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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen von Eigenschaften mindestens einer Struktur im Submikrometerbereich.
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Zur Qualitätskontrolle von Strukturen, die Abmessungen kleiner als 1 μm aufweisen, also im Submikrometerbereich liegen, werden verschiedene nanometergenaue Charakterisierungsverfahren eingesetzt. Insbesondere kommt hierbei Rasterkraftmikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und Super-Resolution-Mikroskopie zum Einsatz. Keine dieser Methoden ermöglicht jedoch eine automatisierte Charakterisierung von Proben mit hohem Durchsatz. Zudem ist oftmals eine aufwändige Vorbereitung der Charakterisierung bzw. eine aufwändige Probenpräparation notwendig. Insbesondere eine nichtinvasive Vermessung in wässriger Umgebung ist technisch sehr umständlich und fehleranfällig.
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So zeigt Druckschrift
CN 103226584 A ein Verfahren, bei dem mittels Clusteranalyse und Triangulation der Abstand eines Schwerpunkts eines Masseobjekts von einem außenliegenden Punkt bestimmt wird. Aus
CN 104316505 A ist ein Verfahren zur Rauschunterdrückung bei einer dreidimensionalen Fluoreszenz-Standard-Spektrum-Bibliothek bekannt. Die Druckschrift
CN 103796303 A offenbart ein Verfahren zum Auffinden eines Endpunkts mittels Clusteranalyse und einer triangularen Methode.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung vorzuschlagen, die die genannten Nachteile überwinden, mit denen also eine Struktur im Submikrometerbereich schnell und mit geringem Präparationsaufwand hinsichtlich ihrer Eigenschaften charakterisiert werden kann.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und eine Vorrichtung nach Anspruch 9. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
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Ein Verfahren zum Bestimmen von Eigenschaften mindestens einer Struktur im Submikrometerbereich weist mehrere Schritte auf. Die mindestens eine Struktur wird auf einem Träger angeordnet und mit mindestens drei Markerstoffen versehen. Die mindestens drei Markerstoffe werden jeweils voneinander beabstandet an der mindestens einen Struktur angeordnet. Außerdem wird eine Mehrzahl von Referenzstrukturen auf dem Träger aufgebracht. Jeweils einer der mindestens drei Markerstoffe, die voneinander unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen, wird durch Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung zur Emission elektromagnetischer Strahlung angeregt und durch eine Fernfeldmikroskopie für jeden der mindestens drei Markerstoffe mehrere zeitlich nacheinander aufgenommene Einfarbenaufnahmen erhalten. In den Einfarbenaufnahmen wird aus Signalen des jeweiligen Markerstoffs eine Position des jeweiligen Markerstoffs ermittelt. Eine der Einfarbenaufnahmen wird als Referenzaufnahme ausgewählt und jeder der verbliebenen Einfarbenaufnahmen bezüglich dieser Referenzaufnahme durch die in jeder der Einfarbenaufnahmen erkennbaren Referenzstrukturen einer Farbkorrektur unterzogen. Somit werden mehrere korrigierte Einfarbenaufnahmen für jeden der mindestens drei Markerstoffe erhalten. Die mehreren korrigierten Einfarbenaufnahmen werden zu einer Gesamtaufnahme kombiniert und eine Position jedes der mindestens drei Markerstoffe in der Gesamtaufnahme durch eine Clusteranalyse ermittelt. Ein Cluster ist hierbei ein vorbestimmter räumlicher Bereich der Gesamtaufnahme, in dem ein gegenüber der restlichen Gesamtaufnahme erhöhter Anteil an Signalen aller drei Markerstoffe ermittelt worden ist. Aus der ermittelten Position der Markerstoffe wird durch Triangulation der Positionen der mindestens drei Markerstoffe eine Position, eine Orientierung, eine Lage und bzw. oder eine Integrität der mindestens einen Struktur ermittelt.
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Durch das Verfahren kann in standardisierter und robuster Weise automatisiert die Struktur hinsichtlich verschiedener Positionierungseigenschaften wie der Position, der Orientierung oder der Lage untersucht werden. Da zum Abbilden der mindestens einen Struktur im Submikrometerbereich, worunter eine Struktur mit Abmessungen kleiner als 1 μm verstanden werden soll, ein konventionelles optisches Fernfeldmikroskop eingesetzt wird, das lediglich insofern modifiziert werden muss, dass die Markerstoffe angeregt werden können, kann die technische Ausstattung zum Durchführen des Verfahrens einfach gehalten werden. Zudem wird eine schnelle und simultane Vermessung mehrerer Strukturen, die sich nebeneinander auf dem Träger befinden, ermöglicht. Um die Triangulation durchführen zu können, werden mindestens drei Markerstoffe an verschiedenen Positionen benötigt. Da die Markerstoffe optisch isoliert voneinander sind, also jeweils unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen, kann eine eindeutige Zuordnung nach der Anregung zu dem jeweiligen Markerstoff erfolgen. Dadurch, dass die Referenzstrukturen auf dem gleichen Träger wie die zu untersuchende Struktur aufgebracht sind, liegen diese auch im gleichen Lichtpfad bei der Fernfeldmikroskopie und können somit zu Korrekturen der erhaltenen Aufnahmen verwendet werden.
