JPWO2016103473A1 - 核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置 - Google Patents

核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置 Download PDF

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Abstract

同一の分析領域について繰り返し位置合わせする場合であっても、上記分析領域の位置を再現よく割り出すことができる核酸分析用基板、並びに当該核酸分析用基板を備えている核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置の提供を目的とする。本発明の核酸分析用基板１００は、基板１０上に区画された複数の分析領域１２を有し、前記各分析領域１２を順次換えて測定される核酸分析用基板１００であって、前記分析領域１２は、ＤＮＡ断片または前記ＤＮＡ断片を担持した担持体を吸着可能な吸着部１３と、前記吸着部１３以外の非吸着部１４とにより構成され、前記非吸着部１４は、少なくとも一部に前記分析領域１２の位置を割り出すための所定形状のマーカ部１５を備えていることを特徴とする。

Description

本発明は、核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置に関する。
近年、核酸の塩基配列を分析する方法として、多数のＤＮＡ断片の塩基配列を並行して分析する方法が知られている。この方法では、例えば、フォトリソグラフィ技術やエッチング技術などを用いて基板上にＤＮＡ断片等を吸着可能な多数の吸着部と吸着し難い非吸着部とを形成し、上記吸着部に分析対象となるＤＮＡ断片等を吸着させて分析を行う（例えば、特許文献１参照）。
上述のような分析方法では、塩基に対応する蛍光色素付き基質を導入した多数のＤＮＡ断片を含む分析領域に励起光を照射し、個々のＤＮＡ断片から発せられる蛍光を検出して塩基を特定する（例えば、非特許文献１参照）。
このような分析方法では、通常、上記分析領域は一つの基板に複数設けられ、一回照射するごとに分析領域を換えて全ての分析領域で分析を行った後、ポリメラーゼ伸長反応を用いて新たな蛍光色素付き基質の導入により上記と同様な操作で各分析領域を分析し、これを繰り返すことで効率よく塩基配列を決定することができる。
米国特許出願公開第２００９／０２７０２７３号明細書
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００５年、第３０９巻、ｐ．１７２８−１７３２
しかしながら、上述したような従来の技術では、同一の分析領域を繰り返して分析する際、サイクルごとに分析領域が位置ずれを起こすことがあり、この位置ずれによりサイクル間でのＤＮＡ断片の対応付けが困難になって正しい塩基配列が得られない虞がある。
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、同一の分析領域について繰り返し位置合わせする場合であっても、上記分析領域の位置を再現よく割り出すことができる核酸分析用基板、並びに当該核酸分析用基板を備えている核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置を提供することにある。
上記課題を解決するためになされた発明は、
基板上に区画された複数の分析領域を有し、前記各分析領域を順次換えて測定される核酸分析用基板であって、
前記分析領域は、ＤＮＡ断片または前記ＤＮＡ断片を担持した担持体を吸着可能な吸着部と、前記吸着部以外の非吸着部とにより構成され、
前記非吸着部は、少なくとも一部に前記分析領域の位置を割り出すための所定形状のマーカ部を備えていることを特徴とする核酸分析用基板である。
また、上記課題を解決するためになされた別の発明は、
当該核酸分析用基板と、
前記核酸分析用基板に対向するように配設され、光を透過する光透過性カバーと、
前記核酸分析用基板と前記光透過性カバーとの間に設けられ、互いに略平行かつ離間するように配設された複数のスペーサと、
前記核酸分析用基板と前記光透過性カバーとの間の隣り合うスペーサに挟まれた部位に形成され、流体が流通する流路と、
前記流路の一端に開口し、前記流体を注入する注入口と、
前記流路の前記注入口と反対側の他端に開口し、前記流体を排出する排出口とを備えている核酸分析用フローセルである。
さらに、上記課題を解決するためになされた別の発明は、
当該核酸分析用フローセルと、
前記核酸分析用フローセルの流路に流体を流通させる流通手段と、
ＤＮＡ断片の反応温度を調整する温調手段と、
光透過性カバーを介して分析対象となる分析領域に励起光を照射する照射手段と、
前記励起光の照射によりＤＮＡ断片から放出された蛍光を前記光透過性カバーを介して検出すると共に、検出された前記蛍光から前記分析領域におけるマーカ部の位置を検出する検出手段と、
前記核酸分析用フローセルが載置され、前記マーカ部を目印にして当該分析領域を所定の位置に移動させる移動手段とを備えている核酸分析装置である。
なお、本明細書において「所定形状」とは、分析領域中において位置の特定に用いられる予め定められた平面視の形状（例えば十字状など）を意味する。また、本明細書において「所定の位置」とは、分析対象となる分析領域を移動させる予め定められた位置を意味する。また、本明細書において「複数のスペーサ」とは、複数の部材からなるスペーサだけでなく、シートを打ち抜いて複数のスペーサ部を形成した中抜きシートなどの単一の部材からなるスペーサをも含む概念である。
本発明は、同一の分析領域について繰り返し位置合わせする場合であっても、上記分析領域の位置を再現よく割り出すことができる核酸分析用基板、並びに当該核酸分析用基板を備えている核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置を提供することができる。
