TWI525353B

TWI525353B - 超高多工分析系統及方法

Info

Publication number: TWI525353B
Application number: TW099102410A
Authority: TW
Inventors: 丹尼斯薩卡琳; 保羅朗得奎斯特; 趙培謙; 鍾誠; 史蒂芬脫爾諾; 黃雁樵; 培茲曼蒙納吉米; 拉維薩克森納; 安妮特格羅特; 亞隆沙里森
Original assignee: 加州太平洋生物科學公司
Priority date: 2009-07-07
Filing date: 2010-01-28
Publication date: 2016-03-11
Also published as: TW201106032A

Description

超高多工分析系統及方法

相關申請案之交互引述

本申請案主張於2009年7月7日提出申請之第61/223,628號美國暫准專利申請案的優先權，全部揭露內容就所有目的在此完整地併入本案以為參考資料。

發明領域

本發明係有關於超高多工分析系統及方法。

發明背景

在分析系統中，增加一既定系統在任一時間所進行的分析數目之能力，係增加該系統的功用與延長使用期限之一關鍵部份。尤其，藉由增加一既定系統之分析的多工因子，可增加該系統的總處理量，藉而增加其效用及同時減少該項用途的相關成本。

在光學分析中，多工之增加通常造成困難度之增加，因其可能需要更加複雜的光學系統、增加照明或偵測能力及新的反應圍阻策略。在一些情況下，系統係尋求增加數倍及甚至級數規模之多工，其使得該等考量更加複雜。同樣地，在特定情況下，待使用該系統的分析環境具高度敏感性，藉此可能不容許一既定系統的不同分析之間之變異。該等目標通常與單純地使該系統更大及具更高功率之蠻力方式相衝突，因該等步驟通常產生甚至更嚴重的後果，如反應之間的串擾、因訊號較低與雜訊較高中之任一或二者所產生的訊號雜訊比降低等。因此，在其等所欲的分析上提供具有顯著增加的多工之分析系統將為有利的，及特別是在高度敏感的反應分析上，及在許多情況下，同時將增加多工的負面效應降至最低。本發明符合該等需求與多種其他需求。

發明概要

本發明提供用於分析基板上的反應區域之非常高多工分析之方法、基板及系統，及特別是用於進行高度敏感、產生低訊號的反應諸如單分子螢光分析之多工系統，如單分子即時核酸定序技術中所用者。

就一方面而言，本發明係用於製造包含一微鏡陣列的一基板之一種方法，其中各微鏡係與一種零模式波導配套，其包括：a)提供具有一頂面之一透明基板；b)在該透明基板製作圖案與蝕刻，以形成具有頂部與側面的突出構造之一陣列；c)澱積一覆蓋材料，藉此該突出構造的頂部包含一覆蓋；d)經由該覆蓋形成一孔徑陣列，藉此各突出構造的頂部包含一孔徑；及e)澱積一反射性澱積材料，藉此各突出構造的側面包含一反射層；藉此該突出構造的陣列包含一微鏡陣列，及位於各突出構造頂部之孔徑包含一種零模式波導。

在一些實施例中，在透明基板製作圖案與蝕刻之步驟b)，係在澱積該覆蓋材料與形成該孔徑陣列之步驟c)與d)之後進行。在一些實施例中，澱積該覆蓋材料與形成該孔徑陣列之步驟c)與d)，係在透明基板製作圖案與蝕刻之步驟b)之後進行。

在一些實施例中，該透明基板包含一種矽石式材料。在一些實施例中，該透明基板包含熔融矽石。在一些實施例中，該覆蓋材料包含鋁。在一些實施例中，該反射性澱積材料包含鋁。

在一些實施例中，該透明基板的蝕刻作用包含一種反應性離子蝕刻方法。在一些實施例中，該突出構造包括圓錐形、角錐形或拋物面形。在一些實施例中，該突出構造包含截圓錐。在一些實施例中，截圓錐的頂部直徑係介於1微米與10微米之間。在一些實施例中，基板上的突出構造數目係介於1,000與1,000,000之間。在一些實施例中，基板上的突出構造數目係介於10,000與500,000之間。

就一方面而言，本發明係一種方法，其步驟包括：a)提供具有一頂面之一透明基板，在其上配置具有一孔徑陣列之一金屬覆蓋層；b)在該覆蓋層上澱積第一光阻；c)在第一光阻製作圖案，以產生剩餘光阻區域之一陣列，各剩餘光阻區域包括包含一孔徑之一金屬覆蓋層區域；d)蝕除該覆蓋層區域及透明基板，藉此形成一突出構造陣列，藉此包含金屬覆蓋層區域之該等剩餘光阻區域係位於突出構造的頂部；e)澱積一金屬澱積層，藉此該金屬澱積層係與突出構造頂部之金屬覆蓋層區域接觸；f)澱積第二光阻；g)在第二光阻製作圖案，以暴露位於突出構造頂部的金屬澱積層區域；及h)處理來自步驟(g)的構造，以移除金屬澱積層的暴露區域。

就一方面而言，本發明係一種方法，其步驟包括：a)提供具有一頂面之一透明基板，在其上配置具有一孔徑陣列之一金屬覆蓋層；b)在該金屬覆蓋層上澱積一保護塗層；c)在該保護層上澱積第一光阻；d)在第一光阻製作圖案，以產生剩餘光阻區域之一陣列，各剩餘光阻區域包括包含一孔徑之一金屬覆蓋層區域；e)蝕除保護層、覆蓋層及透明基板之區域，藉此形成一突出構造陣列，藉此包含金屬覆蓋層區域之該等剩餘光阻區域係位於突出構造的頂部；f)移除第一光阻；g)澱積一金屬澱積層，藉此該金屬澱積層係與突出構造頂部之金屬覆蓋層區域接觸；h)澱積一個第二光阻；i)在第二光阻製作圖案，以暴露位於突出構造頂部的金屬澱積層區域；及j)處理來自步驟(i)之構造，以移除金屬澱積層的暴露區域及移除該保護塗層。

就一方面而言，本發明係一種方法，其步驟包括：a)提供具有一頂面之一透明基板，在其上配置具有一孔徑陣列之一金屬覆蓋層；b)在該金屬覆蓋層上澱積一犧牲層；c)在該犧牲層上澱積第一光阻；d)在第一光阻製作圖案，以產生剩餘光阻區域之一陣列，各剩餘光阻區域包括包含一孔徑之一金屬覆蓋層區域；e)蝕除犧牲層、覆蓋層及透明基板之區域，藉此形成一突出構造陣列，藉此包含金屬覆蓋層區域之該等剩餘光阻區域係位於突出構造的頂部；f)移除第一光阻；g)處理該基板以將該犧牲層後拉；h)澱積一金屬澱積層，藉此該金屬澱積層係與突出構造頂部之金屬覆蓋層區域接觸；i)處理來自步驟(h)之構造以釋出犧牲層，藉此移除該犧牲層上的金屬澱積層部份及暴露該等孔徑。在一些實施例中，該犧牲層包含鍺或矽。

就一方面而言，本發明係一種方法，其步驟包括：a)提供具有一頂面之一透明基板，在其上配置具有一孔徑陣列之一金屬覆蓋層；b)在該金屬覆蓋層上澱積一保護層；c)在該保護層上澱積第一光阻；d)在第一光阻製作圖案，以產生剩餘光阻區域之一陣列，各剩餘光阻區域包括包含一孔徑之一金屬覆蓋層區域；e)蝕除保護層、覆蓋層及透明基板之區域，藉此形成一突出構造陣列，藉此包含金屬覆蓋層區域之該等剩餘光阻區域係位於突出構造的頂部；f)移除第一光阻與保護層；g)在至少部份覆蓋金屬覆蓋層區域之突出構造頂部上，產生一柱狀陣列；h)澱積一金屬澱積層，藉此該金屬澱積層係與突出構造頂部之金屬覆蓋層區域接觸；及i)處理來自步驟(h)之構造以移除柱狀陣列，藉此移除一部份的金屬澱積層。

就一方面而言，本發明係一種方法，其步驟包括：a)提供具有一頂面之一透明基板；b)在該透明基板上澱積第一光阻；c)在第一光阻製作圖案，以產生剩餘光阻區域之一陣列；d)蝕除透明基板區域，藉此形成一突出構造陣列，藉此該等剩餘光阻區域係位於突出構造的頂部；e)移除第一光阻；f)在該透明基板上澱積一金屬澱積層；g)在該金屬澱積層上澱積一硬式塗層；h)將硬式塗層的表面拋光，以暴露透明基板對應於突出構造頂部之部份；i)澱積一金屬覆蓋層；j)在該金屬覆蓋層上澱積一光阻；及k)在該光阻製作圖案及蝕刻該覆蓋層，以在該突出構造的頂部產生一孔徑陣列。

就一方面而言，本發明係一種方法，其包括：a)在該透明基板上澱積一犧牲層；b)藉由選擇性地蝕刻該犧牲層而產生一奈米柱陣列；c)在透明基板製作圖案與蝕刻，以形成具有頂部與側面的突出構造之一陣列，其中該奈米柱係配置於該突出構造的頂部上；d)在步驟c)中所產生的構造上澱積一金屬層；e)在該金屬層上澱積一平坦化層；f)將該平坦化層平坦化，以暴露該突出構造頂部上的金屬層及暴露該奈米柱；及g)處理該基板以移除奈米柱，藉此在突出構造的頂部上形成一孔徑陣列。

在一些實施例中，該犧牲層包含鍺或矽。在一些實施例中，該平坦化層包含一種PECVD氧化物或旋塗式玻璃。在一些實施例中，該平坦化作用包括CMP。在一些實施例中，該金屬層包含鋁。

就一方面而言，本發明係包含一微鏡陣列之一基板，其中各微鏡包含一種零模式波導。

就一方面而言，本發明係配置於具有一頂面與一底面之一透明基板的一頂面上之零模式波導的一陣列，其中該透明基板包含一微鏡陣列，其中各微鏡將發射自零模式波導的光改向離開該透明基板的底面。

就一方面而言，本發明係一微鏡陣列，其包括：a)具有包含一形體陣列的一上表面之一透明基板，其中該形體的頂部與側面包含一反射塗層，及b)延伸通過該反射塗層之一孔徑陣列，其中各形體的頂部包含至少一孔徑，其中藉由該陣列壁上的反射塗層將自孔徑陣列發出的光改向。

在一些實施例中，該形體包含拋物面、圓錐、角錐、截圓錐。在一些實施例中，該形體包含截圓錐。在一些實施例中，該形體包含頂部直徑介於約0.5微米與約5微米之間之截圓錐。在一些實施例中，該形體包含頂部直徑介於約1.5微米與約4微米之間之截圓錐。在一些實施例中，該形體包含頂部直徑介於約2微米與約3微米之間之截圓錐。在一些實施例中，該形體包含距垂直面的側壁角度介於5°與40°之間之截圓錐。在一些實施例中，該形體包含距垂直面的側壁角度介於10°與30°之間之截圓錐。

就一方面而言，本發明係用於測量零模式波導陣列中的分子事件之一系統，其包含：a)配置於具有一頂面與一底面之一透明基板的一頂面上之零模式波導陣列，其中該透明基板包含將光改向至零模式波導之一微鏡陣列；b)一照明系統，其經由該透明基板的底面將照明光束提供至零模式波導；其中該系統之構形係使得微鏡與照明光束交互作用，藉此照明光束經歷建設性干擾，藉此在零模式波導的光強度相對於其他照明區域而言係增加。

就一方面而言，本發明係用於測量零模式波導陣列中的分子事件之一種方法，其包括；a)提供配置於具有一頂面與一底面之一透明基板的一頂面上之零模式波導陣列，其中該透明基板包含將光改向至零模式波導之一微鏡陣列；及b)以照明光束之一陣列，經由該透明基板的底面照明該零模式波導；其中該照明光束與微鏡交互作用，藉此照明光束經歷建設性干擾，藉此在零模式波導的光強度相對於無建設性干擾情況下之強度而言係增加。

就一方面而言，本發明係用於分析一種單分子的性質之一種方法，其包括：a)將具光學特性的一種單分子配置在零模式波導之孔徑內，其中該零模式波導係與一微鏡光耦合；b)以照明光照明該零模式波導；c)以一偵測器收集自零模式波導發出的光，其中藉由微鏡將所發出的光之至少一部份改向至偵測器；及d)使用所收集之發出的光測定該單分子的性質。

在一些實施例中，零模式波導與微鏡係各納入一個單基板中。在一些實施例中，該基板包含各與一微鏡光耦合之零模式波導陣列。

就一方面而言，本發明係用於測定有關一模板核酸分子的序列資訊之一種方法，其包括：a)將一種聚合酶酵素、一種模板核酸分子及一種引子配置在一種零模式波導內，其中該零模式波導係納入亦包含一微鏡之一基板中，b)提供用於聚合作用之核苷酸、試劑及輔因子，其中該聚合酶酵素可接近用於聚合作用之核苷酸、試劑及輔因子，其中聚合酶酵素、模板核酸分子、引子或核苷酸中之至少一者包含一光學標記；c)提供該聚合酶酵素藉由納入核苷酸而合成一增長的核酸股之條件；d)以照明光照明該零模式波導以與該光學標記交互作用；e)以一偵測器收集自零模式波導發出的光，其中藉由微鏡將所發出的光之至少一部份改向至偵測器；及f)使用所收集之發出的光，以測定有關該模板核苷酸的序列資訊。

就一方面而言，本發明係用於觀測自一基板所發出者之一光學系統，其包含：a)具有嵌入其中的一種分色鏡元件與至少一個第一面、一個第二面及一個第三面之一種定形的光學區塊；b)配置用以將照明光經由第一面而送入光學區塊之照明光學元件，其中該照明光自所嵌入的分色鏡元件反射，通過第二面而至包含一發光元件之一基板上；及c)配置用以收集發光元件所發出的光之集光光學元件，其中該發光元件所發出的光通過第二面、通過分色鏡元件、離開第三面及進入該集光光學元件。

在一些實施例中，該照明光係自定形光學區塊的一面內反射至該分色鏡元件上。在一些實施例中，該光係自第二面反射。在一些實施例中，該第一、第二及第三面實質上為平面。

在一些實施例中，該發光元件包含一種螢光元件。在一些實施例中，該基板包含一反應區域陣列，其中之至少一部份包含一發光元件。在一些實施例中，該基板包含一種ZMW陣列。

在一些實施例中，該照明光學元件包含至少一雷射與一照明光學元件串。在一些實施例中，該集光光學元件光學系統包含將所發出的光送至一偵測器之一種集光光學元件串。在一些實施例中，該光學區塊包含折射率介於1.3與2.5之間之一種材料。在一些實施例中，該光學區塊包含二氧化矽或氟化鈣。

就一方面而言，本發明係一種光學偵測系統，其包含：在其上具有多個空間分離式反應區域之一基板；位於反應區域與該光學系統之間的聚焦光學元件，以將來自各分離式反應區域之光學訊號至少部份準直；及一光學系統，其位置係將激發照明引導至配置於該基板上之多個分離式反應區域及接收自該等反應區域所發出的光學訊號。

在一些實施例中，該聚焦光學元件係集成進入該基板或與之連接。在一些實施例中，該聚焦光學元件包含多個集成進入該基板之反射光學元件，各反射光學元件的位置係將來自基板上之一分離的離散式反應區域之光至少部份準直。在一些實施例中，該反射光學元件係選自拋物面鏡、圓錐形鏡、分段式圓錐形鏡、截圓錐形鏡、部分拋物面鏡、梯形鏡及角錐形鏡。在一些實施例中，該聚焦光學元件包含集成進入該基板或與之連接之多個透鏡元件，該多個透鏡元件中之各者的位置係將來自基板上之一分離的離散式反應區域之光至少部份準直。

在一些實施例中，多個空間分離式反應區域係以每平方公分至少100,000個分離式反應區域之密度配置於基板表面上。在一些實施例中，該光學系統之構形係將激發照明引導至基板上之至少10,000個分離式反應區域及分別接收來自其的光學訊號。在一些實施例中，該光學系統之構形係將激發照明引導至基板上之至少50,000個分離式反應區域及分別接收來自其的光學訊號。在一些實施例中，該光學系統之構形係將激發照明引導至基板上之至少100,000個分離式反應區域及分別接收來自其的光學訊號。