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Indem durch die Clusteranalyse ein statistisches Verfahren zur Datenauswertung zum Einsatz kommt, können aus den um die Struktur oder an der Struktur angebrachten mindestens drei Markerstoffen nach deren Positionsbestimmung durch einfache Triangulation bzw. damit zusammenhängende Berechnungen die Positionierungseigenschaften der Struktur erhalten werden. Typischerweise ist die zu untersuchende Struktur mindestens zweidimensional, vorzugsweise aber dreidimensional ausgebildet.
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Eine Mehrzahl von Referenzstrukturen, worunter mindestens zwei Referenzstrukturen, vorzugsweise mindestens fünf Referenzstrukturen, besonders vorzugsweise mindestens zehn Referenzstrukturen verstanden werden sollen, dient einer zuverlässigen Farbkorrektur. Bei dieser Farbkorrektur soll ausgenutzt werden, dass die Referenzstrukturen in verschiedenen Einfarbenaufnahmen stets an gleichen Positionen auftauchen müssen. Falls sich in den verschiedenen Einfarbenaufnahmen nun diese Positionen zwischen den einzelnen Aufnahmen unterscheiden, kann durch Auswählen einer Referenzaufnahme und einer Transformation zwischen den Referenzpositionen dieser Aufnahme und den detektierten Positionen der Referenzstrukturen in den restlichen Aufnahmen auch eine Positionskorrektur der Positionen der Markerstoffe erfolgen, so dass ein optischer Offset korrigiert wird. Typischerweise ist eine Anzahl von verwendeten Referenzstrukturen stets um eins größer als eine Anzahl von bei der Farbkorrektur verwendeten Korrekturparametern.
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Die Clusteranalyse kann hierbei mit einem DBSCAN-Algorithmus durchgeführt werden, also einem ”Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise”-Algorithmus, wie er beispielsweise in dem Artikel von Martin Ester, Hans-Peter Kriegel, Jörg Sander, Xiaowei Xu: A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. In: Evangelos Simoudis, Jiawei Han, Usama M. Fayyad (Hrsg.): Proceedings of the Second International Conference an Knowledge Discovery and Data Mining (KDD-96). AAAI Press, 1996 beschrieben ist. Bei diesem Algorithmus wird eine Signalstärke des jeweiligen Markerstoffs in den Einfarbenaufnahmen zum Bestimmen einer Ortsungenauigkeit verwendet, wobei eine mittlere Position der Signale des jeweiligen Markerstoffs über ein hinsichtlich der Ortsungenauigkeit gewichtetes Mittel bestimmt wird. Eine Signalintensität eines Signals des jeweiligen Markerstoffs in den Einfarbenaufnahmen wird vorzugsweise zur Abschätzung der Ortsungenauigkeit bzw. Positionsungenauigkeit verwendet. Durch diesen Algorithmus können schnell und zuverlässig die Positionen der Markerstoffe ermittelt werden.
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Typischerweise ist die Referenzstruktur als ein lithographisch herstellbares Muster, als ein Metallnanopartikel, vorzugsweise ein Goldnanopartikel, oder als ein Emitter, dessen Emissionsspektrum jedes der Emissionsspektren der mindestens drei Markerstoffe überdeckt, ausgebildet. Der Emitter ist somit in jeder der Einfarbenaufnahmen zu sehen. Sofern ein Metallnanopartikel oder ein lithographisches Muster verwendet werden, müssen diese entsprechend beleuchtet werden, um auf jeder der Einfarbenaufnahmen zu sehen zu sein und als Referenz für Signale der Markerstoffe in diesen Aufnahmen zu dienen.
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Die mindestens eine Struktur, die mittels des Verfahrens untersucht wird, kann ein DNS(Desoxyribonukleinsäure)-Origami sein, das vorzugsweise gefaltet vorliegt. Unter einem DNS-Origami soll hierbei eine Struktur gebildet aus einem Gerüst-DNS-Strang und weiteren DNS-Abschnitten verstanden werde, die eine vorbestimmte Struktur des Gerüststrangs ausbilden. Der DNS-Strang und bzw. oder die DNS-Abschnitte können hierbei weitere Komponenten wie Farbstoffe oder biologische Moleküle, z. B. Proteine oder Enzyme aufweisen.
