DE19803077C1 - Verfahren zur Herstellung von Testkörpern zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Ligandensubstanz Komplexen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Testkörpern zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Ligandensubstanz Komplexen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Testkörpern (Stacked-Layer-Chips (SL-Chips)) zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Ligandensubstanz Komplexen gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
Die Erfindung findet Anwendung im Bereich der medizinischen Diagnostik, der Lebensmittelüberwachung, der Umweltanalytik, der molekularbiologischen Analytik, sowie bei der Entwicklung pharmazeutischer Präparate.
Bisher werden bei der parallelen Untersuchung von Substanzgemischen oft filterbasierte Testsysteme angewendet. Im Falle von Gemischen aus verschiedenen DNA-Fragmenten, setzt man zur Analyse häufig membranbasierte Verfahren wie Southern-Blots [1], Northern-Blots [2], Western-Blots [3, 4], Dot-Blots [5, 6] bzw. Slot-Blots oder andere flächenhaft ausgeführte Testkörper [10] ein, die teilweise als DNA-Mikrochips bezeichnet werden. Letztere verfügen über eine Vielzahl geordnet immobilisierter Reaktanden auf kleinsten Flächen, die den sequenzspezifischen Nachweis von Nukleinsäuren erlauben. Die entsprechenden Testkörper werden flächenhaft auf geeigneten Unterlagen aufgebaut. Dazu werden Oligonukleotide durch geeignete Verfahren in situ an festgelegten Positionen auf flächenhaften Unterlagen synthetisiert [7] oder mit physikalischen Methoden wie z. B. modifizierten Tintenstrahldruckern [8] aufgebracht. Auch Methoden zur Synthese verschiedener immobilisierter Peptide auf einer Fläche und einem nachfolgenden Analyseprozeß auf dieser Fläche sind bekannt [9].
In den folgenden Literaturstellen ist der zitierte Stand der Technik beschrieben:
  • 1. Southern, E.M.
    Detection of specific sequences among DNA-fragments separated by gel electrophoresis.
    J. Mol. Biol. (1975); 98: 503,
  • 2. Thomas P.S.
    Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980); 77(9): 5201-5205,
  • 3. Burnette N.W.
    Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecylsulfate­ polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. (1981); 112: 195-203,
  • 4. Beisiegel U, Schneider W.J., Brown M.S, Goldstein J.L
    Immunoblot analysis of low density lipoprotein receptors in fibroblasts from subjects with familial hypercholesterolemia. J. Biol. Chem. (1982); 257(21): 13150-13156,
  • 5. Kafatos F.C., Jones C.W., Efstratiadis A.
    Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure Nucleic Acids Res. (1979); 7: 1541-1552,
  • 6. Dyson N.J.
    Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis. In: Essential molecular biology: A practical approach.
    Vol. 2 (T.A. Brown, ed.), 111-156, IRL Press, Oxford,
  • 7. Hubbell E.A., Lipshutz R.J., Morris M., Winkler J.L.
    Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
    Patent Nummer: 5593839
    Offenlegungstag: 02.06.1995
    Land: US,
  • 8. Wallace R.W.
    DNA on a chip: serving up the genome for diagnostics and research Molecular Medicine Today (1997), 3(9): 384-389,
  • 9. Hudson D., Johnson C.R., Giebel L.
    Method and apparatus for peptide synthesis and screening Patent Nummer: 5591646
    Offenlegungstag: 07.01.1997
    Land: US,
  • 10. Wölfl S.
    Optischer Nachweis von Hybridisierungssignalen
    Patent Nummer: 196 12 356 A1
    Offenlegungstag: 02.10.1997
    Land: Deutschland.
Die geordnete Immobilisierung einer großen Zahl von Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen bindungsfähigen Substanzen ist derzeit nur unter hohen Kosten und erheblichem apparativen Aufwand möglich.
Hier will die Erfindung Abhilfe schaffen.
Der in den Patentansprüchen angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur geordneten Immobilisierung verschiedener bindungsfähiger Substanzen auf engstem Raum zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird das Problem durch die in den Patentansprüchen dargelegten Merkmale gelöst.
Erfindungswesentlich ist die Verwendung einer makroskopischen Anordnung zur Herstellung dreidimensionaler mikroskopischer Strukturen. Dazu werden die immobilisierbaren Reaktanden jeweils an geeignetes Matrixmaterial gebunden und jeweils schichtweise aufeinander angeordnet. Der geringste Abstand zwischen zwei immobilisierten Reaktanden wird nur durch die technisch erreichbare minimale Schichtdicke bestimmt. Im Gegensatz zu den bisher bekannten Verfahren ist die flächenhafte Ausdehnung des substanzbindenden Bereiches nicht limitierend, so daß die beschriebenen Vorrichtungen in großer Formenvielfalt und mit variablen äußeren Abmessungen hergestellt werden können.