在一些實施例中，該光學系統包含其位置係用於收集來自基板上的分離式反應區域之光學訊號之一物鏡，及位於基板與物鏡之間之一分色鏡，該分色鏡可透射來自基板的光學訊號及反射激發照明，藉此激發照明並非實質上傳送通過該物鏡。

就一方面而言，本發明係分析一基板上之多個離散式反應區域之一種方法，其包括：提供在其上具有多個分離式反應區域之一基板；提供集成進入該基板或與之連接之聚焦光學元件，該聚焦光學元件分別將來自各個分離式反應區域之光學訊號至少部份準直；照明該多個分離式反應區域，以產生與該反應區域中的一反應相關聯之光學訊號；及將藉由聚焦光學元件準直的光學訊號傳送至一偵測器，以偵測該訊號。

就一方面而言，本發明係一分析系統，其包括：在其上具有多個空間離散式反應區域之一基板；一激發照明源；一光學偵測器陣列；一光學元件串，其包含：一多工照明路徑，其包括將來自激發照明源的一光束轉換為多個照明點之多工光學元件，及用於將照明點交替地導向多個訊號來源的第一部份及多個反應區域的至少一個第二部份之切換光學元件；及用於收集自多個反應區域發出的訊號及將該訊號引導至光學偵測器陣列上的空間上離散位置之一訊號收集路徑。

就一方面而言，本發明係一分析系統，其包括：在其上具有多個空間離散式反應區域之一基板；一激發照明源；一光學偵測器陣列；及一光學元件串，其包含：一多工照明路徑，其包括將來自激發照明源的一光束轉換為多個照明點之多工光學元件，及將照明點導向多個反應區域；及用於收集自多個反應區域發出的訊號之一訊號收集路徑，其中該訊號收集路徑包含切換光學元件，其係用於將來自反應區域的第一部份之訊號引導至光學偵測器陣列上之第一部份的空間上離散位置，及將來自反應區域的第二部份之訊號引導至該偵測器陣列上之第二部份的空間離散式區域。

就一方面而言，本發明係用於分析一基板上的高多工反應區域之一系統，其包括：在其上具有多個離散式反應區域之一基板；用於偵測與離散式反應區域相關聯的光學訊號之一偵測系統，其包含：至少第一與第二偵測器；及一光學元件串，其構形係將與基板上的第一組離散式反應區域相關聯之光學訊號引導至第一偵測器，及將與基板上的第二組離散式反應區域相關聯之光學訊號引導至第二偵測器

就一方面而言，本發明係分析來自一基板的多個離散式反應區域之所欲探討的一反應之一種方法，其包括：提供在其上配置第一組反應區域之一基板；辨識出少於全部的第一組反應區域及展現所欲探討的反應之反應區域的一子集；僅在反應區域的該子集監控所欲探討之反應。

圖式簡單說明

第1A-B圖係以圖式方式說明可使用本發明的部份所進行之一例示性核酸定序方法。

第2圖係以圖式方式說明用於監控一基板上之經照明的離散式反應區域之任擇照明策略。第2A圖係以圖式方式說明一種泛光照明模式。第2B圖係以圖式方式說明一種掃描方式的照明作用。第2C圖係以圖式方式說明一種線性照明模式。第2D圖係以圖式方式說明一種目標點陣列照明模式。

第3圖係以圖式方式說明用於進行共焦多工照明與監控一基板上的離散式反應區域之一系統。

第4圖係以圖式方式說明與高多工系統相關聯之潛在的“串擾”議題。

第5A、5B及5C圖係以圖式方式說明使用定形鏡作為聚焦光學元件之一基板，以有效地自該基板上的反應區域集光及有效地照明該反應區域。第5C圖係以圖式方式說明具有延伸進入該微鏡的一反應區域之一構造，及說明在該微鏡構造中納入一光學組件諸如一濾光鏡。

第6A、6B及6C圖係以圖式方式說明三種任擇的圓錐形微反射器(微鏡)構造。

第7圖係以圖式方式說明具有規定尺寸之一種截圓錐形微鏡構造。

第8A-B圖係以圖式方式說明例如可使用諸如微影與蝕刻之方法所製造的微鏡構造。

第9圖係以圖式方式說明微鏡構造可如何藉由建設性干擾增強照明光強度。

第10至18圖係以圖式方式說明用於產生基板之一種製造方法，該基板具有具配套的反應區域之集成聚焦鏡。

第19圖係以圖式方式說明藉由使用一種基蝕方法產生一犧牲柱而用於製造一反應區域之一種方法。

第20圖係以圖式方式說明使用多個微影與蝕刻步驟在一透明基板上形成定形的微鏡構造之一種方法。

第21圖係以圖式方式說明具有一反應區域陣列與一透鏡陣列之一基板，其中該透鏡將反應區域所發出的光改向。

第22A-B圖係以圖式方式說明使用較大視野(FOV)物鏡之一照明與偵測系統，以容許居間的光學組件。

第23圖係以圖式方式說明一基板上的離散區域之時間多工照明方法。

第24圖係以圖式方式說明用於進行一基板之離散區域中的反應之時間多工照明與偵測之一系統。

第25圖係以圖式方式說明“搜尋活性”多工分析之方法。

第26圖係以圖式方式說明一種多工照明光學元件串。

第27A-B圖係以圖式方式說明用於本發明的系統之一種附加的多工照明路徑。

第28圖係以圖式方式說明使用用於本發明的高多工分析系統之多個偵測陣列之一系統。

第29A-B圖以圖式方式說明使用多個偵測陣列之一任擇的系統，其中各陣列接收來自各訊號來源之訊號成分的一子集。

第30圖係以圖式方式說明本發明之一種定形光學元件區塊。

第31圖顯示一種拋物面微反射器構造(第31A圖)與一種平面零模式波導(第31B圖)之SEM影像。

第32圖說明用於模製一圓錐形微反射器之尺寸分量。

第33圖說明用於模製一分段式圓錐形微反射器之尺寸分量。

第34圖顯示在一熔融矽石基板中所形成之微鏡頂部上的一反應區域陣列之SEM影像。

第35圖顯示在其頂部具有一反應區域之一微鏡構造的SEM影像。

第36圖顯示在一微鏡構造頂部上之一反應區域的SEM影像。

第37圖顯示在一熔融矽石基板中所形成之圓錐形微鏡構造的SEM影像。

第38圖顯示在一熔融矽石基板中所形成之圓錐形微鏡構造的SEM影像。

第39圖顯示位於一平坦化層內及在其頂部具有一反應區域之一微鏡構造截面的SEM影像。

第40圖顯示在其等頂部具有反應區域之微鏡構造的SEM影像。

第41圖顯示用於測量來自微鏡構造的增益之一實驗設置的圖式說明。

第42圖顯示自微鏡構造上的零模式波導反應區域所得之雙色DNA定序資料。

發明之詳細說明 I.　多工分析系統

多工光學分析系統係用於廣泛種類的不同應用中。該等應用可包括單分子之分析，及可涉及例如在單一生物分子進行反應之際之即時觀測。為了討論之方便，在此係就一較佳應用：核酸序列資訊之分析及特別是單分子核酸序列分析，論述該等多工系統。雖然就一特定應用敘述，應瞭解本發明的系統之應用係指較廣泛的應用。

就單分子核酸定序分析之內涵而言，觀測一種單一固定化核酸合成複合物，其包含一種聚合酶酵素、試圖闡明其序列之一模板核酸及與該模板序列的一部份互補之一引子序列，以在其等被納入延長的引子序列之際辨識個別的核苷酸。典型地在其納入作用之前、期間或之後，藉由觀測該核苷酸上之一種光學上可偵測的標記，而監控納入作用。在一些情況下，該單分子分析使用一種“一次一鹼基方式”，藉此一次引入一種單一類型的帶標記核苷酸及與該複合物接觸。在納入之際，自該複合物洗除未被納入的核苷酸，及以作為該固定化複合物的一部份之形式偵測被納入的帶標記核苷酸。

在一些實例中，在偵測納入作用時，僅添加一種單一類型的核苷酸。該等方法需要循環經歷各種不同類型的核苷酸(如A、T、G與C)，方可測定模板的序列。因為在任一時間僅一種單一類型核苷酸與該複合物接觸，就定義而言，任一納入事件即為所接觸的核苷酸之納入作用。該等方法雖然有一些效用，通常當模板序列包括多個重複核苷酸時面臨困難，因可納入與單一納入事件不可區分之多個鹼基。在一些情況下，對於該議題所提出的解決方法包括調整所存在的核苷酸濃度，以確保單一納入事件係動力學上有利的。

在其他情況下，同時添加多種類型的核苷酸，但藉由在各類型核苷酸上所存在的不同光學標記而可區分。因此，該等方法可使用一種單一步驟辨識序列中的一特定鹼基。尤其，在固定化複合物中添加各帶有一種可區分的標記之所有四種核苷酸。然後審查該複合物，以辨識納入何種類型的鹼基，及依此方式辨識模板序列中的下一個鹼基。

在一些情況下，該等方法一次僅監控一種鹼基的添加作用，及因此其等(及在一些情況下之單一核苷酸接觸方法)需要附加的控制，以避免在任一特定步驟中添加多個鹼基及因此被偵測系統漏失。典型地，該等方法在該核苷酸上使用終止子基，以在一旦納入一核苷酸後阻止引子的進一步延長作用。典型地可移除該等終止子基，以在一個經偵測的納入事件後容許受控的再延長作用。同樣地，為避免與先前所納入的核苷酸之標記混淆，典型地將該等核苷酸上的標記基設計為可移除的，或在其他情況下可去活化的。

在另一種方法中，即時監控單分子引子延長反應，以辨識在延長作用產物中之核苷酸持續納入作用，以闡明標的模板序列。在單分子即時(或SMRT^TM)定序作用中，當發生時，即監控在一種聚合酶媒介式模板依賴型引子延長反應中之核苷酸納入過程。就較佳方面而言，在一光侷限區域內諸如一種零模式波導或鄰近一透明基板、光學波導等的表面，提供典型為固定化之模板/聚合酶引子複合物(如見第6,917,726號與第7,170,050號美國專利及第2007-0134128號美國專利申請公開案，全部揭露內容就所有目的在此完整地併入本案以為參考資料)。以適用於帶螢光標記核苷酸之一種激發輻射，照明該光侷限區域。因為該複合物係位於一光侷限區域或非常小的照明體積內，僅緊鄰複合物周圍的反應體積受到激發輻射。因此，如在一納入事件期間，與該複合物交互作用之該等帶螢光標記的核苷酸在照明體積內之存在時間，係足以辨識其等已被納入。該定序方法之圖式說明係示於第1圖。如第1A圖所示，在如零模式波導106之一光侷限的一觀測體積(如虛線104所示)內，提供一種聚合酶酵素、一模板核酸及一種引子序列之一固定化複合物102。當一適當的核苷酸類似物如核苷酸108被納入初生的核酸股時，其經照明之一段長時間，係對應於該帶標記核苷酸類似物在納入作用期間在觀測體積內的滯留時間，其產生與滯留作用相關聯之一訊號，如第1B圖中的A軌跡所示之訊號脈衝112。一旦被納入，則將連接至帶標記核苷酸類似物的聚磷酸鹽組份之標記釋放。當下一個適當的核苷酸類似物如核苷酸110與該複合物接觸時，亦將其納入，而導致第1B圖的T軌跡中之一對應訊號114。藉由監控將鹼基納入初生股之作用，如模板序列的基礎互補性所示，可獲得模板的一長段序列資訊。此外，為了獲得例如可為研究與診斷學中之基因定序的廣泛應用所欲之序列資訊量，較高處理量的系統係所欲的。

舉例而言，為了增強系統的定序處理量，典型地監控多個複合物，其中各複合物係定序不同的模板序列。在定序基因體或定序其他大型DNA組份之情況下，該等模板典型地將包含基因體DNA的重疊片段。藉由定序各片段，然後可自片段的重疊序列資料組合出一個相連序列。就較佳方面而言，在一基板上提供陣列式的各種不同複合物。可在光學上或結構上的侷限構造如零模式波導內提供該陣列式複合物，或其等可在一表面上形成圖案模式。任擇地，其等可隨機地配置於一表面上，但經歷標定的陣列式照明或偵測作用，藉此僅監控位於該表面的一陣列模式內之複合物。在此為了討論之目的，該二種構形均在此稱作陣列式複合物等之監控作用。

整體

先前地已使用數種不同機制，以達成離散式反應區域之多工分析及甚至同時多工分析。第2圖說明數種該等方法。例如，在一種簡單的實施中，離散式反應區域之一陣列，係以覆蓋大量的該等離散區域之一種寬的照明光束同時照明，即所謂的“泛光”照明。其係說明於第2A圖中，其中實線圓204係指配置於基板202上的反應區或其他區域，其等係所欲監控者，而虛線206說明照射區域的邊界。如所示，單照明區域係無區別地施用於大量或可能所有的離散式反應區域。

依一特定基板上的反應區域密度而定，該泛光照明可包括使用一種習用的雷射光束或在一些情況下可使用光束擴張光學元件，藉由以一種單一統合光束或點，照明較大量的反應區域，以提供所欲的多工。雖然在其上配置數個反應區域之一基板的廣泛範圍有效地提供照明，泛光照明可能具有所照明區域的照明強度不一致之問題。尤其，在一特定光束中心的照明強度傾向於較大，及在邊緣衰減。因此，不同的反應區域典型地依其等在照明點中的位置，而受到不同的照明。此外，因為對應於該點的整個基板範圍受到照明，其可能造成所施用輻射之無效率使用，如浪費光在照明非反應區域，及因此所施用的輻射比必需者更多。此外，該泛光照明可呈現過量照明的不利效應，諸如電力消耗過量、激發光被反射、基板以及該系統的其他光學組件的自發螢光、加熱作用等。

在其他方法中，如第2B圖所示，一照明光束掃描通過一基板，以照明基板上的多個反應位址或區域。尤其，如箭頭所示，一個相對小的照明點208反復地移動通過基板202的表面，以分別地照明各反應區域如區域204。典型地，該等掃描系統係採用習用的掃描系統諸如檢流計、旋轉鏡或旋轉稜鏡，以隨時間引導光束通過一基板表面。雖然該等掃描系統對於靜態系統特別有效，如除了反應非常緩慢的情況以外之尋求分析一反應的終點，其等並非特別適用於監控反應隨時間的進程。尤其，因為照明光束僅偶爾巡行各位置一段相當短的時間，其無法即時照明與監控在其中發生相當快速的反應之一反應區域。

在其他方法中，使用一標定的照明廓型，以擇優地同時照明多個反應位址。例如，如第2C圖所示，在一種標定的照明方式中，將一照明光束線性化，以提供可同時照明一基板上之數個離散式共線區域之一照明線(如見第US2007/003570號與第US2007/003804號國際專利申請案，全部揭露內容就所有目的在此完整地併入本案以為參考資料)。藉由使用多個光束，或在線性化之前或之後將單一光束分光，如藉由讓該光束通過一繞射光柵，可產生數個平行的照明線如照明線210，以照明一基板上之多列的共線反應區域。該標定照明作用藉由未照明介於照明線之間之基板空間而減少照明作用的浪費，及因而減少與先前所論及的過量照明相關聯之許多議題。然而，仍照明介於共線反應區域之間的空間，如在一特定列內，而產生浪費照明作用與雜訊增加之伴生議題。

在進一步的改良中，如第2D圖所示，標定照明廓型使用各照明一子集或一個單一離散式反應區域之陣列式照明點，如照明點212。藉由僅照明需要照明的空間，如位於該反應區域及/或附近，其進一步增強訊號雜訊比，及增加照明效率而優於線性照明廓型。可使用數種光學構形，以產生該等類型的標定照明廓型，包括如使用將個別的照明光束聚焦成為多個陣列式照明點之透鏡陣列、首先將一個單一光束分光成為一列的多個光束及然後將該等光束中之各者分光成為一正交定向列的附加光束之正交定向型繞射光柵、將一個單一光束轉換成為包括如一基板上之照明點的網格陣列之多種不同的標定照明廓型中之任一者之繞射光學元件(如見於2008年5月9日提出申請之第12/151,979號美國專利申請案及PCT/US2008/05953，其中各者就所有目的在此完整地併入本案以為參考資料)。