本発明の核酸分析用基板の第１の実施形態を示す概略平面図である。 本発明の核酸分析用基板の第２の実施形態を示す概略平面図である。 本発明の核酸分析用基板の第３の実施形態を示す概略図であって、（ａ）は当該実施形態の平面図、（ｂ）は蛍光画像の一例をそれぞれ示す。 本発明の核酸分析用基板の第４の実施形態を示す概略平面図であって、一つの分析領域を拡大した図である。 図４の核酸分析用基板を用いて取得した蛍光画像が歪んでいる状態を示す概略図であって、（ａ）は蛍光画像が伸縮した状態、（ｂ）は蛍光画像が回転した状態、（ｃ）は蛍光画像が回転した他の状態をそれぞれ示す。 図１の核酸分析用基板の作製方法を示す概略図であって、（ａ）は親水性膜形成前の状態、（ｂ）は親水性膜形成後の状態、（ｃ）はレジスト膜形成後の状態、（ｄ）は現像後の状態、（ｅ）はエッチング後の状態、（ｆ）はレジスト膜除去後の状態をそれぞれ示す。 本発明の核酸分析用フローセルの一例を示す概略斜視図であって、光透過性カバーの一部を切断した図である。 本発明の核酸分析装置の一例を示す概略図である。 図８の核酸分析装置の制御過程を示すフローチャートである。 本発明の核酸分析装置を用いた分析方法の一例を示す概略図であって、（ａ）は移動前の蛍光画像中におけるマーカ部の位置関係、（ｂ）は移動前の目標位置範囲とマーカ部との位置関係、（ｃ）は移動後の目標位置範囲とマーカ部との位置関係をそれぞれ示す。 図１の核酸分析用基板を用いた蛍光画像の一例を示す概略図である。
＜核酸分析用基板＞
本発明の核酸分析用基板は、基板上に区画された複数の分析領域を有し、前記各分析領域を順次換えて測定される核酸分析用基板であって、前記分析領域は、ＤＮＡ断片または前記ＤＮＡ断片を担持した担持体（上記ＤＮＡ断片および担持体をまとめて、以下、「分析サンプル」とも称する）を吸着可能な吸着部と、前記吸着部以外の非吸着部とにより構成され、前記非吸着部は、少なくとも一部に前記分析領域の位置を割り出すための所定形状のマーカ部を備えていることを特徴とする。
以下、本発明の核酸分析用基板の第１〜第４の実施形態について図面を参照して説明するが、本発明は、第１〜第４の実施形態および当該図面に記載の実施態様にのみ限定されるものではない。
[第１の実施形態]
図１は、本発明の核酸分析用基板の第１の実施形態を示す概略平面図である。本実施形態の核酸分析用基板１００は、図１に示すように、概略的に、基板１０と、反応領域１１と、分析領域１２と、吸着部１３と、非吸着部１４とを備えている。なお、図１は、基板１０における反応領域１１、分析領域１２およびマーカ部１５（後述）を順次拡大した図である。
基板１０は、その片面上に反応領域１１が形成される板状の基材である。この基板１０としては、例えば、石英板、シリコン板、合成樹脂板などの表面に疎水性の薄膜が形成されているもの等が挙げられる。上記反応領域１１は、後述する複数の分析領域１２に区画された領域である。なお、この実施形態では、反応領域１１が１４０個の分析領域１２に区画されている。
分析領域１２は、分析サンプルｓを吸着する領域である。分析領域１２は、分析サンプルｓを吸着可能な多数の吸着部１３と、吸着部１３以外の非吸着部１４とにより構成されている。
吸着部１３は、上記分析サンプルｓが吸着可能となるように、基板１０上に積層され表面に露出した親水性膜等により形成されている。この親水性膜としては、例えば、分析サンプルｓを固定可能な官能基（例えば、アミノ基等）が導入された無機酸化物などの膜（以下、「特定無機酸化物」ともいう）等が挙げられる。この特定無機酸化物としては、例えば、アミノシラン等が挙げられる。
各分析領域１２は、図１に示すように、平面視円形状の複数の吸着部１３を有し、各吸着部１３は碁盤目状に配列されている。このように、各分析領域１２が複数の吸着部１３を有し、各吸着部１３が碁盤目状に配列されていることで、分析領域１２内の吸着部１３の位置を容易かつ確実に把握することができる。
なお、吸着部１３の平面視の直径は、通常０．０１〜１０μｍである。上記直径の下限としては、吸着部１３の形成容易性および分析サンプル吸着性を向上させる観点から、０．０５μｍが好ましく、０．１μｍがより好ましく、０．２μｍがさらに好ましい。一方、上記直径の上限値としては、吸着部１３の配置密度向上の観点から、５μｍが好ましく、１μｍがより好ましく、０．５μｍがさらに好ましい。
また、吸着部１３の平面視の直径は、当該核酸分析用基板１００を用いる核酸分析装置の検出手段における空間分解能（画素寸法）に対応していることも好ましい。かかる場合、上記直径は、吸着部１３の配置密度向上の観点から、１画素寸法であることが好ましい。
吸着部１３のピッチは、通常０．０５〜５０μｍである。上記ピッチの下限としては、分析上隣り合う吸着部１３どうしの干渉防止性を向上する観点から、０．１μｍが好ましく、０．５μｍがより好ましく、１μｍがさらに好ましい。一方、上記ピッチの上限としては、吸着部１３の配置密度向上の観点から、１０μｍが好ましく、５μｍがより好ましく、２μｍがさらに好ましい。
また、吸着部１３のピッチは、上記直径と同様に、核酸分析装置の検出手段における空間分解能（画素寸法）に対応していることも好ましい。かかる場合、上記ピッチは、蛍光分解能および吸着部１３の配置密度向上の観点から、４〜５画素寸法であることが好ましく、５画素寸法であることがより好ましい。
非吸着部１４は、上記分析サンプルｓが吸着するのを阻止できるように、基板１０上に積層された疎水性膜により形成されている。この疎水性膜を形成する化合物としては、例えば、多価性有機化合物、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物およびニトリル化合物、並びにこれらの塩等が挙げられる。なお、上記化合物は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
非吸着部１４は、その一部に分析領域１２の位置を割り出すための十字状のマーカ部１５を備えている。このマーカ部１５には蛍光を発するＤＮＡ断片が吸着し難いため、分析領域１２の蛍光画像を用いて吸着部１３とマーカ部１５とを容易に区別することができる。
次に、第１の実施形態に係る核酸分析用基板１００を用いた分析領域１２の位置合わせについて説明する。
