KR20240025515A - 선형 푸리에 기점 - Google Patents
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Abstract
본 접근법은 일반적으로 표면을 스캐닝할 때 선형 이동의 편차를 검출하기 위한 이미지-기반 접근법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 접근법은 스캐닝 이미지화 시스템의 작동 동안 선형 스캔 경로의 편차를 실시간으로 검출하기 위한 선형 기점의 사용에 관한 것이다. 이러한 선형 기점은 샘플 부위 및 공백 영역 또는 부위 둘 모두를 포함할 수 있거나, 특정 실시예에서, 선형 기점 내의 긴 샘플 부위(예: 선형 특징)를 이용할 수 있다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 6월 25일자로 출원되고 발명의 명칭이 "LINEAR FOURIER FIDUCIAL"인 미국 가출원 제63/215,152호 및 2021년 6월 30일자로 출원되고 발명의 명칭이 "LINEAR FOURIER FIDUCIAL"인 미국 가출원 제63/216,898호에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 이들 둘 모두는 본원에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 접근법은 일반적으로 표면을 스캐닝할 때 선형 이동의 편차를 검출하기 위한 이미지-기반 접근법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 접근법은 스캐닝 이미지화 시스템의 작동 동안 선형 스캔 경로의 편차를 실시간으로 검출하기 위한 선형 기점의 사용에 관한 것이다.
핵산 시퀀싱 맥락에서, 시퀀싱 기기에 사용하기 위한, 유동 셀 또는 다른 시퀀싱 기재와 같은 샘플 홀더는 표면 상의 영구적으로 또는 일시적으로 고정된 위치에 다수의 개별 부위(예: 샘플 웰 또는 나노웰)를 제공할 수 있다. 이러한 부위에는, 많은 부위 중에서 동일하거나 다를 수 있고, 생물학적 샘플과 같은, 다른 관심 재료와 상호 작용할 수 있는 화학적 그룹 또는 생물학적 분자가 포함될 수 있다. 평면 이미지 촬영이나 라인 스캐닝과 같은, 기재 표면의 이미지 촬영을 통해 부위의 위치를 찾고 이를 분석할 수 있다. 이미지 데이터를 처리하여 부위의 적어도 일부의 위치를 찾고 이를 식별하고/하거나 분석 중인 시료와 관련된 정성적 또는 정량적 측정값을 얻을 수 있다. 이러한 맥락에서, 화학적 또는 생물학적 상호작용이 특정 부위에서 발생하는 경우, 상호작용은 부위에서 검출될 수 있고 부위의 위치 및 동일성은 물론, 부위에 존재하는 특정 그룹 또는 분자와 상관될 수 있다.
스캐닝 이미지화 시스템을 사용하는 시퀀싱 기기의 경우, 스캐닝 동안 이동 스테이지의 임의의 횡방향 이동은 획득된 이미지에서 추출된 시퀀싱 데이터의 저하를 야기할 수 있다. 기울어진 각도에서 직선 이동을 검출하고 보상을 적용할 수 있다. 그러나, 통상적으로 직선 이동의 편차를 검출하고 보상하기 위한 적합한 방법이 없었다. 이러한 작동이 통상적으로 각각의 샘플 클러스터의 위치가 0.1 내지 0.2 픽셀까지 정확할 것을 요구함에 따라, 선형 이동의 이러한 편차는, 시퀀싱 맥락에서, 시퀀싱 작동의 품질에 영향을 줄 수 있다. 현재 시스템에서, 이는 대략 70nm와 동일하다. 또한, 개발 중인 더 높은 밀도의 유동 셀은 40nm 이상의 정확도가 필요할 것으로 예상된다. 이러한 크기의 선형 이동 편차는 기존 판독 접근법을 사용하여 빈번하게 발생할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 선형 운동의 편차를 검출하고 보상하는 것은 이러한 시퀀싱 맥락에서 적절하다.
본 발명은, 복수의 부위가 기재의 표면 상에 고정된 물리적 위치에 배치되는, 기재를 포함하는, 제조 물품을 제공한다. 이러한 물품의 일례는 시퀀싱 유동 셀과 연관된 부위의 패턴화된 배열을 포함할 수 있으며, 여기서 부위 중 일부 또는 전부는 관심 재료를 보유하도록 구성될 수 있다.
일 실시예에서, 선형 스캐닝에 적합한 기재가 제공된다. 이러한 실시예의 다양한 구현에 따르면, 샘플 부위 또는 웰(예: 나노웰)은 주기적 또는 반복 패턴(예: 육각형 또는 직선 패턴)으로 기재의 비기점 영역 상에 배열될 수 있다. 반대로, 기점 영역에서는, 샘플 부위와 "공백" 영역 또는 웰의 조합(예: 웰이 일반적으로 비기점 패턴에 따라 형성(예: 나노 각인) 되지만 제조 중에 웰이 형성(또는 완전히 형성)되지 않거나 웰이 형성되었지만 샘플을 포함하지 않은 위치)인 기점(예: 선형 기점)이 제공된다. 예를 들어, 본원에서 논의된 다양한 실시예에서, 기점(예: 선형 기점)은 "공백" 부위 또는 웰의 각자의 행 사이의 샘플 부위의 전체 행; "공백" 부위 또는 웰의 각자의 행 사이의 샘플 부위의 부분 행(예: 교번하는 샘플 웰 및 "공백"); 또는 각각의 행은 샘플 부위 및 "공백" 둘 모두를 포함하지만, 모든 행은 적어도 하나의 샘플 부위를 갖는(즉, 기점 내에 "사이트 없는" 행이 없음), 다수의 행을 포함한다.
전술한 내용을 염두에 두고, 각각의 실시예가 제공된다. 이 실시예에 따르면, 패턴화된 유동 셀은 기재 및 기재의 비기점 영역 내의 복수의 샘플 부위를 포함한다. 복수의 샘플 부위는 주기적 패턴으로 배열된다. 패턴화된 유동 셀은 복수의 샘플 부위로부터 분리된 기재 상에 형성된 복수의 거친 정렬 기점 및 기재 상에 형성된 복수의 선형 기점을 추가로 포함한다. 각각의 선형 기점은 주기적 패턴에 따라 배열된 샘플 부위 및 공백을 포함한다. 각 공백은 샘플 부위가 위치해야 하지만 없거나 빈 샘플 부위가 위치하는 주기적 패턴의 위치에 해당한다.
추가의 실시예에서, 패턴화된 유동 셀이 제공된다. 이 실시예에 따르면, 패턴화된 유동 셀은 기재 및 기재의 비기점 영역 내의 복수의 샘플 부위를 포함한다. 복수의 샘플 부위는 주기적 패턴으로 배열된다. 패턴화된 유동 셀은 복수의 샘플 부위로부터 분리된 기재 상에 형성된 복수의 거친 정렬 기점 및 기재 상에 형성된 복수의 선형 기점을 추가로 포함한다. 각 선형 기점은 세장형 샘플 부위를 포함한다. 각 세장형 샘플 부위는 2개 이상의 샘플 부위와 연관된 영역에 걸쳐 있다.
다른 실시예에서, 이미지화 작동에서 선형 스캔 경로의 편차를 보정하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법에 따르면, 이미지화 작동을 수행한 패턴화된 표면은 선형 스캔 경로를 따라 전진된다. 패턴화된 표면은 선형 스캔 경로를 따라 전진되면서 이미지화된다. 패턴화된 표면은 복수의 선형 기점을 포함한다. 선형 스캔 경로의 편차는 복수의 선형 기점을 사용하여 검출된다. 선형 스캔 경로의 편차는 패턴화된 표면이 이미지화되는 동안 보정된다.
추가 실시예에서, 시퀀싱 기기가 제공된다. 이 실시예에 따르면, 시퀀싱 기기는: 샘플 용기를 지지하도록 구성된 샘플 스테이지; 상기 샘플 스테이지 상에 존재할 때 상기 샘플 용기를 이미지화하기 위해 조합하여 작동하도록 구성된 대물 렌즈, 광검출기, 및 광원; 및 작동을 수행하도록 구성된 제어기를 포함하고, 상기 작동은: 선형 스캔 경로를 따라 이미지화 작동을 수행한 상기 샘플 용기를 전진시키는 단계; 상기 선형 스캔 경로를 따라 전진됨에 따라 상기 샘플 용기의 패턴화된 표면을 이미지화하되, 상기 패턴화된 표면은 복수의 선형 기점을 포함하는 단계; 상기 복수의 선형 기점을 사용하여 상기 선형 스캔 경로의 편차를 검출하는 단계; 및 상기 패턴화된 표면이 상기 시퀀싱 기기에 의해 이미지화되는 동안 상기 선형 스캔 경로의 편차를 보정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이들 및 기타 특징, 양태 및 이점은 도면 전반에 걸쳐 유사한 문자가 유사한 부분을 나타내는 첨부된 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽을 때 더 잘 이해될 것이다.
도 1은, 본 개시의 양태에 따른, 이미지 스캐닝 시스템의 일례의 상위 레벨 개요를 도시한다.
도 2는, 본 개시의 양태에 따른, 예컨대 생물학적 샘플을 위한, 이미지화 및 이미지 처리 시스템의 블록도 도시이다.
도 3은 도 2에 도시된 유형의 시스템에서 사용하기 위한 데이터 분석 시스템에 포함될 수 있는 기능 컴포넌트의 도식적 개요이다.
도 4는, 본 개시의 양태에 따른, 예시적인 패턴화된 표면의 평면도이다.
도 5는 도 4의 패턴화된 표면의 일부의 확대 절취도이다.
도 6은, 본 개시의 양태에 따른, 예시적인 패턴화된 유동 셀 표면 상의 부위를 도시하는 추가 절취도이다.
도 7은 처리 동안 부위에 대한 이미지 데이터의 픽셀화를 도시하는 패턴화된 유동 셀 표면의 2개의 예시적인 부위의 확대도이다.
도 8은, 본 개시의 양태에 따른, 선형 기점을 사용하여 선형 스캔 경로의 편차를 보정하기 위한 단계들의 프로세스 흐름을 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 각각, 본 개시의 양태에 따른, 종래의 기점 및 선형 기점 둘 모두를 포함하는 이미지 타일의 예를 도시한다.
도 10은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 일례를 도시한다.
도 11은, 본 개시의 양태에 따른, 수직으로 배열된 선형 기점의 레이아웃의 일례를 도시한다.
도 12는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 13은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 다른 일례를 도시한다.
도 14는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 15는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 16은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 17은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 다른 일례를 도시한다.
도 18은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 19는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 20은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 다른 일례를 도시한다.
도 1은, 본 개시의 양태에 따른, 이미지 스캐닝 시스템의 일례의 상위 레벨 개요를 도시한다.
도 2는, 본 개시의 양태에 따른, 예컨대 생물학적 샘플을 위한, 이미지화 및 이미지 처리 시스템의 블록도 도시이다.
도 3은 도 2에 도시된 유형의 시스템에서 사용하기 위한 데이터 분석 시스템에 포함될 수 있는 기능 컴포넌트의 도식적 개요이다.
도 4는, 본 개시의 양태에 따른, 예시적인 패턴화된 표면의 평면도이다.
도 5는 도 4의 패턴화된 표면의 일부의 확대 절취도이다.
도 6은, 본 개시의 양태에 따른, 예시적인 패턴화된 유동 셀 표면 상의 부위를 도시하는 추가 절취도이다.
도 7은 처리 동안 부위에 대한 이미지 데이터의 픽셀화를 도시하는 패턴화된 유동 셀 표면의 2개의 예시적인 부위의 확대도이다.
도 8은, 본 개시의 양태에 따른, 선형 기점을 사용하여 선형 스캔 경로의 편차를 보정하기 위한 단계들의 프로세스 흐름을 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 각각, 본 개시의 양태에 따른, 종래의 기점 및 선형 기점 둘 모두를 포함하는 이미지 타일의 예를 도시한다.
도 10은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 일례를 도시한다.
도 11은, 본 개시의 양태에 따른, 수직으로 배열된 선형 기점의 레이아웃의 일례를 도시한다.
도 12는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 13은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 다른 일례를 도시한다.
도 14는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 15는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 16은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 17은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 다른 일례를 도시한다.
도 18은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 19는, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 추가 일례를 도시한다.
도 20은, 본 개시의 양태에 따른, 선행 기점의 레이아웃의 다른 일례를 도시한다.
본 개시는, 패턴화된 유동 셀의 부위 또는 웰과 같은, 패턴화된 표면의 특징의 위치를 찾고, 스캔 작동 동안 실시간으로 선형 운동의 편차를 검출하는 데 유용한, 처리, 이미지화, 및 이미지 데이터 분석을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 상기 시스템 및 방법은 이러한 패턴화된 표면의 다수의 이미지 또는 하위-이미지를 등록하는 데 사용될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 유동 셀(처리를 통해 표면 상의 부위의 이미지 데이터, 또는 다른 형태의 검출 출력을 생성함)에 사용되는 패턴화된 표면은, 생물학적 샘플의 분석에 사용되는 것과 같은, 분석 샘플 홀더의 유형일 수 있다. 이러한 패턴화된 표면은, 본원에 설명된 방법 및 시스템이 적합한 해상도(예: 1 미크론 미만의 해상도 범위)에서 분해될 특징(예: 샘플 웰 또는 나노웰과 같은 샘플 부위)의 반복 패턴을 포함할 수 있다. 많은 응용에서, 이미지화되고 분석될 재료는, 유리 재료와 같은, 하나 이상의 지지체의 하나 이상의 표면 상에 위치할 것이다. 다양한 화학적 또는 구조적 특징은 처리(예: 혼성화, 추가 분자와 조합, 이미지화, 분석)될 재료의 세그먼트 또는 단편을 결합하거나 고정하기 위해(또는 달리 국소화하기 위해) 부위에서 사용될 수 있다. 기준 마커 또는 영역, 또는 간단히 "기점"은 부위에 대해 알려진 위치에 배치되어, (예: 이미지화를 위한) 시스템에서 지지체의 위치를 찾고, 후속 이미지 데이터에서 부위의 위치를 찾는 데 도움이 된다. 본원에 논의된 바와 같이, 특정 기점, 즉 본원에 기술된 바와 같은 선형 기점은, 적어도 부분적으로, 생물학적 샘플(즉, 샘플 부위)의 처리에 사용되는 부위로부터 형성될 수 있지만, 통상적으로 규칙적이거나 주기적인 패턴(예: 육각형 또는 직선 패턴)으로 배열되는, 샘플 부위의 비기점 패턴으로부터 광학적으로 식별 가능하도록 배열된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 이러한 규칙적인 또는 주기적인 패턴은 병진적으로 주기적이며, 하나 이상의 방향으로 반복된다.
더 상세히 후술되는 바와 같이, 스캐닝 이미지화 시스템을 사용하는 시퀀싱 기기는 통상적으로 작동 동안 이미지화된 기재에 대해 이미지화 광학계를 이동시킨다. 스캐닝 동안 이동 스테이지의 임의의 횡방향 이동은 획득된 이미지로부터 추출된 시퀀싱 데이터의 저하를 야기할 수 있다. 기울어진 각도에서 직선 이동을 검출하고 보상할 수 있지만, 직선 이동의 편차를 검출하고 보상하기 위한 적합한 접근법이 없었다. 시퀀싱 맥락에서, 각 샘플 클러스터의 위치가 0.1 내지 0.2 픽셀까지 정확하다는 것은 염기 호출 품질에 필수적이다. 현재 시퀀싱 시스템에서, 이는 대략 70nm와 동일하다. 그러나, 개발 중인 더 높은 밀도의 유동 셀은 40nm 이상의 정확도를 필요로 할 수 있다. 불행하게도, (이미지화를 수행한 유동 셀을 유지하고 이동시키도록 구성된) 현재 스테이지의 데이터 분석은 이러한 크기의 선형 이동의 편차가 허용 불가능한 속도에서 정상 작동 동안 발생할 수 있음을 보여준다.
이러한 선형 이동의 편차를 보상하기 위해, 스캐닝 이미지화 시스템의 작동 동안 실시간으로 편차가 검출될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 선형 이동의 편차의 이러한 실시간 검출을 허용하는 접근법 및 구조가 기술된다. 예를 들어, 특정 실시예는, 픽셀 행의 1차원 푸리에 변환을 사용하는 것과 같이, 스캐닝 시스템의 횡방향 이동의 고해상도 실시간 검출을 위해 특수 선형 기점을 채용한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "패턴화된 유동 셀"을 포함하는 "시퀀스 유동 셀"은 샘플 유지 및/또는 처리 구조체 또는 장치인 것으로 이해될 수 있음에 유의할 수 있다. 이러한 장치는 분석물이 처리 및 분석을 위해 위치할 수 있는 부위(즉, 샘플 부위 또는 결합 부위)를 포함한다.