該系統選擇性地在光學元件串內附加包括共焦或空間濾波器，以進一步限制在該系統的焦平面之外如與反應區域無關聯者之反射光或所發出的螢光之影響。

第3圖說明該系統之一實例。如所示，系統300包括一反應陣列諸如一種零模式波導陣列302，在其上排有數個離散式反應區域之陣列。在零模式波導陣列之情況下，典型地在基板上提供列與行的陣列之大量零模式波導。在不同的ZMW內提供用於一特定分析之所欲探討的反應物。例如，就藉由合成作用之核酸定序的內涵而言，與ZMW一起提供包括一模板核酸序列、一互補引子序列、一核酸聚合酶酵素及引子延長作用所需之核苷酸或核苷酸類似物的一反應混合物之一定序複合物(如見第1圖)。可以超高密度組合ZMW陣列，提供自每平方公分1000個ZMW至每平方公分1,000,000個ZMW或更多。因此，在任一時間，分析在單一分析系統內或甚至在一個單基板上之自100、1000、3000、5000、10,000、20,000、50,000、100,000或1百萬、1千萬或更多個ZMW或其他反應區域中所發生的反應，可為適合需要的。

如所示，該系統包括用於激發反應區域中的螢光反應物之一激發輻射源，諸如雷射304。一光學元件串306將來自雷射304的激發輻射輸送至ZMW陣列或基板302。該光學元件串亦收集來自陣列上的不同ZMW之螢光訊號，及將該等訊號傳送至一偵測器，諸如EMCCD330。該光學元件串306包括一多工組件，諸如繞射光學元件(DOE)308(亦稱作全像光學元件或HOE)，其將一個單一激發光束轉換為大量的個別激發光束，該等個別激發光束將標定對應陣列上的ZMW302位置之照明點的一陣列。該多個光束係選擇讓激發光通過及反射來自陣列302的螢光之分色鏡316。在通過分色鏡316之前，照明光束可通過可能與一對聚焦透鏡如透鏡310與314配套之一共焦濾光鏡312，以將該等光束聚焦通過該共焦針孔。通過分色鏡316的激發光，然後經由物鏡318而以一標定模式聚焦在陣列302的平面上。

然後藉由物鏡318收集來自陣列302的螢光訊號，及傳送至分色鏡316，分色鏡316則將螢光訊號反射朝向偵測器330。來自陣列上的離散式ZMW之訊號然後通過一空間濾光鏡諸如共焦光罩322，以減少出自焦平面自發螢光或散射光之背景雜訊諸如光致發光，共焦光罩322典型地又與一對聚焦透鏡如透鏡320與324配套。該等訊號然後通過以差別方式引導光譜特性不同的光之一分散性光學元件諸如楔形稜鏡326，以容許基於偵測器上的入射位置而區別不同的螢光訊號。經差別方式引導的訊號成分然後朝向通過附加的聚焦光學元件，如聚焦透鏡328，及最後撞擊該EMCCD偵測器330。如所示，一特定訊號在偵測器上的入射位置係指示(1)該陣列中的發端ZMW，及(2)該訊號成分的光譜特性，其係用於辨識例如在一延長反應中所納入之帶螢光標記核苷酸類似物的類型。

已述及使用上述系統之同時標定照明一陣列中的數千或數萬個ZMW之作用。然而，隨著對於多工需求之增加，增加一陣列上的ZMW密度及提供該等陣列的標定照明作用之能力之困難度，亦隨著因較高的密集照明水平等而起之ZMW串擾(來自鄰近ZMW的訊號當自該陣列出射時彼此污染)、訊號雜訊比減少等議題而增加。

II.　多工方式

雖然上述的系統適用於提供有效的多工光學系統，若能藉由納入特定的系統改良而進一步增加該等系統的多工能力，將為適合需要的。

本發明提供用於監控基板上之數量較多的陣列式複合物之方法、系統及組件。舉例而言，於2008年5月9日提出申請之第12/151,979號美國專利申請案及PCT/US2008/05953(先前在此併入本案)述及分析大量的陣列式反應區域如核酸定序複合物之方法，其係使用引導標定照明點至離散式反應區域及收集來自離散式反應區域的光學訊號之多工光學元件。如所示，該等系統選擇性地亦包括共焦光罩，以增強來自該偵測作用的訊號雜訊比。本發明的系統係用於經由多種途徑而進一步增強全系統的多工。

因此，雖然本發明的系統可用於提供一基板上的10個、100個、1000個、5000個等的離散式反應區域之多工分析，在特佳方面本發明將用於提供超過5000個離散式反應區域、超過10,000個離散式反應區域、超過20,000個離散式反應區域、超過50,000個離散式反應區域及甚至超過100,000個離散式反應區域及至多1,000,000個或更多個離散式反應區域之多工分析。除了藉由本發明的系統可分析之反應區域的剪切數量之外，將理解在一些情況下，經由本發明所提供的各項優點，該等反應區域的配置密度可高於先前所用者。例如，可提供與觀測高密度的離散式反應區域而無過度的干擾或其他問題性議題。該密度例如可為每平方公分1000個、10,000個、100,000個、1,000,000個、10,000,000個或更多個反應區域。觀測體積的密度可增加至所用觀測光之繞射極限，就該等應用中所預期的一些波長而言，其可低至250奈米。在該種間隔，在一正方陣列中可顯現每平方公分至多16e9觀測體積，而在六方密集陣列中稍微更多。經由使用近場光學元件可超越該繞射極限，導致其限制僅由該侷限的實際尺寸所決定，其尺寸可小至50奈米。在一正方陣列中間隔100奈米，導致密度為每平方公分1e10。

此外，就所監控之該數量的區域而言，該多工分析係實質上同時。

“實質上同時”係指在1至5個(較佳1至2個)照相影格的時段內，分析所需數目的區域。就本發明的系統之目的而言，典型地自約每1毫秒至約每10毫秒捕捉一照相影格(或影格速率自約100Hz至約1000Hz)，藉此為歸於一實質上同時的分析之範圍內，該等多工區域之分析應在自約1毫秒至約10毫秒之時間範圍內發生。結果，提供所欲的多工分析之一系統，如在自1毫秒至約10毫秒的窗口內觀測多個位置至少各一次者，將稱為實質上同時，即使該分析係在該窗口內的二個不同時間點進行。

在一些情況下，可使用較慢的影格速率，其將增加二事件可發生的時間階段，及在此之際自照相機的觀點而言似乎仍為實質上同時。可使用例如10Hz至100Hz、10Hz至50Hz、10Hz至20Hz的影格速率，如約15Hz。將理解，發生在毫秒範圍如自1毫秒至約500毫秒、10毫秒至約100毫秒等之取樣速率，可視為實質上同時。

A.　增效型光學元件

在基板上的離散式反應區域之分析中實質增加多工之能力，面臨數項限制。舉例而言，在監控來自單分子反應的螢光訊號之系統中，集光光學元件典型地使用具有相對小的視野之高數值孔徑物鏡。因此，增加的多工典型地需要較密集的反應區域，以使用單一物鏡收集來自數量較多的該等區域之訊號。然而，一基板上之較密集的反應區域產生一系列之附加的解析度議題，例如包括區域之間的串擾等。

第4圖說明光學串擾。如所示，在一基板上提供基板402上的反應區域(如404、410及412)之一陣列，諸如零模式波導404。對於發生在該等區域中之以螢光方式監控的反應進行照明，及發出與該反應相關聯之螢光訊號。如來自相鄰反應區域410與412之實線箭頭406與虛線箭頭408分別所示，該訊號的全向發射廓型造成來自相鄰區域的訊號彼此干擾之可能性，尤其當該等區域在基板上變得更加密集時。該“串擾作用”限制將反應區域密集以供分析之能力。

依據本發明的特定方面，使用強化光學方式以增強訊號收集之效率。

該光學方式中之一者提供添加聚焦光學元件，以用於將反應區域之間的光學串擾降至最低，及在許多應用中亦容許使用具有較大視野的物鏡。藉由減少串擾的可能性，可增進將反應區域密集之能力。同時，藉由改採用視野較高的物鏡，可將配置該等區域的面積擴大。除了降低串擾之外，本發明的聚焦光學元件亦可藉由將光改向進入一偵測器，增加所偵測到的光量，其係在未改向的其他情況下該偵測器所無法偵測者。藉由將光改向，可使用例如所收集的光量與未改向情況相同但具有較低的數值孔徑之一偵測系統，以容許例如較大的視野。就本發明中所預期的方法之內涵而言，具有大的視野可為重要的，例如就容許一次同時觀測數萬個發光或發螢光區域而言。任擇地，藉由引導該光，可使用相同的數值孔徑而收集更多的光。如更詳細地敘述於後，本發明的聚焦光學元件藉由引導照明光進入一陣列諸如一種零模式波導陣列上的一反應區域中，亦可增加照射水平。

微鏡陣列

就一方面而言，本發明係提供定形微鏡的一陣列，其中各微鏡係與一光侷限相關聯，及特別是被納入包含該光侷限的同一基板之定形微鏡的一陣列。

第5A圖說明如本發明之一定形微鏡陣列的一實例。如所示，全基板502包括配置於其表面上之一反應區域陣列，諸如零模式波導504-514。圓錐形或拋物面鏡516-526係集成進入下方的透明基板528，及其構形係將入射光改向至陣列中的ZMW，或將來自陣列中的ZMW之射出光聚焦。尤其，該圓錐形或拋物面鏡典型地由一反射材料諸如一金屬層如鋁、銀、金、鉻等組成，及製入下方基板以提供該鏡表面。

如第5B圖所示，藉由一鏡諸如一拋物面或圓錐形鏡，將自ZMW內之反應所發出的螢光訊號530改向或聚焦，以增加該等訊號的收集效率。如在此所示，例如將進入該基板上的反應區域之全向發出的光改向，藉此使其更容易地被偵測到。在一些情況下，如在此所說明者，至少可將該光部份地準直。此外，就各反應區域或ZMW而言，該鏡構造減少或消除在基板本身內之ZMW之間的串擾。除了減少串擾之外，將理解因將所發出的光改向或聚焦而增強的收集效率，亦增加該系統的靈敏度。同樣地，該定形的光學元件亦用於將入射的照明作用如光532聚焦在反應區域諸如ZMW504-514上。

對於納入該等圓錐形鏡之裝置言，亦可採用任擇的構形。例如，一個零模式波導的核心區域可延伸進入下方的基板中。該實例係說明於第5C圖中，其中反應區域550延伸超過覆蓋層552及進入下方的基板554中，在一些情況下容許將鏡556所反射的訊號更有效地傳至與傳出反應區域550。在總構造內可附加地包括選擇性的組件諸如阻光區域或濾光鏡組件，包括例如光罩558，以進一步增強該鏡系統的光學性質。

雖然在此所述的鏡係稱作“圓錐形”或“拋物面”鏡，將瞭解該集成反射性聚焦光學元件組件之特徵在於其等在基板內提供一反射組件之能力，其藉由將自反應區域發出而通過基板的光改向而增強光的偵測作用，不計其確切的形狀為何。在一些情況下，至少將自反應區域發出的光部份地準直。本發明之定形鏡因而將來自基板上的一光侷限之光，改向至一偵測器或至一光學元件，該光學元件係將光自基板引至一偵測器之光學元件串的一部份。聚焦鏡可包括拋物面構造以外的形狀，諸如圓錐形鏡構形、分段式圓錐形鏡構形、截圓錐形鏡構形、部份拋物面鏡構形、梯式鏡構形、角錐形鏡構形等，前提在於該等構造將光改向，例如藉由部份準直作用而增強自反應區域發射的光或通過反應區域進入基板的光之偵測作用。在許多情況下，該等鏡將具有圓柱對稱。鏡的形狀可為一種擬柱體，例如一種角錐、楔形、稜鏡、反稜柱、鐘狀或其截頭體。當該鏡具有多個側面時，諸如當其包含一角錐或一角錐的截頭體時，該鏡可具有適宜的側面數量。例如，當該鏡包含一角錐時，該角錐可具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或更多個側面。

本發明的定形鏡通常為微鏡，意指該等鏡為小型的，通常具有數微米或數十微米的尺寸。在一些情況下，亦使用微反射器一詞指稱一微鏡。該等鏡所具有的截面尺寸可自約0.1微米至約100微米、約1微米至約50微米或約2微米至約20微米。雖然本發明的鏡之尺寸為數微米至數十微米，在一些情況下本發明的定形鏡可較大，例如自約100微米至約1毫米或更大。

此外，雖然依在基板本身內提供一反射材料諸如一金屬層而說明，將理解可同樣地採用其他反射構形而不使用一金屬層。例如，該等構造可由不同折射率的材料所組成，以提供所表現的功能與在本案他處所述的金屬層相同之一反射介面。例如，自具一折射率的一區域行進通過一介面而進入具一較低折射率的一區域之光，若該光的入射角超過一既定數值(臨界角)，通常將完全地內反射。依此方式，藉由適當地調整該形狀任一側面之材料的折射率，毋需使用一反射層，即可產生本發明的反射構造。

在一些情況下，本發明的定形反射構造包含圓錐形反射器。在理論模式與實驗上，均顯示圓錐形反射器型式中的效率顯著優於非反射器型基板。在一些情況下，圓錐形構造係有用的，因其等可容易地藉由多種方法形成。例如，可藉由控制光阻的幾何形狀及藉由微影條件，而控制壁的錐度。例如藉由控制光阻的聚焦/曝光條件以控制該光阻的拓撲，或藉由灰階微影法，可控制該光阻的幾何形狀。亦可藉由控制蝕刻條件，例如控制表面鈍化作用的量或藉由灰階蝕刻作用，而控制形狀。本發明的圓錐形鏡基板通常包含一種截圓錐構造。該圓錐形鏡基板的截圓錐區之壁可為直的，或可包括一些彎曲。第6圖說明三種圓錐形構造之實例。第6A圖顯示一圓錐形鏡構造，其中該鏡的構造係包含一個直筒圓錐形構造600之一截圓錐，其係配置於一反應區域或反應區下方的基板層中，諸如零模式波導630，以將進入或離開該反應區域的光改向。第6B圖顯示具有一個下圓錐區604與一個上圓錐區606之一種分段式圓錐形構造。在該構造上配置一個反應區域640。在該實施例中，下圓錐區604的側壁具有相對於基板法線之第一角度，及上圓錐區606的側壁具有相對於基板法線之第二角度，其中第二角度大於第一角度。在一些情況下，上部區的壁所具有之相對於法線的一角度將小於下部區。如第6C圖所示，該圓錐形構造可具有一個下截圓錐區608及其壁垂直於基板之一個上圓柱區610。在該構造上配置一個反應區域650。具有第6C圖的廓型之構造可適用於產生高密度的陣列。例如，具有一圓柱頂部與一圓錐形下部之一構造，其所具有的基本尺寸通常將小於具有相同側壁角度的單截圓錐構造。在一些情況下，若該構造的基本尺寸較小，在一特定區域內所置入的構造將更多。第6圖所示的反射構造係以自一底部透明層突出之方式顯示。該底部透明層可為一平面基板，諸如在其上表面上具有突出構造之一熔融矽石晶圓。第6圖之構造通常將具有與該構造的壁相鄰之一反射塗層或一反射區域，以增強光的內反射作用。例如可藉由以一反射層塗覆該突出構造，藉由以反射性材料填充突出構造之間的區域，或藉由在突出構造外使用一種折射率較低的介質以激勵內反射作用，而提供該定形基板的反射性表面。

雖然第6圖的圖解係指反應區域係位於圓錐形構造頂部的中央，在一些情況下，反應區域可能並非位於正中央。製造公差可能造成反應區域偏離中央位置。此外，在一些情況下，例如為領受較高的照明水平，或例如當照明或偵測光學元件係以偏離該特定反應區域的法線之一角度配置時，可生產偏離中央的反應區域。

可以如上述用於ZMW陣列之高密度，組合微鏡陣列。與反應區域配套的微鏡密度例如可為自每平方公分1000個ZMW至每平方公分1,000,000個ZMW或更高。在任一時間，使用此述的微鏡陣列，分析在單一分析系統內或甚至在一個單基板上之自100、1000、3000、5000、10,000、20,000、50,000、100,000個或1百萬個、1千萬個或更多個ZMW或其他反應區域發生之反應，可為適合需要的。