当該核酸分析用基板１００を用いる場合、塩基に対応する蛍光色素付き基質が導入されたＤＮＡ断片（分析サンプル）が吸着した吸着部１３を含む分析領域１２に特定波長の励起光を照射すると、この励起光で励起する特定の色素が存する吸着部１３（以下、「特定吸着部」ともいう）が蛍光を発する。なお、例えば４色蛍光検出（４種の塩基それぞれに対応する異なる４種の蛍光の検出）を行った場合、任意の吸着部１３における特定波長の励起光の照射による蛍光確率は約２５％である。
ここで、非吸着部１４には、少なくとも一部に分析領域１２の位置を割り出すための所定形状のマーカ部１５（蛍光しない部位）が備えられているので、取得した蛍光画像の探索によりマーカ部１５を見つけることで分析領域１２の位置が特定される。次いで、特定された分析領域１２の位置に基づき当該核酸分析用基板１００を移動させ、当該分析領域１２と蛍光画像の取得範囲とを一致させる。これにより、分析対象となる分析領域１２の蛍光画像が取得可能となる。
このように、当該核酸分析用基板１００は、分析領域１２における非吸着部１４が少なくとも一部に分析領域１２の位置を割り出すための所定形状のマーカ部１５を備えているので、繰り返し位置合わせする場合であっても、分析領域１２の位置を再現よく割り出すことができ、その結果、ＤＮＡ断片の塩基配列を確実かつ迅速に分析することができる。
［第２の実施形態］
図２は、本発明の核酸分析用基板の第２の実施形態を示す概略平面図である。第２の実施形態の核酸分析用基板２００は、図２に示すように、概略的に、基板１０と、反応領域１１と、分析領域１２と、吸着部１３と、非吸着部１４とを備えている。第２の実施形態の核酸分析用基板２００は、分析領域１２によって非吸着部１４におけるマーカ部１５の平面視の形状が相異している点で、第１の実施形態とは異なっている。なお、基板１０、反応領域１１、分析領域１２および吸着部１３は、第１の実施形態のものと同様であるため、同一部分には同一の符号を付してその詳細な説明は省略する。
本実施形態では、マーカ部１５の平面視の形状が、少なくとも隣り合う分析領域１２どうしで互いに異なっている。具体的には、図２に示すように、核酸分析用基板２００は、マーカ部１５の平面視の形状が異なる２種類の分析領域１２ａ、１２ｂを有しており、これら種類の異なる分析領域１２ａ、１２ｂが交互（奇数番号の分析領域１２ａと偶数番号の分析領域１２ｂとでマーカ部１５の形状が異なる）に配設されている。この実施形態では、分析領域１２ａがマーカ部１５ａを有していると共に、分析領域１２ｂがマーカ部１５ｂを有している（図２のマーカ部１５の形状参照）。
次に、第２の実施形態に係る核酸分析用基板２００を用いた分析領域１２の位置合わせについて説明する。
当該核酸分析用基板２００を用いる場合、外部のコンピュータ（不図示）に予め奇数番号の分析領域１２ａおよび偶数番号の分析領域１２ｂでのそれぞれのマーカ部１５ａ、１５ｂの形状を記憶させておく。次いで、第１の実施形態の位置合わせと同様の方法で、最初の分析領域１２に位置合わせを行う。
次いで、励起光の照射による蛍光の検出を行う。この蛍光の検出では、対象となる分析領域１２の蛍光画像を取得する際にマーカ部１５の形状を認識させ、認識した形状に基づき当該分析領域１２が奇数番号の分析領域１２ａか、偶数番号の分析領域１２ｂかを判定する。例えば、最初の分析領域１２を奇数番号に設定した場合、この分析領域１２ａの分析後に移動する隣接した分析領域１２は、核酸分析用基板２００の搬送手段（後述）に脱調等の誤動作がない限り、偶数番号のマーカ部１５ｂが認識されるはずである。もし、偶数番号ではなく奇数番号のマーカ部１５ａが認識されたり、取得した蛍光画像中に蛍光が全く検出できない場合は、その領域が分析対象とする分析領域１２ではないことを意味している。
このように、当該核酸分析用基板２００は、マーカ部１５の平面視の形状が、少なくとも隣り合う分析領域１２どうしで互いに異なることで、マーカ部１５の形状から各分析領域１２を区別することができ、分析対象とする分析領域１２を確実に分析することができる。
なお、マーカ部１５の平面視の形状は、全ての分析領域１２で異なっていることが好ましい。具体的には、マーカ部１５の形状として、例えば、数字や区別可能な記号などを模った形状等（不図示）を採用することができる。
このように、マーカ部１５の平面視の形状が全ての分析領域１２で異なっていることで、当該マーカ部１５の形状から各分析領域１２を明確に区別することができ、分析対象とする分析領域１２をより確実に分析することができる。
［第３の実施形態］
図３は、本発明の核酸分析用基板の第３の実施形態を示す概略図である。第３の実施形態の核酸分析用基板３００は、図３（ａ）に示すように、概略的に、基板１０と、反応領域１１と、分析領域１２と、吸着部１３と、非吸着部１４とを備えている。第３の実施形態の核酸分析用基板３００は、吸着部１３および非吸着部１４が第１の実施形態とは異なっている。なお、基板１０、反応領域１１および分析領域１２は、第１の実施形態のものと同様であるため、同一部分には同一の符号を付してその詳細な説明は省略する。また、第３の実施形態に係る核酸分析用基板３００を用いた分析領域１２の位置合わせについては、第１の実施形態と同様であるため、その詳細な説明を省略する。
本実施形態では、非吸着部１４の全領域がマーカ部１５であり、分析領域１２におけるマーカ部１５以外の領域が吸着部１３である。具体的には、図３（ａ）に示すように、マーカ部１５となる十字状の非吸着部１４が分析領域１２の略中心部に形成されており、当該分析領域１２における上記非吸着部１４（マーカ部１５）以外の全ての領域が吸着部１３となっている。なお、図３（ｂ）は本実施形態の核酸分析用基板３００を用いて得られた蛍光画像ｋの一例を示している。この図において、白抜きのドットで表示されている部分は、蛍光を発した分析サンプルｓに対応する部位である。
このように、当該核酸分析用基板３００は、非吸着部１４の全領域がマーカ部１５であり、分析領域１２におけるマーカ部１５以外の領域が吸着部１３であることで、分析サンプルｓを密に配置することができ、一度により多くの分析を行うことができる。
［第４の実施形態］