본원에 논의된 바와 같이, 핵산 시퀀싱 기법에서, 공간적으로 분리되고 기재 상에 국부화될 수 있는, 핵산의 올리고머 또는 중합체 사슬은 생화학적 처리 및 이미지화의 여러 사이클을 거칠 수 있다. 일부 예에서, 각 주기마다, 해당 사이클에서 생화학적으로 처리된 뉴클레오티드 염기에 따라, 각 특징에서 4개의 상이한 표지 중 하나가 검출될 수 있다. 이러한 예에서, 다수(예: 4개)의 상이한 이미지가 주어진 사이클에서 획득되고, 각각의 특징이 이미지에서 검출될 것이다. 시퀀싱은 다수의 사이클을 포함하고, 연속적인 사이클의 이미지 데이터에 표시된 특징의 정렬은 각자의 부위에서 검출된 표지의 시퀀스에 기초하여 각 부위에서 뉴클레오티드의 시퀀스를 결정하는 데 사용된다. 이미지의 부적절한 동록은 예상된 선형 운동의 편차로 인해 이미지화된 부위에서 클러스터의 부적절한 국소화를 포함하는 시퀀스 분석에 악영향을 줄 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "기점"은 (분석할 분자 재료에 대한 부위가 있는 지지체 또는 기재와 같은) 객체에서 및 상기 객체의 획득된 이미지 데이터에서 구별 가능한 참조 영역(예: 점 또는 영역)를 의미하도록 의도된다. 기점은, 예를 들어, 마크, 객체, 형상, 에지, 영역, 불규칙성, 채널, 구덩이, 기둥, 또는, 많은 경우에서와 같이, 기준으로 사용될 수 있는 알려진 위치, 지오메트리, 및/또는 구성에서의 특징의 집합일 수 있다. 기점은 객체의 이미지에서 또는 객체를 검출(예: 이미지화)에서 도출된 다른 데이터 세트에서 검출될 수 있다. 기점은 객체의 평면(예: 패턴화된 유동 셀의 하나 이상의 표면)의 x-좌표 및/또는 y-좌표를 특징으로 할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기점은 x, y 평면에 직교하는 z 좌표에 의해 특정될 수 있어서, 예를 들어, 객체와 검출기의 상대 위치에 의해 정의된다. 기점에 대한 하나 이상의 좌표는 객체의 또는 상기 객체에서 도출된 이미지 또는 다른 데이터 세트의 하나 이상의 다른 특징에 대해 특정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 특정 기점(예: 선형 기점)은, 웰이 (부위의 근본적 또는 암시적 패턴에 기초하여) 예상될 수 있지만 형성되지 않았거나, 웰이 존재하지만, 함께 또는 집합적으로 고려될 때 비기점 영역과 연관된 패턴으로부터 광학적으로 식별할 수 있는 기점을 형성하는 샘플이 없는(즉, "어두운" 웰) "공백" 또는 "공백 영역"뿐만 아니라 특징(예: 샘플 웰 또는 나노웰과 같은 샘플 부위)의 그룹화 또는 배열을 구성하는 것으로 설명되거나 특징지을 수 있다. 본원에 논의된 특정 실시예에서, 선형 기점에 존재하는 샘플 부위는, 부위의 근본적이고 공유된 패턴(예: 육각형 또는 직선 패턴)에 대해 2개, 3개, 또는 그 이상의 부위 위치에 걸쳐 있는 것과 같이, 비기점 샘플 부위에 대해 신장될 수 있다. 따라서, 본원에 논의된 특정 실시예에서, 기점은 (신장되거나 다른 형태의) 샘플 부위 및 "공백" 영역의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 논의된 다양한 실시예에서, 기점(예: 선형 기점)은 "공백" 부위 또는 웰의 각자의 행 사이의 샘플 부위의 전체 행; "공백" 부위 또는 웰의 각자의 행 사이의 샘플 부위의 부분 행(예: 교번하는 샘플 웰 및 "공백"); 또는 각각의 행은 샘플 부위 및 "공백" 둘 모두를 포함하지만, 모든 행은 적어도 하나의 샘플 부위를 갖는(즉, 기점 내에 "사이트 없는" 행이 없음), 다수의 행을 포함한다. 반대로, 다른 실시예에서, 기점(예: 선형 기점)은 공백 또는 (예: 기재의 비기점 영역에서 발견되는 바와 같은) 신장되지 않은 샘플 부위 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 신장된 샘플 부위를 포함할 수 있다.
기점, 이의 형태, 이의 구성, 및 시스템 및 분석 방법에서의 이의 사용과 관련하여 몇몇 예가 본원에서 설명될 것이다. 자동화된 또는 반자동화된 방식으로 상기 방법을 수행하기 위한 시스템이 또한 제공된다는 것이 이해될 것이며, 이러한 시스템은 프로세서; 데이터 저장 장치; 및 이미지 분석을 위한 프로그램을 포함하고, 상기 프로그램은 이미지 등록, 왜곡 보정 등과 같은 기점 데이터를 처리하거나 활용하기 위해 제공되는 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 명령어를 포함한다. 따라서, 본원에서 논의된 방법은, 예를 들어, 이러한 목적을 위해 필요한 컴포넌트 및 실행 가능 루틴을 갖는, 컴퓨터에서 수행될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 시스템은, 다양한 객체에 있을 수 있는, 생물학적 샘플 및 분자와 같은, 다양한 재료 중 임의의 것을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 유용한 객체는 부착된 분석물을 갖는 고체 지지체 또는 고체상 표면이다. 제시된 방법 및 시스템은, 부착된 분자 집합(예컨대 DNA, RNA, 바이러스로부터의 생물학적 물질, 단백질, 항체, 탄수화물, 소분자(예: 약물 후보), 생물학적 활성 분자, 또는 임의의 다른 관심 분석물)을 갖는 패턴화된 유동 셀과 같은, xy 평면에서 특징의 반복 패턴을 갖는 객체와 함께 사용될 때 이점을 제공할 수 있다.
핵산 및 폴리펩타이드와 같은 생물학적 분자를 갖는 특징(예: 샘플 웰 또는 부위)의 패턴화된 배열을 갖는 기재에 대한 응용이 점점 더 많이 개발되었다. 이러한 패턴화된 특징은 DNA 또는 RNA 프로브를 포함할 수 있다. 이는 식물, 동물(예: 인간) 및 기타 유기체에 존재하는 뉴클레오티드 시퀀스에 특이적이다. 일부 응용에서, 예를 들어, 개별 DNA 또는 RNA 프로브는 패턴화된 유동 셀의 표면의 개별 특징(예: 샘플 웰 또는 부위)에 부착될 수 있다. 예컨대 알려지거나 알려지지 않은 사람 또는 유기체로부터의 테스트 샘플은, 표적 핵산(예: 유전자 단편, mRNA 또는 이의 앰플리콘)이 부위 패턴 내의 각자의 부위에서 상보적 프로브에 혼성화되도록, 부위에 노출될 수 있다. 프로브는(예: 표적 핵산 상에 존재하는 표지로 인해 또는 특징에서 혼성화된 형태로 존재하는 프로브 또는 표적의 효소 표지화로 인해) 표적 특이적 프로세스에서 표지화될 수 있다. 이어서, 패턴화된 표면은, 예컨대 어느 표적 핵산이 샘플 내에 존재하는지를 식별하기 위해 특징에 걸쳐 특정 주파수의 빛을 스캐닝함으로써 검사될 수 있다.
패턴화된 유동 세포는 유전자 시퀀싱 및 유사한 응용에 사용될 수 있다. 대체적으로, 유전자 시퀀싱은 DNA 또는 RNA의 단편과 같은 일정 길이의 표적 핵산 내의 뉴클레오티드의 순서를 결정하는 것을 포함한다. 비교적 짧은 시퀀스는 각각의 특징에서 시퀀싱되고, 생성된 시퀀스 정보는, 단편이 사용 가능한 훨씬 더 광범위한 길이의 유전자 재료의 시퀀스를 확실하게 결정하기 위해, 시퀀스 단편을 함께 논리적으로 맞추는 다양한 생물정보학 방법에서 사용될 수 있다. 단편의 특성화를 위해 자동화된 프로세서 실행 가능 루틴이 사용될 수 있으며, 게놈 매핑, 유전자 및 그 기능 식별, 등과 같은 노력에 사용되었다. 표면 상의 샘플 부위의 패턴화된 배열은, 많은 수의 변이가 존재할 수 있고 이것이 개별 프로브 및 표적에 대해 많은 실험을 수행하는 대안을 대체하기 때문에, 게놈 콘텐츠를 특성화하는 데 유용하다. 따라서, 패턴화된 표면(예: 유동 셀의 패턴화된 표면)은 실제 방식으로 이러한 조사를 수행하기 위한 유용한 플랫폼일 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 샘플 결합 부위 또는 웰을 갖는 다양한 패턴화된 표면(예: 패턴화된 유동 셀) 중 임의의 것이 본원에 기재된 방법 또는 시스템에 사용될 수 있다. 이러한 패턴화된 표면은, 각각이 개별 프로브 또는 프로브 집단을 갖는, 특징을 포함할 수 있다. 후자의 경우에, 각 특징의 프로브의 집단은 균질하여 단일 종의 프로브를 가질 수 있다. 예를 들어, 핵산 시퀀싱 유동 셀의 경우, 각 샘플 웰 또는 부위는 각각 공통 시퀀스를 갖는 다중 핵산 분자를 가질 수 있다. 그러나, 일부 다른 예에서, 패턴화된 표면의 각 부위 또는 웰에서의 집단은 불균질할 수 있다. 마찬가지로, 단백질 기반 패턴 표면은 단일 단백질 또는 단백질 집단의 특징을 가질 수 있으며, 이는 동일한 아미노산 시퀀스를 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 프로브는, 예를 들어, 표면에 대한 프로브의 공유 결합을 통해 또는 프로브와 표면의 비공유 상호작용을 통해 패턴화된 표면에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 핵산 분자와 같은 프로브는, 예를 들어, 미국 특허 제9,012,022호 및 미국 특허 출원 공개 제2011/0059865 A1호에 기재된 바와 같이, 겔 층을 통해 표면에 부착될 수 있으며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
핵산 시퀀싱에 사용되는 패턴화된 표면은 종종 핵산 특징의 랜덤 공간 패턴을 갖는다. 예를 들어, Illumina Inc.에서 구입할 수 있는 HiSeq™ 또는 MiSeq™ 시퀀싱 플랫폼은 랜덤 시딩 후 브릿지 증폭에 의해 핵산(들)이 배치되는 지지체(예: 표면)를 포함하는 유동 셀을 활용한다. 그러나, (개별 반응 부위가 표면 상에 패턴으로 형성되는) 패턴화된 표면은 또한 핵산 시퀀싱 또는 다른 분석 응용에 사용될 수 있다. 예시적인 패턴화된 표면, 그의 제조 방법 및 이의 사용 방법이 미국 특허 제9,512,422호; 제8,895,249호; 및 제9,012,022호; 및 미국 특허 출원 공개 제2013/0116153 A1호; 및 제2012/0316086 A1호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 이러한 패턴화된 표면의 특징(예: 반응 또는 포획 부위 또는 웰)은 단일 핵산 주형 분자를 포획하여, 예를 들어, 브릿지 증폭을 통해 균질한 콜로니의 후속 형성을 시드하는 데 사용될 수 있다. 이러한 패턴화된 표면은 핵산 시퀀싱 적용에 유용하다.
패턴화된 표면 (또는 본원의 방법 또는 시스템에 사용되는 다른 객체) 상의 반응 또는 샘플 결합 부위(예: 샘플 웰 또는 나노웰) 와 같은 특징의 크기는 원하는 응용에 적합하도록 선택될 수 있다. 일부 비제한적인 예에서, 패턴화된 표면의 특징은 단일 핵산 분자만을 수용하는 크기를 가질 수 있다. 이러한 크기 범위 내의 복수의 특징을 갖는 표면은 단일 분자 분해능에서의 검출을 위해 분자의 패턴을 구성하는 데 유용하다. 이 크기 범위의 특징은 각각 핵산 분자 콜로니를 포함하는 특징을 갖는 패턴화된 표면에도 유용하다. 따라서, 패턴화된 표면의 특징은 각각 약 1 ㎟ 이하, 약 500μm2 이하, 약 100μm2 이하, 약 10μm2 이하, 약 1μm2 이하, 약 500nm2 이하, 또는 약 100nm2 이하, 약 10nm2 이하, 약 5nm2 이하, 또는 약 1nm2 이하인 영역을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 패턴화된 표면의 특징은 약 1 ㎟ 이상, 약 500μm2 이상, 약 100μm2 이상, 약 10μm2 이상, 약 1μm2 이상, 약 500nm2 이상, 약 100nm2 이상, 약 10nm2 이상, 약 5nm2 이상, 또는 약 1nm2 이상일 것이다. 실제로, 특징은 위에 예시된 것으로부터 선택된 상한과 하한 사이의 범위에 있는 크기를 가질 수 있다. 표면의 특징에 대한 몇몇 크기 범위이 핵산과 관련하여 그리고 핵산의 스케일로 예시되었지만, 이들 크기 범위 내의 특징은 핵산을 포함하지 않는 응용을 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 특징의 크기는 반드시 핵산 응용을 위해 사용되는 스케일로 한정될 필요는 없다는 것이 추가로 이해될 것이다.
복수의 특징을 갖는 객체(예: 유동 셀 표면)를 포함하는 예의 경우, 특징은 별개일 수 있고, 서로 간의 공간으로 분리될 수 있다. 본 맥락에 유용한 패턴화된 표면은 최대 약 100μm, 약 50μm, 약 10μm, 약 5μm, 약 1μm, 약 0.5μm, 또는 그 이하의 에지 간 거리에 의해 분리되는 특징을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 패턴화된 표면은 적어도 약 0.5μm, 약 1μm, 약 5μm, 약 10μm, 약 50μm, 약 100μm 이상의 에지 간 거리로 분리되는 특징을 가질 수 있다. 이러한 예시적인 범위는 문맥에 의해 제공되며, 비제한적이며, 특징에 대한 평균 에지 간 간격, 및 최소 또는 최대 간격에 적용될 수 있다.
특징의 크기 및/또는 특징의 피치는 패턴화된 표면 상의 특징이 원하는 밀도를 가질 수 있도록 달라질 수 있다. 예를 들어, 규칙적인 패턴의 평균 특징 피치는 최대 약 100μm, 약 50μm, 약 10μm, 약 5μm, 약 1μm, 약 0.5μm, 또는 약 350nm 이하일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 규칙적인 패턴의 평균 특징 피치는 적어도 약 0.5μm, 약 1μm, 약 5μm, 약 10μm, 약 50μm, 또는 약 100μm 이상일 수 있다. 이들 범위는 마찬가지로 규칙적인 패턴에 대해서도 최대 또는 최소 피치에 적용될 수 있다. 예를 들어, 규칙적인 패턴에 대한 최대 특징 피치는 최대 약 100μm, 약 50μm, 약 10μm, 약 5μm, 약 1μm, 또는 약 0.5μm 이하일 수 있고/있거나; 규칙적인 패턴의 최소 특징 피치는 적어도 약 0.5μm, 약 1μm, 약 5μm, 약 10μm, 약 50μm, 또는 약 100μm 이상일 수 있다.
패턴화된 표면의 특징 밀도는 단위 면적당 존재하는 특징 수의 관점에서도 이해할 수 있다. 예를 들어, 패턴화된 표면 상의 특징의 평균 밀도는 최소 약 1x103개의 특징/mm2, 1x104개의 특징/mm2, 1x105개의 특징/mm2, 1x106개의 특징/mm2, 1x107개의 특징/mm2, 1x108개의 특징/mm2, 또는 1x109개의 특징/mm2 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 패턴화된 표면 상의 특징의 평균 밀도는 최대 약 1x109개의 특징/mm2, 1x108개의 특징/mm2, 1x107개의 특징/mm2, 1x106개의 특징/mm2, 1x105개의 특징/mm2, 1x104개의 특징/mm2, 또는 1x103개의 특징/mm2 이하일 수 있다.
패턴화된 표면 상에 제공된 특징은 다양한 형상, 단면, 및 레이아웃 중 임의의 것을 가질 수 있다. 예를 들어, 2차원 평면에서(예컨대 표면에서) 관찰할 때, 특징은 둥근형, 원형, 타원형, 직사각형, 정사각형, 대칭, 비대칭, 삼각형, 다각형 등의 둘레를 가질 수 있다. 특징은, 예를 들어, 육각형 또는 직선 패턴을 포함하는 규칙적인 반복 패턴으로 배열될 수 있다. 원하는 레벨의 패킹을 달성하도록 패턴이 선택될 수 있다. 예를 들어, 둥근형 특징은 육각형 배열에서 최적으로 채워진다. 원형 형상에는 다른 패킹 배열을 사용할 수도 있고 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
일반적으로, 패턴화된 표면은 패턴의 가장 작은 기하학적 단위를 형성하는 하위 집합에 존재하는 특징의 수의 관점에서 특성화될 수 있다. 하위 집합은, 예를 들어, 최소 약 2, 3, 4, 5, 6, 10개 이상의 특징을 포함할 수 있다. 특징의 크기 및 밀도에 따라, 기하학적 단위는 약 1 ㎟, 약 500μm2, 약 100μm2, 약 50μm2, 약 10μm2, 약 1μm2, 약 500nm2, 약 100nm2, 약 50nm2, 약 10nm2 이하 보다 적은 면적을 점유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기하학적 단위는 약 10nm2, 약 50nm2, 약 100nm2, 약 500nm2, 약 1μm2, 약 10μm2, 약 50μm2, 약 100μm2, 약 500μm2, 약 1 ㎟ 이상의 면적을 점유할 수 있다. 형상, 크기, 피치 등과 같은 기하학적 단위의 특징의 특성은 패턴화된 표면에 제공된 특징과 관련하여 보다 일반적으로 본원에 설명된 것 중에서 선택될 수 있다.