第7圖顯示用於本發明的微鏡之一圓錐形構造。如第7圖所示之截圓錐構造，構成在透明基板上延伸之一突出構造。該截圓錐可為一圓柱對稱，具有一個直徑為A之實質上圓形的頂面、一個直徑為C之實質上圓形的底部及半高直徑為D。該截圓錐的高度為B。該截圓錐的壁為實質上平直的，及相對於表面的法線具有一角度θ。在此所示之截圓錐構造的側壁為實質上平直的，但該等壁可為非平直及仍作用於將此述的光強度改向。在一些情況下，用於產生該圓錐形構造之方法，將產生自平直至例如具有彎曲廓型不等的壁。在其他情況下，納入非平直的壁，以增進收集效率。在許多情況下，用於產生該突出構造之方法，將造成具有突出、隆起之表面，或在偏離平直廓型的側壁上之其他缺陷。在一些情況下，對於增加一基板上的反應區域密度而言，具有一平直廓型係適合需要的。例如，一彎曲壁諸如一拋物面所具有的底部直徑可能大於一平直側面圓錐。藉由使用底部直徑較小的構造，在一些情況下可達成較高的密集密度。

具有第7圖所示廓型之本發明的例示性圓錐形構造，其頂部直徑A係介於約0.1微米與10微米之間，例如介於1微米與20微米之間，或介於2微米與10微米之間。在一些情況下，截圓錐的頂部直徑A係介於約1微米與約5微米之間。在一些情況下，該直徑係介於2微米與4微米之間。本發明的例示性圓錐形構造所具有的側壁角度θ係介於約2°與45°之間、介於約5°與35°之間、介於約10°與30°之間或介於約14°至約26°之間。所產生的圓錐形構造，係將例如位於圓錐形構造的頂部中央之反應區域所發出的光改向。例示性構造至少將反應區域所發出的光改向進入距該法線的角度約為22.5°之圓錐形構造。在本發明的例示性實施例中，圓錐形構造的高度B係介於約0.2微米與約100微米之間、介於約1微米與約10微米之間，或約2微米至約8微米或約3微米至約6微米。在一些情況下，控制截圓錐高度相對於底部直徑之比例(B/C)係適合需要的。在例示性實施例中，B:C的比例係介於約1:3與約3:1之間，係介於約1:2與約2:1之間、介於約1.5:1至約1:1.5之間或介於約1.2:1至約1:1.2之間。該等技藝從業人士將瞭解A、θ及B之選擇將決定底部寬度C。如上述，為了增加本發明的光學構造之密度，控制該等參數藉此底部寬度C係小至足以容許所增加的密度，可為適合需要的。底部直徑C可介於約0.2微米與約100微米之間、介於約1微米與約10微米之間，或約2微米至約8微米或約3微米至約6微米。

本發明之一例示性圓錐形構造的頂部直徑A係介於約1微米至約5微米之間，高度B係介於約2微米至約8微米之間，及側壁角度係介於約10°至約30°之間。本發明的例示性圓錐形構造將具有配置於圓錐頂部部份之一反應區域，通常約位於頂部中央部份。該反應區域例如可為一種零模式波導，其包含配置通過該圓錐形構造頂面上的反射性覆蓋層之一孔徑。該孔徑所具有的直徑可為約30奈米至約300奈米。

第8(A)與8(B)圖顯示本發明之定形鏡的二種例示性構造。例如藉由發展用於包括半導體製程的微製造及用於產生MEMS裝置諸如該等納入光微影法與蝕刻作用者之方法，可產生該等構造。第8(A)圖顯示一透明基板800，在其所具有的一頂面上配置在其等的側壁上具反射塗層830的突出構造850之一陣列。突出構造850係定形微鏡，其將進入反應區域840的照明光改向及/或將該反應所發出的光改向進入配置於透明基板800的底面880下方之偵測光學元件。反應區域840係零模式波導，其例如由延伸通過配置於微鏡構造頂部上的一覆蓋層820之奈米級孔徑所組成。在一些情況下，反應區域840將延伸進入透明基板中。在微鏡的外側壁上配置一反射層830，以增強該等壁的反射性。在一些情況下，覆蓋820與反射層830將為相同的材料，如鋁。透明表面上方的區域810可含有包含試樣及/或反應物之一液態介質，其可擴散進出該反應區域。在一些情況下，陣列中的所有反應區域將與區域810中的相同溶液接觸。在一些情況下，將在反應區域之間包括障壁，以降低或阻止反應區域之間的擴散作用。

第8(B)圖顯示本發明的定形鏡之一任擇的構造。第8(B)圖說明雖然透明基板802包含突出構造852，全基板卻因平坦化層862而為實質上平面之情況。在例如以通過一覆蓋層822之一孔徑的形式之突出構造852上，配置一反應區域842。可在突出構造852上配置一反射層832，以增進反射性。在一些情況下，未使用反射層832，例如當平坦化層862包含一種反射性材料之情況。平坦化層可包含一種硬質材料諸如一種無機材料，例如一整旋塗式玻璃或氮化矽。平坦化層可包含一種金屬材料諸如鋁。平坦化層可為一軟質材料諸如一種聚合材料，如一種有機聚合物諸如聚醯亞胺或一種矽氧烷式聚合物。例如可經由位於基板812上方的區域中之一液態介質，將試樣與試劑引入反應區域842。

透明基板可包含無機材料、有機材料或同時具有有機與無機材料之複合材料。透明材料典型地係一種剛性材料，其在觀測期間將反應區域維持於固定位置。較佳的材料為矽石式材料諸如熔融矽石，例如當使用半導體或MEMS製程方法以產生微鏡陣列時。透明基板亦可包含無機氧化物材料及玻璃。透明基板材料可為一種非均質材料，諸如一種具有多層的材料。在一些情況下，例如，透明基板可包含一介質堆疊。亦可使用透明的聚合材料。典型所欲者係展現低水平的自發螢光之透明材料。適宜的透明聚合物例如包含甲基丙烯酸酯聚合物，諸如PMMA、聚碳酸酯、環烯烴聚合物、苯乙烯聚合物、含氟聚合物、聚酯、聚醚酮、聚醚碸、聚醯亞胺或或其混合物。

在透明層中的突出構造外側之反射層可包含一種金屬材料，諸如鋁、銅、金、銀、鉻或或其混合物。該反射層亦可包含一種反射性有機聚合物，諸如包含分散於聚合材料中的反射性顆粒之一種複合材料。

覆蓋層係一種不透明或反射性材料。覆蓋層可為一金屬諸如鋁、銅、金、銀、鉻、鈦或或其混合物。在一些實施例中，反射層與覆蓋層包含相同的材料。

本發明的微鏡可增進對於來自基板上的反應區域之光的集光效率，使其優於在無鏡構造情況下所獲得的集光效率。一光學系統的集光效率典型地受到集光系統的數值孔徑影響。本發明的微鏡可增進藉由具一特定數值孔徑如0.5的數值孔徑的一偵測系統所收集之光量，使其比無微鏡情況下所收集之光量多約10%、20%、30%、40%、50%、75%、90%、2倍、3倍、5倍、10倍或更多。偵測系統的數值孔徑例如可為自0.1至0.9。在一些情況下，數值孔徑係介於約0.2與0.5之間。

微鏡構造亦可增加反應區域來自一照明源的照明水平。例如，可增加照明水平，使其比無微鏡情況下之照明水平高20%、30%、40%、50%、75%、90%、2倍、3倍、5倍、10倍或更多。

就一方面而言，本發明係產生鏡構造，藉此照明光進行建設性干擾及藉此增加反應區域中的光強度。光可進行干擾，其係二或多種光波加成或疊合而產生一種新的波模式。例如彼此相關或相參的波可發生干擾，例如因為其等來自相同來源或因為其等具有相同或近乎相同的頻率。例如，就本發明的鏡構造而言，可將入射光自該構造的側壁改向，藉此自側壁的不同部份改向之光在鏡體積內交互作用，而造成建設性或破壞性干擾。因經改向的光來自相同來源，光之經改向的各部份將傾向於具有實質上相同的頻率。在一既定區域中的光進行建設性抑或破壞性干擾，係依該光是否處於同相(建設性)或異相(破壞性)而定。藉由控制微鏡構造的幾何形狀與照明光的性質，可控制建設性或破壞性干擾之區域。

藉由輸入鏡構造與照明光參數，可使用電磁模型化工具諸如有限時域差分法(FDTD)或有限元素法(FEM)，測定建設性干擾之地區。吾等已測定就其中頂部直徑與光束直徑係在直徑方面類似之一圓錐構造而言，可將一局部區域諸如反應區域中的場強度，增加為無建設性干擾情況下之10倍。在一些情況下，具高強度的局部地區之尺寸可為約0.25至約1個波長。就增進照明作用而言，使一光束直徑與微鏡尺寸相同可為有利的。在一些情況下，鏡構造具有一頂面，例如具有一平面頂面之一截圓錐，及該頂面具有一直徑。在該等情況下，該等系統之頂面直徑相對於入射光的光束直徑之比例，係約1:5至約5:1、約1:3至約1:3、約1:2至約2:1或約1:1.5至約1.5:1。

第9圖顯示以經準直的光照明之一微鏡構造之圖解。該圖中之微鏡構造內的不同色調，係代表不同的光強度。該圖顯示鄰近微鏡頂部之數個高強度區域，其中一高強度區域係發生在位於鏡構造的頂部中央之反應區域。藉由使建設性干擾發生在反應區域之方式建構該微鏡構造，可增加反應區域中的光強度，使其高於在微鏡不存在之情況下所得者。可使用建設性干擾以增加反應區域的光強度，使其比無微鏡構造情況下之相同照明光的強度高約30%、40%、50%、75%、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍或超過30倍。

微鏡陣列之製造

可藉由多種方法製造本發明的微鏡陣列。就該陣列的製造方面而言，係在一透明基板上製造諸如突出構造的構造之一陣列。可藉由模製、衝印、壓紋、加工、蝕刻或其他適宜方法，製造該構造陣列。

製造本發明的微鏡陣列之一種較佳方式，係涉及使用微製造方法諸如半導體或MEMS製程方法，其等已高度發展用於製造例如積體電路。類似方法已用於產生供多種應用包括噴墨印表機、加速計、壓力轉換器及顯示器(諸如數位微鏡顯示器(DMD))之MEMS(微機電系統)。微製造方法可施用於大型基板諸如晶圓，其等後續可切成多種裝置，以容許一次製造多種裝置。就一方面而言，本發明係使用該等方法，以製造一透明基板諸如一種玻璃如熔融矽石中之一微鏡陣列。本發明的方法採用光阻方法，諸如光阻，以界定透明基板或其他層上的結構元件。使用蝕刻方法，以產生包括反應區域與微鏡構造之三維構造。使用澱積方法，以在基板上添加層。亦使用其他的半導體製程諸如灰化、拋光、放行及剝落，以產生如更詳細地敘述於後之本發明的微鏡構造。

透明基板可為任一適宜的剛性透明材料。該透明材料可包含例如一種無機氧化物材料，諸如矽石。較佳的材料為熔融矽石。

就一方面而言，本發明係用於製造基板之一種方法，該基板包含與藉由一種方法所納入的微鏡構造配套之反應區域陣列，該方法包括下列步驟：a)提供具有一頂面之一透明基板；b)在透明基板製作圖案與蝕刻，以形成具有頂部與側面的突出構造之一陣列；c)澱積一覆蓋材料，藉此該突出構造的頂部包含一覆蓋；d)形成通過該覆蓋之一孔徑陣列，藉此各突出構造的頂部包含一孔徑；及e)澱積一反射性澱積材料，藉此各突出構造的側面包含一反射層；藉此該突出構造陣列包含一微鏡陣列，在各突出構造頂部之孔徑包含一種零模式波導。該方法涉及反應區域與微鏡構造二者之製造。更詳述於此之一組方法首先涉及製造反應區域，例如以一孔徑陣列之形式，然後製造微鏡構造。另一組方法首先涉及在透明基板上製造微鏡構造，然後製造反應區域。

為了製造本發明的陣列，將用於不同尺寸需求的不同形體之不同方法組合，可能為有用的。例如，本發明的方法可使用一種用於製造反應區域之193奈米微影製程，及用於製造微鏡構造之I-線微影法。此並非典型的生產方法，因其需要在製程中間將基板自一生產設施送至另一生產設施。

第10圖至第18圖說明用於製造反應區域陣列之本發明的例示性方法，各反應區域係與一透明基板內的一微鏡光學元件配套。該等例示性方法並非提供構成本發明的方法之窮舉清單。該等方法各涉及不同組的步驟。在一些情況下，可將一方法的步驟組與另一方法的步驟組組合，以製造本發明的基板。例如，一方法中之用於製造微鏡構造的步驟，可與用於製造孔徑的步驟組合。此外，所提供之說明可能未舉出將被納入的所有步驟。例如，在許多情況下，在此未述及之灰化、淨化、移除光阻、沖洗及乾燥步驟，在許多情況下將納入本發明的方法中。

雖然所述方法中的步驟顯示，當適宜時特定層係直接位於其他層之上，本發明的方法包括在所述層之間納入中間層，但未明顯地在此舉出。例如，就多種光阻方法而言，例如在光阻與光阻下方的層之間包括一保護層或一抗反射塗層諸如BARC。應瞭解可在所述方法內納入該等層。除非特別說明，當適宜時可變更此述方法的步驟順序。

在一些情況下，該等方法提供蝕刻數層之蝕刻步驟，例如同時穿過一金屬覆蓋層與透明基板，或同時穿過一保護層、一金屬覆蓋層及透明基板三者。雖然該等方法通常顯示同時蝕刻該等層，在一些情況下，在各層進行個別的微影與蝕刻步驟。例如當蝕刻穿過一金屬層與透明基板時，在一些情況下，所欲者係首先澱積一光阻及在第一光阻作出圖案以蝕刻該金屬層，及澱積與在第二光阻作出圖案以蝕刻該透明基板。在一些情況下，以提供例如分段式圓錐形構造之一方式，可進行多個蝕刻步驟。例如，第一微影與蝕刻方法可蝕刻該金屬層，及以垂直於該表面方式直接向下延伸進入該透明基板，以形成一圓柱構造；及第二微影與蝕刻方法以相對於表面法線的一角度產生側壁，而形成一下方圓錐構造。依此方式，藉由使用多個蝕刻步驟，可製造諸如第6C圖所示的鏡構造。

第10圖說明種半導體製造製程方法，其說明該微鏡光學元件與一種零模式波導陣列之製造，其中首先製造微鏡元件，及在後續步驟中製造ZMW。如步驟I所示，首先以一光阻層1002塗覆一透明基板層1000。該光阻然後在步驟II中曝光與顯影，以提供鏡陣列的所欲圖案1004。在步驟III中，例如使用一種乾式蝕刻轉移方法，將其轉移至下方的基板，以產生鏡陣列之一負凸紋1006。在此述的方法中，製造具有拋物面構造之鏡的一陣列。在一些情況下，在轉移步驟後提供一平滑化步驟可為適合需要的，以減緩來自較粗糙的蝕刻表面之潛在的光學像差。該等平滑化步驟可包括例如平緩蝕刻步驟，以提供表面的平滑化，例如較低壓電漿蝕刻及/或在所轉移的表面上澱積平滑層材料。該等平滑層的實例包括例如折射率匹配型材料，諸如SiO_x或SiO₂層，其等可使用習用的保角澱積方法，諸如低壓化學蒸氣澱積作用(LPCVD)製程、電漿強化式CVD製程(PECVD)等，而澱積在該表面上。

在轉移步驟III之後，則在步驟IV中在作出圖案的基板上澱積一反射性材料層1008。在特佳方面，該反射性材料係一金屬塗層，諸如鋁或鉻，其經由金屬化製程如蒸發作用或濺鍍作用而澱積在作出圖案的表面上，以界定鏡陣列的反射表面。在一些情況下，使用一種保角澱積方法如蒸發作用，而完成澱積作用或金屬化作用。

在金屬化步驟之後，在步驟V中，在反射層1008上澱積一填充層或平坦化層1010。該步驟可使用多種填充材料，包括附加的金屬層(或連續金屬層)、無機材料諸如矽、二氧化矽、聚合材料、半導體材料等。在特佳方面，澱積一矽石式層作為填充層，及較佳該層包含二氧化矽或其他玻璃類材料。可經由數種習用方法，包括使用旋塗式玻璃材料諸如倍半矽氧烷，或經由基板上的矽填充層之蒸氣澱積作用與後續氧化作用，而完成玻璃填充層之製造。