図４は、本発明の核酸分析用基板４００の第４の実施形態を示す概略平面図であって、一つの分析領域１２を拡大した図である。第４の実施形態の核酸分析用基板４００は、概略的に、基板１０と、反応領域１１と、分析領域１２と、吸着部１３と、非吸着部１４とを備えている。第４の実施形態の核酸分析用基板４００は、図４に示すように、マーカ部１５が分析領域１２の中心部に加え、さらに４つの角部に配設されている点で、第１の実施形態とは異なっている。なお、基板１０、反応領域１１および分析領域１２は、第１の実施形態のものと同様であるため、その詳細な説明は省略する。また、吸着部１３は第１の実施形態のものと同様であり、図４では便宜上複数ある吸着部１３の記載を省略している。
本実施形態では、マーカ部１５が、分析領域１２内における各吸着部１３位置の補正に用いられる。具体的には、当該核酸分析用基板４００は、分析領域１２の中心部に位置するマーカ部１５ｃと、当該分析領域１２の４つの角部に形成されたＬ字状のマーカ部１５ｄとを備えている。また、４つの角部に位置するマーカ部１５ｄは、中心部に位置するマーカ部１５ｃと隣り合う角部のマーカ部１５ｄを結んだ直線との間隔ａが等しくなるように配置されている。また、図示していないが、各吸着部１３はマーカ部１５以外の分析領域において５画素間隔で碁盤目状に配列されている。
次に、第４の実施形態に係る核酸分析用基板４００を用いた分析領域１２内での各吸着部１３の位置の補正について、図５を参照して説明する。
例えば、当該核酸分析用基板４００を用いて取得した蛍光画像が歪みを有する場合、以下の方法で吸着部１３の位置の補正を行うことができる。すなわち、図５（ａ）に示すように、蛍光画像ｋ１の歪みにより、当該蛍光画像ｋ１中心部のマーカ部１５ｃに対応する部位１５ｃ’（以下、「マーカ対応部１５ｃ’」ともいう）と隣り合う角部のマーカ部１５ｄに対応する部位（マーカ対応部１５ｄ’）を結んだ直線との間隔がｂ、ｃ、ｄ、ｅになったとする。かかる場合、実際の吸着部１３の位置を推定する方法として、例えば、マーカ対応部１５ｃ’を中心とする左上、右上、左下、右下の領域毎に補間する線形補間方法等の補間方法が挙げられる。
例えば、上記線形補間方法の一例として、ｂ、ｃ、ｄ、ｅそれぞれに対してａ（図４参照）との商を求め、５画素寸法を乗算することで実際のピッチが算出される。具体的には、図５（ａ）に示すマーカ対応部１５ｃ’よりもＢ側の領域のＢＤ方向の実際のピッチはｂ／ａ×５画素寸法、マーカ対応部１５ｃ’よりもＥ側の領域のＣＥ方向の実際のピッチはｅ／ａ×５画素寸法、マーカ対応部１５ｃ’よりもＤ側の領域のＢＤ方向の実際のピッチはｄ／ａ×５画素寸法、マーカ対応部１５ｃ’よりもＣ側の領域のＣＥ方向の実際のピッチはｃ／ａ×５画素寸法と算出され、これを用いて各吸着部１３の位置の補正を行う。
なお、蛍光画像の歪みは、核酸分析装置の検出器に依存するため、上記算出は、１サイクル目の最初の分析領域１２のみでよく、この算出結果を用いて以降に分析する分析領域１２での補正を行う。また、上記検出器を２台以上用いて分析する場合は、それぞれの検出器で上記算出および補正を行う。
一方、当該核酸分析用基板４００に照射する励起光の光軸に対する回転方向の蛍光画像の歪み（ずれ）については、以下の方法で吸着部１３の位置の補正を行うことができる。すなわち、図５（ｂ）に示すように、検出器により得られた蛍光画像ｋ２におけるマーカ対応部１５ｄ’から、傾きθ１を算出する。次いで、算出された傾きθ１分の修正を行うことで回転方向の補正を行う。なお、蛍光画像ｋの回転方向の歪みは、核酸分析装置の検出器に依存するため、上記算出は、１サイクル目の最初の分析領域１２のみでよく、この算出結果を用いて以降に分析する分析領域１２での補正を行う。また、検出器を２台以上用いて分析する場合は、それぞれの検出器で上記算出および補正を行う。例えば、図５（ｃ）は、上記検出器と異なる他の検出器で検出された蛍光画像ｋ３（傾きθ２）を示している。
このように、マーカ部１５が分析領域１２内における各吸着部１３位置の補正に用いられることで、分析領域１２における各吸着部１３の位置を正確に把握することができる。
＜核酸分析用基板の作製方法＞
次に、上述した核酸分析用基板の作製方法について説明する。図６は、図１の核酸分析用基板１００の作製方法を示す概略図である。当該核酸分析用基板１００は、例えば、特開２０１１−９９７２０号公報に準じた方法を用いて作製することができる。すなわち、片面上に予め疎水性の薄膜が積層された基板１０を用い（図６（ａ）参照）、上記疎水性の薄膜上に、例えば真空蒸着法や、スパッタリング蒸着法、ＣＶＤ法、ＰＶＤ法等により特定無機酸化物などからなる親水性の薄膜１６を蒸着する（図６（ｂ）参照）。
次いで、得られた親水性の薄膜１６上にレジスト１７を塗布した後（図６（ｃ）参照）、フォトリソグラフィ技術を用いて所定のパターニングを行い（図６（ｄ）参照）、パターニングされたレジスト１７をマスクとして不要な親水性の薄膜をエッチングにより除去し（図６（ｅ）参照）、残ったレジスト１７を溶解除去する（図６（ｆ）参照）ことで、親水性の薄膜１６からなる所望の吸着部１３が形成された核酸分析用基板１００を作製することができる。なお、分析領域１２における吸着部１３以外の部位は、上記疎水性の薄膜が露出しているため非吸着部１４となる。
＜核酸分析用フローセル＞
本発明の核酸分析用フローセルは、当該核酸分析用基板と、前記核酸分析用基板に対向するように配設され、光を透過する光透過性カバーと、前記核酸分析用基板と前記光透過性カバーとの間に設けられ、互いに略平行かつ離間するように配設された複数のスペーサと、前記核酸分析用基板と前記光透過性カバーとの間の隣り合うスペーサに挟まれた部位に形成され、流体が流通する流路と、前記流路の一端に開口し、前記流体を注入する注入口と、前記流路の前記注入口と反対側の他端に開口し、前記流体を排出する排出口とを備えている。
以下、本発明の核酸分析用フローセルについて図面を参照して説明するが、本発明は、当該図面に記載の実施態様にのみ限定されるものではない。