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Es kann vorgesehen sein, dass die Markerstoffe als Fluorophore oder als Quantenpunkte, die auch als ”Qdots” bezeichnet werden, ausgebildet werden. Die mindestens drei Markerstoffe können dabei sowohl ausschließlich als Fluorophore oder ausschließlich als Quantenpunkte als auch als eine Mischung von Fluorophoren und Quantenpunkten, also beispielsweise einer der Markerstoffe ein Fluorophor, die anderen beiden jeweils ein Quantenpunkt, vorliegen.
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Da vorzugsweise eine Mehrzahl von Aufnahmen je Markerstoff, also eine Mehrzahl von Einfarbenaufnahmen je Emissionsspektrum erhalten wird, sollte eine Korrektur eines thermischen Treibens in den Einfarbenaufnahmen durchgeführt werden, um somit eine einzelne Einfarbenaufnahme mit korrigierten Positionen des jeweiligen Markerstoffs bzw. der Referenzstrukturen zur Weiterverarbeitung zur Verfügung zu haben.
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Ein Abstand zwischen den jeweiligen Markerstoffen kann durch eine paarweise Distanzanalyse bestimmt werden, bei der jeweils zwei Positionen von Signalen unterschiedlicher Markerstoffe hinsichtlich ihres Abstands analysiert werden. Hierdurch wird eine robuste Bestimmung der Abstände erhalten. Indem der Abstand jeder Position eines der Markerstoffe zu allen Positionen eines weiteren der Markerstoffe bestimmt wird, kann über eine Darstellung der ermittelten Abstände in einem Histogramm und einem Fit einer Gauß'schen Normalverteilung oder einer anderen symmetrischen Verteilung der mittlere Abstand ermittelt werden, wobei die Normalverteilung die Distanz bzw. den Abstand als einzigen freien Parameter aufweist. Ein Amplitudenparameter des Fits wird proportional zu einer Anzahl an einfließenden Abständen sowie eine Breite der Normalverteilung aus einer Quadratwurzel der mittleren Positionsungenauigkeiten der beiden betrachteten Markerstoffe bestimmt. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass Messfehler oder Ausreißer weniger stark ins Gewicht fallen.
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Typischerweise wird durch die Clusteranalyse eine mittlere Position der Signale des jeweiligen Markerstoffs erhalten und der Bestimmung der Positionierungseigenschaften der mindestens einen Struktur zugrunde gelegt. Außerdem kann vorgesehen sein, dass nach der Positionsbestimmung des jeweiligen Markerstoffs eine Fehlerabschätzung durchgeführt und im weiteren Verfahren berücksichtigt wird, um die Positionierungseigenschaften der mindestens einen Struktur ebenfalls mit Fehler angeben zu können.
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Aus einer Zirkularität der Markerstoffe kann eine Ablageorientierung der Struktur bestimmt werden, d. h. es kann bestimmt werden, welche der Seiten der Struktur dem Betrachter gerade zugewandt ist. Dies ist dadurch möglich, dass eine Anordnung der mindestens drei Markerstoffe dahingehend untersucht wird, ob sie im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn angeordnet sind. Je nach bestimmtem Umlaufsinn kann dann bei bekannter theoretischer Anordnung der Markerstoffe darauf geschlossen werden, welche Seite gerade dem Träger zugewandt ist. Um die Lage bzw. Ablageorientierung zu bestimmen, sollte mindestens ein Markerstoff mehr verwendet werden als die Struktur Dimensionen hat, d. h. eine Anzahl der verwendeten Markerstoffe sollte um mindestens eins größer als eine Dimensionszahl der mindestens einen Struktur sein.
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In besonders bevorzugter Weise wird eine dreidimensionale Struktur verwendet, an der mindestens vier Markerstoffe angeordnet sind. Vorzugsweise ist jeder der Markerstoffe an einer anderen Seite der mindestens einen Struktur angeordnet.