然後在步驟VI中，如經由表面研磨、拋光或蝕刻或其等之組合而移除上表面，以暴露位於拋物面鏡的頂部部份中之一開口1012。然後在步驟VII中，在具有孔徑諸如配置通過其及與各拋物面鏡構造的開口進行光通訊之ZMW核心1016之上表面上，澱積一金屬覆蓋層1014，之以界定具集成拋物面鏡之ZMW陣列。

第11圖顯示以一透明基板製造本發明的集成反應區域與微鏡之另一例示性方法。在步驟(I)中，在其頂面配置一覆蓋層1110之一透明基板1100上，澱積一光阻1120如一光阻。在該光阻製作圖案與顯影，以製造形體1125之一陣列。在步驟(II)中，蝕刻該覆蓋層1110，以製造一反應區域陣列1140諸如穿過該覆蓋的孔徑。亦可藉由諸如此述之其他方法製造反應區域1140之陣列，諸如使用犧牲柱或藉由e-光束蝕刻該覆蓋層。在步驟(III)中，在基板上澱積一保護層1150。在步驟(IV)中，澱積用以界定鏡構造1160的形體之一光阻，及製作圖案。在步驟(V)中，使用單一或多個蝕刻步驟，以產生在此示為圓錐形之微鏡構造。然後將光阻移除，以暴露出保護層。在步驟(VI)中，例如藉由濺鍍作用或蒸發一金屬1170而澱積反射層。在步驟(VII)中，澱積用以界定鏡構造1180的頂部之一光阻及製作圖案。在步驟(VIII)中，蝕刻未被光阻覆蓋的金屬部份，以暴露出其下的保護層。然後移除該保護層，以開啟孔徑。所產生的陣列具有由穿過該覆蓋的孔徑層所組成之一反應區域，該孔徑層各配置於一鏡構造頂部。

本發明之一種任擇的例示性方法係示於第12圖。步驟(I)與(II)使用光阻1220，在透明基板1200頂部的覆蓋層1210中製造孔徑1240的一陣列。亦可藉由諸如此述之其他方法製造反應區域1240之陣列，諸如使用犧牲柱或藉由e-光束蝕刻該覆蓋層。在步驟(III)中，澱積用以界定微鏡構造1260之一光阻及製作圖案。在步驟(IV)中，控制光阻的幾何形狀及蝕刻條件，以製造具有微鏡構造的梯形側壁之一形體，該微鏡構造在此示為具有實質上平直側壁之一圓錐形構造。在步驟(V)中澱積反射層，如以一金屬層1270之形式。在步驟(VI)中，澱積一光阻1280及製作圖案，以暴露出在微鏡頂部構造上之光阻區域上方的區域。在步驟(VII)中，蝕刻所暴露出之金屬，然後移除該光阻以暴露出孔徑，因此產生各與微鏡配套的反應區域之一陣列。

第13圖顯示本發明的另一例示性方法。首先，步驟(I)與(II)使用光阻1320，在透明基板1300頂部的覆蓋層1310中製造孔徑1340的一陣列。亦可藉由諸如此述之其他方法製造反應區域1340之陣列，諸如使用犧牲柱或藉由e-光束蝕刻該覆蓋層。然後，在步驟(III)中澱積一保護層1350。在步驟(IV)中，澱積用以界定該微鏡構造1360之一光阻及製作圖案。在步驟(V)中，使用一蝕刻方法以製造具有梯形側壁的微鏡構造，及移除該防蝕與保護層。在步驟(VI)中，藉由光阻的澱積、製作圖案及移除，在微鏡構造頂部產生光阻柱狀物1380，及在步驟(VII)中澱積金屬1370，以在微鏡上形成一反射層。在步驟(VII)中，移除該光阻，移除光阻柱狀物及已澱積在其等頂部上的金屬，藉此產生各與微鏡配套的反應區域之一陣列。

在顯示於第14圖之另一例示性方法中，步驟(I)與(II)使用光阻1420，在透明基板1400頂部的覆蓋層1410中製造孔徑1440的一陣列。然後，在步驟(III)中，澱積一犧牲層1450。較佳的犧牲層包含鍺或矽。在步驟(IV)中，澱積用以界定該微鏡構造1460之一光阻及製作圖案。在步驟(V)中，使用一蝕刻方法以製造具有梯形側壁的微鏡構造，及使用拉開方法以拉開微鏡頂部上之犧牲層的邊緣。在步驟(VI)中，澱積金屬1470作為微鏡的反射層。濺鍍作用可為適用於該金屬澱積步驟之一方法，因其可產生有效的側壁覆蓋作用，而不覆蓋犧牲層的側壁。在步驟(VII)中，釋放該犧牲層，亦移除犧牲層頂部上之光阻與金屬層。在釋放犧牲層方面使用一種濕式釋放方法可為有利的，因藉由容許釋放物質擴散通過進出孔，在一些情況產生有助於有效移除犧牲層頂部上的光阻與金屬層之氣泡。在一些情況下，使用音波處理以及濕式釋放方法。該方法產生各與一透明基板上的微鏡配套之反應區域的一陣列。

第15圖顯示本發明之一任擇方法。在步驟(I)中，在透明基板上1500上澱積用以界定微鏡1510之一光阻及製作圖案。然後使用例如一種反應性離子蝕刻方法，在透明基板1500中製造微鏡構造。在步驟(III)中，在該微鏡構造上澱積一金屬反射層1520。在步驟(IV)中，澱積一平坦化層1530，諸如一旋塗式玻璃或PECVD氧化物。平坦化層的厚度例如可為8微米至10微米。平坦化層可為一種硬質材料諸如旋塗式玻璃，或可為一種軟質平坦化層。軟質平坦化層例如可為一種旋塗式UV熟化型有機聚合物，諸如桑默斯(Summers)J91或SK9。當平坦化層包含一種硬質材料時，該平坦化通常進行拋光，例如以步驟(V)中說明的化學機械拋光(CMP)進行。當平坦化層包含一種軟質材料諸如一種UV熟化型聚合物時，則可在UV熟化之後使用氧蝕刻作用，以蝕除旋塗式聚合物的頂部區域而達到微鏡頂部，其係類似於拋光作用。該拋光或氧蝕刻步驟暴露微鏡構造的頂部。在步驟(VI)中，在該表面上澱積一金屬覆蓋層1540。在步驟(VII)中，澱積用於界定孔徑1550之一光阻及製作圖案。在步驟VIII中，蝕刻該覆蓋層以形成反應區域1560，及移除光阻，以產生各與一透明基板上的微鏡配套之反應區域的一陣列。

第16圖顯示本發明之又另一任擇方法。在步驟(I)中，在透明基板1600上澱積用以界定微鏡1610之一光阻及製作圖案。然後使用例如一種反應性離子蝕刻方法，在透明基板1600中製造微鏡構造。在步驟(III)中，在該微鏡構造上澱積一金屬反射層1620。在步驟(IV)中，澱積一軟質平坦化層1630諸如一種聚合層。軟質平坦化層例如可為一種旋塗式UV熟化型有機聚合物，諸如桑默斯(Summers)J91或SK9。在步驟(V)中，澱積用於界定反應區域1640之光阻及製作圖案。在步驟(VI)中，進行深蝕刻，其蝕穿軟質平坦化層1630與金屬層1620，以形成反應區域1660。在步驟(VII)中，移除光阻與軟質平坦化層，藉此產生各與一透明基板上的微鏡配套之反應區域1660的一陣列。

第17圖與第18圖顯示本發明的任擇方法，其使用自澱積在一透明基板諸如熔融矽石上的一層所形成之小型柱狀物(奈米柱)。該奈米柱係形成在表面上及稍後移除，以產生本發明的反應區域。該奈米柱可自一層之任一適宜材料形成。用於形成奈米柱的較佳材料為多晶矽(poly-Si)或多晶鍺(poly-Ge)。例如可藉由非晶矽之低壓化學蒸氣澱積作用(LPCVD)、電漿強化型化學蒸氣澱積作用(PECVD)或固相結晶作用(SPC)，在透明基板上澱積多晶矽。可在此述的其他方法諸如上述該等方法中，納入使用奈米柱諸如多晶矽奈米柱，以製造反應區域。雖然述及用於多晶矽所製成的奈米柱之一些方法，應瞭解該等方法可使用其他適宜材料所製成的奈米柱。

就第17圖所示之方法而言，在步驟(I)中，在一透明基板的頂部上產生多晶矽奈米柱的一陣列，例如藉由在該透明基板上澱積一多晶矽層，澱積光阻及在該光阻製作圖案以界定奈米柱，及蝕除不需要的多晶矽區域，以產生該奈米柱。在步驟(II)中，澱積用於形成微鏡構造之一光阻及製作圖案。在步驟(III)中，進行透明基板之蝕刻作用，以產生具有梯形側壁的微鏡構造。在步驟(IV)中，澱積厚的金屬，藉此掩埋奈米柱及填充微鏡構造之間的區域。在步驟(V)中，例如藉由CMP將金屬層平面化，藉此暴露出奈米柱的頂部。然後在步驟(VI)中移除暴露出的奈米柱，以產生反應區域的一陣列。在該實施例中，金屬係作用為覆蓋層及微鏡構造的壁上之反射表面。在一些情況下，厚的金屬層可適用於熱管理，因所產生的金屬層可具有相對高的熱傳送係數。

第18圖顯示使用奈米柱以產生反應區域陣列之一任擇方法。在步驟(I)中，在一透明基板的頂部上產生多晶矽奈米柱的一陣列，例如藉由在該透明基板上澱積一多晶矽層，澱積光阻及在該光阻製作圖案以界定奈米柱，及蝕除不需要的多晶矽區域，以產生該奈米柱。在步驟(II)中，澱積用於形成微鏡構造之一光阻及製作圖案。在步驟(III)中，進行透明基板的蝕刻作用，例如反應性離子蝕刻作用，以產生微鏡構造。在步驟(IV)中，澱積金屬層，藉此在微鏡頂部構造上形成一金屬覆蓋層，及在微鏡構造的側面上形成一反射層。在步驟(V)中，澱積一平坦化層諸如旋塗式玻璃，以填充微鏡構造之間的區域。在步驟(VI)中，進行一平坦化或拋光步驟，以將微鏡頂部構造上的平坦化層與金屬層平面化，及暴露出奈米柱構造。在步驟(VII)中，移除奈米柱構造，以產生各與一微鏡構造配套的孔徑或反應區域之陣列。

第19圖顯示使用一犧牲層形成本發明的一反應區域諸如一奈米級孔徑之一種方法。第19圖所示之方法可被納入或與此述的任一適宜方法組合，包括上述第10至18圖的該等方法中之任一者，以形成與本發明的微鏡配套之反應區域陣列。在步驟(I)中，在透明基板1900上塗覆一犧牲材料1910，及在犧牲材料1910上塗覆一硬質光罩層1920。犧牲材料例如可為多晶矽或多晶鍺。硬膜層材料例如可為一種氧化物或氮化物，諸如矽氧化物或氮化矽。在後續蝕刻步驟期間，硬膜層材料應具有對於犧牲材料之可接受的選擇性。在步驟(II)中，使用微影法蝕刻硬質光罩。在步驟(III)與步驟(IV)中，蝕刻該犧牲層。使用如步驟(IV)中所示之一種控制式過度蝕刻作用進行蝕刻，以產生一特定的基蝕及形成一犧牲柱。可進行基蝕，藉此硬膜層光罩的直徑或其他表面尺寸(W₁)係犧牲層直徑(Wp)之1.1至3倍。在一些情況下，W₁/Wp係介於約1.5至約2.5之間。在一些情況下，W₁/Wp係介於約1.6至約2.2之間。基蝕尺寸例如可介於約10奈米與約300奈米之間、介於約50奈米與約200奈米之間或介於約70奈米與約150奈米之間。然後在該表面上澱積金屬覆蓋1930。如藉由濺鍍作用之一方式進行覆蓋澱積作用，藉此該金屬係澱積在硬質光罩延伸超過犧牲層之區域下方的透明區域上。在步驟(VI)中，例如以優先溶解犧牲材料之一作用劑移除犧牲柱，以暴露出反應區域1940。當犧牲材料為鍺及金屬覆蓋為鋁時，可使用一種含水的氧化劑，其將溶解鍺而未顯著地移除鋁。

可在單一步驟或多個步驟中，進行蝕刻透明基板以形成微鏡構造之作用。在一些情況下，可使用一系列的光微影與蝕刻步驟，以形成鏡構造。雖然使用多重蝕刻步驟將增加該方法之步驟，在一些情況下，可使用該等步驟系列，以提供對於微鏡構造的更多控制。在一些情況下，可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30或更多個步驟。第20圖顯示使用多個微影與蝕刻步驟之一例示性方法。對於第20圖所描述之方法而言，以光阻塗覆基板2000、製作圖案及蝕刻9次。蝕刻第一層，例如，以產生具最底層直徑之一圓柱構造。然後進行後續的各光阻層之圖案製作，以具有直徑略小於前一層之圓形。該多重步驟方法之結果係構造2010之一陣列，該構造廓型係由抗蝕劑所界定。在一些情況下，該方式將導致具有由層2010所界定的一系列階地2020之一構造。若為所欲，可平滑化該等構造的壁，例如藉由濕式或乾式蝕刻，以使得階地構造部份地或完全地平順。該構造可經反射方式塗覆，及可在藉由多重蝕刻步驟形成微鏡構造之前或之後，如此述製造配套的反應區域。第20圖所述的構造2010係以具有相對平直側壁(具階地)之形式顯示，但可使用多重蝕刻步驟方法，以製造具有包括彎曲壁、分段式圓錐形構造、拋物面構造等的任一任意形狀之構造。該多重蝕刻步驟可納入等向、非等向或灰階蝕刻步驟之任一組合。雖然所述方法產生一圓柱對稱構造，將理解亦可使用該多重步驟方法，以產生具有並非圓柱對稱的其他對稱性之構造。

在一些情況下，本發明的方法使用抗蝕劑，以使用微影法界定與產生構造。該等抗蝕劑例如可為光阻或e-光束抗蝕劑。該等光阻可使用紫外線、深紫外線、G-線、H-線、I-線或其他適宜的波長或波長組顯影。所用的光阻類型，及因此該方法所用之儀器配置類型，將依所產生的形體尺寸而定。在此述的許多方法中，將使用解析度較高的抗蝕劑與設備以製造對應於反應體積之孔徑，其中該孔徑尺寸可為10奈米至500奈米，及使用解析度較低的光阻與相關儀器配置以產生微鏡，其可具有1微米至20微米的形體尺寸。技藝中已知多種抗蝕劑，及多者可自諸如羅門哈斯希普勵(Rohm and Haas and Shipley)公司以商品取得。本發明的方法中所用之光阻可為負型或正型光阻。當述及使用一負型光阻之一方法時，應瞭解當可行時亦可使用一適宜的正型光阻，及反之亦然。當適當時，亦可使用化學增幅作用，以增加光阻的靈敏度。依適當及如技藝中所教導者，可進行光阻之移除及基板之淨化、沖洗、灰化與乾燥。

在一些情況下，用於反應區域(如ZMW)之光微影工具，係使用可產生形體尺寸約10奈米至約100奈米的構造之光微影曝光工具。該系統例如包括AMSL XT1250曝光工具。

在本發明的一些方面使用蝕刻方法，以在透明基板中或在其他層中產生三維形體，以構成例如光學元件諸如微鏡或透鏡，或反應體積諸如奈米級孔徑。所用的蝕刻方法將依所用的材料類型、形體尺寸及光阻系統而定。在一些情況下，使用濕式蝕刻作用或濕式化學蝕刻作用。亦可使用電化學蝕刻作用。在一些實施例中，使用電漿蝕刻作用或反應性離子蝕刻(RIE)作用作為蝕刻方法。例如當所欲者係具有高的高寬比之構造時，亦可使用深反應性離子蝕刻作用(DRIE)。亦可使用例如以二氟化氙進行之乾式蒸氣相蝕刻作用。當適於產生本發明的構造時，可使用體型微加工作用或面型微加工作用。用於本發明的方法中之蝕刻作用，可為灰階蝕刻作用。控制光阻形成作用與蝕刻作用之條件，以產生具有所欲的幾何形狀之側壁諸如具有所欲的側壁角度，以作用為微鏡。