図７は、本発明の核酸分析用フローセルの一例を示す概略斜視図であって、光透過性カバーの一部を切断した図である。当該核酸分析用フローセル５００は、図７に示すように、概略的に、核酸分析用基板１００と、光透過性カバー２１と、スペーサ２２と、流路２３とを備えている。なお、本実施形態では、核酸分析用基板として上述した核酸分析用基板１００を用いているため、同一部分には同一の符号を付してその詳細な説明は省略する。
光透過性カバー２１は、核酸分析用基板１００に対向するように配設され、光を透過する平板状のカバーである。光透過性カバーの材質としては、例えば、ソーダガラス、石英ガラス、サファイアガラスなどのガラス、透明ポリイミド樹脂、ポリカーボネート樹脂などの光透過性樹脂等が挙げられる。
スペーサ２２は、核酸分析用基板１００と光透過性カバー２１との間に設けられ、互いに略平行かつ離間するように配設されている。当該核酸分析用フローセル５００は、複数のスペーサ２２を有している。スペーサ２２の材質としては、例えば、特開２００６−８７９７４号公報に記載の熱硬化性や光硬化性のエポキシ樹脂、アクリル樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられる。これらの中で、上記ガラスや光透過性樹脂との接着強度向上の観点から、シリコーン樹脂が好ましく、ポリシロキサンがより好ましく、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）がさらに好ましい。また、スペーサ２２の厚さとしては、特に制限されないが、使用する試薬量低減および作製容易性の観点から、０．０５〜２ｍｍが好ましく、０．２〜１ｍｍがより好ましい。
流路２３は、核酸分析用基板１００と光透過性カバー２１との間の隣り合うスペーサ２２に挟まれた部位に形成され、流体が流通する流路である。この流路２３には、例えば、ＤＮＡ断片と反応する試薬等の流体が流される。具体的には、流路２３は、核酸分析用基板１００と光透過性カバー２１とスペーサ２２との間に囲まれ、流れ方向に直行する断面が長方形状に形成されており、流れ方向に長手形状の略直方体の空間により構成されている。流路２３は、その一端に開口し流体を注入する注入口２３ａと、注入口２３ａと反対側の他端に開口し流体を排出する排出口２３ｂとを有している。
このように、当該核酸分析用フローセル５００は、当該核酸分析用基板１００を備えているので、核酸分析の際、繰り返し位置合わせする場合であっても、分析領域１２の位置を再現よく割り出すことができ、その結果、ＤＮＡ断片の塩基配列を確実かつ迅速に分析することができる。
＜核酸分析用フローセルの作製方法＞
次に、核酸分析用フローセル５００の作製方法について説明する。当該核酸分析用フローセル５００は、例えば、上述した核酸分析用基板１００上に２本のスペーサ２２が互いに平行になるように接着剤を用いて接着する。次いで、接着したスペーサ２２上に光透過性カバー２１を接着剤を用いて接着する。なお、上記接着剤の種類は、核酸分析に影響を与えない限り特に限定されない。以上のようにして、本発明の核酸分析用フローセル５００を作製することができる。
＜核酸分析装置＞
本発明の核酸分析装置は、当該核酸分析用フローセルと、前記核酸分析用フローセルの流路に流体を流通させる流通手段と、ＤＮＡ断片の反応温度を調整する温調手段と、光透過性カバーを介して分析対象となる分析領域に励起光を照射する照射手段と、前記励起光の照射によりＤＮＡ断片から放出された蛍光を前記光透過性カバーを介して検出すると共に、検出された前記蛍光から前記分析領域におけるマーカ部の位置を検出する検出手段と、前記核酸分析用フローセルが載置され、前記マーカ部を目印にして当該分析領域を所定の位置に移動させる移動手段とを備えている。
以下、本発明の核酸分析装置について図面を参照して説明するが、本発明は、当該図面に記載の実施態様にのみ限定されるものではない。
図８は、本発明の核酸分析装置の一例を示す概略図である。当該核酸分析装置６００は、図８に示すように、概略的に、核酸分析用フローセル５００と、流通手段３１と、温調手段３２と、照射手段３３と、検出手段３４と、移動手段３５とを備えている。なお、核酸分析用フローセル５００は、上述の＜核酸分析用フローセル＞の項で説明した核酸分析用フローセル５００と同様であるため、同一部分には同一の符号を付してその詳細な説明は省略する。
流通手段３１は、核酸分析用フローセル５００の流路２３に流体を流通させる。流通手段３１は、試薬を含む複数の試薬容器３１１を収容する試薬冷却保管庫３１２と、試薬容器３１１へアクセスするノズル３１３と、上記試薬を核酸分析用フローセル５００へ導入する配管３１４と、ＤＮＡ断片と反応した試薬等を廃棄する廃液タンク３１５とを備えている。
温調手段３２は、ＤＮＡ断片の反応温度を調整する。温調手段３２は、後述のＸＹステージ３５１上に設けられ、分析するＤＮＡ断片（分析サンプルｓ）と上記試薬との反応を促進させる温調基板３２１を備えている。温調基板３２１は、例えば、ペルチェ素子を内臓している。
照射手段３３は、励起光となるＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）などの光源３３１と、光源３３１から出射された励起光に対して任意の波長を選択可能なフィルタ切替機構３３２と、上記励起光を反射しかつ後述の蛍光を透過するダイクロイックミラー３３３と、分析する分析サンプルｓに励起光を照射する対物レンズ３３４と、上記Ｘ軸およびＹ軸の両軸に直交するＺ軸方向に対物レンズ３３４を駆動させ上記励起光のフォーカスを調整するＺステージ３３５とを備えている。
検出手段３４は、励起光の照射によりＤＮＡ断片から放出された蛍光を光透過性カバー２１を介して検出すると共に、検出された蛍光から分析領域１２におけるマーカ部１５の位置を検出する。検出手段３４は、分析サンプルｓが発する蛍光を回収する対物レンズ３３４と、対物レンズ３３４からの平行光を蛍光波長ごとに分割する蛍光分離用ダイクロイックミラー３４１と、平行光を結像させるチューブレンズ３４２と、結像された像を検出するＣＭＯＳセンサなどのセンサを有する検出器３４３とを備えている。なお、検出手段３４の対物レンズ３３４は、上述した照射手段３３のものが兼用されているため、同一の符号を付している。