특징의 규칙적인 패턴을 갖는 표면은 특징의 상대 위치에 대해 순서화될 수 있지만, 각 특징의 하나 이상의 다른 특성에 대해서는 랜덤할 수 있다. 예를 들어, 핵산 시퀀싱 표면의 경우, 핵산 특징은 상대 위치에 따라 정렬될 수 있지만 임의의 특징에 존재하는 핵산 종에 대한 서열에 대한 지식에 대해서는 랜덤일 수 있다. 더 구체적인 예를 들어, 특징의 반복 패턴을 주형 핵산을 시딩하고 각 특징에서의 주형을 증폭시켜 (예: 클러스터 증폭 또는 브리지 증폭을 통해) 특징에서 주형의 복제물을 형성함으로써 형성된 핵산 시퀀싱 표면은 규칙적인 패턴의 핵산 특징을 가질 것이지만, 패턴에 걸쳐서 핵산의 시퀀스의 분포에 관해서는 랜덤할 것이다. 따라서, 표면 상의 핵산 재료의 존재의 검출은 특징의 반복 패턴을 산출할 수 있는 반면, 시퀀스 특이적 검출은 표면에 걸쳐서 신호의 비-반복 분포를 산출할 수 있다.
이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 제공된 패턴, 순서, 랜덤성 등의 설명은 오직 객체(예: 이러한 특징(예: 고체 지지체 또는 표면 상의 특징)을 갖는 고체 기재) 상의 특징에 관련될 뿐만 아니라, 본원에 기술된 바와 같은 특징을 갖는 이러한 객체를 포함하거나 도시하는, 이미지 데이터 또는 이러한 이미지 데이터로부터 생성된 이미지에 관련된 것이다. 이와 같이, 패턴, 순서, 랜덤성 등은, 컴퓨터 판독가능 매체 또는 컴퓨터 컴포넌트, 예컨대 그래픽 사용자 인터페이스 또는 다른 출력 장치를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 이미지 데이터를 저장, 조작 또는 통신하는 데 사용되는 다양한 포맷들 중 임의의 것으로 존재할 수 있다.
위에서 그리고 전체적으로 논의된 바와 같이, 패턴화된 유동 셀은 유동 셀의 표면에 각인된 샘플 부위(예: 웰 또는 나노웰)의 규칙적인 패턴을 갖는다. 이러한 패턴은 일반적으로 육각형 또는 정사각형이며, 상이한 배향을 가질 수 있다. 실제로, 육각형 패턴은 선형 스캐닝 이미지화 시스템을 사용하는 현재 시스템에서 관례적으로 사용된다. 이러한 맥락에서, 육각형 패턴은 통상적으로 스캐닝 방향에 직각으로 정렬된 하나의 축을 가질 수 있다. 이러한 축은 통상적으로 이미지 수직 축이 스캐닝 방향과 정렬되는 상태로 이미지가 통상적으로 제시되는 방식으로 인해 "수평"으로 지칭된다. 개별 웰의 위치는 통상적으로 유동 셀 패턴 상의 공지된 위치에서 기점을 사용함으로써 가능하게 된다.
종래의 접근법에서, 본원에서 관례적인 또는 거친 정렬 기점으로 지칭될 수 있는, 특정 기점은 동심의 어두운 원과 밝은 원으로 이루어진 "과녁 모양" 패턴의 형태일 수 있다. 유동 셀로부터 스캐닝된 각각의 이미지(통상적으로 "타일" 또는 "이미지 타일"로 지칭되는 각각의 이미지)는 현재 플랫폼 상에 4 내지 8개의 과녁 모양 기점을 가질 수 있다. 이러한 "과녁 모양" 기점에서 획득된 이미지 데이터는 이미지의 두 주축을 따라 이동, 기울어짐, 배율 변화를 보상하는 등의 이미지 보정을 수행하는 데 사용될 수 있는, 아핀 변환과 같은, 기하학적 변환을 생성하는 데 사용된다. 그러나, 이러한 "과녁 모양" 기점에서 획득된 이미지 데이터는 이미지 지오메트리의 비선형 보정을 위한, 즉 이미지화 광학계에 대한 샘플의 선형 이동 편차를 식별하고 보정하기 위한 충분한 정보를 제공하지 않는다.
스캐닝 메커니즘의 횡방향 이동(예: 선형 운동 편차)을 검출하는 한 가지 방법은 유동 셀의 웰 패턴에 대한 1차원(1-D) 푸리에 변환을 사용한다. 이는 웰 패턴의 기간에 해당하는 푸리에 변환에서 피크의 위상을 검출함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 이 접근법의 유용성에 영향을 미칠 수 있는 두 가지 문제가 있다. 먼저, 유동 셀의 웰 패턴의 간격(즉, 피치)은 광학 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 샘플링 한계 미만일 수 있다. 예를 들어, 각각의 웰 위치에 대한 이미지에 2개 미만의 픽셀이 존재할 수 있다(예: 1.9 픽셀/웰). 그 결과, 웰 패턴의 기간은 1-D 푸리에 변환으로 직접 표현될 수 없다. 그러나, 앨리어싱을 이용함으로써, 여전히 약간 또는 중간 정도 과소 샘플링된 데이터의 위상을 안정적으로 검출하여, x-방향으로의 횡방향 이동을 정확하게 추정할 수 있다.
그러나, 샘플 밀도를 증가시키고, 이에 따라, 처리량 및 효율을 개선하기 위해, 유동 셀의 피치를, 예컨대 1.8 픽셀/피치 이하의 유동 셀 피치(예: 1.7 픽셀/피치)로 감소시키는 인센티브가 존재한다. 약간의 중간 정도의 과소 샘플링된 데이터를 처리하는 데 사용되는 앨리어싱 접근법은 이 정도의 과소 샘플링을 해결하는 데 적합하지 않다.
육각형 유동 셀 패턴과 관련된 추가적인 문제는 대안적인 행이 서로에 대해 1/2 웰 거리만큼 오프셋된다는 것이다. 그 결과, 일부 1-D 푸리에 변환은 신호를 상실하며, 여기서 픽셀 행은 유동 셀 상의 2개 행의 샘플 웰에 걸쳐 있다.
이들 문제를 염두에 두고, 이러한 문제 중 하나 또는 둘 모두를 해결하는 데 사용될 수 있는, 본원에서 선형 기점으로 지칭되는, 다양한 기점이 본원에 기술된다. 본원에서 논의된 선형 기점에서, 다수의 웰 위치는 웰 부위의 전체 패턴에서 파단을 생성하도록 "비워져" 있을 수 있다. 예를 들어, 기점 패턴은 유동 셀 내의 중심 위치에 걸쳐(예: x-축 또는 다른 축에 대해 중심에 위치한) 비워진 2개의 외측 행 내의 웰을 갖는 3개 행의 웰을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 인접한 행 상의 교번하는 웰 위치로부터 발생하는 문제는 기점에 의해 해결될 수 있다. 하나의 이러한 구현의 제2 양태에서, 웰의 중심 행 내의 교번하는 웰이 또한 비워진다. 이러한 방식으로, 기점에서의 유효 피치가 증가되어, 이러한 기점 패턴에서의 웰 피치가 Shannon-Nyquist 한계에 영향을 받지 않을 것이고, 이에 의해 더 엄격한 픽셀 피치가 유동 셀 내에서 전체적으로 사용되게 한다.
전술한 것은 용어 및 프로세스와 관련하여 유용한 배경 및 맥락을 제공하지만, 다음은 본원에 기술된 바와 같이 기점을 갖는 샘플 기재를 활용하거나 처리할 수 있는 적합한 시스템 및 기능적 작업 흐름의 일례를 제공한다. 예를 들어, 도 1은 생물학적 샘플을 처리하기 위해 개시된 기점 및 해당하는 등록 기술과 함께 사용될 수 있는, 시퀀싱 시스템과 같은, 광학 이미지 스캐닝 시스템(10)의 이례를 도시한다. 이러한 이미지화 시스템(10)과 관련하여, 이러한 이미지화 시스템은 통상적으로 이미지화될 샘플 또는 다른 객체(예: 샘플 웰과 같은, 이격된 샘플 부위의 패턴화된 표면을 갖는 유동 셀 또는 시퀀싱 카트리지)를 유지하는 샘플 스테이지 또는 지지체 및 이미지화 작동에 사용되는 광학계를 포함하는 광학 스테이지를 포함한다는 것이 이해될 수 있다.
도 1을 참조하면, 예시적인 이미지화 스캐닝 시스템(10)은, 유동 셀의 이미지 타일, 하위 타일, 또는 라인과 같은, 영역의 이미지를 획득하거나 생성하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 도 1에 예시된 예는 후면 조명 작동 구성에서 구성된 예시적인 이미지 스캐닝 시스템을 도시한다. 도시된 예에서, 대상 샘플은 대물 렌즈(142) 아래의 샘플 스테이지(170) 상에 위치한 샘플 용기(110)(예: 유동 셀) 상에 배치된다. 광원(160) 및 연관된 광학계가 레이저 광과 같은 광선을 샘플 용기(110) 상의 선택된 샘플 위치로 지향시킨다. 샘플은 형광을 발하고 결과적인 빛은 대물 렌즈(142)에 의해 수집되어 광검출기(140)로 향하여 형광을 검출한다. 샘플 스테이지(170)는 샘플 용기(110) 상의 다음 샘플 위치를 대물 렌즈(142)의 초점에 위치시키기 위해 대물 렌즈(142)에 대해 이동된다. 대물 렌즈(142)에 대한 샘플 스테이지(170)의 이동은 샘플 스테이지 자체, 대물 렌즈, 전체 광학 스테이지, 또는 이들 구조의 임의의 조합을 이동시킴으로써 달성될 수 있다. 추가 예는 또한 고정된 샘플에 대해 전체 이미지화 시스템을 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 유체 전달 모듈 또는 장치(100)는 시약(예: 형광 뉴클레오티드, 완충액, 효소, 절단 시약 등)의 흐름을 샘플 용기(110) 및 폐기물 밸브(120)로(및 이를 통해) 유도한다. 일부 응용에서, 샘플 용기(110)는 샘플 용기(110) 상의 복수의 샘플 위치에서 핵산 시퀀스의 클러스터를 포함하는 유동 셀로서 구현될 수 있다. 시퀀싱될 샘플은, 다른 선택적인 컴포넌트와 함께, 유동 셀의 기재에 부착될 수 있다. 실제로, 유동 셀의 표면 상에 제공된 복수의 샘플 위치는 이격된 샘플 부위(예: 웰 또는 나노웰)로서 배열될 수 있고, 이는 결국 각각이 복수의 샘플 위치의 해당하는 하위 집합을 포함하는 타일, 하위 타일, 및 라인 영역으로 세분될 수 있다.
도시된 예시적인 이미지 스캐닝 시스템(10)은 또한 샘플 용기(110) 내의 유체의 온도 또는 상태를 선택적으로 조절할 수 있는 온도 스테이션 액추에이터(130) 및 히터/쿨러(135)를 포함한다. 카메라 시스템(140)(예: 광검출기 시스템 140)은 샘플 용기(110)의 시퀀싱을 모니터링하고 추적하기 위해 포함될 수 있다. 광검출기 시스템(140)은, 예를 들어, 필터 스위칭 조립체(145), 대물 렌즈(142), 및 포커싱 레이저 조립체(예: 포커싱 레이저(150) 및 포커싱 검출기(141)) 내의 다양한 필터와 상호작용할 수 있는, CCD 카메라로서 구현될 수 있다. 광검출기 시스템(140)은 CCD 카메라로 제한되지 않고, 다른 카메라 및 이미지 센서 기술이 사용될 수 있다.
광원(160)(예: 선택적으로 다수의 레이저를 포함하는 조립체 내의 여기 레이저) 또는 다른 광원이 (선택적으로 하나 이상의 재이미지화 렌즈, 광섬유 장착 등을 포함할 수 있는) 광섬유 인터페이스(161)를 통한 조명을 통하여 샘플 내에서 형광 시퀀싱 반응을 조명하기 위해 포함될 수 있다. 낮은 와트 램프(165) 및 역이색성(185)이 또한 도시된 예에 제시되었다. 일부 응용에서, 포커싱 레이저(150)는 이미지화 동안 꺼질 수 있다. 다른 응용에서, 대안적인 초점 구성은 제2 포커싱 카메라를 포함할 수 있고, 이는 데이터 수집과 동시에 표면으로부터 반사되는 산란된 빔의 위치를 측정하기 위한 사분면 검출기, 위치 감응 검출기, 또는 유사한 검출기일 수 있다.
후면 조명 장치로서 도시되지만, 다른 예는 대물 렌즈(142)를 통해 샘플 용기(110) 상의 샘플 상으로 지향되는 레이저 또는 다른 광원으로부터의 광(즉, 전면 조명 구성)을 포함할 수 있다. 샘플 용기(110)는 대물 렌즈(142)에 대한 샘플 용기(110)의 이동 및 정렬을 제공하기 위해 샘플 스테이지(170) 상에 장착될 수 있다. 샘플 스테이지(170)는 3개의 방향 중 임의의 방향으로 이동할 수 있게 하는 하나 이상의 액추에이터를 가질 수 있다. 예를 들어, 직교 좌표계의 측면에서, 액추에이터는 스테이지가 대물 렌즈(142)에 대해 x, y 및 z 방향으로 이동할 수 있도록 제공될 수 있다. 이는 샘플 용기(110) 상의 하나 이상의 샘플 위치가 대물 렌즈(142)와 광학 정렬로 위치되도록 할 수 있다.
초점 컴포넌트(175)가 초점 방향(통상적으로 z-축 또는 z-방향으로 지칭됨)으로의 샘플 용기(110)에 대한 광학 컴포넌트의 위치설정을 제어하기 위해 포함되는 것으로 이러한 예에 도시되어 있다. 초점 컴포넌트(175)는 광학 컴포넌트(예: 대물 렌즈(142))에 대해 샘플 스테이지(170) 상의 샘플 용기(110)를 이동시켜 이미지화 작동을 위한 적절한 초점 조정을 제공하기 위해 광학 스테이지 또는 샘플 스테이지에, 또는 둘 다 모두에, 물리적으로 결합된 하나 이상의 액추에이터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 액추에이터는 예를 들어 스테이지에 대한 기계적, 자기적, 유체적 또는 다른 부착 또는 스테이지와의 직접적 또는 간접적 접촉에 의한 것과 같이, 각각의 스테이지에 물리적으로 결합될 수 있다. 하나 이상의 액추에이터는 샘플 스테이지를 동일한 평면 내에 유지하면서(예: 광축에 수직인 레벨 또는 수평 자세를 유지하면서) 스테이지를 z-방향으로 이동시키도록 구성될 수 있다. 하나 이상의 액추에이터는 또한 스테이지를 기울이도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 이는 샘플 용기(110)가 그의 표면의 임의의 기울기를 고려하여 동적으로 수평이 되도록 수행될 수 있다.
시스템의 포커싱은 일반적으로 대물 렌즈(142)의 초점 평면을 선택된 샘플 위치에서 이미지화될 샘플과 정렬시키는 것을 지칭한다. 그러나, 포커싱은 또한 예를 들어 시험 샘플의 이미지에 대한 원하는 레벨의 선명도 또는 콘트라스트와 같은, 샘플의 표현에 대한 원하는 특성을 획득하거나 강화하기 위한 시스템에 대한 조정을 지칭할 수 있다. 대물 렌즈의 초점 평면의 사용가능한 피사계 심도가 아주 작을 수 있기 때문에(때때로 대략 1μm 이하), 초점 컴포넌트(175)는 이미지화되는 표면을 밀접하게 따른다. 샘플 용기가 기기 내에 고정된 것처럼 완벽하게 평평하지 않을 수 있기 때문에, 초점 컴포넌트(175)는 (통상적으로 y-축으로 지칭되는) 스캐닝 방향을 따라 이동하는 동안 이러한 프로파일을 따르도록 설정될 수 있다.
이미지화되는 샘플 위치에서 시험 샘플로부터 나오는 광은 하나 이상의 광검출기(140)로 지향될 수 있다. 광검출기는, 예를 들어, CCD 카메라를 포함할 수 있다. 초점 영역으로부터 나오는 광만이 광검출기(들)로 통과하도록 허용하기 위해 개구가 포함되고 위치할 수 있다. 개구는 초점 영역의 외측에 있는 영역으로부터 나오는 광의 컴포넌트를 필터링함으로써 이미지 품질을 개선하기 위해 포함될 수 있다. 방출 필터가 필터 스위칭 조립체(145) 내에 포함될 수 있고, 이는 결정된 방출 파장을 기록하도록 그리고 임의의 표유 레이저 광을 차단하도록 선택될 수 있다.
다양한 예에서, 샘플 용기(110)(예: 플로우 셀)는 샘플이 제공되는 하나 이상의 기재를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다수의 상이한 핵산 시퀀스를 분석하기 위한 시스템의 경우, 샘플 용기(110)는 시퀀싱될 핵산이 결합, 부착 또는 회합되는 하나 이상의 기재를 포함할 수 있다. 다양한 예에서, 기재는 예를 들어 유리 표면, 플라스틱 표면, 라텍스, 덱스트란, 폴리스티렌 표면, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아미드 겔, 금 표면, 및 실리콘 웨이퍼와 같은 핵산이 부착될 수 있는 임의의 불활성 기재 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부 애플리케이션에서, 기재는 샘플 용기(110)에 걸쳐 매트릭스 또는 패턴으로 형성된 복수의 위치에서 채널 또는 다른 영역 내에 있다.