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Eine Vorrichtung zum Durchführen des beschriebenen Verfahrens weist eine optische Aufnahmeeinheit und eine elektronische Verarbeitungseinheit auf. Die optische Aufnahmeeinheit ist eingerichtet, eine Fernfeldmikroskopie an dem Träger, der mit der mit mindestens drei Markerstoffen versehenen mindestens einen Struktur und der Mehrzahl von Referenzstrukturen versehen ist, durchzuführen, indem die mindestens drei Markerstoffe durch Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung durch eine an der optischen Aufnahmeeinheit angeordnete Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung emittieren. Die elektronische Verarbeitungseinheit ist dazu eingerichtet, eine Position des jeweiligen Markerstoffs in den Einfarbenaufnahmen zu ermitteln, eine der Einfarbenaufnahmen als Referenzaufnahme auszuwählen und jede der weiteren Einfarbenaufnahmen bezüglich dieser Referenzaufnahme durch die in jeder der Einfarbenaufnahmen erkennbaren Referenzstrukturen durch eine Farbkorrektur zu korrigieren, die farbkorrigierten Einfarbenaufnahmen zu der Gesamtaufnahme zu kombinieren und abschließend die Position jedes der mindestens drei Markerstoffe in der Gesamtaufnahme durch eine Clusteranalyse zu ermitteln, sowie aus der ermittelten Position der mindestens drei Markerstoffe in der Gesamtaufnahme durch Triangulation eine Position, eine Orientierung, eine Lage und bzw. oder eine Integrität der mindestens einen Struktur zu ermitteln.
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Hierzu kann die optische Aufnahmeeinheit als ein Fluoreszenzmikroskop ausgebildet sein, die Markerstoffe also zur Fluoreszenz angeregt werden. Dies erlaubt eine einfache und zuverlässige Anregung sowie eine entsprechend einfache Erfassung der Signale der Markerstoffe.
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Vorzugsweise ist die optische Aufnahmeeinheit zum Anregen einer Emission elektromagnetischer Strahlung der mindestens drei Markerstoffe mit mindestens einer Laserstrahlquelle, vorzugsweise mindestens drei Laserstrahlquellen unterschiedlicher Wellenlänge, und bzw. oder einer polychromatischen Lichtquelle mit mindestens drei Filtergläsern unterschiedlicher Farbe ausgestattet. Hiermit kann gezielt und mit einem einfachen Aufbau jeder der drei Markerstoffe aktiviert und zur Emission angeregt werden.
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Es kann vorgesehen sein, dass die Markerstoffe zur besseren Sichtbarkeit in den Aufnahmen im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums emittieren, d. h. jeweils bei einer Wellenlänge zwischen 400 nm und 700 nm.
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Das beschriebene Verfahren wird typischerweise mit der beschriebenen Vorrichtung durchgeführt.
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Ein Computerprogrammprodukt weist eine auf einem maschinenlesbaren Träger, vorzugsweise einem digitalen Speichermedium, gespeicherte Befehlsfolge zum Durchführen des beschriebenen Verfahrens und bzw. oder zum Ansteuern der beschriebenen Vorrichtung auf, wenn das Computerprogrammprodukt auf einer elektronischen Recheneinheit bzw. der elektronischen Verarbeitungseinheit abläuft. Vorzugsweise kann das Computerprogrammprodukt direkt in einen internen Speicher der elektronischen Recheneinheit geladen werden oder ist in diesem bereits gespeichert und umfasst typischerweise Teile eines Programmcodes zum Durchführen des beschriebenen Verfahrens oder zum Ansteuern der beschriebenen Vorrichtung, wenn das Computerprogrammprodukt auf der elektronischen Recheneinheit abläuft bzw. ausgeführt wird. Das Computerprogrammprodukt kann auch ein Computerprogramm umfassen, das Softwaremittel zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens und bzw. oder zum Ansteuern der beschriebenen Vorrichtung aufweist, wenn das Computerprogramm in einem Automatisierungssystem oder auf der Recheneinheit ausgeführt wird.
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Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden nachfolgend anhand der 1 bis 10 beschrieben.
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Es zeigen:
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1 eine Draufsicht auf eine schematisch dargestellte zu untersuchende Struktur;
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2 eine perspektivische Ansicht einer weiteren zu untersuchenden Struktur;
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3 ein Emissionsspektrum verschiedener Markerstoffe;
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4 eine schematische seitliche Ansicht einer Probe mit darauf befestigter zu untersuchender Struktur sowie Markerstoffen und Referenzstruktur;
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5 ein schematisches Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Bestimmen der Eigenschaften der zu untersuchenden Struktur;
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6 eine 1 entsprechende Draufsicht auf die zu untersuchende Struktur mit eingezeichnetem Winkel zu Bestimmung der Eigenschaften;
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7 ein Diagramm mit Clustern von Signalen der Markerstoffe,
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8 eine seitliche schematische Ansicht einer Vorrichtung zum Bestimmen der Eigenschaften mindestens einer Struktur im Submikrometerbereich,
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9 eine schematische Darstellugn einer paarweisen Distanzanalyse und
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10 ein aus der paarweisen Distanzanalyse erhaltenes Histogramm.