移動手段３５は、核酸分析用フローセル５００が載置され、マーカ部１５を目印にして分析領域１２を所定の位置に移動させる。移動手段３５は、同一平面内において直交するＸ軸およびＹ軸の各方向に搬送可能なＸＹステージ３５１と、ＸＹステージ３５１を駆動する駆動用モータ（不図示）とを備えている。なお、ＸＹステージ３５１は、オープンループ方式で制御される。
＜分析方法＞
次に、本発明の核酸分析装置６００を用いたＤＮＡ断片の塩基配列の分析方法について、図８〜図１１を参照して説明する。なお、ここでは、分析サンプルｓがＤＮＡ断片を担持する担持体であり、上述した第１の実施形態の核酸分析用基板１００を備えている核酸分析用フローセル５００を用いた場合を例にして説明する。
当該核酸分析装置６００を用いた分析は、例えば、以下に例示する「フローセルの用意」、「フローセルの設置」、「試薬の導入」、「温度調整」、「ステージの移動」および「ステージの位置合わせ」等のステップを組み合わせることにより行うことができる。以下、これら各ステップについて詳説するが、当該核酸分析装置６００を用いた分析は、以下に記載の態様にのみ限定されるものではない。
［フローセルの用意］
このステップでは、予め分析サンプルｓが担持された核酸分析用フローセル５００（図７参照）を用意する。核酸分析用フローセル５００内の核酸分析用基板１００は、図１に示すように、基板１０上の各分析領域１２に吸着部１３と非吸着部１４とを有し、非吸着部１４の中央部には十字状のマーカ部１５が形成されている。なお、分析サンプルｓは、吸着部１３のみに担持されている。
［フローセルの設置］
このステップでは、上記［フローセルの用意］において用意した核酸分析用フローセル５００を核酸分析装置６００のＸＹステージ３５１に設けられた温調基板３２１上に固定する。
［試薬の導入］
このステップでは、流通手段３１のノズル３１３が試薬冷却保管庫３１２内の試薬容器３１１にアクセスし、試薬を吸引する。次いで、吸引された試薬を配管３１４および注入口２３ａを介して核酸分析用フローセル５００内の流路に注入し、注入された試薬を吸着部に担持されている分析サンプルｓに接触させて反応させる。なお、上記反応後の試薬は、配管を介して廃液タンク３１５に捨てる。
［温度調整］
このステップでは、核酸分析用フローセル５００を温調基板３２１で温度調整し、分析サンプルｓが所定の温度になるように調整する。この温度調整により、核酸分析用フローセル５００内の分析サンプルｓと試薬とが反応する。その際、上述の試薬の導入および温度調整を適宜繰り返してＤＮＡの伸長反応を行う。この伸長反応は、ポリメラーゼおよびそれぞれ異なる蛍光色素でラベルされた４種類のヌクレオチドを反応させることで行う。上記ヌクレオチドは、ＦＡＭ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ｄＧＴＰ、Ｃｙ５−ｄＴｓＴＰである。試薬中にはポリメラーゼが含まれており、ＤＮＡ断片に相補的な蛍光ヌクレオチドが１塩基だけ取り込まれる。
［ステージの移動］
このステップでは、反応した分析サンプルｓを観察するために、駆動用モータ（不図示）によりＸＹステージ３５１を駆動させて予め設定した位置へ核酸分析用フローセル５００を移動させる。ここで、上述の「予め設定した位置」とは、目標とする最初の分析領域１２の位置であり、検出手段３４の蛍光検出範囲内にマーカ部１５が存在するであろう位置を意味している。なお、ステージの正確な位置合わせについては、後述の［ステージの位置合わせ］のステップで詳述する。
［ステージの位置合わせ］
このステップでは、まず、検出手段３４のＺステージ３３５を駆動させ、対物レンズ３３４における分析サンプルｓのフォーカス位置を調整する。次いで、対物レンズ３３４をフォーカス位置に移動させた後、フィルタ切替機構３３２を用いて特定の波長の励起光を分析サンプルｓに照射する。その際、励起光の照射により、吸着部１３に担持された分析サンプルｓのうちの励起波長に対応した分析サンプルｓのみが蛍光を発する。一方、マーカ部１５は蛍光を発しない。
次いで、検出手段３４を用いて蛍光画像ｋを取得する。その際、例えば上述した４色蛍光検出の場合、分析サンプルｓが１／４の確率で蛍光を発しているので、取得した蛍光画像ｋ中に蛍光を発しないマーカ部１５の形状を認識することができる。次いで、図１０に示すように、蛍光画像ｋ取得範囲に対して、予めコンピュータ（不図示）に記憶させた形状のマーカ部１５を探索する。その際、マーカ部１５を探索できれば、マーカ部１５中心のＸ軸、Ｙ軸の画素値（蛍光画像ｋにおけるマーカ部１５の画素換算の座標）を算出する（図１０（ａ）参照）。もし、マーカ部１５を探索できなければ、ＸＹステージ３５１を駆動して次の分析領域へ移動する。なお、上記算出された画素値が目標位置範囲３４４内であれば、ＸＹステージ３５１の位置合わせは行わない。一方、上記算出された画素値が目標位置範囲３４４外であれば、目標位置範囲３４４内の中心位置に対する当該画素値の相対的な画素数Ｘａ、Ｙａを算出する（図１０（ｂ）参照）。次いで、算出されたＸａ、Ｙａを位置合わせに必要なパルス数に変換し、移動手段３５へ送信する。この送信後、移動手段３５の駆動用モータを駆動させ、ＸＹステージ３５１を移動させる（図１０（ｃ）参照）。
次いで、再度励起光の照射および検出手段３４によるマーカ部１５の位置検出を行い、マーカ部１５が目標位置範囲３４４内に移動したか否かを確認する。その際、マーカ部１５が目標位置範囲３４４内にあればＸＹステージ３５１の位置合わせは完了する。一方、マーカ部１５が目標位置範囲３４４外にあれば、再度上記位置合わせを行う。次いで、この位置合わせが完了した後、当該位置(上記パルス数)を記憶しておく。なお、ＸＹステージ３５１の位置合わせ後、マーカ部１５の位置が変化していない場合は駆動用モータの脱調とみなし、アラームを発して分析を中止する。
［蛍光検出］
このステップでは、再度検出手段３４の対物レンズ３３４を駆動させ、フォーカス位置を調整する。なお、フォーカス位置の再調整は、ＸＹステージの移動による垂直方向のずれを補正するためであるが、検出手段３４および分析サンプルｓが十分な被写界深度を有するのであれば、本調整は不要である。