本發明的一些方法涉及反射層或覆蓋層之澱積作用。可藉由濕式方法包括自溶液旋塗在層上，或藉由氣相方法，而完成該等反射層的澱積作用。適宜的方法包括電鍍作用、濺鍍澱積作用、物理氣相澱積作用、蒸發作用、分子束磊晶法、原子層澱積作用及化學蒸氣澱積作用。可使用金屬作為反射層與覆蓋層。適宜的金屬包括金、鎳、鋁、鉻、鈦、鉑及銀。反射及/或覆蓋層可包含鋁，其可藉由濺鍍作用而澱積，例如使用可自CVC、諾發(Novellus)或MRC公司取得之一種商品化濺鍍工具。

當在本發明的方法期間澱積各層時，在一些情況下，該等層在移至方法中的下一步驟之前進行處理。例如，所澱積的層可進行退火、平面化、淨化、鈍化或輕度蝕刻，以增進其性質。

在本發明的一些方法中，澱積保護層或犧牲層。保護層可為聚合層，或可為無機層。適宜的保護層或犧牲層包括鍺(Ge)與非晶矽(a-Si)。保護層可用於產生此述的形體。可就其選擇性反應性，例如對於濕式化學蝕刻劑的選擇性反應性，選擇用於保護層或犧牲層之材料類型。例如，在一些情況下，在二氧化矽與鋁存在下，以加熱的過氧化氫選擇性地蝕刻鍺之能力，造成其被用於製造與奈米級孔徑配套之光學微鏡構造。

在一些方法中，使用一種拉開方法。拉開方法通常涉及自一層內之一形體邊緣蝕刻，以減少該形體的尺寸。可使用選擇性地與具有暴露邊緣的一層反應之一種濕式化學試劑，進行拉開作用。在一些情況下，係使用過氧化氫拉開一鍺層。

一些方法使用一拋光步驟，以自基板移除一表面區域。適宜的方法包括化學機械拋光作用或化學機械平坦化作用(CMP)。

本發明的一些方法納入一平坦化層。用於澱積平坦化層之方法將依所用的材料類型而定。平坦化層可為一種硬質材料，諸如一種無機材料例如氮化矽；其可為一金屬材料諸如鋁；或其可為一軟質材料，諸如一種聚合材料如一種有機或矽式聚合物。平坦化層可為玻璃，諸如一種二氧化矽材料。在一些情況下，平坦化層包含一種旋塗式玻璃諸如一種矽酸鹽、磷矽酸鹽或矽氧烷材料。適宜的旋塗式玻璃材料例如可自漢威(Honeyewell Corporation)公司取得。平坦化層可包含例如摻雜其他作用劑以控制其熔融性質之一種玻璃，諸如硼-磷-矽酸鹽玻璃(BPSG)。適宜的聚合性平坦化材料例如包括聚醯亞胺。

可將本發明的陣列納入分析系統中，以用於分析發生在該陣列的反應區域中之多個反應。此述的陣列典型地具有來自頂部的流體可到達之反應區域，及其為來自底部的光學分析可到達。因此通常將該陣列納入一容器中，及在該容器中引入所欲探討之一反應混合物。在一些情況下，個別的反應區域皆與一體積的流體接觸，該流體可具有例如可進行分析之多個核酸模板分子，及其可具有核苷酸、輔因子及用於進行待分析的反應之其他添加劑。

包含該陣列之容器可置於具有適當的光學組件、電腦控制及資料分析系統之一儀器內。包含該陣列之容器將被固定於該儀器內，藉此可控制反應條件諸如容器溫度與容器的大氣條件。容器的大氣條件可包括試樣上方的氣體組成，例如濕度及其他氣體物種諸如氧之水平。

集成透鏡陣列

如同集成拋物面鏡，可使用多種習用技術製造透鏡陣列，包括例如半導體製造方法、聚合材料的微模製等。例如，如同用於上述集成鏡之製造方法的部份，諸如反應性離子蝕刻作用之蝕刻方法可用於製造該等透鏡陣列。任擇地，如上所提及，可變的離子佈植方法可用於改變基板組件的折射率，而以一現有基板界定透鏡。如亦將理解者，亦可在基板中製造對於來自反應區域的光提供增強的集光作用之附加光學元件。例如，上述的離子佈植方法，可用於界定直接用於基板中之各個不同反應區域之繞射光柵。

在任擇方面，以將傳至及/或來自基板的螢光訊號至少部份準直或聚焦之透鏡陣列，置換(或在一些情況下擴增)該圓錐形或拋物面鏡。第21圖說明該種透鏡陣列。如所示，總裝置2100再度包括配置在一透明基板2116的第一表面2114上之一陣列的零模式波導，如ZMW2102-2112，及所欲探討的反應在其中進行。微米或奈米透鏡如透鏡2118-2128之一陣列，係配置於透明基板2116的對向(或後)表面2134上。如所示，該等透鏡具有同一尺寸，及其係以與ZMW陣列配合之一節距配置，藉此各ZMW具有其本身的配套透鏡。如同第5B圖的鏡陣列，將自ZMW發出的光改向，例如藉由與其配套的透鏡部份準直，及收集與分析該光以監控所欲探討的反應。雖然該等透鏡在消除基板內的串擾方面不如拋物面鏡構造有效，其等提供成本與容易製造之附加的效益，及在一些情況下可用於取代或輔助該等集成鏡。

如所示，透鏡陣列可集成進入下方的透明基板。任擇地，透鏡陣列可分別地製造及與下方的基板接合，以提供相同或類似的結果。雖然以配置在陣列的後表面之一種單層透鏡說明，將理解該透鏡陣列可由各定址基板上的不同區域之多個透鏡層所組成，或在基板上的一特定區域組合以提供一所欲的光學功能性。另外，雖然以自透明基板的後表面突出之透鏡說明，在一些情況下，透鏡可在透明基板內集成。例如，透鏡可在適當位置組裝進入下方之基板，藉由提供在該等位置的基板之折射率變化。如習用的透鏡製造，可使用微加工技術將個別透鏡嵌入基板中，以提供雙折射率。另外，藉由在基板的選擇部份產生一折射率梯度，基板的該等部份可作用為透鏡。可藉由數種方式，例如包括離子佈植方法，改變基板例如一種玻璃基板的折射率。除了透鏡或透鏡陣列之外，可同樣地將繞射光柵或其他光學功能性組裝進入下方的基板中。

因為藉由聚焦光學元件將來自基板的訊號至少部份準直，對於窄視野、高數值孔徑物鏡之需求減少，而可使用較廣視野、較低NA物鏡，其通常賦予全系統成本與可用性之優點，因可使用製造較不嚴密的物鏡。此外，用於製造較高倍物鏡的異類材料當暴露於激發輻射時，可引起物鏡本身的光致發光之增加。

此外，因為使用較低倍物鏡，在物鏡與基板之間所提供的間隔，可大於當使用高數值孔徑物鏡時所通常提供者。該附加的間隔容許在基板與集光物鏡之間插入附加光學組件，如適當的分色鏡。在至少一個例示性實施例中，在基板與物鏡之間提供之一分色鏡，容許將來自集光物鏡及其他集光光學元件組件的照明光分開。藉由進一步將激發路徑與偵測路徑分開，及尤其藉由提供並未看見激發光之一集光物鏡，可完全消除集光路徑中因激發照明通過該物鏡所引起之自發螢光或光致發光。該光學裝置之一圖解係示於第22A圖。如所示，全系統2200包括在其上配置數個反應區域2204之一基板2202。亦以集成進入該基板(如所示)或以個別組件之形式，包括例如用於將來自反應區域的光學訊號準直及/或將照明作用聚焦在反應區域上之聚焦光學元件(如上述的集成微鏡或透鏡)。該系統亦包括一激發光源2206或多個激發光源，以提供激發光至基板2202。激發光係經由位於集光物鏡2210與基板2202之間之分色鏡2208而導向基板。藉由將來自集光物鏡2210的激發光分開，可避免與集光物鏡2210的自發螢光相關聯之問題，自發螢光可為引起雜訊的重要原因之一。

在藉由分色鏡2208反射至基板2202之前，激發照明作用典型地亦將經歷附加的操作，諸如分光、波束整形、濾波等。例如，激發光可通過多工光學元件，如繞射光學元件(DOE)2212，以提供大量的個別的小射束；以及通過用於將小射束聚焦在基板的焦平面上之聚焦光學元件，如物鏡2214。

所發出的訊號憑藉其等來自激發光之不同光譜特性，通過分色鏡2208及藉由集光物鏡2210收集。如先前所示，當業已藉由聚焦光學元件將來自基板的訊號部份準直時，集光物鏡可具有顯著較低的倍數，如自用於無聚焦光學元件的一系統之視野3毫米以下的一種60X(數值孔徑為0.9)或更高倍物鏡，改為視野45毫米以上的一個4X(數值孔徑為0.28)或更低倍物鏡，而仍提供足以用於單分子分析之靈敏度。如同第2圖所示之系統，所收集的訊號然後例如可藉由通過稜鏡2216而進行光譜分離作用，及例如經由透鏡2218而進一步聚焦，或在偵測器2220進行偵測之前進行其他操作。

基板的分色鏡與照明路徑之一附加或任擇的圖解，係示於第22B圖。如所示，分色鏡層2208係夾在二個稜鏡2250與2252之間的介面。來自一照明源如雷射2206之激發輻射，係導向分色鏡2208。如所示，激發輻射首先被基板2202的後表面反射，如實線箭頭所示。激發光然後被分色鏡2208反射朝向基板及配置於其上的反應區域，如第22A圖中的反應區域2204。自反應區域所發射的螢光訊號然後可通過分色鏡2208進入物鏡2210，及進入光學元件串的剩餘部份及偵測系統，如第22A圖中所示。藉由如第22B圖中所示以垂直於光程之一定向提供總分色鏡元件，而非如第22A圖中所示之相對於該定向之傾斜，可減少引入該物鏡空間的光學像差量，而光學像差視情況可能降低在偵測平面或共焦平面之影像品質。

B.時間多工

就一方面而言，可經由一既定系統的時間多工，如在不同時間暴露不同的區域，以輔助或取代此述的其他增加多工之方案，而達成多工之增加。該系統可包括以相對低速在不同的區域組之間切換，其係類似於一種掃描方式，如在不同的時間在不同區域照明及/或偵測，其中對於不同區域而言，不同的時序較不具關鍵性。任擇地，及參照本發明的部份，分析之時間多工係以就一特定分析而言之充分頻率進行，在不同的區域實質上同時進行照明作用及/或偵測作用，藉此自照相影格擷取速率之方面而言，在不同區域的偵測作用似乎是同時，如先前所說明者。

本發明的該方面係以圖式方式說明於第23圖中。如所示，在一基板2300上提供第一照明模式，其係在第一時間點如時間t=0照明反應區域2310的第一子集2302。然後在時間t=1，將標定的照明模式切換至照明區域2310的一個不同子集2304。就本發明之目的而言，t=0與t=1在時間上係充分接近，如切換頻率係充分的，藉此該二照明模式係實質上同時的，如該辭彙在本案他處所述及者。雖然所顯示者係在t=0與t=1之間切換的二個子集模式，將理解如本發明之多種不同的照明模式可在所欲的時段內照明與切換，以提供不同區域之實質上同時的照明作用。例如，可以實質上同時之方式分別地照明區塊、縱列、部份或區域之隨機或任意的選擇或子集。

在至少一實施中，本發明的時間多工系統使用一種光學切換組件，其可選擇性與快速地在二或多個不同的光路徑之間切換，而照明基板上的不同區域。例如，在第一方面，一分析系統的照明路徑包括位於光程內之一種可切換式定向鏡，以將激發照明的方向切換至基板上的不同位置。在更複雜的系統中，可使用可快速地將標定照明作用導向一基板的不同部份之一種可程式鏡陣列，諸如一種數位光學處理器(DLP)。如可選擇性地切斷子集或甚至個別小射束的光程之其他動態切換組件，例如包括MEMS快門陣列、空間光調變器諸如LCDSLM。第24圖說明該種照明路徑之一實例。如所示，照明路徑2400包括一激發輻射源，諸如雷射2402。該雷射係導向通過適當的多工光學元件，諸如一或多個繞射光學元件、光柵等，如DOE2404，以產生所欲多工之一標定照明模式。該標定照明模式係導向一鏡2406，其選擇性地將部份的照明模式引導通過剩餘的光學元件串，諸如分色鏡2410與物鏡2408，以入射在基板2414上之該區域的一部份上。該鏡的快速切換造成在不同時間對於基板2414上的不同區域之高頻率照明作用，但較佳位於該偵測系統的影格擷取期間內。在特佳方面，該切換系統的運作頻率係超過該系統中的偵測器之入射速率，如照相機的影格擷取速率。尤其，在一個單一影格擷取事件中切換至少1次，及較佳至少2次，及在一些情況下例如更常切換至少3次、4次、5次或更多次，在照相機獲取一個單一影格的時間內，該切換過程應為該偵測系統基本上無法偵測與不可觀測的。舉例而言，對於影格速率如自100至1000Hz之一種高速照相機而言，偵測系統的切換頻率應至少為100Hz、200Hz、1000Hz、2000Hz或甚至更高。如將理解者，在一些情況下，個別的小射束動態調制作用可用於調整個別小射束或小射束子集之相對強度，以針對因光學系統中的其他像差如漸暈等所引起之跨基板的變化進行調整。

如將理解者，雖然述及以間歇方式傳送多工光學元件2404之多工光束的不同部份至基板2414，在一些情況下，切換組件可能單單地將多工光束改向至基板2414的不同部份，以進一步增強多工。例如，在一些情況下，多工光學元件2404可產生照明第一區域子集之一照明模式，如第23圖中之子集2302。切換功能然後引導相同模式的標定照明作用至一附加的區域子集，如第23圖中之區域2304。因此，可選擇性地設計該多工光學元件以提供相同功能，諸如照明每隔一縱列或排的反應區域。然後設計該切換光學元件諸如鏡2406之構形，以在一半的期間將光束改向照明居間縱列或排的反應區域。

C.搜尋活性

雖然本發明的許多方面係朝向增加經歷分析反應用的照明及/或偵測作用之反應區域的總數目，在一些情況下，可經由初始審查大量的反應區域，接著僅對於具活性如顯示所欲探討反應的跡象之該等區域的一子集進行後續照明及/或偵測作用，而達成一有效的多工。因此，在又一方面，增加的多工僅施用在一基板上之活性區域。實際上，該方法審查大量的反應區域，但僅繼續分析一小型子集。因此，雖然對於一高多工進行有效地初始審查，最終的分析係在可能甚至不需要一超高多工因子之顯著較小的反應區域子集上進行。所得的分析有效地增加多工，亦即相關區域的分析處理量之水平較高，同時不需在整個分析期間維持高多工分析。結果，所需的能量輸入可能比直接的高多工方式低，同時具有在訊號雜訊比等方面之增益。第25圖以圖式方式說明前所提及的方法之概觀。如所示，首先廣泛地審查具有大量的潛在反應區域之2502一基板2500，以辨識活性反應區域(如實心圓2504所示)。該廣泛照明作用可為統一泛光照明整個基板或其顯著部份之形式，或可為對於不同區域的掃描分析之形式，以辨識該等展現活性者。任擇地，可類似地使用標定照明方式，以辨識活性區域2504。一旦辨識出，然後配置光學系統而僅照明該等展現活性的區域，造成僅照明及因此監控來自該等區域的訊號(如虛線圓2506所示)。

該選擇性照明作用可採用多種不同的光學系統或組件。例如，如同上述的時間多工照明方法，可快速地配置可程式鏡陣列，而僅照明一特定基板上所選擇的確切區域。同樣地，如習用的平面LCD顯示器中所用之具有可定址畫素的LCD光罩，可用於選擇性地照明一基板上的所欲區域。該等組件可如有關第24圖中之鏡2406所述地配置，以選擇性地阻斷定向前往基板的非活性區域之小射束。尤其，藉由提供一種LCD式光罩，可選擇性地定址個別畫素，使其等對於激發照明如小射束的透射作用開啟或封閉，因而控制最後入射在基板上之小射束的數目與模式。