Der Nachweis bindender Substanzen erfolgt unter Verwendung geeigneter Nachweissysteme nach einer Bindungsreaktion gegen immobilisierte Reaktanden auf den Schnittflächen des dreidimensionalen Objektes. Die Schnitte sind dabei so zu führen, daß die nachweisrelevanten Schichten der dreidimensionalen Anordnung freigelegt und für das Substanzgemisch zugänglich werden. Zur Freilegung der Schichten können physikalische oder chemische Verfahren zur Anwendung kommen. Im Gegensatz zu den bekannten flächenhaft ausgeführten Anordnungen können zu analysierende Substanzen nicht nur an die Schnittfläche selbst, sondern auch an die Flächen binden, die in die Tiefe des dreidimensionalen Objektes weisen.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit zur Immobilisierung von Reaktanden mit unterschiedlicher chemischer Grundstruktur durch die Variation der Testkörpermatrix unter Beibehaltung der Testkörpergeometrie.
Die Erfindung wird an einem Beispiel in den nachfolgenden Schritten näher erläutert. Die beigefügte Zeichnung zeigt ein Strukturbild des SL-Chips aus dem Beispiel.
Beispiel
  • 1. Nylonmembranen wurden entweder mit alkalisch denaturierter DNA des Phagen Lambda oder mit ebenfalls alkalisch denaturierter genomischer DNA aus Hühnererythrozyten beschickt und durch UV-Licht fixiert. Die einzelnen Membranen hatten jeweils eine Flächengröße von 1 cm × 2 cm.
Die Verwendung von Nylonmembranen stellt nur eine Möglichkeit zur Matriximmobilisierung von DNA dar. Generell sind alle Immobilisierungsmethoden verwendbar, die zur Konstruktion von Objekten nach Patentanspruch 1-2 geeignet sind und die an ihren Schnittflächen die Bindung und Detektion von Substanzen durch geeignete Nachweissysteme erlauben.
  • 2. Die Membranen wurden mit Kontaktkleber nach Angaben des Herstellers aufeinander verklebt, so daß sich ein Membranobjekt mit den Maßen 2 cm × 1 cm und einer Dicke von insgesamt 2 mm ergab.
Die Verwendung des Kontaktklebstoffes ist erfindungsgemäß nicht zwingend notwendig. Neben der Verwendung anderer Klebstoffe kann auch eine physikalische Fixierung der Membranschichten erfolgen. Auch kann die Unterscheidung zwischen Matrix und Klebstoff entfallen. Generell sind alle Methoden verwendbar, die zur Konstruktion von Objekten nach Patentanspruch 1-2 geeignet sind und die an ihren Schnittflächen die Bindung und Detektion von Substanzen durch geeignete Nachweissysteme erlauben.
  • 3. Vom Membranobjekt wurden 1 cm lange und 2 mm breite Stücke abgeschnitten. Diese Objektstücke enthielten jeweils Schnittflächen aller verklebten Membranen.
Die angegebenen geometrischen Formen und Maße sind nicht bindend. Die Parameter können je nach Anwendungszweck und dem zur Verfügung stehenden Auswertegerät angepaßt werden.
  • 4. Ein Objektstück wurde über Nacht mit einer Lambda-spezifischen DNA-Sonde hybridisiert, die zuvor mit Fluorescein-12-dGTP markiert worden war. Nach dem Waschen fluoreszierte nur die mit Lambda-DNA beschickte Membranschicht des Objektstückes. Zur Beobachtung diente ein Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung geeigneter Objektive und eines geeigneten Filtersatzes.
Die Nachweis- und Detektionsmethoden beschränken sich nicht auf die hier beschriebene. Je nach gebundener Substanz müssen geeignete und spezifische Methoden ausgewählt werden.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Testkörpern (Stacked-Layer-Chips (SL-Chips)) zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Li­ gandensubstanz Komplexen, dadurch gekennzeichnet,
  • a) daß immobilisierte Reaktanden jeweils an geeignetes Matrixmaterial gebunden und dreidimensional, schichtweise aufeinander angeordnet sind,
  • b) daß der geringste Abstand zwischen zwei immobilisierten Reaktanden durch die technisch erreichbare minimale Schichtdicke bestimmt ist,
  • c) daß geeignete Schnittflächen durch die dreidimensionale Anordnung der Reaktandenschichten zum Nachweis von Bindungspartnern dienen und
  • d) daß weitere Schichten verwendet werden, deren Schnittflächen nicht der Bindung von Bindungspartnern dienen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
  • a) daß Nukleinsäuren oder Proteine,
  • b) daß Desoxyribonukleinsäuren, Ribonukleinsäuren sowie ihre natürlich vorkommenden oder synthetischen Derivate oder Analoga jeweils in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form,
  • c) daß natürlich vorkommende oder synthetische Derivate oder Analoga von Proteinen und Peptiden verwendet werden,
  • d) daß Reaktanden immobilisiert werden, deren chemische Grundstruktur sich von Proteinen oder Nukleinsäuren unterscheidet.
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