次いで、フィルタ切替機構３３２を用い、中央値が波長４９０ｎｍおよび５９５ｎｍの２つの波長帯の励起光を切り替えながら分析領域１２に当該励起光を照射し、都度蛍光を検出する。ここで、中央値が波長４９０ｎｍの励起光はＦＡＭ−ｄＣＴＰおよびＣｙ３−ｄＡＴＰを、中央値が波長５９５ｎｍの励起光はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−ｄＧＴＰおよびＣｙ５−ｄＴｓＴＰを、それぞれ蛍光検出するために用いられる。
分析サンプル１２から発せられた蛍光は、蛍光分離用ダイクロイックミラー３４１を介して２つの検出器３４３に取り込まれる。ここで、蛍光分離用ダイクロイックミラー３４１は、４色の蛍光波長領域について緩やかな反射特性を持つので、２つの検出器３４３を用いて分析サンプルｓから発した輝点の蛍光強度比をそれぞれ算出することができる。そのため２つの検出器３４３における結像面上での強度比を算出することによって、この分析サンプルｓの蛍光が上述した４色の蛍光のいずれに帰属するかを判定することが可能となる。なお、分析領域１２には、数万〜数十万の分析サンプルｓが担持されており、蛍光検出によりどの位置の分析サンプルｓがどの蛍光を発したかを一括して検出する。
次に、蛍光検出で検出された蛍光画像ｋの一例を図１１に示す。図１１において、符号３４５は蛍光画像ｋの画素、符号１３’は吸着部１３に対応する蛍光画像ｋ上の部位、符号１５’はマーカ部１５に対応する蛍光画像ｋ上の部位をそれぞれ示している。図１１は、各吸着部１３が１．４μｍ間隔で配置され、検出手段３４の空間分解能が０．２８μｍ／画素であり、吸着部１３が蛍光画像ｋの５画素間隔と同じ間隔で配置されている場合の蛍光画像の例である。また、この例では、分析サンプルｓの大きさが０．２８μｍ以上である。そのため、分析サンプルｓの蛍光検出時は、十字状のマーカ部１５の端から５画素間隔でサンプル位置を特定し、各分析サンプルｓの位置ごとに９画素（３画素四方）の蛍光検出を行う。
一つの分析領域１２での蛍光検出完了後、次の分析領域１２に移動する。次いで、再度ＸＹステージ３５１の位置合わせを行い、当該分析領域１２での蛍光検出を行う。このようなＸＹステージ３５１の移動、分析サンプルｓの位置合わせ、分析サンプルｓの位置の記憶、および蛍光検出を全分析領域１２が完了するまで繰り返す。なお、分析時間を短縮するため、上記分析サンプルｓの位置合わせは任意の分析領域１２のみで行い、他の分析領域１２では上述の記憶した位置情報を用いて行ってもよい。以上が当該分析における１サイクルの動作の概略である。
次いで、２サイクル目以降を行う。２サイクル目以降のステージ移動において、上記１サイクル目の位置合わせで得られた最初の分析領域１２の位置へ移動し、位置合わせを行う。この位置合わせは、核酸分析装置６００内部の温度変化による熱膨張を補正するために行う。この位置合わせ完了後、補正した位置を記憶する。
次の分析領域１２以降は、1サイクル目で得られた最初の分析領域１２からの相対位置で移動する。例えば、1サイクル目での最初の分析領域１２およびそれ以降２つの分析領域１２の位置が、それぞれ１，０００μｍ、２，０００μｍ、３，０００μｍであったとする。そして２サイクル目の最初の分析領域１２が９５０μｍである場合、以降２つの分析領域１２の位置は、それぞれ１，９５０μｍおよび２，９５０μｍとなる。
なお、この動作ではＸＹステージ３５１の繰返し位置決め精度の誤差分、位置ずれが生じる可能性がある。ＸＹステージ３５１の繰返し位置決め精度が十分小さい場合、検出ロスはほとんど生じないが、大きい場合は無視できない。もし上記繰返し位置決め精度が大きい場合は、検出ロスと検出時間を考慮し、位置合わせをする分析領域１２を増加する必要がある。
以上のサイクルを繰返し、分析サンプルｓのＤＮＡ塩基配列を分析する。例えば、ある分析サンプルｓがサイクルごとにＣｙ３→Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ→ＦＡＭ→Ｃｙ５→・・・の蛍光を発したとすると、蛍光色素に対応したｄＮＴＰから、サンプルの塩基配列はＡ→Ｇ→Ｃ→Ｔ→…と決定することができる。このようにして、数万〜数十万の分析サンプルｓを一括して蛍光検出し、これらの分析サンプルｓ全ての塩基配列を並列に決定する。
なお、この例では1サイクル目から分析サンプルｓのＤＮＡ塩基配列の分析を開始したが、1サイクル目は分析領域１２のマッピング動作としてもよい。このマッピング動作では、例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−ｄＧＴＰを全分析サンプルのＤＮＡ断片に取り込ませると、５９５ｎｍの励起光で全分析サンプルが蛍光を発する。これにより、マーカ部をより確実に検出できるので、位置合わせができない分析領域１２を低減することができる。
このように、当該核酸分析装置６００は、当該核酸分析用基板１００を有する核酸分析用フローセル５００を備えているので、繰り返し位置合わせする場合であっても、吸着部１３の位置を再現よく割り出すことができ、その結果、ＤＮＡ断片の塩基配列を確実かつ迅速に分析することができる。
なお、本発明の核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置は、上述した実施形態の構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
例えば、上述した実施形態では、マーカ部１５の形状として十字状やカギ状のものを例示したが、例えば星形状や円形状など、分析領域１２においてマーカ部１５の位置を特定できる限り、いずれの形状のマーカ部をも採用することができる。
また、図４および図５においては、マーカ部１５が分析領域１２の中心部および４つの角部に形成されている核酸分析用基板４００について説明したが、上記中心部にマーカ部１５が形成されていないものや、一方の対角のみにマーカ部１５が設けられているもの等も本発明の範疇である。