除了在一基板上的不同區域提供可控制式光罩照明作用之外，上述方式亦可用於調節一基板上的不同區域之照明強度。尤其，藉由調制通過不同光罩元件的光，可調制基板所接收的光強度。上述的調制作用特別適用於因應其他光學組件所造成的標定照明作用中之不均一性，如多工光學元件如DOE等中的變化所造成之不均一性。尤其，可製造一灰階光罩，或在可程式空間光調變器之情況下進行程式化，以調整在不同照明區域之標定照明作用之間之任一預定的不均一性。尤其，可獲得一特定光程的照明廓型之一取樣品，包括多工光學元件，及基於該模式配置空間光調變器或光罩，以適當地修正偏差，如減少較亮的照明點之強度。

D.增強型多工照明作用

在其他方面，本發明使用與一或多個繞射元件組合的多個照明源而提供增強型多工照明作用，以照明大量的離散反應區域。在該等情況下，可將二、三、四、五、十或更多個雷射光束引導通過一或多個繞射光學元件，以在一基板上產生大量的照明點。

在例如使用一繞射光學元件提供離散光束而照明一基板上的大量離散區域時，為確保將充分的電力輸送至大量的照明區域，典型地需要增加施用至該系統的電力。就超高多工系統而言，用於進行此之個別照明源因為成本與可用性，在商業上並非可行。例如，在特定的例示性應用中，係將單一照明源光束分成提供約5微瓦/平方微米之小射束。若要對於80,000個離散點達到該相同的照射功率，則表示單一照明光束將具有約500百萬瓦。

除了雷射議題之外，繞射光學元件典型所產生的光束模式在相對小的視野具有合理的光束均一性。然而，當希望擴張視野時，該照明模式的非均一性對於一些應用而言將過量。因此，在多工照明規模例如擴張一級數或更多時，將預期跨照明點的照明強度之顯著變化。

因此，就一方面而言，本發明提供導向通過一或多個繞射元件的多個照明源及/或來源光束，以提供具有容易取得、低功率照明源及較高的跨照明視野均一性之超高多工照明作用。

在第一方面，將多個照明光束以不同角度引導通過單一繞射元件，以提供反射多個光束的輸出照明模式及發端光束中的角度變化。其係以圖式方式說明於第26圖中。如所示，實線2602與虛線2604所示之多個照明光束，係以如角度2608所示的不同角度導向繞射光學元件2606。自各發端光束的DOE所發射之照明“小射束”2610所產生的模式，係以其本身的模式(如以基板2612上的實心與空心點而圖式說明)導向基板2612上，其中各模式係以該二發端光束之間的角度差異之一函數方式偏位。

除了使用多個照明源光束之外，本發明亦設想使用多個繞射元件，其中各繞射元件接收發端照明光束的一子集，以產生一關聯模式。尤其，因為自單一繞射元件所發射的較高多工模式在整個較大的視野所提供之變異可能過量，可使用各在一特定基板的一區域子集提供一照明模式之多個繞射元件，藉此將照明作用變異性限制在相對小的視野中所存在者，及因此不超過用於所欲應用之範圍。

該種系統的一實例係說明於第27A圖中。尤其，如所示，提供一種多工繞射光學元件2706，其可包含一種單一集成組件或多個連接型繞射光學元件2704。多個發端照明光束(如發射自多個照明源如雷射2700之實線、短虛線及長虛線所示)係導向多工DOE2706，其中各光束係以自其他光束稍微偏移的一角度導向DOE。如所示，可包括一個多面體稜鏡、波導陣列、光纖束或其他光學組件，以將各光束改向至其適當的DOE組件。此外，陣列中的各DOE組件可在角度方面偏斜，以提供所發射的小射束通過剩餘的光學元件串之最佳方向。

自集成DOE2706內的各DOE元件2704所產生之光束模式，然後透射通過將光束聚焦在一基板2714上之光學元件串(如透鏡2708、2710及物鏡2712所示)。如所示，將不同的光束聚焦，以將其等的照明模式提供至該基板的不同子集。例如，如該光束的示意展開圖所示，來自各組件2704的照明模式之交錯可用於提供多重偏位，但係與基板2714上的照明模式交錯，如第26圖所示之模式。任擇地，不同的小射束模式可導向基板上之完全不同的區域如象限等，以照明個別的基板區域。

第27B圖說明用於達到高多工之數種DOE組件構形，包括五DOE陣列組件(a)與(d)、七DOE陣列組件(b)與(e)及九DOE陣列組件(c)與(f)。依多工水平與所欲的照明模式而定，亦可用其他構形。就較佳方面而言，除了在角度空間中將各入射光束均勻地分成照明模式中之大量的小射束之外，一陣列中的各DOE組件將被配置具有不同的偏斜角展。例如，就第27B圖中所說明的九面式DOE組件而言，陣列中之各個別的DOE組件或面可提供來自一個單一入射光束之100x100的小射束。其等可具有均一的間距如在Θx與Θy角度空間皆為0.1毫弧度(mrad)。第一DOE(#1)的偏斜角展例如在Θx方向為5毫弧度，第二DOE(#2)將在Θx與Θy角度空間皆偏斜5毫弧度，第三DOE(#3)將在Θy角度空間偏斜5毫弧度等等。

如將理解者及如上所提及者，各DOE可用於將一或多個照明光束轉換成為導向基板之小射束模式。

E.多工偵測作用

類似於施用於此述分析系統的照明側之多工方式，及輔助或作為該等方式的一替代方案，本發明亦在該系統的收集側提供增強的多工，如用於收集與偵測自一基板上之反應區域所發射的訊號之光程。尤其，對於超高多工系統潛力之至少一項限制，係偵測例如自一基板上之較大型與較大量的離散區域所發射訊號之能力。如將理解者，在任一時間對於來自一基板上之不同區域的訊號偵測之預期的實際限制，將受限於一特定偵測系統中之畫素或偵測器元件的數目。

尤其，一特定的偵測器像素將僅可偵測入射在其上的訊號，及在其他考量不存在下，對於來自一來源的訊號與來自另一來源或組合來源的訊號將無法辨別。然而如將瞭解者，每個像素具一訊號之實際限制在於其本身並非完全可行，因多個像素上的訊號偵測作用提供大量的不同資訊，諸如光譜資訊、陣列位置等(如見第2007-0206187號美國專利申請公開案、第WO2007/095119號國際專利申請公開案及於2008年6月5日提出申請之第12/134,186號美國專利申請案，其中各者之全部揭露內容就所有目的在此完整地併入本案以為參考資料)。類似地，將陣列上的訊號成分分離係有助於避免訊號交叉污染。鑑於該等與其他考量之結果，在多工方式中，偵測器陣列區域的有效率使用之最佳化，將為有利的。

在第一實例中，自一基板上的反應區域之一陣列所發射的訊號，可導向一偵測器陣列或甚至完全不同的偵測器陣列上之不同區域，以最佳地偵測來自高多工基板的訊號。在一相關實例中，來自個別訊號來源的不同訊號成分可導向不同的偵測器。

任擇地或附加地，正如同照明的時間切換作用，自一基板的不同區域所發射之訊號可在時間上分隔，但在其他情況下在不同的時間導向一基板之相同、重疊、相鄰或離散部份。再次，藉由以超過及較佳顯著超過最慢的訊號期間之一頻率施用該切換作用，該時間分隔作用將提供對於所欲訊號事件之無縫偵測作用。此外，藉由將訊號分析過程與切換作用同步化，可容易地將基板上的一特定位置指定予一訊號事件，甚至當該等訊號係入射在一偵測器陣列的相同位置上時。如將理解者，相同或類似的組件可用於訊號方向的光學切換作用，如在標定照明模式的切換作用部份所論及者。此外，將理解先前所論及的LCD光罩可同樣地用於集光路徑，以針對來自離散式反應區域或反應區域子集之訊號，選擇性地開啟與關閉該集光路徑。

藉由“工作分擔”偵測器在不同訊號來源之間的偵測區域，雖然在不同的時間點，可使得以單一偵測器或一組偵測器偵測的訊號來源數目倍增超過未使用時間多工之一方法。

在一相關方面及如上所提及者，可將包含大量離散式反應區域之一個別基板，分成多個不同的子視野(sub-FOV)，其中各者可導向一個不同的偵測器，以順應高多工基板。為有效率與同時地監控該等子視野，較佳保有達成該監控方法之單一光學元件串。因此，就一方面而言，本發明提供照明一基板上的數個反應區域之一光學系統，但將來自反應區域的多個子集中之各者之訊號導向不同的偵測器。

用於收集來自一基板的不同區域之螢光訊號及將其等傳送至不同偵測器之一光學系統之一實例，係以圖式方式說明於第28圖中。如所示，系統2800包括一基板2802，其具有位於其上或其內的數個離散式反應區域或所欲探討的區域。基板2802及特別是用於分析之區域，係配置於物鏡2804的前焦平面。如所示，物鏡2804與筒鏡2806將所欲探討區域成像在位於筒鏡2806的後焦平面及靠近反射光罩2808之一中間影像平面。反射光罩2808將影像分割，及將一子集反射朝向偵測器2810及一部份朝向偵測器2812。典型地在焦平面中提供該反射光罩的反射點，藉此不會造成保真度之損失。另外顯示該等偵測路徑中之各者包括光譜分離光學元件，分別如聚焦透鏡2814與2816及2818與2820，以及用於分色的分散性光學元件，分別諸如稜鏡2822與2824。雖然係以將影像分成二個分開偵測的影像之形式說明，將理解可配置反射光罩或其他分像光學元件，以將影像分成更多的影像組份，如2、3、4、8、16或更多個離散的影像組份，其中各者可導向一個不同的偵測器。

如先前所提及，可以數種方式完成分像作用。例如，在簡單方面，反射光罩2808可包含如一種具有分開的偏斜片段之風輪式鏡，其中各面在一個不同的偵測路徑反射一部份的影像。任擇地，使用微稜鏡或微鏡陣列，如作為反射光罩2808，以將各子視野的影像導向不同的偵測路徑，其具有以一所欲方向引導入射光之多面體表面的陣列。如將理解者，可如本發明配置該等陣列，以將影像分成數個離散的組成影像。

在一相關系統中，可將來自基板上之不同訊號來源的不同訊號成分，區別地導向不同的偵測器。尤其，在如第22圖中所示之單一偵測器系統中，如藉由分散性光學元件2216將多個訊號成分在空間上分離，及成像在偵測器2220上。就超高多工陣列基板而言，當不同的訊號來源緊密地配置在該陣列上時，在空間上分離不同訊號成分的影像之能力變得更加困難，因並無足夠的偵測器區域供容納分離的成分，及其等開始映射至偵測器陣列的實質上重疊部份。藉由將不同的訊號成分導向不同的偵測器，可將該基板上之更密集的訊號來源成像。其係以圖式方式說明於第29A圖。尤其，如示意影像2902所示，4個訊號成分如光譜上獨特與分離的螢光訊號影像2904-2910，係成像在一偵測器陣列的一部份上。藉由將訊號成分的子集如訊號2904/2906與2908/2910區別地引導至不同的偵測器，可有效地成像近乎二倍數目的訊號來源如ZMW，而不需擔心訊號重疊。以該數目的偵測器如二個偵測器可成像的訊號來源之數目，提供成像至多二倍訊號來源之能力。然而在較佳的情況下，用於區別相鄰訊號來源所需之附加的間隔，可能使得來自不同來源的訊號成分之間需具有較大的間隔。因此，可成像的訊號來源之數目，可能並非完全地跟隨偵測器數目。

在第29B圖中提供用於完成上述偵測多工之光學系統的一圖式說明。在所示的系統中，該系統的激發光學元件之設置係與第22圖所示的系統類似，如在物鏡與基板之間具有一雙色濾光鏡。尤其，如所示，全系統2950包括一或多個激發光源，諸如雷射2952與2954。如同所有的該等系統，激發來源的數目可依據特定應用的需求而改變，如該系統中所用的不同螢光團之激發波長、所用雷射之波長。在所示的例示性系統中，藉由將二種激發光源(照明光源)導向分色鏡2956而將其等組合於相同的光程中，分色鏡2956透射來自雷射2954的光及反射來自雷射2952的光束，藉此該二光束成為共線。再次，在所示的系統中，激發光束係導向一附加的分色鏡2958，其作用係將激發光反射朝向基板2960，同時將具有不同波長的螢光訊號傳送至集光物鏡2962。如所示，該訊號首先自另一組件的表面反射，如該光學元件串中的一個分開的鏡或該基板的後表面，如上在第22圖中所述者。來自基板2960之光譜上分離的訊號成分，如經螢光標記的不同試劑所發射者，然後通過分色鏡2958與物鏡2962。然後藉由通過一分散性光學元件諸如楔形稜鏡2964，將訊號成分分成光譜上分離的訊號成分(如自稜鏡2964所發出的實線與虛線箭頭所示)。訊號成分然後導向分色鏡2966，其反射訊號成分的一子集及透射另一組訊號成分。然後將訊號成分的不同子集中之各者成像在偵測器2968或2970上。如上所示，雖然顯示具有二個偵測器，將理解可使用附加的偵測器，以將訊號成分的其他子集成像，如經由使用附加的分色鏡而可具有各導向一個不同的偵測器之四個訊號成分。

F.玻璃填充式物域

就一方面而言，本發明係提供具有一玻璃填充式光學空間之改良型光學系統。如此述，用於分析例如具有分析化學反應所用的螢光試劑之反應區域陣列之光學元件系統，通常具有入射在反應區域上之照明光學元件，及偵測發生在反應區域中之反應所發出的光之集光光學元件。在一些情況下，可使用藉由作用為例如照明波長的光之一鏡但傳送發射波長的光之一分色鏡元件，以控制照明作用與集光系統的光程。在一些情況下，使用一種自立式分色鏡可導致光學像差及損失。在本發明中納入一種定形光學區塊，其在照明光學元件與試樣之間及在集光光學元件與試樣之間的光學空間具有一嵌入式分色鏡元件。該光學元件區塊所具有的折射率典型地將超過空氣的折射率。藉由具有較高的折射率，所發出的光中之較大部分可藉由具一特定進光孔徑的偵測光學元件收集。此外，藉由嵌在光學區塊內的分色鏡，減少入射在該區塊上之光線的偏斜角度及圓錐角度，而在一些情況下導致較佳的分色鏡光譜性能及增加系統靈敏度。

包含一種定形光學元件區塊之一系統的一例示性實施例係示於第30圖。照明(激發)光學元件3030將照明光3035引導通過面3001而進入光學區塊3000。在所示的實施例中，在區域3070塗有一反射性材料以增強內反射作用之面3002將照明光反射。該照明光然後自嵌入式分色鏡元件3010反射，通過面3002而進入可包含多個反應區域之基板3020，該反應區域所具有之反應可藉由偵測螢光事件而測量。所發出的光3045，如來自反應區域的螢光，經由面3002進入該區塊，及透射通過分色鏡元件3010。在所示的實施例中，基板3020係與光學區塊3000光耦合，以將反射損失與像差降至最低。所發出的光然後經由面3003離開該定形光學區塊，及進入集光光學元件3040。雖然第30圖顯示反射照明光及透射所發出的光，在一些實施例中，嵌入式分色鏡將透射照明光及反射所發出的光。

照明光與所收集的光透射通過之該定形光學元件區塊的面可為平面，及可以最大化光學性能之一角度配置。例如，可將該等面製造為垂直於相關光學元件串的主光線。依此方式，就修正像差之目的而言，該定形區塊可作用為一個厚、不傾斜的平板。在一些實施例中，該定形光學元件區塊的一或多面可為彎曲的，以將通過該面的光改向而提供透鏡功能。該等面可如所欲地以凹或凸方式彎曲，以將照明光或所發出的光改向。

通常預期光學元件區塊將包含該系統的光程長度之大部分。亦即，通過光學元件區塊之光程距離，將至少為照明光學元件與基板之間或集光光學元件與基板之間的總光程距離之50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或更高。在一些情況下，照明光學元件、基板、集光光學元件或上述的任一組合，係與具有折射率高於空氣的一材料之定形光學元件區塊光耦合。例如可使用其折射率與定形光學區塊或另一組件緊密配合之一流體、油或聚合物，而使得該等元件光耦合。