하나 이상의 제어기(190)(예: 프로세서 또는 ASIC 기반 제어기(들))는, 도 1을 참조하여 설명된 예시적인 이미지 스캐닝 시스템(10)과 같은, 스캐닝 시스템의 작동을 제어하기 위해 제공될 수 있다. 제어기(190)는, 예를 들어, 포커싱, 스테이지 이동, 및 이미지화 작동과 같은 시스템 작동의 양태를 제어하도록 구현될 수 있다. 다양한 응용에서, 제어기는 하드웨어, 소프트웨어, 또는 선행하는 조합을 사용하여 구현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제어기는 연관된 메모리(194)를 가진 하나 이상의 CPU 또는 프로세서(192)를 포함할 수 있다. 다른 예를 들어, 제어기는 작동을 제어하기 위한 하드웨어 또는 다른 회로를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 회로는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 필드 프로그램가능 게이트 어레이(FPGA), 주문형 집적 회로(ASIC), 프로그램가능 로직 장치(PLD), 복합 프로그램가능 로직 장치(CPLD), 프로그램가능 로직 어레이(PLA), 프로그램가능 어레이 로직(PAL) 또는 다른 유사한 처리 장치 또는 회로. 또 다른 예를 들어, 제어기는 이러한 회로와 하나 이상의 프로세서의 조합을 포함할 수 있다.
기점으로서 사용하기 위한 특징(예: 웰과 같은 샘플 부위)의 배열의 이미지 데이터의 획득 및 등록이 이러한 예시적인 시스템의 맥락에서 본원에서 설명되고 논의될 수 있지만, 이는 이들 기술이 구현될 수 있는 단지 하나의 예이다. 본 설명을 읽은 후에, 당업자는 본원에 기술된 시스템 및 방법이 이러한 및 다른 스캐너, 현미경 및 다른 이미지화 시스템으로 구현될 수 있는 방법을 이해할 것이다.
이전의 설명이, 시퀀싱 시스템과 같은, 광학 이미지 스캐닝 시스템(10)의 양태를 커버하지만, 도 2 및 도 3은 기능적 작업 흐름의 맥락에서 이러한 시스템(10)의 사용을 논의한다. 선형 스캔 경로의 편차의 검출 및 보정에 사용되는 선형 기점과 같은, 기점의 후속 논의에 대한 유용한 실제 맥락을 제공하기 위해 이 논의가 제공된다. 이러한 방식으로, 기점의 사용 및 중요성, 그리고 후속하여 설명된 접근법에서의 이들의 사용이 보다 충분히 이해될 것을 희망한다.
이를 염두에 두고, 도 2를 참조하면, 시스템 컴포넌트와 함께 예시적인 작업 흐름을 도시하는 블록도가 제공된다. 이 예에서, 작업 흐름 및 해당하는 시스템 컴포넌트는 (예컨대 생물학적 응용에 대한) 패턴화된 유동 셀을 처리하고, 패턴화된 유동 셀 표면을 이미지화하고, 상기 이미지화로부터 유래된 데이터를 분석하는 데 적합할 수 있다.
도시된 예에서, (뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 및 다른 생체활성 시약과 같은) 분자가 미리 제조될 수 있는 각각의 샘플 용기(110) 내에 도입될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 이러한 샘플 용기(110)는 유동 셀, 시퀀싱 카트리지, 또는 이미지화를 위해 샘플 부위를 포함하는 기재를 갖는 다른 적합한 구조체를 포함할 수 있다. 시스템 컴포넌트를 사용한 도시된 작업 흐름은 DNA 사슬과 같은 생체 중합체를 합성하거나 생체 중합체를 시퀀싱하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 본 기술은 시퀀싱 작동, 유전자 발현 작동, 진단 응용 등으로 제한되지 않지만, 후술되는 바와 같이, 샘플 또는 샘플 홀더의 이미지화에서 검출된 여러 라인, 스와스 또는 영역에 대해 수집된 이미지 데이터를 분석하기 위해 보다 일반적으로 사용될 수 있다 것이 이해되어야 한다. 분자 또는 다른 검출가능한 특징에 대한 반응 또는 포획 부위를 포함하는 다른 기재는 개시된 기술 및 시스템과 유사하게 사용될 수 있다.
본 맥락에서, 예시적인 생물중합체는 핵산, 예컨대 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 다른 예시적인 생물중합체는 (폴리펩타이드로도 지칭되는) 단백질, 다당류, 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 임의의 다양한 생물중합체가 설명된 기술에 따라 처리될 수 있지만, 설명을 용이하게 하고 단순화하기 위해, 예시적인 상황에서 처리 및 이미지화를 위해 사용되는 시스템 및 방법이 핵산의 처리와 관련하여 설명될 것이다. 일반적으로, 설명된 작업 흐름은 샘플 용기(110)를 처리할 것이며, 이들 각각은 반응 부위의 패턴화된 표면을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "패턴화된 표면"은 상이한 개별 및 이격된 반응 부위의 집단을 갖는 지지체 또는 기재의 표면을 지칭하여, 상이한 반응 부위가 이들의 상대 위치에 따라 서로 구별될 수 있게 한다. 생물중합체의 단일 종이 각각의 개별 반응 부위에 부착될 수 있다. 그러나, 생물중합체의 종의 다수의 복사본이 반응 부위에 부착될 수 있다. 전체적으로 볼 때, 패턴은 복수의 상이한 부위에 부착된 복수의 상이한 바이오 중합체를 포함할 수 있다. 반응 부위는 동일한 기재 상의 상이한 어드레스 가능 위치에 배치될 수 있다. 대안적으로, 패턴화된 표면은 각각 상이한 반응 부위를 형성하는 별개의 기재를 포함할 수 있다. 부위는 특정 공지된 위치에 부착된 DNA 단편을 포함할 수 있거나, 또는 표적 생성물이 합성되어야 하는 웰 또는 나노웰일 수 있다. 일부 응용에서, 시스템은, 공통 뉴클레오티드에 기초한 중합체 분자와 같은, 분자를 연속적으로 합성하거나 시퀀싱하도록 설계될 수 있다.
도 2의 도식적 표현에서, 분석 시스템은 (예컨대 생물학적 패턴화된 표면을 포함할 수 있는) 샘플 용기(110) 내에 제공된 샘플을 처리하고, 패턴화된 표면 상의 개별 부위뿐만 아니라 부위 사이의 공간을 나타내는 이미지 데이터, 및 패턴화된 표면에 제공된 기점의 표현을 생성하도록 설계된 처리 시스템(224)(예: 시퀀싱 시스템 또는 스테이션)을 포함할 수 있다. 데이터 분석 시스템(226)은 이미지 데이터를 수신하고 본 개시에 따라 이미지 데이터를 처리하여 본원에 설명된 바와 같이 이미지화 데이터로부터 의미있는 값을 추출한다. 그러면, 하류 처리/저장 시스템(228)은 이 정보를 수신하고, 원하는 경우, 이미지화 데이터와 함께, 상기 정보를 저장할 수 있다. 하류 처리/저장 시스템(228)은, 생리학적 상태를 진단하고, 시퀀싱 목록을 편집하고, 유전자 발현을 분석하는 등의 목적으로, 이미지 데이터 또는 이미지 데이터로부터 유도된 처리된 데이터를 추가로 분석할 수 있다.
본 맥락에 관련될 수 있는 데이터 분석 시스템(226) 및/또는 하류 처리/저장 시스템(228)과 관련하여, 이미지 데이터는 Illumina 시퀀서에 대해 구매가능한 실시간 분석(RTA) 프로토콜을 사용하여 분석될 수 있다. 기점은, 부위의 스와스 내에서 또는 부분적으로, 아래에 설명된 대로 형성되고 배치될 수 있다. 어두운 영역(비-신호 생성 영역 또는 픽셀) 및 밝은 영역(신호 생성 영역 또는 픽셀)은 각각 0 및 255의 강도 레벨, 또는 이들 사이의 임의의 원하는 다른 레벨 또는 레벨들을 할당받을 수 있다. 기점의 존재를 나타내는 데이터는 상관 관계를 최대화하기 위해 가능한 x 및 y 오프셋에서 교차 상관되고 이동될 수 있다. 교차 상관을 최대화하는 하위 픽셀 x 및 y 시프트를 결정하기 위해 예를 들어 2차원 가우시안으로 영역이 맞춰질 수 있다. 이러한 프로세스는 기점이 위치하는 이미지의 상이한 영역에서 반복될 수 있다. 각 영역에서 결정된 하위 픽셀 x 및 y 오프셋은 설계된 패턴화된 표면의 특징이 이미지 데이터에 어떻게 나타나는지 설명하는 기하학적 변환 또는 기하학적 변환 세트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Affine 변환 또는 투영 변환이 이러한 방식으로 파생될 수 있다. 본원에 논의된 특정 실시예에서, 특정 기점, 즉 선형 기점은 스캐닝 작동 동안 실시간으로 선형 운동의 편차가 있는지 여부를 결정하고, 샘플 스테이지 및/또는 광학계의 운동을 제어하는 메커니즘에 대한 제어 피드백 루프 중 하나 또는 둘 다 또는 이미지-기반 보정 계수로서 이러한 검출된 편차의 보정을 허용하는데, 사용될 수 있다.
처리 시스템(224)은 처리가 진행됨에 따라 다양한 시약을 샘플 용기(110)에 전달하기 위해 (도 2의 예에서 뉴클레오티드 전달 시스템(230)으로 도시된) 생체분자 시약 전달 시스템을 사용할 수 있다. 생체분자 시약 전달 시스템은 도 1의 유체 전달 모듈 또는 장치(100)에 해당할 수 있다. 처리 시스템(224)은 샘플 용기(110) 및 해당 샘플이 진행되는 복수의 작동을 수행할 수 있다. 이러한 진행은, 예를 들어, 다른 스테이션으로 샘플 용기(110)의 물리적 이동, 또는, 샘플 용기(110)가 이동되거나 광학 시스템이 이동되거나, 둘 다이거나, 유체의 전달이 밸브 작동을 통해 수행되는 시스템에서 (유동 셀과 같은) 샘플 용기(110)의 로딩을 포함하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 시스템은, 후속 사이클을 위한 준비에서 플러싱, 이미지화, 및 탈차단이 뒤따르는 반응이 단일 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드로 촉진되는 순환 작동에 대해 설계될 수 있다. 실제 시스템에서, 샘플 용기(110) 및 해당 샘플은 처리 시스템(224)에 배치되고, 모든 유용한 정보가 테스트 샘플로부터 추출되기 전에 다수의 연속 사이클에서 반응, 플러싱, 이미지화, 탈차단 등에 대해 자동화된 또는 반자동화된 시퀀스의 작동이 수행된다. 다시, 도 2에 예시된 작업 흐름은 제한적이지 않으며, 본 기술은 임의의 응용에 사용되는 임의의 적합한 시스템으로부터 획득된 이미지 데이터에 대해 작동할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 본 개시에서 "이미지화" 또는 "이미지 데이터"에 대한 언급이 이루어졌지만, 다른 검출 기술도 사용될 수 있지만, 많은 실제 시스템에서, 이는 전자 검출 회로(예: 카메라 또는 이미지화 전자 회로 또는 칩)로부터의 데이터의 실제 광학 이미지화 및 추출을 수반할 것이고, 관심 분자를 특성화하는 전자 또는 디지털 검출 결과 데이터도 "이미지" 또는 "이미지 데이터"로 간주되어야 한다는 것에 유의해야 한다.
도 2에 도시된 예에서, 뉴클레오티드 전달 시스템(230)은 프로세스 스트림(232)을 샘플 용기(110)에 제공한다. 샘플 용기(110)(예: 유동 셀)로부터의 유출물 스트림(234)은, 예를 들어, 뉴클레오티드 전달 시스템(230)에서 재포획되고 재순환될 수 있다. 예시된 예에서, 유동 셀의 패턴화된 표면은 추가 시약을 제거하고 이미지화를 위해 샘플 용기(110) 내의 샘플을 명확하게 하기 위해 플러시 스테이션(236)에서 플러시될 수 있다(또는 다수의 경우에서 도 1의 폐기물 밸브(120)와 같은 적절한 밸브 작동에 의한 플러싱에 의해). 이어서, 샘플 용기(110)는, (동일한 장치 내에 있을 수 있는) 이미지화 시스템(10)에 의해, 예컨대 라인 이미지화 또는 영역 이미지화 기술을 사용하여, 이미지화된다. 이에 의해 생성된 이미지 데이터는, 예를 들어, 주형에 기반하는 것과 같이, 점진적으로 구축되는 뉴클레오티드 사슬의 시퀀스를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 하나의 가능한 실시예에서, 이미지화 시스템(10)은 패턴화된 표면 상의 개별 부위를 위치시키고 각 부위에 가장 최근에 부착되거나 결합된 뉴클레오티드의 유형을 결정하기 위해 분석될 수 있는 점진적 픽셀화된 이미지 데이터를 생성하기 위해 공초점 라인 스캐닝을 이용할 수 있다. "스텝 앤 슛(Step and Shoot)" 또는 다른 영역 기반 이미지화 접근법을 이용하는 기술과 같은, 다른 이미지화 기술이 또한 적절하게 채용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 이미지화 시스템(10)의 이미지화 컴포넌트는 보다 일반적으로 "검출 장치"로 간주될 수 있고, 표면의 고해상도 이미지화가 가능한 임의의 검출 장치가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 검출 장치는 본원에 설명된 밀도, 피치 및/또는 특징 크기로 특징을 구별하기에 충분한 해상도를 가질 것이다. 검출 장치의 예는 라인 또는 영역 이미지를 획득하면서 객체와 검출기를 정적인 관계로 유지하도록 구성되는 것들이다. 언급된 바와 같이, 라인 스캐닝 장치 및 지속적 또는 연속적 영역 이미지(예: "스텝 앤 슛" 검출기)를 획득하는 시스템이 사용될 수 있다. 라인 스캐닝 검출기는 객체의 표면의 y 치수를 따라 라인을 스캐닝하도록 구성될 수 있고, 라인의 최장 치수는 x 차원을 따라 발생한다. 검출 장치, 객체 또는 둘 모두가 스캐닝 검출을 달성하기 위해 이동될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어 핵산 시퀀싱 응용에서 유용한 검출 장치는 미국 특허 출원 공개 제2012/0270305 A1호; 제2013/0023422 A1호; 및 제2013/0260372 A1호; 및 미국 특허 제5,528,050호; 제5,719,391호; 제8,158,926호 및 제8,241,573호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
일례에서, 본원에 기술된 방법 또는 시스템에 사용되는 이미지화 시스템(10)은 패턴화된 표면의 y-차원을 따라 스캔하여, 프로세스에서 패턴화된 표면 부위의 평행한 스와스를 스캐닝할 수 있다. 패턴화된 표면은 x-차원을 따라 부위의 스와스의 상대적 위치를 구별하는 거친 정렬 마커를 포함할 수 있다. 사용될 때, 거친 정렬 마커는, 예컨대 부위의 스와스 중 적어도 하나의 위치를 결정하기 위해 검출 장치와 협력할 수 있다. 선택적으로, 패턴화된 표면을 갖는 검출 장치 및/또는 샘플 용기(110)의 상대 위치는 스와스에 대해 결정된 위치에 기초하여 조정될 수 있다. 일부 예에서, 스와스의 위치를 결정하는 것은, 등록 또는 특징 식별을 수행하는 데 사용되는 컴퓨터와 같은, 프로세서 또는 컴퓨터에 의한 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 시스템은 이미지 데이터 내의 특징에 대한 위치뿐만 아니라 기점에 기초하여 참조된 각각의 부위에서 분자를 특성화하기 위해 컴퓨터 상의 알고리즘을 수행하도록 기능할 수 있다.
(예: 이미지화 시스템(10)에서) 이미지화 후에, 샘플 용기(110)는 탈차단을 위해 탈차단 스테이션(240)으로 진행할 수 있고, 그 동안 차단 분자 또는 보호 그룹이 마킹 염료와 함께 마지막 첨가된 뉴클레오티드로부터 절단된다. 처리 시스템(224)이 시퀀싱을 위해 사용되는 경우, 예를 들어, 이미지화 시스템(10)으로부터의 이미지 데이터는 저장되고 데이터 분석 시스템(226)으로 전달될 것이다.