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1 zeigt in einer Draufsicht eine zu untersuchende Struktur, die 100 nm mal 100 nm große, gefaltete DNS-Origami-Struktur 1. Die dargestellte Struktur 1 ist auf einem Träger 10 als zweidimensionale Figur angeordnet und kann als Template für funktionale Bauteile nanometerskaliger elektronischer oder optoelektronischer Schaltkreise eingesetzt werden. Um die Struktur 1 zu untersuchen, sind um die DNS-Origami-Struktur 1 herum auf dem Träger 10 bzw. an der oder auf der DNS-Origami-Struktur 1 drei Markerstoffe 2, 3 und 4 angeordnet, die jeweils in verschiedenen Wellenlängen sichtbare elektromagnetische Strahlung emittieren. Zusätzlich sind auf dem Träger 10 lithographisch erzeugte Referenzstrukturen 5 angeordnet.
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In 2 ist in einer 1 entsprechenden Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel der zu untersuchenden Struktur 1 im Submikrometerbereich gezeigt. Wiederkehrende Merkmale sind in dieser wie auch in den folgenden Figuren mit identischen Bezugszeichen versehen. Die DNS-Origami-Struktur 1 ist nun jedoch würfelförmig, d. h. als dreidimensionale Struktur auf dem Träger 10 ausgeführt. Auf jeder Seite des Würfels befindet sich einer der Markerstoffe 2, 3 oder 4, wobei sich auf einer einem Betrachter abgewandten Seite nun ein zusätzlicher, vierter Markerstoff 29 befindet. Zur eindeutigen Zuordnung kann generell vorgesehen sein, dass eine Anzahl verwendeter Markerstoffe um eins größer als eine Dimension der Struktur 1 ist. Außerdem ist wiederum eine Referenzstruktur 5 auf dem Träger 10 in Form eine Goldnanopartikels vorgesehen.
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Die drei Markerstoffe 2, 3 und 4 sind in dem dargestellten Ausführungsbeispiel Quantenpunkte, die auf verschiedenen Wellenlängen emittieren. 3 zeigt ein Diagramm der Emissionsspektren. Auf der Abszisse ist eine Wellenlänge in Nanometern aufgetragen, auf der Ordinate eine relative Intensität in Prozent. Durch einen Laserstrahl 6 mit einer Wellenlänge von 488 nm werden die drei Markerstoffe 2, 3 und 4 jeweils zur Emission angeregt. Der Markerstoff 2 zeigt dabei das Emissionsspektrum 7 mit einer Zentralwellenlänge von 525 nm, der Markerstoff 3 das Emissionsspektrum 8 mit einer Zentralwellenlänge von 585 nm während der Markerstoff 4 das Emissionsspektrum 9 mit einer Zentralwellenlänge von 655 nm aufweist. Durch diese optische Isolierung können Signale der einzelnen Markerstoffe 2, 3 und 4 zuverlässig voneinander getrennt werden.
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In weiteren Ausführungsbeispielen können allerdings auch Farbstoffe bzw. Fluorophore als Marker verwendet werden, die mit jeweils einem Laserstrahl angeregt werden. Die somit drei verwendeten Laserstrahlen weisen hierzu unterschiedliche Wellenlängen auf. Sofern lithographische Strukturen oder Metallnanopartikel als Referenzstruktur 5 verwendet werden, kann auch Streulicht des Nanopartikels zum Auffinden der Referenzstruktur 5 verwendet werden. Hierzu wird die Referenzstruktur 5 mit polychromatischem Weißlicht beleuchtet.
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4 zeigt in einer seitlichen Ansicht einen Träger 10 aus Glas, dessen Oberfläche mit einer Schicht 11 geblockt ist, die auch Antibiotinverbindungen 12 enthält. Aus der Struktur 1 ragen auf der Seite ohne Markerstoffe 2, 3, 4 Biotinmoleküle, die über eine Biotin-Antibiotin-Bindung 12 die Struktur 1 am Träger 10 fixieren. Entscheidend ist hierbei, dass die Struktur 1 über eine Messdauer ortsfest gehalten wird. Die drei Markerstoffe 2, 3 und 4 sind zur Verdeutlichung vergrößert auf der Struktur 1 dargestellt. Neben der Struktur 1 befindet sich ein sogenannter ”TetraSpec bead” als Referenzstruktur 5, der breitbandig elektromagnetische Strahlung emittiert und somit in allen Aufnahmen zu sehen ist, bei denen einer der Markerstoffe 2, 3 oder 4 zum Leuchten angeregt wird. Die Referenzstruktur 5 kann in beliebigem Abstand zu der zu untersuchenden Struktur 1 angeordnet sein, solange sie sich auf dem gleichen Träger 10 befindet bzw. in einem gleichen Lichtpfad eines zur Untersuchung verwendeten Mikroskops wie die Struktur 1 liegt.