分色鏡元件係嵌入該定形光學元件區塊中，顯示該分色鏡元件係與該區塊光學接觸，及在分色鏡元件與光學區塊之間通常很少或全無氣隙存在。在一些情況下，分色鏡可模製或成形進入該定形光學元件區塊中。在其他情況下，分色鏡元件可以例如流體、油或聚合材料而與該部份的光學區塊耦合。

定形光學元件區塊係由在所欲探討的波長為透明之一材料製成。該區塊例如可由玻璃質氧化物材料製成。該區塊例如可包含二氧化矽或氟化鈣。可納入添加劑以調整該區塊的折射率與其他性質。在一些情況下，該區塊在所欲探討的波長具有介於約1.1與約5.0之間之折射率，可為適合需要的。該折射率例如可為或介於約1.3與約2.5之間，或介於約1.4與2.0之間。雖然在一些情況下，高折射率係適合需要的；在一些情況下，折射率較高的材料將傾向於具有較高的自發螢光水平。因此吾等已發現具有該等範圍內的折射率之材料，係特別適用的。該區塊在分析所用的波長範圍具有低的自發螢光水平，係通常所欲的。分析系統典型地將使用例如在約400奈米至約700奈米範圍的可見光。亦可使用紅外光與紫外光。照明光之波長通常不同於所發出的光之波長。

III.實例第1例：拋物面鏡基板

製造具有配置通過一金屬層的零模式波導之基板，該金屬層係澱積在一玻璃基板中所界定的一拋物面形體上。該等裝置係依據第10圖及隨同的說明所述之方法製造，除了未進行後續的基板平坦化作用(步驟V-VII)之外。使用聚焦離子光束(FIB蝕刻方法)，製造用於界定零模式波導核心之通過金屬層的孔徑，以界定直徑約120奈米之一核心。第31A圖顯示使用掃描式電子顯微法(SEM)，自構造的金屬層側成像之所得構造。可見位於該構造的中央頂部之開口形式的零模式波導核心。

亦提供如不具有第31B圖所示之任一拋物面或其他反射構造之一比較基板，其具有配置於一平面玻璃基板上的一平面金屬層中之截面尺寸約略相同的一種零模式波導。測試反射構造在傳至或來自一種零模式波導核心的光之輸送運作。將一螢光染料澱積在二種不同的波導構造之敞開側上，及皆以相同的激發照明作用照明，及偵測所發出的螢光。基於來自該二比較基板中的各者之一組零模式波導的平均螢光強度，發現配置於該反射構造上之波導所提供的螢光訊號比習用ZMW高6倍，顯示全系統的集光效率之增強。

第2例：圓錐形鏡基板之理論模擬

使用第32圖與第33圖所分別說明的各種組件模製構造。例如，就第32圖所說明之平直的圓錐形構造而言，尺寸設定如下：d1=1.25微米；d2=5微米及h=4.69微米。該模式假設用於收集自基板/反射器組件所發出的光之一物鏡，具有0.5的數值孔徑及相對於光軸的最高集光角度為+/-20度，藉此提供自70至110度之相對於基板底面的集光角度。基於第32圖所示之圓錐形模式，自圓錐反射出的光線角度係自43.58度(Θ_tr)至105.52度(Θ_br)。

就第33圖所示之二種分段式圓錐形反射器而言，尺寸設定為：d1=1.25微米；d2=3微米；d3=5微米；h1=1微米；及h2=3.69微米。在該情況下，反射器所反射與發出的光線角度係介於82.37度(Θ_tr)至116.06度(Θ_br)之範圍。

就上述二種結構型式而言，使用數值孔徑為0.95之一集光物鏡之物鏡的光子收集效率估計約為70%，相較於不包括反射器組件之一基板如第31B圖所示之配置於一透明基板層上的一種零模式波導之收集效率約為42%。該分析預測因微鏡之納入而增進光學性能，但該分析實質上係一種不包括繞射作用或波效應之光線追跡分析，及因而無法提供所預期性能的完整相貌。亦已進行以向量式工具所進行之分析，其確認來自本發明的微鏡構造之光學增進作用。

第3例：使用犧牲柱在微鏡構造上製造奈米級反應區域之陣列

藉由350℃的LPCVD，在熔融矽石上澱積一層500奈米形式的多晶鍺。使用一種248奈米步進機、科林(Lam)蝕刻機、寬度調整自300奈米至120-150奈米，在多晶鍺中蝕刻出柱狀物。使用一種248奈米步進機與杉土拉(Centura)-MXP蝕刻機，進行鏡之蝕刻作用。該陣列然後在600℃退火，以減少自發螢光及進行有機污染物之除氣，接著在濕式溶液(50℃的30%過氧化氫)中進行鋁蒸發作用及去覆蓋作用(除去多晶鍺)，而不攻擊鏡面上的鋁。第34圖所示的SEM顯微圖顯示具有配套微鏡之反應區域陣列的一部份。第35圖顯示在其頂部具有一反應區域之單一微鏡構造。第36圖顯示位於一微鏡構造頂部之一奈米級反應區域。

第4例：使用一犧牲鍺層與一硬膜層光罩製造奈米級反應區域

依序以一多晶鍺層與一硬質光罩層諸如二氧化矽或氮化矽，塗覆一熔融矽石基板。使用光微影法，以界定直徑約380奈米的環形之一陣列，及蝕刻該硬質光罩以產生具有約略該等尺寸的硬質光罩盤。然後使用30%含水過氧化氫之一控制式過度蝕刻作用，蝕刻該鍺層，以在硬質光罩盤之下方產生直徑約200奈米的鍺柱狀物。可藉由調整條件與材料而控制蝕刻速率。例如，當使用無摻雜型多晶鍺時，30%含水過氧化氫在50℃的蝕刻速率約為460奈米/分鐘；而當使用摻雜型多晶鍺時，30%含水過氧化氫在室溫的蝕刻速率約為200奈米/分鐘。在該表面上濺鍍厚度約100奈米的鋁。使用加熱至約50℃以上的含水過氧化氫，移除多晶鍺柱。SEM顯微圖證實在熔融矽石上的一鋁膜中，產生直徑介於自200奈米至250奈米範圍之孔。

第5例：在一熔融矽石基板上所產生的圓錐形微鏡構造

第37圖顯示在一熔融矽石基板上所形成的例示性圓錐形微鏡構造之掃描式電子顯微圖。測得第37(A)圖之圓錐形構造的頂部直徑約為2.40微米，及底部直徑約為4.90微米。測得第37(B)圖之圓錐形構造的頂部直徑約為1.68微米，及底部直徑約為4.18微米。在熔融矽石基板上所製成的其他微鏡構造(未顯示)，其頂部直徑/底部直徑/高度經測定約為：1.30/3.96/3.45微米、1.49/4.17/3.18微米、1.68/4.34/3.30微米、2.79/5.27/3.36微米、2.55/5.60/3.23微米、2.66/5.38/3.72微米。

第37(C)圖顯示經鋁塗覆之一圓錐形微鏡構造，其具有通過微鏡構造頂部的鋁層之一種零模式波導孔徑。

第38(A)至(E)圖顯示在一熔融矽石基板上所產生的圓錐形構造之SEM顯微圖。第38圖的構造，係對應於例如在第15圖所述方法的步驟(II)之後的構造。第39圖顯示一微鏡的一截面之SEM顯微圖，該微鏡在其頂部具有一孔徑。第39圖所示之構造，係對應於第15圖所述方法的步驟(VIII)之後所形成的一構造。在該構造中，微鏡構造係被一平坦化層諸如一種旋塗式玻璃所環繞。

第40圖顯示微鏡構造的一陣列，其等係在一熔融矽石基板上形成及在其等頂部各具有孔徑。

第6例：圓錐形微鏡構造之增益測量

進行測量，以測定使用與零模式波導耦合的微鏡構造所產生之增益量。以熔融矽石(FuSi)製備一基板，其在微鏡頂部具有ZMW構造及在該基板的平面部份上具有可比較的ZMW構造。第41圖顯示實驗設置之圖式說明，其中光係透射通過基板上的ZMW構造。透射通過ZMW構造的光，係以一光學元件串收集及在一CCD照相機上偵測。光學偵測系統的數值孔徑為0.5。第1表列出自基板平坦區域上的ZMW構造及自微鏡構造頂部上的ZMW構造所偵測之強度的代表性測量。計算自該等測量之增益約為5.9。應瞭解所測得的增益將依該集光光學元件的數值孔徑而定。

第7例：在微鏡上的反應區域中之DNA定序

自一個500微米厚的熔融矽石(FuSi)基板，製備各在其頂面上具有單一零模式波導孔徑的微鏡構造之一陣列。使用具有抗蝕劑回流與3微米深的反應性離子蝕刻作用(RIE)之接觸微影法，接著藉由濺鍍平滑化作用與400℃退火作用，在基板中形成微鏡構造。然後在該表面上濺鍍塗覆一個200奈米的鋁層。在鋁層製作圖案及進行蝕刻，以在鄰近微鏡構造的頂部中央處產生一個直徑120奈米的ZMW。使用過度蝕刻，藉此ZMW孔徑延伸進入熔融矽石(FuSi)基板約50奈米。經測定一代表性微鏡構造的頂部直徑約為3.4微米及底部直徑約為6.8微米。如Eid等人於期刊“Science”第323期第133-138頁(2009年)乙文所述，以類似於Lundquist等人於期刊“Optics Letters”第33期第1026頁(2008年)乙文所述之數值孔徑為0.3之一光學系統，進行一種單分子定序反應。第42圖顯示在具有鹼基C與G的區塊之一線性模板上之一種雙色定序反應，針對強度相對於時間所收集的資料之一部份，其係如Eid等人所述分別藉由經核苷酸647G與555C標記的染料而辨識。第42圖中的暗色尖峰係對應於647G，而較淡的尖峰係對應於555C，展現使用具微鏡陣列的零模式波導之核酸定序。如Eid等人所述，可以一類似方式進行四色定序。

雖然就說明之目的述及一些細節，即可理解可在本發明的範圍內實施該等嫻熟技藝者所知或理解之數種變異。就尚未明確地在此併入本案之程度而言，在本揭露內容所提及之所有發表的參考文獻與專利文件，係就所有目的在此完整地併入本案以為參考資料。

102．．．固定化複合物

104．．．虛線

106．．．零模式波導

108．．．核苷酸

110．．．核苷酸

112．．．訊號脈衝

114．．．訊號

202．．．基板

204．．．反應區域

206．．．虛線

208．．．照明點

210．．．照明線

212．．．照明點

300．．．系統

302．．．零模式波導陣列

304．．．雷射

306．．．光學元件串

308．．．繞射光學元件(DOE)

310．．．聚焦透鏡

312．．．共焦濾光鏡

314．．．聚焦透鏡

316．．．分色鏡

318．．．物鏡

320．．．聚焦透鏡

322．．．共焦光罩

324．．．聚焦透鏡

326．．．楔形稜鏡

328．．．聚焦透鏡

330．．．EMCCD偵測器

402．．．基板

404．．．零模式波導

406．．．實線箭頭

408．．．虛線箭頭

410．．．反應區域

412．．．反應區域

502．．．全基板

504．．．零模式波導

506．．．零模式波導

508．．．零模式波導

510．．．零模式波導

512．．．零模式波導

514．．．零模式波導

516．．．圓錐形或拋物面鏡

518．．．圓錐形或拋物面鏡

520．．．圓錐形或拋物面鏡

522．．．圓錐形或拋物面鏡

524．．．圓錐形或拋物面鏡

526．．．圓錐形或拋物面鏡

528．．．透明基板

530．．．螢光訊號

532．．．光

550．．．反應區域

552．．．覆蓋層

554．．．基板

556．．．鏡

558．．．光罩

600．．．直筒圓錐形構造

604．．．下圓錐區

606．．．上圓錐區

608．．．下截圓錐區

610．．．上圓柱區

630．．．零模式波導

640．．．反應區域

650．．．反應區域

800．．．透明基板

802．．．透明基板

810．．．區域

812．．．基板

820．．．覆蓋層

822．．．覆蓋層

830．．．反射塗層

832．．．反射層

840．．．反應區域

842．．．反應區域

850．．．突出構造

852．．．突出構造

862．．．平坦化層

880．．．底面

1000．．．透明基板層

1002．．．光阻

1004．．．圖案

1006．．．負凸紋

1008．．．反射性材料層

1010．．．填充層或平坦化層

1012．．．開口

1014．．．金屬覆蓋層

1016．．．零模式波導核心

1100．．．透明基板

1110．．．覆蓋層

1120．．．光阻

1125．．．形體

1140．．．反應區域

1150．．．保護層

1160．．．鏡構造

1170．．．金屬

1180．．．鏡構造

1200．．．透明基板

1210．．．覆蓋層

1220．．．光阻

1240．．．反應區域

1260．．．微鏡構造

1270．．．金屬層

1280．．．光阻

1300．．．透明基板

1310．．．覆蓋層

1320．．．光阻

1340．．．孔徑

1350．．．保護層

1360．．．微鏡構造

1370．．．金屬

1380．．．光阻柱狀物

1400．．．透明基板

1410．．．覆蓋層

1420．．．光阻

1440．．．孔徑

1450．．．犧牲層

1460．．．微鏡構造

1470．．．金屬

1500．．．透明基板

1510．．．微鏡

1520．．．金屬反射層

1530．．．平坦化層

1540．．．金屬覆蓋層

1550．．．孔徑

1560．．．反應區域

1600．．．透明基板

1610．．．微鏡

1620．．．金屬反射層

1630．．．平坦化層

1640．．．反應區域

1660．．．反應區域

1900．．．透明基板

1910．．．犧牲材料

1920．．．硬質光罩層

1930．．．金屬覆蓋

1940．．．反應區域

2000．．．基板

2010．．．構造

2020．．．階地

2100．．．總裝置

2102．．．零模式波導

2104．．．零模式波導

2106．．．零模式波導

2108．．．零模式波導

2110．．．零模式波導

2112．．．零模式波導

2114．．．第一表面

2116．．．透明基板

2118．．．透鏡

2120．．．透鏡

2122．．．透鏡

2124．．．透鏡

2126．．．透鏡

2128．．．透鏡

2134．．．對向(或後)表面

2200．．．全系統

2202．．．基板

2204．．．反應區域

2206．．．激發光源/雷射

2208．．．分色鏡

2210．．．集光物鏡

2212．．．繞射光學元件(DOE)

2214．．．物鏡

2216．．．稜鏡/分散性光學元件

2218．．．透鏡

2220．．．偵測器

2250．．．稜鏡

2252．．．稜鏡

2300．．．基板

2302．．．第一子集

2304．．．不同的子集

2310．．．反應區域

2400．．．照明路徑

2402．．．雷射

2404．．．繞射光學元件(DOE)

2406．．．鏡

2408．．．物鏡

2410．．．分色鏡

2414．．．基板

2500．．．基板

2502．．．潛在反應區域

2504．．．實心圓/活性反應區域

2506．．．虛線圓

2602．．．實線

2604．．．虛線

2606．．．繞射光學元件

2608．．．角度

2610．．．照明小射束

2612．．．基板

2700．．．雷射

2704．．．繞射光學元件

2706．．．多工繞射光學元件

2708．．．透鏡

2710．．．透鏡

2712．．．物鏡

2714．．．基板

2800．．．系統

2802．．．基板

2804．．．物鏡

2806．．．筒鏡

2808．．．反射光罩

2810．．．偵測器

2812．．．偵測器

2814．．．聚焦透鏡

2816．．．聚焦透鏡

2818．．．聚焦透鏡

2820．．．聚焦透鏡

2822．．．稜鏡

2824．．．稜鏡

2902．．．示意影像

2904．．．螢光訊號影像

2906．．．螢光訊號影像

2908．．．螢光訊號影像

2910．．．螢光訊號影像

2950．．．全系統

2952．．．雷射

2954．．．雷射

2956．．．分色鏡

2958．．．分色鏡

2960．．．基板

2962．．．集光物鏡

2964．．．楔形稜鏡

2966．．．分色鏡

2968．．．偵測器

2970．．．偵測器

3000．．．光學區塊

3001．．．面

3002．．．面

3003．．．面

3010．．．分色鏡元件

3020．．．基板

3030．．．照明(激發)光學元件

3035．．．照明光

3040．．．集光光學元件

3045．．．光

3070．．．區域