데이터 분석 시스템(226)은, 후술되는 바와 같이, 4개의 공통 DNA 뉴클레오티드 중 어느 것이 패턴화된 표면 상의 각각의 부위에서 마지막으로 추가되었을 수 있는지를 결정하기 위해 사용자 인터페이스 및 이미지 데이터의 자동화된 또는 반자동화된 분석을 제공하는 범용 또는 응용-특정 프로그래밍된 컴퓨터를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 분석은 4개의 공통 DNA 뉴클레오티드 각각에 대한 고유한 태깅 염료의 색상에 기초하여 수행될 수 있다. 이러한 이미지 데이터는 하류 처리/저장 시스템(228)에 의해 추가로 분석될 수 있으며, 이는 아래에 설명된 바와 같은 이미지 데이터로부터 파생된 데이터 및, 적절한 경우, 이미지 데이터 자체를 저장할 수 있다. 다시, 시퀀싱 응용은 하나의 예로 의도되고, 본 기술에 의해 작동되는 유사한 이미지화 데이터를 생성하는 다른 작동(예: 진단 응용, 임상 응용, 유전자 발현 실험 등)이 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 구현에서, 패턴화된 표면을 갖는 샘플 용기(110)(예: 유동 셀)는 고정된 또는 실질적으로 고정된 위치에 남아 있을 수 있고, 언급된 "스테이션"은 (예: 원하는 화학물질의 도입 및 반응, 플러싱, 이미지화, 이미지 데이터 수집 등을 위해) 설명된 바와 같이 샘플 용기(110)에 작용하는 통합 하위 시스템을 포함할 수 있다. 데이터 분석은 다른 처리 작동과 동시에(즉, "실시간"으로) 수행될 수 있거나 수행될 수 있거나, 이미지 데이터, 또는 이미지 데이터로부터 도출된 데이터를, (동일한 시스템의, 또는 다른 곳의) 적절한 메모리로부터 액세스함으로써 후처리될 수 있다. 많은 응용에서, 패턴화된 표면 "용기"는 패턴화된 표면이 존재하고 이를 통해 원하는 화학물질이 순환되는 카트리지 또는 유동 셀을 포함할 것이다. 이러한 응용에서, 이미지화는 유동 셀을 통해 수행될 수 있다. 유동 셀은 (예: x-y 평면에서) 적절하게 위치되고, 이미지화를 위해 필요에 따라 (예: x-방향, y-방향으로) 이동될 수 있다. 원하는 화학물질에 대한 연결은 장치에 장착될 때 유동 셀에 직접 이루어질 수 있다. 또한, 장치 설계 및 사용되는 이미지화 기술에 따라, 유동 셀 내에 매립된 패턴화된 표면은 초기에 x-y 평면에 배치될 수 있고, 이미지화 동안 이 평면에서 이동될 수 있거나, 이미지화 컴포넌트는 이미지화 동안 이 평면에 평행하게 이동될 수 있다. 일반적으로, 여기서도, "x-y 평면"은 부위를 지지하는 패턴화된 표면의 평면, 또는 이에 평행한 평면이다. 따라서, 유동 셀은 x-y 평면에서 연장되는 것으로 언급될 수 있으며, x-방향은 유동 셀의 더 긴 방향이고, y-방향은 더 짧은 방향이다(유동 셀은 직사각형임). 그러나, 이러한 배향은 반전될 수 있음을 이해해야 한다. 유동 셀 및 대응하는 패턴화된 표면은 또한 z-방향으로 이동될 수 있으며, 이는 통상적으로 x-방향 및 y-방향 둘 모두에 직교하는 초점-방향이다. 이러한 이동은 유동 셀을 제자리에 고정하고, 유동 셀에 유체를 연결하고, 이미지화(예: 정확한 z-깊이에서 이미지화 부위에 대한 광학 초점을 맞춤)에 유용할 수 있다. 일부 응용에서, 광학계는 정밀한 이미지화를 위해 x-방향으로 이동될 수 있다.
도 3은 본 접근법에 관련될 수 있는 예시적인 데이터 분석 시스템(226) 및 그의 기능 컴포넌트 중 일부를 도시한다. 위에서 언급된 바와 같이, 데이터 분석 시스템(226)은 하나 이상의 프로그래밍된 컴퓨터를 포함할 수 있으며, 이때 프로그래밍은 설명된 프로세스를 수행하기 위해 실행되는 코드를 갖는 하나 이상의 기계 판독가능 매체에 저장된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 응용 특정 집적 회로(ASIC) 및/또는 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA)(또는 다른 하드웨어 기반 솔루션)가 본원에 설명된 바와 같이 데이터 분석 시스템(226)에 기인한 기능의 일부 또는 전부를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예시된 예에서, 데이터 분석 시스템(226)은 샘플 용기(110) 내의 반응 또는 캡처 부위(즉, 웰과 같은 특징)의 패턴화된 표면의 이미지 데이터를 획득하는 하나 이상의 이미지화 시스템(10)에 대한 데이터 분석 시스템(226)의 네트워킹을 허용하도록 설계된 인터페이스(260)를 포함한다. 인터페이스(260)는, 적절한 경우, 데이터를 수신하고 조절할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 이미지화 시스템(10)는, 함께 패턴화된 표면(또는 그의 일부(예: 라인 또는 타일))의 이미지를 형성하는 개별 픽처 요소 또는 픽셀을 나타내는 디지털 이미지 데이터를 출력할 것이다. 도시된 예에서, 프로세서(262)는 처리 코드에 의해 정의된 복수의 루틴에 따라 수신된 이미지 데이터를 처리한다. 처리 코드는 다양한 유형의 메모리 회로(264)에 저장될 수 있다. 본 개시에 사용되는 바와 같이, 용어 "기계 판독가능"은 기계(예컨대, 컴퓨터, 프로세서, 또는 탐지 및 신호 해석 장치나 회로(예: 컴퓨터 메모리 및 메모리 액세스 컴포넌트와 회로, 이미지화 또는 신호 해석 및 처리 컴포넌트와 회로와 협력하는 이미징 또는 기타 검출 장치) 등과 협력하는 컴퓨터나 프로세서)에 의해 검출 가능하고 해석 가능함을 의미한다.
본 기술에 유용한 컴퓨터 및 프로세서는, 컴퓨터에 의해 처리된 데이터를 획득하는 데 사용되는 검출 장치와 네트워크로 연결되거나 상기 검출 장치와는 별개인, 특수(예: 애플리케이션 특정) 회로 및/또는 범용 컴퓨팅 장치(예: 검출 장치의 일부인 프로세서)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 정보(예: 이미지 데이터)는 본원에 개시된 데이터 분석 시스템(226)의 컴포넌트 사이에서 직접 또는 컴퓨터 네트워크를 통해 송신될 수 있다. 근거리 통신망(LAN) 또는 광역 통신망(WAN)은, 데이터 분석 시스템(226)을 포함하는 컴퓨터 및 컴퓨팅 장치가 연결된 인터넷에의 액세스를 포함하는, 기업 컴퓨팅 네트워크일 수 있다. 일례에서, LAN은 송신 제어 프로토콜/인터넷 프로토콜(TCP/IP) 산업 표준을 따른다. 일부 예에서, 정보(예: 이미지 데이터)는 입력 장치(예: 디스크 드라이브, 컴팩트 디스크 플레이어, USB 포트 등)를 통해 본원에 개시된 데이터 분석 시스템(226)에 입력된다. 일부 예에서, 상기 정보는, 예컨대 디스크 또는 플래시 드라이브와 같은 저장 장치로부터, 정보를 로딩함으로써 수신된다.
위에서 언급된 바와 같이, 일부 예에서, 처리 회로는 지지체, 부위, 분자 등의 하나 이상의 이미지 데이터 세트가 획득되는 동안 실시간 또는 거의 실시간으로 이미지 데이터를 처리할 수 있다. 이러한 실시간 분석은 핵산이 부착된 이미지화된 표면에 유체 및 검출 작동의 반복 주기가 적용되는 핵산 시퀀싱 응용에 유용하다. 또한, 본원에서 논의된 바와 같이, 이러한 실시간 분석은 적절한 보정 조치가 수행되게 하도록 이미지 획득 동안 선형 운동의 편차를 검출하는 데 특히 유익하다. 본원에 언급된 바와 같이, 규모가 충분히 작은(예: 2 또는 3개 미만의 픽셀에 걸쳐 있는) 특징의 경우, 선형에서의 편차는 하류 처리에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 시퀀싱 데이터의 분석은 종종 계산 집약적일 수 있어서, 다른 데이터 획득 또는 분석 알고리즘이 처리 중에 있는 동안 실시간 또는 거의 실시간으로 또는 백그라운드에서 본원에 기재되어 있는 방법을 수행하는 것이 유익할 수 있게 한다. 본 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 실시간 분석 방법은 Illumina, Inc.에서 시판되는 MiSeq™ 및 HiSeq™ 시퀀싱 장치에 사용되고/되거나, 미국 특허 출원 공개 제2012/0020537 A1호에 기술된 것이며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 샘플의 처리 및 이들의 이미지화와 함께 사용되는, 용어 "실시간" 및 "거의 실시간"은 샘플이 처리되고 이미지화되는 동안 처리가 적어도 부분적으로 발생하는 것(즉, 처리가 데이터 획득과 동시에 발생함)을 전달하기 위한 것이다. 다른 예에서, 이미지 데이터는 유사한 알고리즘에 의한 후속 분석을 위해 획득되고 저장될 수 있다. 이는 이미지화가 수행되는 곳과 동일하거나 상이한 물리적 부위에서 처리 작업을 다루기 위해 다른 장비(예: 강력한 처리 시스템)를 허용할 수 있다. 이는 또한 재처리, 품질 검증 등을 허용할 수 있다.
현재 고려되는 예에 따르면, 이미지 데이터 상에서 실행되는 처리 코드는 이미지 데이터를 분석하도록 설계된 이미지 데이터 분석 루틴(270)을 포함한다. 이미지 데이터 분석은 이미지 데이터에서 가시적이거나 인코딩된 개별 부위의 위치뿐만 아니라 부위가 가시적이지 않은 위치(즉, 부위가 없거나, 또는 의미있는 방사선이 기존 부위로부터 검출되지 않은 경우)를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이미지 데이터 분석은 또한 부위의 위치를 찾는 데 도움이 되는 기점의 위치를 결정하는 데 사용될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 생물학적 패턴화된 표면 이미지화 맥락에서, 이미지화된 분자에 부착된 형광 염료의 존재로 인해 패턴화된 표면의 각각의 부위가 비-부위 위치보다 더 밝게 보일 것이다. 부위는, 예를 들어 부위에서의 프로브에 대한 표적이 검출되고 있는 샘플 내에 존재하지 않을 때, 그들의 주변 영역보다 더 밝게 보일 필요가 없음을 이해할 것이다. 개별 부위가 나타나는 색상은 이용되는 염료, 및 이미지화 목적을 위해 이미지화 시스템(28)에 의해 사용되는 빛의 파장 범위(예: 빛의 여기 파장 범위)의 함수일 수 있다. 표적이 결합되지 않았거나 표지가 없는 부위는, 패턴화된 표면의 예상 위치와 같은, 다른 특성에 따라 식별될 수 있다. 마커의 설계 및 기능에 따라, 임의의 기점 마커가 이미지 중 하나 이상에 나타날 수 있다.
일단 이미지 데이터 분석 루틴(270)이 이미지 데이터 내의 개별 부위의 위치를 찾으면, 값 할당은 272 단계에서, 종종 제공된 임의의 기점 마커의 함수로서 또는 이를 참조하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 값 할당 단계(272)는 해당 위치의 픽셀로 표현되는 이미지 데이터의 특성에 기초하여 각 부위에 디지털 값을 할당할 것이다. 즉, 예를 들어, 값 할당 루틴(272)은 특정 색상 범위 또는 빛의 파장 범위가, 상기 위치의 픽셀 그룹 또는 클러스터에 의해 표시된 대로, 여기 후 임계 시간 내에 특정 위치에서 검출되었음을 인식하도록 설계될 수 있다. 이러한 맥락에서 272 단계에서 수행된 값 할당은 해당 값을 전체 부위에 할당하여 훨씬 더 방대하고(예: 많은 픽셀이 각각의 부위에 해당할 수 있음) 훨씬 더 큰 수치 값(즉, 각각의 픽셀을 인코딩하기 위해 훨씬 더 많은 수의 비트)을 갖는 이미지 데이터 자체를 추가로 처리할 필요성을 완화한다.
추가의 예를 들어, 본 조성물, 장치, 및 방법은 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 기술 및 장치에서 발광 이미지를 생성하도록 적합하게 사용될 수 있다. 이러한 SBS 접근법에서, 유동 셀 또는 다른 미세 유체 장치는 본원에 기술된 바와 같은 샘플 및 샘플 캡처 부위를 포함할 수 있고, 하나 이상의 분석물은 시퀀싱 작동의 일부로서 부위 위로 유동될 수 있다. 임의의 적합한 수의 여기 파장을 사용하여 순서대로 여기될 수 있는 적합한 수의 발광단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 4개의 공진 파장에서 4개의 별개의 여기 공급원(λ1, λ2, λ3, 및 λ4)이 4-채널 SBS 화학 스킴에 사용될 수 있거나, 2개의 여기 파장(λ1및 λ2)이 2-채널 SBS 화학 스킴에 사용될 수 있거나, 하나의 여기 파장(λ1)이 1-채널 SBS 화학 스킴에 사용될 수 있다. 4 채널, 3-채널, 2-채널 또는 1-채널 SBS 스킴의 예는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2013/0079232 A1호에 기재되어 있으며, 이는 전체적으로 본원에 참고로 포함되고, 본원에 기재된 장치 및 방법과 함께 사용하기 위해 변경될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 발광 이미지화를 사용하여 DNA를 시퀀싱하는 데 사용하기 위한 하나의 이러한 SBS 접근법에서, 제1 발광단은 A에 결합될 수 있고, 제2 발광단은 G에 결합될 수 있고, 제3 발광단은 C에 결합될 수 있고, 제4 발광단은 T에 결합될 수 있다. 다른 예를 들어, 발광 이미지화를 사용하여 RNA를 시퀀싱하는 데 사용하기 위한 기술에서, 제1 발광단은 A에 결합될 수 있고, 제2 발광단은 G에 결합될 수 있고, 제3 발광단은 C에 결합될 수 있고, 제4 발광단은 T에 결합될 수 있다.
실제로, 다중 채널 시스템(예: 4채널 시스템)에서 각각의 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 사이클은 각각의 채널에 대한 연관된 별개의 여기 및 판독 작동을 갖고 각각의 채널은 각각의 사이클에서 별도로 판독된다. 즉, 4-채널 시스템에서 각각의 SBS 사이클에 대해, 각각이 상이한 채널에 해당하는 4개의 여기 및 판독 작동이 있다. DNA 이미지화 응용에서, 예를 들어, 4개의 공통 뉴클레오티드는 별도의 구별 가능한 색상(또는 보다 일반적으로, 빛의 파장 또는 파장 범위)으로 나타낼 수 있으며, 각각의 색상은 각각의 SBS 사이클 동안 별도로 판독되는 별개의 채널에 해당한다.
인덱싱 할당 루틴(274)은 할당된 값 각각을 이미지 인덱스 또는 맵 내의 위치와 연관시키며, 이는 기점 마커의 알려진 또는 검출된 위치를 참조하여, 또는 이러한 마커에 의해 인코딩된 임의의 데이터를 참조하여 이루어질 수 있다. 아래에서 더 완전히 설명되는 바와 같이, 맵은 샘플 용기(110)의 개별 부위의 알려진 또는 결정된 위치에 해당할 것이다. 동일하거나 상이한 물리적 장치에 제공될 수 있는 (도 3에서 데이터 스티칭 단계(276)로 도시된) 데이터 분석 루틴은샘플 용기(110) 내에 존재하는 샘플의 분자의 식별 또는 특성화, 및, 원하는 경우, 분자 데이터의 논리적 분석을 허용한다. 예를 들어, 시퀀싱의 경우, 데이터 분석 루틴을 통해 방출 스펙트럼을 참조하여 각 부위에서 분자의 특성을 파악할 수 있다(즉, 태그나 기타 메커니즘이 빛의 파장에 의해 여기될 때 검출 가능한 신호를 생성했음을 나타내는, 이미지에서 부위를 검출할 수 있는지 여부). 이어서, 부위에서의 분자 및 동일한 부위에서 검출된 후속 분자를 논리적으로 시퀀스로 조립할 수 있다. 이어서, 이러한 짧은 시퀀스는 데이터 분석 루틴(276)에 의해 추가로 분석되어, 이들이 샘플 도너 객체에서 발생할 수 있는 가능한 더 긴 시퀀스를 결정할 수 있다.
도 3의 도시에서와 같이, 프로세서(262)에 의해 실행되는 루틴과 상호작용하기 위해 장치-특정 인터페이스, 또는 일부 응용에서, 종래의 컴퓨터 모니터, 키보드, 마우스 등으로 이루어질 수 있는 작동자(OP) 인터페이스(280)가 제공될 수 있다는 것에 유의할 수 있다. 작동자 인터페이스(280)는 이미지화 데이터가 처리되고 분석되고 생성된 값이 인덱싱되고 처리됨에 따라 루틴을 제어, 시각화 또는 상호작용하는 데 사용될 수 있다.
도 4는 샘플 용기(110)의 일부로서 또는 그 내부에 존재할 수 있는 패턴화된 표면(288)의 일례를 도시한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 복수의 그리드 또는 스와스(290)(여기서 수직 스와스로서 도시됨)는 각각 이미지화될 다수의 개별 타일(294)을 포함하도록 제공될 수 있다. 각각의 이미지 타일(294)은 결국 처리 작동(예: 시퀀싱 작동)의 상이한 사이클에서 관심 활동을 표시할 수 있는 다수의 샘플 부위(예: 캡처 또는 반응 부위)을 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, 패턴화된 표면(288)에 대한 광범위한 레이아웃이 가능하고, 본 기술은 임의의 원하는 또는 특정 레이아웃으로 제한되도록 의도되지 않는다. 점진적인 스캐닝 맥락에서, 이미지화가 진행됨에 따라, 샘플 용기(110)(또는 그 내부의 패턴화된 표면(288))는 각각의 스와스(290)가 이미지화될 수 있도록 인덱스 방향으로 상대적인 이동을 겪을 것이다. 거친 정렬 기점(예: "자동 중심 설정"기점)은 이미저에 대해 그리드 또는 스와스(290)를 적절히 위치시키는 것을 허용하거나, 또는 처리 시스템(224) 또는 이미지화 시스템(10)의 패턴화된 특징을 위치시키기 위해 지지체 내에 또는 지지체 상에 형성될 수 있다. 도 4의 도면에서, 패턴화된 표면(288)이 위치할 수 있는 주변 유동 셀이 도시되지 않는다는 점에 유의해야 한다.