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Ein Ausführungsbeispiel des Verfahrens zum Bestimmen der Eigenschaften der Struktur 1 ist in einem schematischen Ablaufdiagramm in 5 dargestellt. Das beschriebene Verfahren basiert auf optischer Fernfeld-Lokalisationsmikroskopie sowie computergestützter automatisierter Datenanalyse. Diese computergestützte automatisierte Datenanalyse wird durch eine Optimierung einer durch die Mikroskopie erhaltenen Rohdatenerfassung und Markereigenschaften ermöglicht. Im Gegensatz zu bislang verwendeten Verfahren wird die optische Isolierung nun jedoch, wie in 3 gezeigt, durch Verwenden von mindestens drei spektral getrennten Sensorpunkten der Markerstoffe 2, 3 und 4 erreicht. Dies entspricht dabei einem Minimalsystem zur Charakterisierung von zweidimensionalen DNS-Origami-Strukturen.
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Um einzelne Farbdetektionskanäle der bei verschiedenen angeregten Markerstoffen 2, 3 und 4 erhaltenen Einzelfarbaufnahmen der Struktur 1 zueinander korrelieren zu können, wird ein nanometergenaues Farbverschiebungskalibrationsverfahren mit Hilfe von oberflächenfixierten ”TetraSpec beads”, d. h. in allen Farben leuchtenden Markerpartikeln als Referenzstruktur 5 angewandt. Als Markerstoffe 2, 3 und 4 können hierbei beliebige Fluoreszenzobjekte verwendet werden, die spezifisch an die zu untersuchende Struktur 1 gebunden werden bzw. um die zu untersuchende Struktur 1 herum auf dem Träger 10 angeordnet werden. Die Markerstoffe 2, 3 und 4 sollen möglichst großflächig über die bzw. um die zu untersuchende Struktur 1 verteilt werden.
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Zunächst erfolgt bei dem in 5 dargestellten Verfahren in Schritt 13 eine Initialisierung eines Multifarben-Fernfeldmikroskops mit einem xyz-Verfahrtisch und einem automatischen Fokus. Anschließend werden in Schritt 14 die Messparameter festgelegt, insbesondere ein Messraster, eine Beleuchtungsleistung und Beleuchtungseigenschaften, eine Anzahl von Aufnahmen pro Farbkanal, also pro Wellenlänge und ein Messzyklus, der im gezeigten Ausführungsbeispiel gerade 10 Aufnahmen je Farbkanal vorsieht.
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In Schritte 18 erfolgt eine Vermessung der Probe mit vorab festgelegten Messparametern. Alternativ kann in Schritt 15 eine Vermessung einer Referenzprobe zur Farbverschiebungskorrektur erfolgen, die in diesem Ausführungsbeispiel mindestens 3 Messzyklen umfasst. Nachfolgend wird in Schritt 16 eine Positionsbestimmung der Referenzprobe in jedem Farbkanal mit einer Fehlerabschätzung und Korrektur einer thermischen Drift bzw. eines thermischen Treibens vorgenommen. In Schritt 17 werden über eine lineare Transformation ein oder mehrere Parameter zwischen den Farbkanälen wie Verschiebung, Rotation und Skalierung bestimmt. Sowohl von Schritt 17 als auch von Schritt 18 kommend wird in Schritt 19 eine Positionsbestimmung der Markerstoffe 2, 3 und 4 in allen aufgezeichneten Einfarbenaufnahmen, eine Korrektur des thermischen Treibens und einer Farbverschiebung vorgenommen und somit für jeden Farbkanal eine korrigierte Einfarbenaufnahme erhalten. Die Korrektur der Farbverschiebung wird hierbei mittels der in allen Aufnahmen detektierbaren Position der Referenzstrukturen 5 vorgenommen. Indem eine der Einzelfarbaufnahmen als Referenzaufnahme verwendet wird und alle anderen Aufnahmen dergestalt korrigiert werden, dass die Positionen der Referenzstrukturen 5 in allen Einzelfarbaufnahmen übereinstimmen, muss auch die Position der Markerstoffe in den einzelnen Einfarbenaufnahmen nach dieser Farbkorrektur in einem festgelegten Verhältnis zueinander stehen.