また、上述した核酸分析用フローセル５００の説明では、核酸分析用基板１００を備えているものについて説明したが、本発明の核酸分析用基板の構成を満たす限り、いずれの核酸分析用基板をも採用することができる。
また、図７においては、互いに略平行かつ離間するように配設されている２本のスペーサ２２を備えている核酸分析用フローセル５００について説明したが、３本以上のスペーサ２２を備え、複数本の流路２３を備えている核酸分析用フローセルであってもよく、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の材料を用いて形成され流路部を中抜きした中抜きシートを備えている核酸分析用フローセル等を採用することもできる。
また、上述した核酸分析装置６００の説明では、核酸分析用フローセル５００を備えているものについて説明したが、本発明の核酸分析用フローセルの構成を満たす限り、いずれの核酸分析用フローセルをも採用することができる。
また、図８においては、検出手段３４が２つの検出器３４３を備えている核酸分析装置６００について説明したが、蛍光分離用ダイクロイックミラーを増設し、検出手段３４が３つまたは４つの検出器を有する核酸分析装置であってもよい。
１０ 基板
１１ 反応領域
１２ 分析領域
１３ 吸着部
１４ 非吸着部
１５ マーカ部
２１ 光透過性カバー
２２ スペーサ
２３ 流路
２３ａ 注入口
２３ｂ 排出口
３１ 流通手段
３２ 温調手段
３３ 照射手段
３４ 検出手段
３５ 移動手段
１００、２００、３００、４００ 核酸分析用基板
５００ 核酸分析用フローセル
６００ 核酸分析装置
ｓ 分析サンプル
ｋ 蛍光画像
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は、核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置に関する。
背景技術
［０００２］
近年、核酸の塩基配列を分析する方法として、多数のＤＮＡ断片の塩基配列を並行して分析する方法が知られている。この方法では、例えば、フォトリソグラフィ技術やエッチング技術などを用いて基板上にＤＮＡ断片等を吸着可能な多数の吸着部と吸着し難い非吸着部とを形成し、上記吸着部に分析対象となるＤＮＡ断片等を吸着させて分析を行う（例えば、特許文献１参照）。
［０００３］
上述のような分析方法では、塩基に対応する蛍光色素付き基質を導入した多数のＤＮＡ断片を含む分析領域に励起光を照射し、個々のＤＮＡ断片から発せられる蛍光を検出して塩基を特定する（例えば、非特許文献１参照）。
［０００４］
このような分析方法では、通常、上記分析領域は一つの基板に複数設けられ、一回照射するごとに分析領域を換えて全ての分析領域で分析を行った後、ポリメラーゼ伸長反応を用いて新たな蛍光色素付き基質の導入により上記と同様な操作で各分析領域を分析し、これを繰り返すことで効率よく塩基配列を決定することができる。
先行技術文献
特許文献
［０００５］
特許文献１：米国特許出願公開第２００９／０２７０２７３号明細書
非特許文献
［０００６］
非特許文献１：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００５年、第３０９巻、ｐ．１７２８−１７３２

Claims (8)

  1. 基板上に区画された複数の分析領域を有し、前記各分析領域を順次換えて測定される核酸分析用基板であって、
    前記分析領域は、ＤＮＡ断片または前記ＤＮＡ断片を担持した担持体を吸着可能な吸着部と、前記吸着部以外の非吸着部とにより構成され、
    前記非吸着部は、少なくとも一部に前記分析領域の位置を割り出すための所定形状のマーカ部を備えていることを特徴とする核酸分析用基板。
  2. マーカ部の平面視の形状が、少なくとも隣り合う分析領域どうしで互いに異なっている請求項１に記載の核酸分析用基板。
  3. マーカ部の平面視の形状が、全ての分析領域で異なっている請求項２に記載の核酸分析用基板。
  4. 各分析領域は複数の吸着部を有し、前記各吸着部が碁盤目状に配列されている請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の核酸分析用基板。
  5. 非吸着部の全領域がマーカ部であり、分析領域における前記マーカ部以外の領域が吸着部である請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の核酸分析用基板。
  6. マーカ部が、分析領域内における各吸着部位置の補正に用いられる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の核酸分析用基板。
  7. 請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の核酸分析用基板と、
    前記核酸分析用基板に対向するように配設され、光を透過する光透過性カバーと、
    前記核酸分析用基板と前記光透過性カバーとの間に設けられ、互いに略平行かつ離間するように配設された複数のスペーサと、
    前記核酸分析用基板と前記光透過性カバーとの間の隣り合うスペーサに挟まれた部位に形成され、流体が流通する流路と、
    前記流路の一端に開口し、前記流体を注入する注入口と、
    前記流路の前記注入口と反対側の他端に開口し、前記流体を排出する排出口とを備えている核酸分析用フローセル。
  8. 請求項７に記載の核酸分析用フローセルと、
    前記核酸分析用フローセルの流路に流体を流通させる流通手段と、
    ＤＮＡ断片の反応温度を調整する温調手段と、
    光透過性カバーを介して分析対象となる分析領域に励起光を照射する照射手段と、
    前記励起光の照射によりＤＮＡ断片から放出された蛍光を前記光透過性カバーを介して検出すると共に、検出された前記蛍光から前記分析領域におけるマーカ部の位置を検出する検出手段と、
    前記核酸分析用フローセルが載置され、前記マーカ部を目印にして当該分析領域を所定の位置に移動させる移動手段とを備えている核酸分析装置。
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