도 5는 도 4의 패턴화된 표면(288)의 스와스(290) 중 하나의 확대도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 사용된 이미지화 기술에 따라, 스와스(290)는 스와스(290)를 따라 점진적으로 이동하는 평행 스캔 라인(310)에서 이미징 시스템(10)에 의해 스캐닝될 수 있다. 또한, 많은 시스템에서, 패턴화된 표면은, 화살표(312)로 표시된 바와 같이, 하나의 방향으로 천천히 이동되는 반면, 이미지화 광학계는 정지 상태로 유지될 것이다. 이어서, 평행 스캔 라인(310)은 샘플의 점진적인 이동으로부터 기인할 것이다. 각각의 스와스(290)는 생성된 이미지 데이터에서 유사하게 이미지화되고 식별될 수 있는 기점 마커로서 지정된 영역을 포함할 수 있다. 도시되지 않았지만, 일련의 라인과는 대조적으로, 표면의 영역이 패스 또는 획득마다 스캐닝할 수 있는 영역 스캔이 또한 사용될 수 있다.
도시된 예에서, 패턴화된 표면의 그리드 또는 스와스(290)는, 이미지화 시스템(10)이 각각의 패스에서 생성 또는 이미지화할 수 있는 스캔 라인(310)의 길이(318)보다 더 넓을 수 있는 폭(316)을 갖는다. 즉, 전체 폭(316)은 단일 패스로 스캐닝 또는 이미지화되지 않을 수 있다. 이는 이미지화 광학계로 인한 라인 길이(318)의 고유한 제한, 컴포넌트(예: 스캔 라인을 생성하는 데 사용되는 미러 또는 기타 광학 컴포넌트)의 초점 조정 또는 이동과 관련된 제한, 디지털 검출기의 제한 등에 기인할 수 있다. 스와스(290)는 다수의 패스로 스캐닝될 수 있고, 각각의 부위에 대한 값이 이미지 데이터로부터 추출될 수 있다.
도 5에서, 예를 들어, 스와스(290)의 전체 폭(316)은 2개의 중첩 영역(320, 322)에 수용될 수 있다. 각각의 영역(324, 326)에 의해 나타낸 바와 같이, 각각의 영역(320, 322)의 폭은 스캔 라인(310)의 길이(318)보다 약간 작을 수 있다. 이러한 구현에서, 이는, 예컨대 에지 또는 다른 특징을 참조하여, 이미지 데이터로부터 도출된 값을 통합하는 데 사용되는 특징의 검출을 허용할 것이다. 둘 모두의 패스에서 이미지화될 수 있는 공통 영역 또는 중첩(328)이 존재함에 유의할 수 있다.
도 6은 스와스(290)의 복수의 샘플 부위(340)(예: 웰 또는 나노웰)를 통해 스캔 라인(310)을 다소 더 상세히 도시한다. 예를 들어, 플로우 셀의 맥락에서, 부위(340)는, 각 웰이 핵산(예: DNA) 콜로니에 의해 점유되는, 겔로 채워진 웰일 수 있다. 전술한 바와 같이, 일부 구현에서, 부위(340)는 임의의 적합한 그리드 패턴으로 또는 심지어 랜덤으로 레이아웃될 수 있다. 도시된 예에서, 부위(340)는 육각형 패턴으로 레이아웃되지만, 직사각형 패턴(예: 직선 패턴), 및 다른 패턴이 채용될 수 있다. 각각의 부위(340)의 위치는 하나 이상의 기점 또는 기준 특징, 예컨대 패턴화된 표면의 그리드 또는 부분의 에지(342)를 참조하여 알려질 것이다. 랜덤 부위 위치의 경우, 이들은 모든 관심 부위의 위치를 검출하도록 설계된 초기 이미지화 시퀀스에 의해 배치되고 매핑될 수 있다.
도 7은 패턴화된 표면의 관심 영역의 점진적인 스캐닝에 의해 수집된 이미지 데이터에 기초하여 생성될 수 있는 유형의 예시적인 이미지의 일부를 나타낸다. 실제 이미지(350)는 각각이 각각 이미지화 시스템(10)에 의해 디지털 값을 할당받는 다수의 픽셀(352)로 구성된다. 고려되는 맥락에서, 이미지(350)를 나타내는 픽셀 데이터는 밝은 픽셀(354) 및 더 어두운 픽셀(356)에 해당하는 값을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 어두움(즉, 비-신호 생성 영역 또는 픽셀) 및 밝음(즉, 신호 생성 영역 또는 픽셀)은 각각 0 및 255의 강도 레벨, 또는 이들 사이의 임의의 원하는 다른 레벨 또는 레벨들을 할당받을 수 있다. 실제로, 이들의 개별 디지털 값에 의해 표시된 바와 같이, 개별 부위(340)가 픽셀 사이의 대조 또는 색상 값 차이를 검출함으로써 식별될 수 있도록 다양한 회색 레벨 또는 심지어 색상 인코딩이 이용될 수 있다.
예시 및 설명의 목적을 위해, 도 7은 각각의 부위(340)(예: 웰)를 다수의 픽셀(352)에 걸쳐 있는 것으로 도시한다는 것에 유의할 수 있다. 그러나, 실제로, 처리량 및 효율을 증가시키기 위해 웰 크기가 감소함에 따라, 각각의 샘플 부위(340)는 적은 수의 픽셀(예: 1, 2, 3 또는 4개의 픽셀)에 의해 효과적으로 이미지화될 수 있다. 결과적으로, 본원에 논의된 바와 같이, 각각의 샘플 부위(340)에 대한 감소된 픽셀 커버리지는 스캐닝 작동과 연관된 선형 운동의 편차의 결과를 실질적으로 증가시킨다. 예를 들어, 예상되는 선형 운동의 편차로 인해, 주어진 웰 부위(340)와 관련된 기본 픽셀(354)이 잘못 해석되어 유용한 신호가 누락되거나 (예: 다른 우물에) 잘못 적용될 수 있다. 본원에서 논의된 현재 접근법은 이러한 편차를 해결하는 데 사용될 수 있다.
기점의 현재 고려되는 일부 형태, 유형 및 사용을 논의하기 전에, 사용을 위한 예시적인 처리, 데이터 인코딩 및 디코딩, 및 부위의 등록 및 개시된 기점 기술에 기초한 이미지 데이터의 간단한 논의가 제공된다. 본원에 기술된 바와 같은 기점의 등록, 및 이에 의해 순차적 이미지화 작업의 이미지 데이터에서 검출가능한 부위(340)의 등록은 기점을 정렬하고(예: 위치를 정하고 오버레이하거나 정렬시킴), 예를 들어, 이미지 데이터로부터의 밝은 픽셀(354)의 수에 기초하여, 2차원 상호 상관(또는 적합 유사성의 다른 척도)을 결정하고, 하나 이상의 차원에서(예: x 및 y 차원에서) 기점 사이의 오프셋을 결정함으로써 수행될 수 있다. 오프셋은, 예를 들어, 다음의 작동이 반복되는 반복 프로세스를 통해 결정될 수 있다: 기점 중 하나가 다른 기점에 대해 이동되고, 적합의 상관 수준의 변화가 결정되고(예: 상관의 증가는 중첩되는 기점의 밝은 픽셀(354) 수의 증가로 나타남), 하나 이상의 기점의 결정된 위치가 적합의 상관을 증가시키는 방향으로 이동된다. 최적의 상관을 생성하는 오프셋이 특정된 임계 상관, 또는 달리 원하는 상관이 결정될 때까지 반복이 진행될 수 있다. 변환은 오프셋에 기초하여 결정될 수 있고, 변환은 목표 이미지 내의 특징(예: 부위(340))의 나머지에 적용될 수 있다. 따라서, 목표 이미지 내의 특징에 대한 위치는, 오버레이될 때 이미지 데이터 내의 기점 사이에서 결정된 오프셋에 기초하여 변환을 사용하여, 이미지 데이터 사이의 상대적 스케일 및/또는 배향을 이동함으로써 결정될 수 있다.
다양한 변환 모델 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 선형 변환, 기하학적 변환, 투영 변환, 또는 아핀 변환을 포함하는 글로벌 변환이 유용하다. 변환은, 예를 들어, 회전, 병진, 스케일링, 전단 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 목표 검출 데이터 또는 참조 데이터의 왜곡을 조정하는 데에는 탄성 또는 비강성 변환도 유용할 수 있다. 객체의 치수를 따라 라인을 스캔하는 검출 장치를 사용할 때 왜곡이 발생할 수 있으며, 여기서 라인의 최장 치수는 x-차원을 따라 발생한다. 예를 들어, 신장 왜곡은 x-차원을 따라 (그리고 때때로 x-차원만을 따라) 발생할 수 있다. 예를 들어, 영역 검출기의 맥락에서 x 및 y 차원 모두에서 왜곡이 확산되는 것을 포함하여 다른 검출기에서도 왜곡이 발생할 수 있다. 탄성 또는 비강성 변환은 라인 스캐닝 기기로부터 획득된 이미지 데이터에 존재하는 선형 왜곡과 같은 왜곡을 보정하는 데 사용될 수 있거나, 영역 검출기로부터 획득된 이미지 데이터에 존재하는 왜곡을 확산시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 보정 계수가 기준 데이터, 목표 데이터 및/또는 변환에 적용될 수 있으며, 이는 검출 장치에 의해 도입된 (또는 도입될 것으로 예상되는) 왜곡을 정정한다. 패턴화된 특징이 이미지화되는 예의 경우, 비선형 보정이 x-차원의 위치 함수로서 특징 위치에 적용될 수 있다. 예를 들어, 적용되는 비선형 보정은 특징의 검출에 사용된 광학 시스템으로부터 발생하는 왜곡을 고려하기 위해 3차 다항식일 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 현재 사용 중인 종래의 기점, 예컨대 "과녁 모양" 기점은 2차원(2-D)이고 등록은 각각의 기점에 대한 템플릿 이미지와 2-D 교차 상관을 이용한다. 이는 각각의 기점에 대해 2-D 고속 푸리에 변환(FFT)을 필요로 한다. FFT는 고도로 최적화되지만, 1-D FFT는 상당히 덜 계산 집약적이며 실시간 처리 및 보정에 더 적합할 수 있다. 종래의 기점이 아핀 변환을 정확하게 적용하는 데 유용하지만, 종래의 기점의 수를 증가시키는 것은 x-축을 따라 정합의 정밀도를 증가시키기 위한 최적의 선택이 아닐 수 있다.
본원에서 논의되고 아래에서 더 상세히 전개되는 바와 같이, x-축을 따라 1-D FFT(즉, 선형 FFT)에 기초한 방법을 사용하여, 제한된 거리 범위 내의 x-차원에서 높은 해상도를 제공한다. 예를 들어, 선형 FFT가 이미지 타일 내의 각각의 픽셀 행에 대해 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 선형 FFT는 1,024 픽셀의 길이를 갖고, 이미지 타일에 중심을 둔다. 선형 FFT를 사용하면 각 픽셀 행 내의 웰 패턴을 직접 확인할 수 있다. 즉, 각각의 픽셀 행의 중앙 1,024 픽셀에 걸쳐 x-축을 따라 선형 FFT를 수행함으로써, 복소 위상은 이미지 타일의 각각의 픽셀 행에 대한 피크의 위치에서 빈으로부터 추출될 수 있다. 이러한 방식으로, (전술한 바와 같은) 종래의 기점은 x-축 및 y-축 둘 모두를 따라 절대 좌표 결정을 위해 사용될 수 있고, 하기에 기술되는 선형 기점의 위치를 찾는 것을 돕고, 선형 FFT는 선형 기점에 기초하여 중간 위치에 대한 상세한 정보를 제공할 수 있다.
이를 염두에 두고, 아래에서 논의되는 바와 같이, 선형 특징(예: 선형 기점)은 패턴화된 표면 상에 통합될 수 있다. 하나의 가능성은 선형 기점으로서 수직 라인의 수를 사용하는 것이다. 이는 실행 가능할 수 있지만, 이 접근법은 선형 FFT의 가능한 이점을 완전히 활용하지 않을 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 선형 기점 설계의 다른 가능한 실시예가 선형 FFT-기반 등록에 최적화될 수 있다. 예를 들어, FFT-기반 등록 방법의 정확도는 규칙적인 패턴의 긴 시퀀스에 기초한다. 앨리어싱 효과에 의존하는 것을 피하기 위해, 패턴의 피치는 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 한계보다 더 커야 하지만, 그것은 최대 정밀도를 달성하기 위해 그 한계 내에서 최대한 조밀해야 한다.
이전의 내용을 염두에 두고서, 본 명세서에 설명된 특정 실시예는, 기존 기준점의 각 쌍 사이뿐만 아니라 이들 사이의 간격을 포함하여, 적절한 간격으로 이미지 타일의 x축을 따라 배향된(예: 중심을 둔) 선형 기점을 활용한다. 웰이 (부위(340)의 기본 또는 암시된 패턴에 기초하여) 예상되지만 형성되지 않는 경우, 또는 웰이 존재하지만, 샘플이 없는(즉, "어두운" 웰) 경우, 이러한 선형 기점은 샘플 부위(예: 웰) 및 "공백" 또는 "공백 영역" 둘 모두를 포함할 수 있다. 선형 기점(예: 선형 기점 영역)을 형성하는 부위(340) 및 공백이 함께 또는 집합체로 고려될 때, 이들은 비기점 영역과 연관된 패턴으로부터 광학적으로 식별 가능한 선형 기점을 형성한다. 또한, 본원에서 논의된 바와 같이, 거친 정렬 마커는, 존재하는 경우, 본원에 논의된 바와 같이 선형 기점을 사용하여 선형 운동을 평가하기 전에, 패턴화된 표면과 검출 장치를 거칠게 정렬시키는 데 사용될 수 있다(360 단계, 도 8). 예를 들어, 검출기가 광학 스캐닝 장치인 맥락에서, 유동 셀 표면은 패턴화된 표면의 위치, 예컨대 순차적 영역 또는 라인 이미지화를 개시하기 위한 위치와 이미지화 광학계를 거칠게 정렬시키는 데 사용되는 하나 이상의 거친-정렬 마커를 포함할 수 있다. 이 경우에, 거친 정렬 마커는 패턴화된 표면의 근위 에지 근처에 위치할 수 있고, 근위 에지는 부위(340의) 스캐닝을 위한 개시 위치에 또는 그 근처에 있다. 거친-정렬 마커는 패턴화된 표면이 다수의 스와스에서 스캐닝될 때 유용하다. 특정 구현에서, 패턴화된 표면의 각각의 스와스는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 선형 기점을 포함할 것이며, 이는 실시간으로 스캐닝(362 단계)하는 동안 선형 운동의 편차를 검출(364 단계) 및/또는 보정(368 단계)하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 스와스 내의, 중의 또는 사이의 (선형 기점을 포함하는) 거친 정렬 마커 및 기점 둘 모두가 패턴화된 표면 상에 특징(예: 부위(340))의 위치를 찾기 위해 검출 시스템에 의해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 거친 정렬 마커는 유동 셀에 부재할 수 있고, 대신에 해당하는 정렬 기능은 패턴화된 표면 상에 존재하는 다른 기점을 사용하여 수행된다.
앞선 배경과 맥락을 염두에 두고, 도 9a 및 도 9b는 각각 이미지 타일(294)의 레이아웃의 상이한 예를 도시한다. 앞서 언급된 바와 같이, 종래의 접근법에서, 특정 기점(380)(예: 종래의 또는 거친 정렬 기점)은 동심원 및 교번하는 어두운 원과 밝은 원으로 이루어진 "과녁 모양" 패턴의 형태일 수 있다. 유동 셀로부터 스캐닝된 각각의 이미지 타일(294)은 4 내지 8(예: 4, 6, 또는 8)개의 종래의 기점(380)을 가질 수 있고, 이러한 기점(380)에서 획득된 이미지 데이터는, 이미지의 두 주축을 따라 이동, 기울어짐, 배율 변경을 보상하는 것 같은, 이미지 보정을 수행하는 데 사용될 수 있는, 절대 위치 지정 및 기하학적 변환(예: 아핀 변환) 생성에 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 종래의 기점(380)(예: 포수형 기점)에서 획득된 이미지 데이터는 이미지 지오메트리의 비선형 보정에 대한 충분한 정보를 제공하지 않는데, 즉 이미지화 광학계에 대한 샘플의 선형 이동의 편차를 식별하고 보정하는 것이 아니다.
종래의 등록 및 부위 위치 설정에 사용되는 기점(380)에 더하여, 도 9a 및 도 9b의 이미지 타일(294)은 스캔 작동 동안 선형 운동의 편차를 결정하는 데 사용될 수 있는 선형 기점(384)을 포함하는 것으로 도시되어 있다. 예를 들어, 이러한 선형 기점(384)은 x-차원 내에서 고해상도 위치 결정을 수행하는 데 사용될 수 있고, 도 9a에 도시된 예에서, 정렬된 종래의 기점(380) 쌍 사이뿐만 아니라 쌍을 이루는 종래의 기점(380) 사이의 간격으로 이미지 타일(294) 상에 위치할 수 있다. 상이한 레이아웃에서, 도 9b에 도시된 바와 같이, 종래의 기점(380)은 정렬되는 대신 도시된 y-차원에서 이격(즉, 오프셋)될 수 있다. 알려진 오프셋으로 인해, 종래의 기점(380)(예: 거친 정렬 또는 "과녁 모양" 기점)은 여전히 거친 정렬 기능뿐만 아니라 본원에 논의된 바와 같이 선형 기점(384)을 국소화하기 위해 사용될 수 있다.