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Zum Bestimmen der Positionen der Markerstoffe 2, 3 und 4 werden in jedem Farbkanal, d. h. bei jeder Emissionswellenlänge der Markerstoffe 2, 3 und 4, Serien von Fluoreszenzbildern aufgezeichnet, wobei pro Farbkanal in dem dargestellten Ausführungsbeispiel ca. 100 Aufnahmen gemacht werden. In jeder der Aufnahmen wird die Position des jeweiligen Markerstoffs 2, 3 oder 4 anhand der Signale dieses Markerstoffs 2, 3 oder 4 mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich bestimmt und auf thermische Bewegung hin, wie oben bereits diskutiert, korrigiert. Anschließend werden diese korrigierten Einfarbenaufnahmen für eine Identifikation der zu untersuchenden Struktur zu einer Gesamtaufnahme kombiniert und einer Clusteranalyse unterzogen, Schritt 20 entspricht.
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Hierzu werden zunächst in der Gesamtaufnahme Cluster identifiziert, also räumliche Bereiche vorbestimmter Größe in den einzelnen Aufnahmen, in denen eine Dichte an Signalen bzw. ein Signalanteil der von dem jeweiligen Markerstoff 2, 3 oder 4 herrührenden Signale einen vorbestimmten Wert gegenüber der restlichen Aufnahme überschreitet. In Schritt 21 erfolgt nun eine Analyse dieser indizierten Cluster: Durch einen DBSCAN-Algorithmus der einzelnen Farbpositionen eines jeden der indizierten Cluster erfolgt eine nanometergenaue Bestimmung einer mittleren Position der Markerstoffe 2, 3 und 4 und eine Verifizierung der Eigenschaften der Markerstoffe 2, 3 und 4, bei der auch eine Ortsbestimmungsunschärfe der Markerstoffe 2, 3 und 4 in jedem aufgezeichneten Bild als Fehlerabschätzung berücksichtigt wird. Anschließend werden die ermittelten Positionen der Markerstoffe 2, 3 und 4 zueinander korreliert und ausgewertet. Da jeder Farbkanal einer unabhängigen Verifizierung der DNS-Origami-Struktur 1 entspricht, ist eine robuste Identifikation der Strukturen 1 auch bei stark rauschbehafteten Messdaten möglich.
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Zur finalen Auswertung werden in Schritt 22 die ermittelten Positionen der Markerstoffe 2, 3 und 4 durch eine Triangulation in Beziehung zueinander gesetzt und es erfolge eine Bestimmung einer Position der Struktur 1 in der Gesamtaufnahme als Ortsangabe, einer Orientierung der Struktur 1 als Angabe einer Rotation hinsichtlich einer vorgegebenen Ausrichtung, einer Lage oder Zirkularität der Struktur 1 als Angabe, ob eine Oberseite oder eine Unterseite einem Betrachter zugewandt ist, und bzw. oder einer Integrität der Struktur 1, d. h. ob eine korrekte Strukturfaltung gegeben ist, an der die Markerstoffe 2, 3 und 4 wie vorgesehen angeordnet sind. Abschließend erfolgt in Schritt 24 eine Kumulierung der analysierten Daten sowie ein Abgleich mit theoretischen Erfahrungswerten sowie eine Ausgabe der ermittelten Parameter zur Qualitätskontrolle.
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Durch das beschriebene Verfahren können fast 10000 Proben/stunde vermessen werden bei minimalem Aufwand mit der Probenpräparation.
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Außerdem wird eine nicht-invasive Qualitätskontrolle auch in wässriger Umgebung gewährleistet. Das Verfahren ermöglicht somit einen Lückenschluss zwischen Ensembleverfahren wie der Gelelektrophorese und Einzelmolekülmessungen.
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6 zeigt in einer 1 entsprechenden Ansicht die Struktur 1 mit den Markerstoffen 2, 3 und 4 sowie einem zur Triangulation verwendeten Dreieck. Ein Winkel Θ des Dreiecks ist in dem dargestellten Ausführungsbeispiel ein Winkel von 64°. 7 zeigt eine Gesamtaufnahme mit verschiedenen Signalpunkten der Markerstoffe 2, 3 und 4. Die Signalpunkte des Markerstoffs 4 liegen hierbei unten, während die Signalpunkte des Markerstoffs 2 sich links oben befinden. Die Signalpunkte des Markerstoffs 3 sind dementsprechend rechts oben angeordnet. Eine x-Position ist auf der Ordinate in Nanometern aufgetragen, die y-Position auf der Abszisse ebenfalls in Nanometern. Die Mittelpunkte der jeweiligen Cluster sind durch die Clusteranalyse bereits erfasst und das in 6 bereits eingezeichnete Dreieck ist in 7 zwischen den Mittelpunkten der Cluster ebenfalls gezeigt. Durch das Dreieck und entsprechende Triangulation kann nun die zu untersuchende Struktur ermittelt werden.
