程により得られた情報に基づいて、基板から生体物質を遊離する生体物質遊離工程を更に含む、請求項５に記載の生体物質解析方法。
  7. 　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
    　前記基板を照射する照射部と、
    　前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と
    を備える生体物質解析装置。
  8. 　前記生体物質解析装置は、前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部を備える、請求項７に記載の生体物質解析装置。
  9. 　前記生体物質と結合し得る分子は刺激分解性リンカーである、請求項７に記載の生体物質解析装置。
  10. 　前記照射部は２以上の種類の光を照射し得る、請求項７に記載の生体物質解析装置。
  11. 　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板に対して、前記基板を区画化して、経時的に異なる区画を有する照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる、生体物質解析用プログラム。
  12. 　生体物質と結合し得る分子が固定化された基板と、
    前記基板を照射する照射部と、
    前記基板を区画化して、照射を経時的に異なる区画を有する照射パターンに制御する照射制御部と、
    前記照射パターンでの照射により得られた情報に基づいて、前記区画における生体物質の有無及び／又は標的の生体物質か否かを解析する解析部と
    を含む生体物質解析装置、
    　前記照射パターンで照射することをコンピュータに実行させる、生体物質解析用プログラム、及び
    　前記解析部により得られた結果を表示する表示装置
    を備える、生体物質解析システム。
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