선형 기점(384)의 예시적인 구현에서, 도 10으로 돌아가서, 도시된 예에서 각각의 선형 기점은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상 웰 패턴에 기초하여 3개의 열을 포함한다. 도시된 예에서, 선형 기점(384)에 해당하는 3개의 열은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상적이고 주기적인 웰 패턴의 샘플 부위(340)와 함께 상부 및 저부 상에 배치된다. 이 예에서 선형 기점(384)은 "공백" 웰 또는 부위(396)의 2개의 외부 열(392)를 포함하거나 그렇지 않으면 "공백"이다(즉, 비기점 영역(388)에 존재하는 패턴에 해당하거나 비어 있는 어두운 웰을 갖는 위치에 형성된 웰을 갖지 않음). 이 예에서, "공백" 행(392)은 인접한 행 상의 교번하는 웰 위치와 관련하여 발생할 수 있는 문제를 다룬다. 또한, 경계를 이루는 비기점 영역(388)의 인접한 행은 선형 기준점(384)의 중앙 행(400)과 동일한 샘플 위치(예: 웰) 정렬을 가질 것이다. 하나의 샘플 실시예에서, 광학 왜곡의 영향을 최소화하거나 제한하기 위해, 선형 기점(384)의 길이는 적어도 1,024 픽셀이고, 이는 비기점 웰 패턴이 선형 기점(384)의 옆에 그리고 선형 기점(384)의 위와 아래에 존재할 수 있도록 각자의 스와스에 중심 설정된다.
도시된 예에서, 선형 기점(384)의 중심 행은, 샘플을 유지할 수 있고 따라서 샘플 데이터를 획득 및 수집하는 데 사용될 수 있는 웰 부위(340)를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 웰 패턴의 간격(즉, 피치)이 광학 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 샘플링 한계 미만인 경우, 웰 패턴의 기간은 1-D 푸리에 변환으로 직접 표현될 수 없다. 이를 염두에 두고, 도시된 예는 중앙 행(400) 내의 유효 기준 피치를 한계 이상으로 가져오기 위해 샘플 부위(340)를 공백(396)과 교번한다. 그 결과, 도 10에 도시된 바와 같은 선형 기점은 종래의 기점에 비해 상당히 더 적은 손실된 웰 부위 위치를 가질 것이고, 따라서 더 작은 간격으로 위치할 수 있다. 예시된 선형 기점 설계는 종래의 기점에 비해 더 높은 해상도를 갖지만, 제한된 총 범위를 갖는다. 상응하게, 도시된 선형 기점(384)은 x-축을 따른 상대적 변위(예: 스캔 경로와 연관된 선형 운동의 편차)를 검출하기 위해 종래의 기점(예: 과녁 모양 기점)보다 더 적합하다. 그러나, 반대로, 선형 기점(384)은 y-차원에서 감도가 거의 또는 전혀 없다.
도 10에 도시된 것에 대한 대안적인 실시예에서, 도 11에 도시된 바와 같이, x-차원 편차 또는 이동을 교정하기 위해 사용될 수 있는 선형 기점(384)은 대신 "수직" 기점(즉, y-차원에서 길이 방향으로 이어지는 선형 기점)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 "수직" 선형 기점(384)은, 종래의 또는 거친 정렬 기점(380) 사이에서 작동하는 것과 같이, 기재 상에 형성된 트렌치 또는 날카로운 라인으로서 형성될 수 있다.
도 12를 참조하면, 선형 기점(384)의 구현의 추가 예가 도시되어 있다. 이 예에서, 각각의 선형 기점(384)은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상 웰 패턴에 대해 일반적으로 기초하여 3개의 열을 포함한다. 도시된 예에서, 선형 기점(384)에 해당하는 3개의 열은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상적이고 주기적인 웰 패턴의 샘플 부위(340)와 함께 상부 및 저부 상에 배치된다. 이 예에서 선형 기점(384)은 "공백" 웰 또는 부위(396)의 2개의 외부 열(392)를 포함하거나 그렇지 않으면 "공백"이다(즉, 패턴(388)에 해당하거나 비어 있는 어두운 웰을 갖는 위치에 형성된 웰을 갖지 않음). 전술한 예에서와 같이, "공백" 행(392)은 샘플 웰(340)에 대한 고밀도 환경에서 인접한 행의 교대 웰 위치와 연관된 조밀한 피치 밀도와 관련하여 발생할 수 있는 문제를 다룬다.
또한, 도 12의 도시된 예에서, 선형 기점(384)의 중심 행은 공백 부위(396)와 교번되는 (수직 차원에 해당하는 라인 스캔의 방향으로) 수평 배향된 긴 샘플 웰 부위(344)(본원에서 선형 특징(344)으로도 지칭됨)를 포함한다. 도시된 실시예의 선형 특징(344)은 일반적으로 이격된 2개의 부위(340)와 도시된 예의 중간 피치 거리에 걸쳐 있지만, 다른 형상 및/또는 치수도 고려된다. 본원에 기재된 바와 같이, 웰 패턴의 간격(즉, 피치)이 광학 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 샘플링 한계 미만인 경우, 웰 패턴의 기간은 1-D 푸리에 변환으로 직접 표현될 수 없다. 이를 염두에 두고, 도시된 예는 중앙 행(400) 내의 유효 기준 피치를 한계 이상으로 가져오기 위해 선형 특징(344)을 공백(396)과 교번한다.
도 13 내지 도 15에 도시된 추가 예에서, 선형 기점(384)은 샘플 부위(340) 및 공백(396)의 3개 초과의 열을 포함하는 것으로 도시된다. 예를 들어, 도시된 실시예에서, 선형 기점(384)은 샘플 부위(340) 및 공백(396)의 5개의 행을 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, 광학 왜곡의 효과를 최소화하거나 제한하기 위해, 선형 기점(384)의 길이는 적어도 1,024 픽셀일 수 있고, 선형 기점(384)은 각자의 스와스 내에 (x-차원에 대해) 중심 설정될 수 있다.
예를 들어, 도 13으로 돌아가면, 도시된 선형 기점(384)은 5개의 행을 포함한다. 선형 기점(384)의 상부, 중심 및 하부 행은 공백 부위(396) 및 샘플 부위(340)의 주기적인 교번하는 배열을 포함한다. 이 예에서, 주기적 배열은 하나의 공백 부위(396)이고, 이어서 2개의 샘플 부위(340), 이어서 공백 부위(396), 등등이다. 도 13의 선형 기점(384)은 행 내에 중간 또는 간격을 두는 공백 부위(396)가 없는 샘플 부위(340)의 공백이 아닌 두 개의 행(404)을 포함한다. 하나의 비공백 행(404)은 선형 기점(384)의 상부와 중심 행 사이에 위치하는 반면, 다른 비공백 행(404)은 선형 기점(384)의 중심과 하부 행 사이에 위치한다. 전술한 예에서와 같이, 선형 기점(384) 내의 공백 부위(396)에 의해 제공되는 전체 패턴의 파단은 선형 기점(384) 내의 샘플 부위(340) 사이의 피치 또는 간격이 Shannon-Nyquist 샘플링 한계를 초과하고, 추가로 선형 운동의 편차가 검출되게 하는 유용한 영역을 제공할 수 있다.
도 13을 추가로 참조하면, 특정 실시예에서, 선형 기점(384)은, 라인 스캔의 스캔 방향과 같은, 일반적으로 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 정렬된 2개 이상의 비공백 부위(340)(예: 샘플 웰)를 포함한다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 3개의 비공백 부위(340A, 340B, 340C)는 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 정렬된다. 특정 양태에서, 실질적으로 평행하게 열로 정렬된 2개 이상의 비공백 샘플 부위(340)는 그 값이 가산되기 때문에 푸리에 변환 시 더 큰 "양의" 신호를 제공한다.
또한, 특정 실시예에서, 선형 기점(384)은, 라인 스캔의 스캔 방향과 같은, 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 대체로 정렬된 2개 이상의 공백 부위(396)를 포함한다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 3개의 공백 부위(396A, 396B, 396C)는 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 정렬된다. 특정 양태에서, 실질적으로 평행하게 열로 정렬된 두 개 이상의 공백 부위(396)는 그 값이 가산되기 때문에 푸리에 변환 시 더 큰 "음의" 신호를 제공한다.
추가로 예시된 바와 같이, 특정 실시예에서, 선형 기점(384)은 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 대체로 정렬된 2개 이상의 비공백 웰(340)을 포함하고, 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열 내에 일반적으로 정렬된 2개 이상의 공백 부위(396)를 포함한다. 예를 들어, 도 13에 나타낸 바와 같이, 선형 기점(384)은 2개 이상의 공백 부위(396)의 열(이 중 하나는 채워지지 않은 라인(1)으로 표시됨) 사이에 2개 이상의 비공백 샘플 부위(340)의 5개 열(채워진 라인(1~5)로 표시됨)을 포함한다.
특정 양태에서, 비공백 샘플 부위(340)(예: 샘플 웰) 및 공백 부위(396)의 배열은 선형 기점(384)의 증가된 검출 가능성을 제공하면서 또한 비공백 웰이 샘플/분석물 영역으로서 사용되게 한다.
도 14를 참조하면, 선형 기점(384)의 추가 예가 도시되어 있다. 교번하는 공백 부위(396) 및 샘블 부위(340)의 행이 샘플 부위(340)의 전체 행과 교번되는 도 13의 예시적인 선형 기점(384)과 달리, 도 14의 예시적인 선형 기점(384)은 서로 다른 주기적인 반복 패턴을 갖는 공백 부위(396)와 샘플 부위(340)의 열을 활용한다. 이 예에서, (여기서 선형 기점(384)의 저부, 중심, 및 상부 행을 구성하는) 선형 기점(384)의 행(420)은 1 대 2의 교번하는 패턴(예: 하나의 공백 부위(396), 2개의 샘플 부위(340), 하나의 공백 부위(396) 등)에서 샘플 부위(340) 및 공백 부위(396)를 포함한다. 행(420) 사이(즉, 상단과 중앙 행 사이, 중앙과 하단 행 사이)에는 선형 기점(384)의 행(424)이 위치하며, 여기서 샘플 부위(340) 및 공백 부위(396)는 1:1 교번 패턴(예: 하나의 공백 부위(396), 하나의 샘플 부위(340), 하나의 공백 부위(396))으로 되어 있다. 전술한 예에서와 같이, 선형 기점(384) 내의 공백 부위(396)에 의해 제공되는 전체 패턴의 파단은 선형 기점(384) 내의 샘플 부위(340) 사이의 피치 또는 간격이 Shannon-Nyquist 샘플링 한계를 초과하고, 추가로 선형 운동의 편차가 검출되게 하는 유용한 영역을 제공할 수 있다.
도 14를 추가로 참조하면, 특정 실시예에서, 선형 기점(384)은 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 일반적으로 정렬된 2개 이상의 비공백 샘플 부위(340)(예: 샘플 웰)를 포함하고, 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 일반적으로 정렬된 2개 이상의 공백 부위(396)를 포함한다. 예를 들어, 도 14에 나타낸 바와 같이, 선형 기점(384)은 2개 이상의 공백 부위(396)의 2개의 열 세트(예: 쌍)(채워지지 않은 라인(1 및 2)로 표시된 한 쌍) 사이에 (채워진 라인(1~3)으로 표시된) 2개 이상의 비공백 샘플 부위(340)의 3개의 열을 포함한다.
도 15를 참조하면, 선형 기점(384)의 행이 행에서 행으로 오프셋되는 반복 패턴으로 공백 부위(396) 및 샘플 부위(340)를 포함하는 추가 예가 도시되어 있다. 이 예에서, 선형 기점(384)에 4개의 행이 존재한다. 도 14의 예와는 달리, 도 15의 선형 기점(384)의 행(428) 각각은 동일한 교번의 패턴(예: 2개의 공백 부위(396), 하나의 샘플 부위(340), 2개의 공백 부위(396))을 갖지만, 인접한 행에서 서로 오프셋된다. 그 결과, 선형 기점(384)의 2개의 내부 행에서 각각의 샘플 부위(340)는 인접한 다른 샘플 부위(340)를 갖지 않고, 대신에 인접한 공백 부위(396)에 의해 둘러싸인다. 전술한 예에서와 같이, 선형 기점(384) 내의 공백 부위(396)에 의해 제공되는 전체 패턴의 파단은 선형 기점(384) 내의 샘플 부위(340) 사이의 피치 또는 간격이 Shannon-Nyquist 샘플링 한계를 초과하고, 추가로 선형 운동의 편차가 검출되게 하는 유용한 영역을 제공할 수 있다.
도 15를 추가로 참조하면, 특정 실시예에서, 선형 기점(384)은 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 일반적으로 정렬된 2개 이상의 비공백 샘플 부위(340)(예: 샘플 웰)를 포함하고, 스캔 방향에 실질적으로 평행한 열에 일반적으로 정렬된 2개 이상의 공백 부위(396)를 포함한다. 예를 들어, 도 15에 나타낸 바와 같이, 선형 기점(384)은 2개 이상의 공백 부위(396)의 2개의 열 세트(예: 쌍)(채워지지 않은 라인 및 2)로 표시된 한 쌍) 사이에 (채워진 라인(1)으로 표시된) 2개 이상의 비공백 샘플 부위(340)의 1개의 열을 포함한다.
도 16 내지 도 20을 참조하면, 선형 기점의 5개의 추가적인 실시예가 도시되고 설명된다. 도 12에 예시된 실시예와 마찬가지로, 긴 샘플 웰 부위(344)(본원에서 선형 특징(344)으로도 지칭됨)가 도 16 내지 도 20에 도시된 실시예에 통합된다. 그러나, 선형 특징(344)이 기재의 x-차원을 따라 수평으로 배치되는 도 12의 실시예와 달리(즉, 각각의 선형 특징(344)이 선형 기점(384)의 행 내에 있음), 도 16 내지 도 20의 도시된 예시적인 실시예에서, 선형 특징(344)은 대신에 기재의 y-차원을 따라 수직으로(즉, 라인 스캐닝 방향으로) 배치되어, 선형 기점(384)의 다수(예: 2, 3, 4 등)의 행을 스캐닝하는 반면, 각각의 행 내에서, 각각의 선형 특징(344)는 각각의 행 내에서 단일 샘플 부위(340)와 연관된 공간만을 점유한다. 이전에 언급된 바와 같이, 일부 실시예에서, 다른 샘플 부위(340)와 같이 긴 샘플 부위(예: 선형 특징(344))는 샘플/분석물 영역으로서 사용될 수 있고, 따라서 기점과 관련된 영역 또는 스폿이 고정되거나 미리 결정된 마커와 관련되는 기술과는 대조적으로 의미있는 데이터 수집 또는 생성을 위한 부위를 제공할 수 있다.
예를 들어, 그리고 도 16으로 돌아가면, 일 실시예가 도시된다. 이 예에서, 각각의 선형 기점(384)은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상 웰 패턴에 대해 일반적으로 기초하여 3개의 열을 포함한다. 도시된 예에서, 선형 기점(384)에 해당하는 3개의 행은, 도시된 예에서, 선형 기점(384)에 해당하는 3개의 행 모두에 걸쳐 있는 수직으로 배향된 선형 특징(344)을 포함한다. 즉, 도시된 실시예에서 수직으로 배향된 선형 특징(344)은 3개의 정상적으로 이격된 샘플 부위(340) 및 개재된 피치 거리에 걸쳐 있지만, 다른 지오메트리 및/또는 차원이 또한 고려된다. 이해되는 바와 같이, 다른 실시예에서, 수직으로 배향된 선형 특징(344)은 선형 기점(384)의 모든 행보다 작게 걸칠 수 있다. 도시된 예에서, 선형 기점(384)은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상적이고 주기적인 웰 패턴의 샘플 부위(340)와 함께 상부 및 저부 상에 배치된다. 선형 기점이 x 차원에서 제한된 범위(예: 1,024 픽셀)를 가질 수 있으므로, 비기점 영역(388)에 존재하는 정상적이고 주기적인 웰 패턴의 측면에 배치될 수도 있다.
도시된 예에서, 선형 기점(384)의 실시예는, 본원의 다른 곳에서 논의되고 설명된 바와 같이, 공백 부위(396)를 포함하지 않는다. 대신에, 도시된 샘플 부위(340) 및 선형 특징(344) 둘 모두는 분석 중인 샘플 및/또는 분석물을 보유하도록 구성되고, 따라서 기재 표면 공간이 샘플이 없는 공백 부위(396)를 유지하는데 손실되지 않는다.
이 예에서, 선형 기점(384)의 최상부 및 최하부 열은 샘플 부위(340)와 선형 특징(344)의 부분을 1 대 2 교번 패턴(예: 하나의 선형 특징(344), 2개의 샘플 부위(340), 하나의 선형 특징(344))으로 포함한다. (즉, 상부 및 하부 행 사이의) 도시된 예에서 선형 기점(384)의 중심 행은 대신에 선형 특징(344) 및 샘플 부위(340)의 1 대 1 교번하는 패턴(예: 하나의 선형 특징(344), 하나의 샘플 부위(340), 하나의 선형 특징(344))을 나타낸다. 이 예에서, 선형 특징(344)과 샘플 부위(340) 사이의 피치의 변화는, 샘플 부위(340) 사이의 및/또는 샘플 부위(340)과 선형 기점(384) 내의 선형 특징(344) 사이의 피치 또는 간격이 Shannon-Nyquist 샘플링 한계를 초과하고, 추가로 선형 운동의 편차가 검출될 수 있게 하는 유용한 영역을 제공할 수 있다. 또한, 위에서 언급된 바와 같이, 이는, 푸리에 변환 시 더 큰 "양의" 신호를 제공하는 수직으로 배향된 선형 특징(344)에 의해 촉진될 수 있다.