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Da bei dem beschriebenen Verfahren auf der Probe 10 eine Mehrzahl von DNS-Origami-Strukturen 1 aufgebracht werden, in dem dargestellten Ausführungsbeispiel mehrere Hundert, jedoch bei nicht allen dieser Strukturen 1 ein entsprechendes Signal in einer vorbestimmten Anzahl von Einfarbenaufnahmen, beispielsweise mindestens 25 Prozent, auffindbar sind, werden für die weitere Auswertung nur diejenigen Signalpunkte berücksichtigt, die dieses Kriterium erfüllen. Somit ergeben sich bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel 539 mögliche Punkte, an denen die Struktur 1 sitzen kann. Von diesen Punkten wiesen 63 Prozent auch einen Signalpunkt des Markerstoffs 2, 30 Prozent einen Signalpunkte des Markerstoffs 3, 47 Prozent einen Signalpunkt des Markerstoffs 4 und 10 Prozent Signalpunkte aller drei Markerstoffe 2, 3 und 4 in der theoretisch zu erwartenden Umgebung um einen der möglichen Punkte, an denen die Struktur 1 sitzt, auf. Diese 10 Prozent der Punkte wurden schließlich für die in 7 gezeigte Analyse herangezogen.
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8 zeigt in einer schematischen seitlichen Ansicht eine Vorrichtung zum Bestimmen von Eigenschaften der Struktur 1, bei der ein Fluoreszenzmikroskop 24 durch eine Laserstrahlungsquelle 28 einen Laserstrahl 26 auf die Träger 10 und die darauf befindliche zu untersuchende Struktur emittiert und somit die Markerstoffe 2, 3 und 4 anregt. Statt der Laserstrahlungsquelle 28 können auch drei Laserstrahlungsquellen unterschiedlicher Wellenlängen oder eine Beleuchtungseinheit, die in mehreren Wellenlängen, also polychromatisch emittiert, jedoch mehrere Farbfilter zum Erzeugen einer monochromatischen Anregungsstrahlung für die Markerstoffe 2, 3 und 4 angeordnet sein.
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Das Fluoreszenzmikroskop übermittelt die Einzelfarbenaufnahmen an einen Computer 25 als elektronische Verarbeitungseinheit bzw. elektronische Auswerteeinheit, der das beschriebene Verfahren durchführt. Hierbei kann der Computer 25 auch eine auf einem maschinenlesbaren Träger, vorzugsweise einem digitalen Speichermedium, gespeicherte Befehlsfolge, also ein Computerprogramm zum Durchführen des beschriebenen Verfahrens aufweisen, die alternativ oder zusätzlich auch zum Ansteuern des Fluoreszenzmikroskops diene kann, wenn das Computerprogramm auf dem Computer 25 abläuft. Vorzugsweise kann ein Computerprogrammprodukt direkt in einen internen Speicher des Computers 25 geladen werden oder ist in diesem bereits gespeichert und umfasst typischerweise Teile eines Programmcodes zum Durchführen des beschriebenen Verfahrens oder zum Ansteuern des Fluoreszenzmikroskops, wenn das Computerprogrammprodukt auf dem Computer 25 abläuft bzw. ausgeführt wird. Abschließend werden die ermittelten Eigenschaften der Struktur 1 von dem Computer 25 auf einem Display 27 als Ausgabeeinheit dargestellt.
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Das Vorgehen bei einer paarweisen Distanzanalyse ist in 9 an einem bewusst einfach gehaltenen Beispiel dargestellt. Ausgehend von zwei Signalen des Markerstoffs 2, die durch ”A” und ”B” gekennzeichnet sind und deren Positionen in 9 in einem kartesischen Koordinatensystem mittels einer x-Koordinate und einer y-Koordinate angegeben sind, werden Verbindungen von einem der beiden Markerstoffe zu allen Positionen von Signalen des Markerstoffs 3, die durch ”a”, ”b” und ”c” gekennzeichnet sind, ermittelt. Diese Distanzen werden gruppiert und die erhaltene Verteilung in dem in 10 dargestellten Histogramm dargestellt. Auf der Ordinate ist hierbei eine Anzahl von ermittelten Abständen der jeweiligen Klasse aufgetragen, während auf der Abszisse der Abstand aufgetragen ist.
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An dieses Histogramm wird eine Gauß'sche Normalverteilung gefittet, deren einziger Parameter der mittlere Abstand ist. Aus einer Summe quadrierter mittlerer Fehler der Positionen wird eine quadrierte Breite der Normalverteilung erhalten. Ein Amplitudenparameter des Fits ist proportional zu einer Anzahl an einfließenden Abständen sowie der Breite der Normalverteilung.
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Lediglich in den Ausführungsbeispielen offenbarte Merkmale der verschiedenen Ausführungsformen können miteinander kombiniert und einzeln beansprucht werden.