추가의 예에서, 도 17으로 돌아가서, 이 예에서, 각각의 선형 기점(384)은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상 웰 패턴의 3개의 행에 해당한다. 도시된 예에서, 선형 기점(384)에 해당하는 3개의 행은, 도시된 예에서, 선형 기점(384)에 해당하는 3개의 행 모두에 걸쳐 있는 수직으로 배향된 선형 특징(344)을 포함한다. 즉, 도시된 실시예에서 선형 특징(344)은, 라인 스캔의 방향에 해당하고, 이 예에서, 3개의 정상 이격된 샘플 부위(340)와 개재 피치 거리를 더하는 정도에 해당하는 선형 기점(384)의 높이에 걸쳐 있지만, 다른 지오메트리 및/또는 차원이 또한 고려된다. 이해되는 바와 같이, 다른 실시예에서, 수직으로 배향된 선형 특징(344)은 선형 기점(384)의 모든 행보다 작게 걸칠 수 있고, 이러한 경우에서 수직 정렬될 수 있거나 수직 차원(즉, 예시된 라인 스캔의 방향)에서 교대로 오프셋될 수 있다. 도시된 예에서, 선형 기점(384)은 비기점 영역(388)에 존재하는 정상적이고 주기적인 웰 패턴의 샘플 부위(340)와 함께 상부 및 저부 상에 배치된다. 선형 기점이 x 차원에서 제한된 범위(예: 1,024 픽셀)를 가질 수 있으므로, 비기점 영역(388)에 존재하는 정상적이고 주기적인 웰 패턴의 측면에 배치될 수도 있다.
도시된 예에서, 선형 기점(384) 내에서, 수직으로 배향된 선형 특징(344)은, 본원에 논의된 바와 같이, 예컨대 공백 또는 공백 공간 또는 영역(즉, 공백 웰(396) 또는, 공백이든 아니든, 웰이 형성되지 않는 영역)에 해당할 수 있는 간격 또는 공백 영역(408)을 통해, 수평으로 오프셋 또는 이격될 수 있다. 도시 및 명확화의 목적을 위해, 도시된 예에서, 실제 상황에서 공백 영역(408)의 범위를 더 잘 설명하기 위해 공백 또는 형성되지 않은 웰의 해당 간격은 표시되지 않았지만, 기본 패턴이 덜 명확해지는 대가를 치르게 된다. 전술한 예에서와 같이, 공백 또는 영역(408)은 샘플 웰에 대한 고밀도 맥락에서 인접한 행의 교대 웰 위치와 관련된 피치 밀도와 관련하여 발생할 수 있는 문제를 해결하는 데 도움이 된다. 이러한 방식으로, 너무 근접하게 이격된 인접한 행 상의 교번하는 웰 위치로부터 발생하는 문제는 선형 기점(384)에 의해 해결될 수 있다. 또한, 공백 영역(408)을 갖는 특정 영역에서 선형 기점(384)에서의 유효 피치는 광학 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 샘플링 한계 미만이지 않도록 증가되어, 1-D 푸리에 변환을 사용하여 웰 패턴의 주기의 표현 및/또는 결정을 촉진한다. 실제로, 특정 양태에서, 수직으로 배향된 선형 특징(344)은 푸리에 변환 시 더 큰 "양의" 신호를 제공한다. 이를 염두에 두고, 도시된 예는 유효 기점 피치가 광학 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 샘플링 한계 초과인 선형 기점(384) 내의 영역을 달성하기 위해 공백 영역(408)과 수직으로 배향된 선형 특징(344)을 교번한다.
앞서 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 선행 및 다른 예에서, 선형 기점을 포함하는 특징 사이의 수평 간격은 웰 패턴과 연관된 웰 간격의 정수 배수 이외의 것(즉, 비기점 육각형 웰 패턴의 인접한 웰 사이의 간격)일 수 있다. 참조로서, 도 17에 도시된 이전 예는 선형 기점(384)의 선형 특징(344) 사이의 간격을 가지며, 이는 웰 간격의 정수배(여기서는 2x)이다. 그러나, 이러한 선형 특징(344) 사이의 선형 기점(384) 내의 간격은 정수의 웰 간격일 필요가 없고, 대신에, 비-정수의 웰 간격일 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 이전의 내용을 염두에 두고, 선형 기점(384)의 다양한 구현에서 선형 기점(384)의 선형 특징(344) 사이의 간격 패턴(예: 교번하는 간격 패턴)이 사용될 수 있다. 예를 들어, "유닛"은 웰의 기본 패턴과 관련되거나 관련되지 않을 수 있는 길이 유닛이며, 2:3:2:3 …; 1:2:1:2 …; 1:3:1:3 …; 등의 (단위의) 선형 특징 간격 패턴은 선형 기점(384) 내에서 이용될 수 있다.
이전의 내용을 염두에 두고, 도 18 내지 도 20에 도시된 예로 돌아가면, 이러한 변형의 다양한 양태가 도시된다. 도 18을 참조하면, 이 예에서, 도 17의 실시예에서 볼 수 있는 것과 유사한 선형 특징(344)의 배열이 도시되어 있다. 그러나, 이전의 예와는 대조적으로, (공백 영역(408)에 해당하는 것으로 예시된) 선형 특징(344) 사이의 간격은 비기점 영역(388)의 웰(340)에 해당하는 웰 간격의 비-정수배이다. 예시의 목적을 위해, 이 예에서, 선형 특징(344)운 1.5 x 웰 간격에 해당하는 거리만큼 선형 기점(384)으로 이격된다. 그러나, 이해되는 바와 같이, 적합한 비-정수배의 웰 간격(예: 1.25 x, 1.33 x, 1.5 x, 1.66 x 1.75 x 등)이 사용될 수 있다.
도 19를 참조하면, 이 예에서, 선형 기점(384)의 선형 특징(344) 사이의 간격도 비기점 영역(388)의 웰(340)에 해당하는 비-정수배의 웰 간격이다. 또한, 선형 기점(384)의 선형 특징(344)은 이전의 예에서보다 더 적은 범위(예: 길이)를 갖는 것으로 도시되어 있다. 특히, 도시된 예에서, 수직으로 배향된 선형 특징(344)은 비기점 영역(388)의 기본 육각형 패턴의 2개의 행(즉, 2개의 정상적으로 이격된 샘플 부위(340) 면적 + 개재 피치 거리)을 갖는다. 이러한 방식으로, 선형 기점(384)은 기재의 더 작은 수직 범위를 점유하도록 구성되어, 통상적인 샘플 웰(340)에 대해 더 큰 영역이 허용되게 설계될 수 있다.
추가의 예에서, 도 20으로 돌아가서, 특정 실시예에서, 선형 기점(384)의 선형 특징(344) 사이의 간격은 선형 특징(344) 사이에 간격의 교번하는 패턴을 포함할 수 있다. 즉, 선형 특징 사이의 공백 영역(408)은 2개의 상이한, 교번하는 폭 또는 범위일 수 있다. 이것의 일례가 도 20에 도시된다. 도시된 예에서, 각각의 선형 특징(344)은 제1 폭 또는 범위를 갖는 공백 영역(408A)에 의해 제1 면 상의 가장 가까운 선형 특징으로부터 분리되고, 제1 폭 또는 범위와 상이한 제2 폭 또는 범위를 갖는 공백 영역(408B)에 의해 제2 면(예: 반대 또는 대향 면) 상의 가장 가까운 선형 특징으로부터 분리된다. 이러한 방식으로, 선형 특징(344)의 패턴이 형성될 수 있으며, 이는 그 자체로 x-차원에서의 위치에 관한 정보를 제공한다. 이해되는 바와 같이, 제1 및 제2 공백 영역(408A, 408B) 둘 모두에 대한 선형 특징 사이의 간격은 웰의 기본 패턴과 관련될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 즉, 하나 또는 둘 모두의 이격 간격은 비기점 영역에서 관찰되는 육각형 패턴에 존재하는 웰 간격의 정수배에 기초할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 본원에 기술된 다른 예에서와 같이, 공백 영역(408A, 408B)을 갖는 교번된 선형 특징(344)은 유효 기점 피치가 광학 시스템에 대한 Shannon-Nyquist 샘플링 한계 초과인 영역을 선형 기점(384) 내에 영역을 제공한다.
이러한 서면 설명은 베스트 모드를 포함하여 본 발명을 개시하고 또한 임의의 장치 또는 시스템을 제조 및 사용하고 임의의 통합된 방법을 수행하는 것을 포함하여 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 예를 사용한다. 본 개시의 특허 가능한 범주는 청구범위에 의해 한정되며, 당업자에게 상기되는 다른 예를 포함할 수 있다. 이러한 다른 예은 청구항의 문자 그대로의 언어와 다르지 않은 구조적 요소를 가지고 있거나, 청구범위의 문자 그대로의 언어와 실질적으로 다르지 않은 등가의 구조적 요소를 포함하는 경우, 청구범위의 범위 내에 있도록 의도된 것이다.
Claims (30)
- 패턴화된 유동 셀로서,
기재;
상기 기재의 비기점 영역 내의, 주기적인 패턴으로 배열되는 복수의 샘플 부위;
상기 복수의 샘플 부위로부터 분리된 상기 기재 상에 형성된 복수의 거친 정렬 기점;
상기 기재 상에 형성된 복수의 선형 기점으로서, 각각의 선형 기점은 상기 주기적 패턴에 따라 배열된 샘플 부위 및 공백을 포함하고, 각각의 공백은 웰이 배치되어야 하지만 비어 있거나 빈 샘플 웰이 배치되는 상기 주기적 패턴의 위치에 해당하는 복수의 선형 기점을 포함하는, 패턴화된 유동 셀. - 제1항에 있어서, 상기 주기적 패턴은 육각형 또는 직선 패턴을 포함하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 상기 거친 정렬 기점은 과녁 모양 패턴을 포함하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 상기 복수의 선형 기점의 하위 집합은 거친 정렬 기점의 쌍들 사이에서 상기 기재 상에 형성되는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 상기 복수의 거친 정렬 기점은 상기 복수의 선형 기점에 대해 수직 오프셋 패턴에 있는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 상기 복수의 선형 기점 중 상기 선형 기점은 상기 패턴화된 유동 셀을 이미지화할 때 픽셀의 행이 스캐닝되는 방향에 해당하는 x-차원으로 형성되는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 각각의 선형 기점의 각각의 행은 하나 이상의 공백을 포함하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 각각의 선형 기점은 각각이 하나 이상의 공백을 갖는 행에 의해 배치되는 공백을 갖지 않는 하나 이상의 행을 포함하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 각각의 선형 기점은 상기 주기적 패턴의 3개, 4개, 또는 5개의 행을 포함하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제1항에 있어서, 각각의 선형 기점은 샘플 부위 및 공백의 교번하는 패턴을 포함하는 하나 이상의 행을 포함하는, 패턴화된 유동 셀.
- 패턴화된 유동 셀로서,
기재;
상기 기재의 비기점 영역 내의, 주기적인 패턴으로 배열되는 복수의 샘플 부위;
상기 복수의 샘플 부위로부터 분리된 상기 기재 상에 형성된 복수의 거친 정렬 기점;
상기 기재 상에 형성된 복수의 선형 기점으로서, 각각의 선형 기점은 긴 샘플 부위를 포함하는 선형 특징을 포함하고, 각각의 선형 특징은 2개 이상의 샘플 부위에 해당하는 영역에 걸쳐 있는, 복수의 선형 기점을 포함하는, 패턴화된 유동 셀. - 제11항에 있어서, 각각의 선형 기점은 하나 이상의 공백을 추가로 포함하고, 각각의 공백은 웰이 배치되어야 하지만 비어 있거나 빈 샘플 웰이 배치되는 상기 주기적 패턴의 위치에 해당하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제11항에 있어서, 각각의 선형 기점은:
상기 주기적 패턴에 해당하는 2개 이상의 행을 포함하고, 상기 2개 이상의 행은:
샘플 부위 또는 공백 중 하나 또는 둘 모두; 및
상기 각각의 선형 기점의 샘플 부위 또는 공백과 교번하는 복수의 선형 특징으로서, 각각의 선형 특징은 상기 주기적 패턴의 다수의 행에 걸쳐 있는, 복수의 선형 특징을 포함하는, 패턴화된 유동 셀. - 제13항에 있어서, 각각의 공백은, 존재하는 경우, 웰이 배치되어야 하지만 비어 있거나, 빈 샘플 웰이 배치되는 상기 주기적 패턴의 위치에 해당하는, 패턴화된 유동 셀.
- 제11항에 있어서, 각각의 선형 기점은:
선형 특징 및 공백의 교번하는 패턴을 포함하는 중심 행; 및
모든 공백을 포함하는 한 쌍의 측면 행을 포함하는, 패턴화된 유동 셀. - 제11항에 있어서, 상기 선형 특징은 상기 주기적 패턴의 행에 대한 배향과 일치하도록 수평으로 배향되고, 상기 주기적 패턴은 육각형 패턴인, 패턴화된 유동 셀.
- 제11항에 있어서, 상기 선형 특징은 상기 주기적 패턴의 행에 대한 배향에 수직이도록 수직으로 배향되고, 상기 주기적 패턴은 육각형 패턴인, 패턴화된 유동 셀.
- 제11항에 있어서, 상기 선형 특징은 상기 주기적 패턴 내의 샘플 부위 사이의 거리의 비-정수배인 간격 거리만큼 이격되는, 패턴화된 유동 셀.
- 제11항에 있어서, 상기 선형 특징은 교번하는 제1 및 제2 간격 거리에 의해 이격되는, 패턴화된 유동 셀.
- 이미지화 작동에서 선형 스캔 경로의 편차를 보정하기 위한 방법으로서,
선형 스캔 경로를 따라 이미지화 작동을 수행하는 패턴화된 표면을 전진시키는 단계;
상기 선형 스캔 경로를 따라 전진됨에 따라 상기 패턴화된 표면을 이미지화하되, 상기 패턴화된 표면은 복수의 선형 기점을 포함하는 단계;
상기 복수의 선형 기점을 사용하여 상기 선형 스캔 경로의 편차를 검출하는 단계; 및
상기 패턴화된 표면이 이미지화되는 동안 상기 선형 스캔 경로의 편차를 보정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제20항에 있어서, 상기 선형 스캔 경로의 편차는 상기 이미지화 동안 실시간으로 검출되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 패턴화된 표면을 이미지화하는 단계는 상기 패턴화된 표면의 공초점 라인 스캐닝을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 추가로:
상기 패턴화된 표면을 이미지화하기 전에 복수의 거친 정렬 기점을 사용하여 검출 장치를 상기 패턴화된 표면과 정렬시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제20항에 있어서, 각각의 선형 기점은 상기 패턴화된 표면의 주기적 패턴에 따라 배열된 샘플 부위 및 공백을 포함하고, 각각의 공백은 샘플 부위가 배치되어야 하지만 비어 있거나 빈 샘플 부위가 배치되는 상기 주기적 패턴의 위치에 해당하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 각각의 선형 기점은 긴 샘플 부위를 포함하고 상기 선형 스캔 경로에 해당하는 방향으로 배향된 선형 특징을 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 선형 스캔 경로의 편차를 검출하는 단계는 각각의 픽셀 행에 걸쳐 1차원(1-D) 고속 푸리에 변환을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 시퀀싱 기기로서:
샘플 용기를 지지하도록 구성된 샘플 스테이지;
상기 샘플 스테이지 상에 존재할 때 상기 샘플 용기를 이미지화하기 위해 조합하여 작동하도록 구성된 대물 렌즈, 광검출기, 및 광원; 및
작동을 수행하도록 구성된 제어기를 포함하고, 상기 작동은:
선형 스캔 경로를 따라 이미지화 작동을 수행하는 상기 샘플 용기를 전진시키는 단계;
상기 선형 스캔 경로를 따라 전진됨에 따라 상기 샘플 용기의 패턴화된 표면을 이미지화하되, 상기 패턴화된 표면은 복수의 선형 기점을 포함하는 단계;
상기 복수의 선형 기점을 사용하여 상기 선형 스캔 경로의 편차를 검출하는 단계; 및
상기 패턴화된 표면이 상기 시퀀싱 기기에 의해 이미지화되는 동안 상기 선형 스캔 경로의 편차를 보정하는 단계를 포함하는, 시퀀싱 기기. - 제27항에 있어서, 상기 제어기는 상기 이미지화 동안 실시간으로 상기 선형 스캔 경로의 편차를 검출하도록 구성되는, 시퀀싱 기기.
- 제27항에 있어서, 상기 제어기는 작동을 수행하도록 추가로 구성되고, 상기 작동은:
상기 패턴화된 표면을 이미지화하기 전에 복수의 거친 정렬 기점을 사용하여 상기 대물 렌즈를 상기 패턴화된 표면과 정렬시키는 단계를 포함하는, 시퀀싱 기기. - 제27항에 있어서, 상기 제어기는 상기 패턴화된 표면의 각각의 픽셀 행에 대해 1차원(1-D) 고속 푸리에 변환을 수행함으로써 상기 선형 스캔 경로의 편차를 검출하도록 구성되는, 시퀀싱 기기.
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